使用人工微rna下調基因表達的製作方法

2023-12-09 09:25:26 2

使用人工微rna下調基因表達的製作方法
【專利摘要】本發明涉及使用人工微RNA下調基因表達。具體地，本發明描述了包含前體miRNA分離的核酸片段、人工miRNA以及它們在下調基因表達中的用途。
【專利說明】使用人工微RNA下調基因表達
[0001] 本申請是申請日為2008年12月17日的中國專利申請200880121660.8 「使用人
工微RNA下調基因表達」的分案申請。
[0002]本申請要求於2007年12月18日提交的第61/014，510號美國臨時申請的優先權，該臨時申請的公開內容全文引入本文以供參考。
【技術領域】
[0003]本發明的領域一般涉及植物分子生物學。具體地講，它涉及下調靶序列表達的構建體和方法。
【背景技術】
[0004]微RNA(miRNA)僅僅在幾年前被首次鑑定出來，但是已清楚的是，它們在調苄基因活性中起重要作用。這些20-22核苷酸非編碼RNA能夠經由鹼基配對與特異性靶mRNA雜交，並且通過介導RNA裂解或翻譯阻抑來下調這些轉錄物的表達。
[0005]最近的研究已經表明，miRNA在發育期間具有重要功能。在植物中，已經表明他們控制多個發育過程，包括開花時間、葉子形態學、器官極性、花形態學以及根發育(綜述於Mallory 和 Vaucheret (2006) Nat Genet38:S31_36 中)。由於 miRNA 的確定的調節作用，他們有可能還參與某些主要作物特徵例如抗旱性和抗病性。
[0006]miRNA被RNA聚合酶II轉錄成聚腺苷酸化的和加帽的信使，稱為pri_miRNA。將這些pr1-miRNA加工成更小的轉錄物,稱為pre_miRNA,這些前體具有形成穩定的髮夾結構的能力(參見 Bartel (2004)Cellll6:281-297 Jones-Rhoades MW，Bartel DP, BartelB.MicroRNAS and their regulatory roles in plants.Annu Rev Plant Biol.2006 ；57:19-53。)雖然在後生動物中,pr1-miRNA在細胞核中通過Drosha被加工成pre-miRNA,並且在細胞質中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟與動物中的途徑不同，因為植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在髮夾加工中的已知功能以外，與Dicer同源的RNaseIII 酶 DICER-LIKE1 (DCLl)還可具有 Drosha 功能(Kurihara 和 Watanabe (2004) Proc NatlAcad ScilOl:12753-12758)。
[0007]最近已經在擬南芥祀向病毒mRNA序列(Niu等人(2006) NatureBiotechnology24:1420-1428)或內源基因(Schwab等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)中描述了人工微RNA (amiRNA)。為了改變沉默的空間模式，可在不同啟動子下表達amiRNA構建體(Schwab 等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)。人工 miRNA 置換微 RNA 及其在前體miRNA中的互補星狀序列並替代靶向將被沉默的mRNA的序列。內源miRNA導致的沉默可見於多種空間上的、時間上的、和發育表達上的模式中(Parizotto等人(2007)GeneSDevl8:2237-2242 ;Alvarez 等人(2006)Plant Celll8:1134-51)。可構建人工 miRNA 以收集和擴展沉默模式的多樣性和特異性。迄今仍無在作物植物中使用amiRNA的報導。
[0008]公布於2004年I月29日的W02004/009779描述了用於在植物中調苄基因表達的組合物和方法。[0009] 申請人:的受讓人的美國專利申請公布2005/0138689公布於2005年6月23日，描述了 miRNa以及它們沉默靶序列的作用。
[0010]序列表簡沭
[0011]根據以下的詳細描述以及序列表，可更全面地理解本發明，以下的詳細描述和序列表形成本申請的一部分。
[0012]序列描述概要說明了後附的序列列表。此序列列表中以單個字母表示核苷酸，以單獨的3字母表示胺基酸，如Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和Biochemical Journal219 (2):345-373(1984)所描述的 IUPAC-1UB 標準中所規定的。
[0013]SEQ ID NO:1-10對應於用於擴增玉米基因組微RNA(miRNA)前體的引物。
[0014]SEQ ID NO分別對應於 159c、164h、168a、169r、和 396h 的玉米 miRNA 前體序列。
[0015]SEQ ID NO: 16對應於人工miRNA (amiRNA)序列，該序列用於沉默玉米八氫番茄紅素去飽和酶(ros)轉錄。
[0016]SEQ ID NO:17-21 分別對應於 159c_PDS、164h_PDS、168a_PDS、169r_PDS、和396h-PDS的amiRNA前體包含的「星狀序列」。星狀序列主要是miRNA前體中的互補序列，miRNA前體與miRNA形成雙鏈。
[0017]SEO ID NO:22-26 分別對應於 159c_PDS、164h_PDS、168a_PDS、169r_PDS、和396h-PDS的amiRNA前體。這些前體當在玉米中表達時導致內源PDS轉錄的沉默。
[0018]SEQ ID NO:27-30 分別對應於截短的 amiRNA 前體 169r-PDS-sht、169r-PDS-med、396h-PDS-sht、和 396-PDSied。與 169r_PDS 相比，將 169r_PDS 前體(SEQ ID NO:25)截短了其長度的 11% (169r-PDS-sht, SEQ ID NO:27)和其長度的 35% (169r-PDS_med，SEQID NO:28)。與 396h-PDS 相比，將 396h-PDS 前體(SEQ ID NO:26)截短了其長度的 18%(396h-PDS-sht,SEQ ID NO:29)和其長度的 46% (396h-PDS-med, SEQ ID NO:30)。所有截短的前體包含miRNA和星狀序列。
[0019]SEQ ID NO:31_34 分別對應於 159c_FAD、168a_FAD、169r_FAD、和 396h_FAD 的amiRNA前體。這些前體當在玉米中表達時導致內源fad2_l (負責將油酸轉化成亞油酸的脂肪酸去飽和酶)轉錄的沉默。
[0020]SEQ ID NO:35_38對應於致死葉斑病的miRNA靶和星狀序列。
[0021]SEQ ID NO:39-41對應於多藥耐藥性蛋白的miRNA靶和星狀序列，該蛋白是一種轉運蛋白。
[0022]SEQ ID NO:42_43 分別對應於 168a_MRP 和 396h_MRP 的 amiRNA 前體序列。這些前體當在玉米中表達時導致MRP沉默，MRP導致植酸含量減少。

【發明內容】

[0023]本發明涉及包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ ID NO:11所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:11的核苷酸430至450被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷 酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID N0:11的核苷酸244至264被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0024]受關注的其它分離的核酸片段也包括以下片段:
[0025]a)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:12所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:12的核苷酸94至114被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:12的核苷酸163至183被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0026]b)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:13所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:13的核苷酸53至73被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:13的核苷酸97至117被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0027]c)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:14所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:14的核苷酸110至130被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO: 14的核苷酸184至203被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第 可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；以及
[0028]d)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:15所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0029]可將這些分離的核酸片段中的任何一種用於製備重組構建體，所示重組構建體包含這些可操作地連接至至少一個調控序列的分離核酸片段。
[0030]可將這些構建體轉化到植物細胞中以便轉化的植物細胞在其基因組中包含重組構建體。
[0031]在另一方面，本發明涉及減少靶基因在植物細胞中表達的方法，所述方法包括:
[0032](a)用包含任何一種本文所述分離的核酸片段的核酸構建體轉化至少一種植物細胞；以及
[0033](b)選擇那些轉化的植物細胞，其靶序列的表達水平在與野生型植物細胞中的靶基因的表達水平進行比較時減少。
【具體實施方式】
[0034]與本申請有關的信息可參見於2004年10月12日提交的美國專利申請10/963，238和10/963,394。上述專利申請全文引入本文以供參考。
[0035]可用於理解本發明的其他參考文獻包括於2004年7月I日提交的美國專利申請10/883,374 ;於2004年8月6日提交的美國專利申請10/913,288 ;和於2006年I月6日提交的美國專利申請11/334，776。
[0036]本文中所列出的每篇參考文獻的公開內容均全文以引用方式併入本文。
[0037]如本文所用的並在所附的權利要求書中的單數形式「一個」和「所述」包括複數涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，「一株植物」的涵義包括多株該類植物。「一種細胞」的涵義包括一個或多個細胞及其本領域的技術人員已知的等同物，等等。
[0038]在此公開的上下文中使用了許多術語和縮寫。給出了如下定義。
[0039]「微RNA或miRNA」指寡核糖核酸，它調控包含靶序列的多核苷酸的表達。微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經在動物和植物中鑑定出的非編石馬 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002 ；Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros, Science294:862-8642001 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002 ；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-7282002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002),它調控包含靶序列的多核苷酸的表達。它們由更長的前體轉錄物加工得到，前體轉錄物的大小在大約70至2000nt的範圍內或者更長，並且這些前體轉錄物具有形成穩定的髮夾結構的能力。在動物中，涉及miRNA前體加工的酶稱為Dicer，這是一種 RNAse II1-樣蛋白(Grishok 等人，Celll06:23-342001 ；Hutvagner 等人，Science293:834-8382001 ;Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15:2654-26592001)。植物也具有 Dicer-樣酶，DCLl (以前稱為 CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，並且最近的證據表明，其象Dicer —樣也涉及髮夾前體的加工以產生成熟miRNA (Park等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。此外，最近的研究已經清楚地表明，至少某些miRNA髮夾前體最初是作為較長的聚腺苷酸化轉錄物存在，並且在單個轉錄物中可以存在幾個不同的miRNA以及相關髮夾(Lagos-Quintana等人，Science294:853-8582001 ;Lee 等人，EMBO J21:4663-46702002)。最近的研究還測定了從dsRNA產物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產物是通過DICER加工髮夾而產生的(Schwartz等人，2003，Cellll5:199-208)。似乎所加工的dsRNA的兩個末端的穩定性(即G:C vs.A:U含量，和/或錯配)影響鏈選擇，低穩定性末端更易於通過解旋酶解旋。低穩定性末端的
末端鏈被整合至RISC複合物內，而另一條鏈被降解。
[0040]「pr1-miRNA」或「初級miRNA」是由RNA聚合酶II轉錄得到的長的、聚腺苷酸化的RNA,它編碼miRNA。「pre-miRNA」是已經進行了加工以形成較短序列的初級miRNA，該較短序列的RNA具有形成穩定的髮夾結構的能力，並且可被進一步加工以釋放miRNA。在植物中由dicerlik e進行兩個加工步驟，因此在功能上區別「pr1-miRNA」和「pre-miRNA」是困難的。因此，本文將前體miRNA或初級miRNA在功能上定義為能夠產生miRNA的核苷酸序列。根據該功能定義，以及根據本文實施例和討論，這一點將是清楚的:前體miRNA、初級miRNA和/或本發明的miRNA能以「基本上對應於」前體miRNA、初級miRNA和/或miRNA的核糖核酸或脫氧核糖核酸的形式表示。應當理解，以其雙鏈形式存在的DNA將包含一個能夠被轉錄成所述miRNA前體的鏈。描述了具有miRNA的表達構建體、重組DNA構建體、和轉基因生物，該miRNA編碼導致所述miRNA前體表達的DNA。
[0041 ] 「可變核苷酸亞序列」是指置換一部分pre-miRNA序列的一部分核苷酸序列，前提條件是該亞序列不同於被置換的序列，即，它不能是相同的序列。
[0042]「靶基因」指編碼靶RNA的基因，即，從其中轉錄靶RNA的基因。該基因可編碼mRNA、tRNA、小 RNA 等。
[0043]「靶基因」指其表達將被調節(例如下調)的RNA。靶序列可以是一部分開放閱讀框、5』或3』非翻譯區域、外顯子、內含子、側接區域等。
[0044]「星狀序列」是miRNA前體中的互補序列，miRNA前體與miRNA形成雙鏈。星狀序列的互補序列不需要是完全互補序列。有時存在非螺旋的中斷取代(即G:T鹼基配對等)以及1-3個錯配。
[0045]術語「基因組」是指:(I)存在於生物體的每一個細胞或者病毒或細胞器中的全套遺傳物質(基因和非編碼序列)；(2)作為(單倍體)單位從一個親本遺傳的全套染色體。
[0046]「子代」包括植物的任何後續世代。後代將從其親本植物遺傳並且穩定地分離基因和轉基因。
[0047]單位、前綴和符號可以以其SI接受的形式表示。除非另外說明，核酸是以5'到 方向從左往右寫；胺基酸序列分別是以氨基到羧基方向從左往右寫。本說明書中提及
的數值範圍包括限定該範圍的數字，並且包括在該限定範圍內的每一個整數。在本文中胺基酸可用通常已知的三字母符號或IUPAC-1UB Biochemical Nomenclature Commission推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可以用其通常接受的單字母代碼表示。除非另有說明，在本文中使用的軟體、電和電子術語是如在The New IEEE Standard Dictionary ofElectrical and Electronics Terms (第5版，1993)中所定義的。把說明書作為一個整體時，下面定義的術語就定義得更全面。
[0048]術語「重組構建體」、「表達構建體」、「嵌合構建體」、「構建體」和「重組DNA構建體」本文可互換使用。重組構建體包括人造的核酸片段組合，例如天然條件下不一起存在的調控序列和編碼序列。例如嵌合構造可包括源於不同來源的調控序列和編碼序列，或者包括源於同一來源但以不同於天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。此類構建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決於用以轉化宿主細胞的方法，該宿主細胞是本領域的技術人員所熟知的。例如可以使用質粒載體。技術人員熟知為了成功地轉化、篩選和繁殖包括本發明任何分離的核酸片段的宿主細胞，必須存在於載體上的遺傳元件。技術人員也將認識到不同的獨立轉化事件將導致不同水平和不同模式的表達(Jones 等人，EMBO J.4:2411-2418 (1985) ；De Almeida 等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989))，因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白表達的免疫印跡分析或表型分析等完成。
[0049]該構建體可以包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修飾核苷酸的任何組合。構建體可以轉錄以形成RNA，其中RNA可以能夠形成雙鏈RNA和/或髮夾結構。構建體可以在細胞中表達，或者分 離，或者合成製得。構建體還可以包含啟動子或幫助構建體操作或表達的其他序列。
[0050]本文所用"阻抑「或」沉默"或「抑制」可互換使用，是指相對於野生型生物體中其正常表達水平，靶序列的產物表達的下調。抑制包括，相對於野生型表達水平，表達降低了約 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。
[0051]本文所用術語「編碼」是指可被加工以產生RNA和/或多肽的DNA序列。
[0052]本文所用術語「表達」是指產生功能產物，例如由導入的構建體、內源DNA序列或穩定導入的異源DNA序列產生RNA轉錄物。該術語還可以指由產生自任何上述DNA前體的mRNA產生多肽。因此，核酸片段的表達可以指核酸片段的轉錄(例如生成mRNA或其他功能RNA的轉錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白(多肽)。
[0053]本文在序列方面所用的「異源」是指，源自外來物種的序列，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其天然形式在組成和/或基因組基因座方面顯著修飾的序列。例如，對於核酸，其可以是源自外來物種的核酸，或者是合成設計的核酸，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其天然形式在組成和/或基因組基因座方面顯著修飾的核酸。異源蛋白可以源自外來物種，或者，如果源自相同物種，通過人為介入而從其起源形式顯著修飾。
[0054]術語「宿主細胞」是指含有或者其中導入核酸構建體，並且支持該構建體複製和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞例如大腸桿菌(E.coli)，或真核細胞例如真菌、酵母、昆蟲、兩棲動物、線蟲或哺乳動物細胞。或者，宿主細胞是單子葉植物或雙子葉植物細胞。單子葉植物宿主細胞的一個實例是玉米宿主細胞。
[0055]「植物」包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細胞以及同一植株的子代。植物細胞包括但不限於 得自下列物質的細胞:種子、懸浮培養物、胚、分生區域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
[0056]術語「植物部分」包括分化和未分化的組織，包括但不限於下列部分:根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織和多種形式的細胞和培養物(例如單個細胞、原生質體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在於植株或植物器官、組織或細胞培養物中。
[0057]術語「植物器官」是指構成植株的形態和功能不同部分的植物組織或組織群。
[0058]術語「導入」是指將核酸(例如表達構建體)或蛋白提供至細胞中。導入包括指將核酸整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸可以整合進細胞的基因組內，以及包括指將核酸或蛋白暫時提供給細胞。導入包括指穩定的或暫時性的轉化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組DNA構建體/表達構建體)插入細胞內的情況下的「導入」意指「轉染」或「轉化」或「轉導」，並且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可以整合進細胞的基因組(如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)內、轉變成自主的複製子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
[0059]在應用於植物細胞時，術語「基因組」不僅包括在細胞核內發現的染色體DNA，而且還包括在細胞的亞細胞成分(例如線粒體、質體)內發現的細胞器DNA。
[0060]術語「分離的」是指材料例如核酸或蛋白，其:(1)基本上或本質上不含通常伴隨在其天然存在環境中發現的材料或者與在其天然存在環境中發現的材料相互作用的成分，或者(2)如果材料在其天然環境中，則已經通過人為介入改變了材料的組成和/或在細胞基因座上放置了不是該材料的天然基因座的基因座。
[0061]本文所用的「結構域」或「功能結構域」是指能夠引起植物中的生物反應的核酸序列。本發明涉及由單獨起作用或者與其他miRNA序列協同起作用的至少21核苷酸序列組成的miRNA。由此，結構域可以指個體miRNA或miRNA群。而且，與其骨架序列有關的miRNA序列可以被認為是用於將miRNA加工成其活性形式的結構域。本文所用的「亞結構域」或「亞功能結構域」是指能夠引起植物中的生物反應的結構域的亞序列。miRNA可以被認為是骨架序列的亞結構域。「鄰接」序列或結構域是指順序連接的，在結構域之間沒有加入的核苷酸插入的序列。鄰接結構域串的一個實例存在於SEQ ID NO:7957中，其代表作為連續串的SEQ ID NO:1-2652，據信該連續串可以是以順序串聯而連接在一起的2652miRNA序列。
[0062]RNA幹擾是指由短幹擾性RNA(SiRNA)介導的動物中序列特異性轉錄後基因沉默的過程(Fire等人，Nature391 =8061998)。在植物中的對應過程通常稱為轉錄後基因沉默(PTGS)或RNA沉默，並且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據信轉錄後基因沉默過程是用於防止外來基因表達的進化保守的細胞防禦機制，並且通常由不同植物區系和門所共享(Fire等人，Trends Genet.15:3581999)。這種防止外來基因表達的保護作用可能是通過特異性破壞病毒基因組RNA的同源單鏈RNA的細胞反應，響應源自病毒感染或源自轉座因子隨機整合到宿主基因組內的雙鏈RNA(dsRNA)的生成而進化而來。dsRNA在細胞中的存在通過還沒有完全表徵的機制引發了 RNAi反應。
[0063]細胞中長dsRNA的存在刺激稱為「dicer」的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer參與dsRNA加工成稱為短幹擾性RNA(siRNA)的dsRNA的短片段(Berstein等人.，Nature409:3632001)和/或pre miRNA加工成miRNA。源自dicer活性的短幹擾性RNA的長度通常是約21至約23個核苷酸，並且包含約19個鹼基對雙鏈體(Elbashir等人，Genes Dev.15:1882001)。還有人提出Dicer參與從保守結構的前體RNA上切下21-和22-核苷酸小的時序RNA(stRNA)，所述小的時序 RNA 參與翻譯控制(Hutvagner 等人,2001, Science293:834)。RNAi響應還涉及內切核酸酶複合物，通常稱為RNA誘導沉默複合物(RISC)，其介導具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈RNA的裂解。靶RNA的裂解在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補的區域中間發生(Elbashir等人，Genes Dev.15:1882001)。此外，RNA幹擾還涉及小RNA(例如微RNA或miRNA)介導的基因沉默，假定是經由調節染色質結構並由此防止靶基因序列轉錄的細胞機制(參見，例如，Allshire，Science297:1818-18192002 ；Volpe等人，Science297:1833-18372002 Jenuwein, Science297:2215-22182002 ;和 Hall 等人，Science297:2232-22372002)。這樣，本發明的miRNA分子可用於通過與RNA轉錄物相互作用或者作為另一種選擇通過與特定基因序列相互作用來介導基因沉默，其中這樣的相互作用導致在轉錄或轉錄後水平上的基因沉默。
[0064]已經在多種系統中研究了 RNAi。(Nature391:8061998)首次在秀麗隱杆線蟲(C.elegans)中觀察到 RNAi。Wianny 和 Goetz (Nature Cell Biol.2:701999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介導的RNAi。Hammond等人(Nature404:2932000)描述了在用dsRNA轉染的果妮(Drosophila)細胞中的 RNAi。Elbashir 等人,(Natur e411:4942001)描述了通過在包括人胚胎腎和HeLa細胞 的培養的哺乳動物細胞中導入合成21-核苷酸RNA的雙鏈體而誘導的RNAi。
[0065]小RNA在控制基因表達中起重要作用。很多發育過程(包括開花)的調節是由小RNA控制的。現在有可能通過使用在植物中產生小RNA的轉基因構建體來以工程手段改變植物基因的基因表達。[0066]小RNA似乎是通過與互補RNA或DNA靶序列鹼基配對來行使功能的。當與RNA結合時，小RNA或者引發靶序列的RNA裂解或者引發翻譯抑制。當與DNA靶序列結合時，據信小RNA可介導靶序列的DNA甲基化。無論具體機制是什麼，這些事件的後果是基因表達受到抑制。
[0067]微RNA(miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經在動物和植物中鑑定出的非編碼 RNA(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002；Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros,Science294:862-8642001 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002 ；Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-7282002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Reinhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。它們是由大小為大約70至200nt的較長的前體轉錄物加工生成的，並且這些前體轉錄物能夠形成穩定的髮夾結構。在動物中，涉及miRNA前體加工的酶稱為 Dicer，這是一種 RNAse II1-樣蛋白(Grishok 等人，Celll06:23-342001 ；Hutvagner 等人，Science293:834-8382001 ；Ketting 等人，Genes.偏差(Dev.) 15:2654-26592001)。植物也具有 Dicer-樣酶，DCLl (以前稱為 CARPEL FACTORY/SHORTINTEGUMENTS1/SUSPENS0R1)，並且最近的證據表明，其象Dicer —樣也涉及髮夾前體的加工以產生成熟 miRNA (Park 等人，Curr.Biol.12: 1484-14952002 ； Re inhart 等人，Genes.Dev.16:1616-16262002)。此外，最近的研究已經清楚地表明，至少某些miRNA髮夾前體最初是作為較長的聚腺苷酸化轉錄物存在，並且在單個轉錄物中可以存在幾個不同的miRNA以及相關髮夾(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8582001 ；Lee 等人，EMBO J21:4663-46702002)。最近的研究還測定了從dsRNA產物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產物是通過DICER加工髮夾而產生的(Schwartz等人，2003，Cellll5:199-208)。似乎所加工的dsRNA的兩個末端的穩定性(即G:C vs.A:U含量,和/或錯配)影響鏈選擇，低穩定性末端更易於通過解旋酶解旋。低穩定性末端的5'末端鏈被整合至RISC複合物內，而另一條鏈被降解。
[0068]在動物中，有直接的證據表明特異性miRNA在發育中的作用。基於當產生lin_4和let-7miRNA的基因突變時所產生的表型，已經發現，秀麗隱杆線蟲(Celegans)中的 I in-4 和 let_7miRNA 控制時序發育(Lee 等人，Cell75:843-8541993 ； Re inhart 等人，Nature403-901-9062000)。此外，這兩種miRNA都表現出與其在發育定時中的作用一致的時序表達模式。其他動物miRNA表現出發育調節的表達模式，是時序和組織特異性的(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-8532001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-7392002 ;Lau 等人，Science294:858-8622001 ；Lee 和 Ambros，Science294:862-8642001)，導致這樣的假設，在很多情況下，miRNA可能涉及重要發育過程的調節。同樣，在植物中，很多miRNA的差異表達模式意味著其在發育中的作用(Llave等人，PlantCelll4:1605-16192002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Reinhart 等人，Genes.Dev.16 =1616-16262002)。然而，miRNA的發育作用尚未在植物中直接證實，因為迄今為止沒有關於特異性植物miRNA相關發育表型的報導。
[0069]微RNA看起來通過與位於由這些基因產生的轉錄物中的互補序列結合來調節靶基因。對於lin-4和let-7，靶位點位於靶mRNA的3 ' UTR中(Lee等人，Cell75:843-8541993 ；ffightman 等人，Cell75:855-8621993 ；Reinhart 等人，Nature403:901-9062000 ;Slack 等人，Mol.Cell5:659-6692000)，並且在 lin-4 和 let_7miRNA 與其革巴位點之間有幾個錯配。結合lin-4或let-7miRNA似乎引起由祀miRNA編碼的蛋白的穩態水平的下調，而不影響自身的轉錄物(Olsen和Ambros, Dev.Biol.216 =671-6801999)。另一方面，最近有證據表明，在某些情況下，miRNA可引起靶轉錄物在靶位點內特異性RNA裂解(Hutvagner 和 Zamore, Science297:2056-20602002 ；Llave 等人，Plant Celll4:1605-16192002)。看起來有可能miRNA可進入至少兩條靶基因調控途徑:蛋白下調和RNA裂解。進入RNA裂解途徑的微RNA摻入了 RNA誘導沉默複合物(RISC)，該複合物與RNAi相似或相同。
[0070]本發明涉及包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ ID NO: 11所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 11的核苷酸430至450被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID N0:11的核苷酸244至264被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0071]該分離的核酸片段包含前體miRNA，也可稱為「miRNA主鏈」。本領域的技術人員熟知區分轉錄物是全長pr1-miRNA或是pre-miRNA是困難的。因此,將前體miRNA功能定義為能夠生產miRNA的核苷酸序列。
[0072]受關注的其它分離的核酸片段包括以下片段；
[0073]a)從包含前體miRNA的分離的核酸片段轉錄得到的片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ ID NO: 12所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID N0:12的核苷酸94至114被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:12的核苷酸163至183被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0074]b)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:13所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:13的核苷酸53至73被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:13的核苷酸97至117被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；
[0075]c)包含前體miRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:14所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO:14的核苷酸110至130被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO: 14的核苷酸184至203被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交；以及
[0076]d)包含前體m iRNA的分離的核酸片段，所述前體miRNA基本上對應於如SEQ IDNO:15所示的脫氧核糖核苷酸序列⑴其中SEQ ID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，該第一可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，以及(ii)進一步地，其中SEQ ID NO:15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，該第二可變核苷酸亞序列的大小在約19至約30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與前體miRNA的第一個可變亞序列雜交。
[0077]可將這些分離的核酸片段中的任何一種用於製備重組構建體，所示重組構建體包含這些可操作地連接至至少一個調控序列的分離核酸片段。
[0078]可將這些構建體轉化到植物細胞中以便轉化的植物細胞在其基因組中包含重組構建體。優選地植物細胞可以是單子葉植物植物細胞。單子葉植物細胞的實例包括但不限於玉米、高梁、小麥、大米、燕麥、裸麥、大麥、甘鹿、小米、竹子、香蕉和蘭花
[0079]最優選的單子葉植物細胞是玉米。
[0080]在另一方面，本發明涉及減少靶序列在植物細胞中表達的方法，所述方法包括:
[0081](a) 用包含任何一種本文所述分離的核酸片段的核酸構建體轉化至少一種植物細胞；以及
[0082](b)選擇那些轉化的植物細胞，其靶序列的表達水平在與野生型植物細胞中的靶序列表達水平進行比較時減少。
[0083]生物信息學方法已經成功地用於預測植物miRNA的祀標(Llave等人，PlantCelll4:1605-16192002 ；Park 等人，Curr.Biol.12:1484-14952002 ；Rhoades 等人，CellllO =513-5202002)，因此，似乎植物miRNA與其推定靶的整個互補性高於動物miRNA。植物miRNA的這些預測靶標中的大部分編碼涉及植物發育模式或細胞分化的轉錄因子家族的成員。
[0084]所關注序列的一般種類包括例如涉及調節或信息的基因，例如鋅指、轉錄因子、同源異型基因，或細胞周期和細胞死亡調節劑例如激酶，以及涉及持家的基因，例如熱激蛋白。
[0085]靶序列可包括編碼區和非編碼區如啟動子、增強子、終止子、內含子等。
[0086]靶序列可以是內源性序列，或者可以是導入的異源序列或轉基因。本發明方法可用於改變轉基因的調節或表達，或用於除去轉基因或其他導入的序列例如導入的位點特異性重組位點。靶序列還可以是來自病原體的序列，例如，靶序列可以來自植物病原體例如病毒、黴菌或真菌，昆蟲或線蟲。miRNA可以在植物中表達，這樣在感染或侵染之後，植物將靶向病原體並且給植物賦予一定程度的抗性。
[0087]在植物中，靶序列的其他種類包括影響農學特徵、抗昆蟲性、抗病性、抗除草劑性、不育、穀粒特徵和商品的基因。所關注基因應當還包括涉及油、澱粉、糖類或營養物代謝的那些，以及影響例如種仁大小、蔗糖載量等的那些。穀粒質量在特徵中反應，例如油的水平和類型，飽和與不飽和，必需胺基酸的質量和量，以及纖維素水平。例如，可抑制植酸生物合成途徑的基因以產生高可利用磷表型。參見例如在W002/059324中公開的植酸生物合成酶，包括肌醇多磷酸激酶-2多核苷酸，在W003/027243中公開的肌醇I，3，4-三磷酸5/6-激酶多核苷酸，以及在W099/05298中公開的肌醇1_磷酸合成酶和其他植酸生物合成多核苷酸，所有這些專利都引入本文以供參考。可抑制木質化途徑中的基因來提高消化性或能量利用率。可抑制影響細胞周期或細胞死亡的基因來抑制生長或應激反應。可抑制影響DNA複製和/或重組的基因以提高遺傳變異性。可抑制影響開花時間的基因以及影響能育性的基因。可抑制任何靶序列以評估或證實其在特定特徵或表型中的作用，或切開分子、調節、生化或蛋白組學(proteomic)途徑或網絡。
[0088]可使用多種啟動子。能基於所需結果選擇這些啟動子。應當認識到，通過在植物表達盒中使用不同啟動子來提高不同應用，以調節miRNA表達的時間、位置和/或水平。如果需要的話，這樣的植物表達盒可以含有啟動子調節區(例如賦予誘導型、組成型、環境或發育調節的、或細胞或組織特異性/選擇性表達的調節區)，轉錄起始開始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。
[0089]可以採用組成型、組織優先型或誘導型啟動子。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉錄起始區，源自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I'-或2'-啟動子，遍在蛋白I啟動子，Smas啟動子，肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5，683，439)，Nos啟動子，pEmu啟動子，rubiSco啟動子，GRP1-8啟動子，以及來自本領域技術人員已知的各種植物基因的其他轉錄起始區。如果需要低水平的表達，可以使用弱啟動子。弱組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子(W099/43838和美國專利6，072，050)，核心35S CaMV啟動子等。其他組成型啟動子包括例如美國專利5，608，149 ；5，608，144 ;5，604，121 ;5，569，597 ;5，466，785 ;5，399，680 ;5，268，463 ；和 5，608，142。還參見美國專利6，177，611，其引入本文以供參考。
[0090]誘導型啟動子的是可以通過低氧或寒冷脅迫誘導的Adhl啟動子，可通過熱脅迫誘導的Hsp70啟動子,PPDK啟動子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)啟動子,二者都是可通過光誘導的。還有用的啟動子有，是可化學誘導的啟動子，例如是安全劑誘導的In2-2啟動子(美國專利5，364，780)，是雌激素誘導的ERE啟動子，以及是植物生長素誘導的，並且是絨氈層(tapetum)特異性的，但是在愈傷組織中也有活性的Axigl啟動子(PCTUS01/22169)。
[0091]處於發育控制下的啟動子的實例包括優先在一些組織例如葉、根、果實、種子或花中啟動轉錄的啟動子。示例性啟動子是花葯特異性啟動子5126 (美國專利5，689，049和5，689，051)。種子優先的啟動子的實例包括但不限於27kD g玉米醇溶蛋白啟動子和臘狀啟動子，Boronat, A.等人(1986) Plant Sc1.47:95-102 ；Reina, Μ.等人 Nucl.AcidsRes.18(21):6426 ;和 Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet.203:237_244。在胚芽、果皮和胚乳中表達的啟動子公開在US專利6，225，529和PCT出版W000/12733中。這些專利的公開內容全文引入本文以供參考。
[0092]在某些實施方案中，由誘導型啟動子，特別是由病原體誘導型啟動子表達基因是有益的。這樣的啟動子包括源自發病機理相關蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原體感染後誘導的，所述蛋白是例如PR蛋白、SAR蛋白、b-Ι，3-葡聚糖酶，殼多糖酶等。參見例如Redolfi 等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254 ；Uknes 等人(1992)Plant Cell4:645-656;和 Van Loon (1985) Plant Mol.Virol.4:111_116。還參見 W099/43819，其引入本文以供參考。
[0093]所關注的啟動子是在 病原體感染部位或接近病原體感染部位局部表達的啟動子。參見例如Marineau等人(1987) Plant Mol.Biol.9:335-342 ;Matton等人(1989)MolecularPlant-Microbe Interactions〗:325-331 ;Somsisch 等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:2427-2430 ；Somsisch 等人(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98 ；和 Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:14972-14977。還參見 Chen 等人(1996) Plant J.10:955-966 ；Zhang等人(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:2507-2511 ;Warner 等人(1993) Plant J.3:191-201 ；Siebertz 等人(1989) Plant Celll:961-968 ;美國專利 5，750，386 (線蟲誘導型)；以及其中所引用的參考文獻。特別關注的是有關玉米PRms基因的誘導型啟動子，其表達是由病原體串珠鐮孢菌(Fusarium moniIiforme)誘導的(參見例如Cordero等人
(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。
[0094]此外，在病原體發現經由傷口或昆蟲損害而找到進入植物的入口時，傷口誘導型啟動子可用於多核苷酸的構建。這樣的傷口誘導型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449 ;Duan 等人(1996)NatureBiotech.14:494-498) ；wunl 和 wun2,美國專利 5, 428,148 ；winl 和 win2 (Stanford 等人(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208);系統素(McGurl 等人(1992)Science225:1570-1573) ；WIP1(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792 ；Eckelkamp 等人
(1993)FEBS Lett.323:73-76) ;MPI 基因(Corderok 等人(1994) Plant J.6 (2):141-150)；等，其引入本文以供參考。
[0095]化學調節的啟動子可用於通過施用外來化學調節劑來調苄基因在植物中的表達。根據這一目標，啟動子可以是化學誘導型啟動子，其中施用化學物質來誘導基因表達，或化學抑制型啟動子，其 中施用化學物質來抑制基因表達。化學誘導型啟動子是本領域已知的，並且包括但不限於玉米In2-2啟動子，其是通過苯磺醯胺除草劑安全劑來激活的，玉米GST啟動子，其是通過用作芽前除草劑的疏水親電性化合物而激活的，以及菸草PR-1a啟動子，其是通過水楊酸激活的。所關注的其他化學調節的啟動子包括留類化合物反應性啟動子(參見例如糖皮質激素誘導型啟動子，Schena等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2):247-257)，以及四環素誘導型和四環素抑制型啟動子(參見例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229_237，和美國專利5，814，618和5，789，156)，其引入本文以供參考。
[0096]組織優先的啟動子可用於定向提高特定植物組織內的序列的表達。組織優先的啟動子包括 Yamamoto 等人(1997) Plant J.12 (2):255-265 ;Kawamata 等人(1997) PlantCell Physiol.38(7):792-803 ;Hansen 等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343;Russell 等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168 ;Rinehart 等人(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341 ；Van Camp 等人(1996)Plant Physiol.112(2):525-535;Canevascini 等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524 ；Yamamoto 等人(1994)PlantCell Physiol.35(5):773-778 ;Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196 ；Orozco 等人(1993) Plant Mol Biol.23 (6):1129-1138 ;Matsuoka 等人(1993) Proc Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 ;和 Guevara-Garcia等人(1993) Plant J.4(3):495_505。如果需要的話，可修飾這樣的啟動子以進行弱表達。
[0097]葉優先的啟動子是本領域已知的。參見例如Yamamoto等人(1997) PlantJ.12(2):255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol.105:357-67 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778 ;Gotor 等人(1993)Plant J.3:509-18 ;0rozco 等人(1993) Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138 JPMatsuoka 等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590。此外，可以使用cab和rubisco的啟動子。參見例如Simpson等人(1958)EMBO J4:2723-2729 和 Timko 等人(1988)Nature318:57_58。
[0098]根優先的啟動子是已知的，並且可以選自文獻中記載的很多啟動子或者從不同相容物種中重新分離的啟動子。參見例如Hire等人(1992) Plant Mol.Biol.20 (2):207-218 (大豆根特異性穀氨醯胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner (1991)PlantCell3(10):1051-1061(法國菜豆的GRP1.8基因的根特異性控制元件);Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.14 (3):433-443 (根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)JPMiao等人(1991)Plant Cell3(l):11-22(編碼胞質穀氨醯胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達)。還參見Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7):633_641，其中描述了兩種根特異性啟動子，它們是從得自固氮非豆科(nonlegume)Parasponia andersonii以及相關非固氮非豆科(nonlegume)山麻黃(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因分離的。將這些基因的啟動子與β -葡糖醒酸酶報導基因連接，並且導入非豆科(nonlegume)菸草(Nicotiana tabacum)和豆科百脈根(Lotus corniculatus)內，在這兩種情況下,都保持了根特異性啟動子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他們對於髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表達的rolC和rolD根誘導基因的啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (I):69-76)。他們推斷，增強 子和組織特異性DNA決定子在這些啟動子中解離。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合以表明編碼章魚鹼合酶的農桿菌屬(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特別活性，以及TR2'基因在完整植物中是根特異性的，並且通過葉組織中的傷害來刺激，這是用來與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用的特別期望的特徵組合(參見EMBO J.8 (2) =343-350) 0與nptll (新黴素磷酸轉移酶II)融合的TRl'基因表現出類似特徵。另外的根優選的啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995) Plant Mol.Biol.29(4):759-772) JProlB 啟動子(Capana 等人(1994) Plant Mol.Biol.25(4):681-691。還參見美國專利 5,837,876 ;5，750，386 ；5, 633,363 ;5，459，252 ；5，401,836 ;5，110，732 ;和5，023，179。雲扁豆蛋白(Murai 等人(1983) Science23:476-482和 Sengopta-Gopalen 等人(1988)PNAS82:3320_3324。
[0099]轉化方案以及用於將核苷酸序列導入植物內的方案可以根據被定向轉化的植物或植物細胞的類型，例如單子葉植物或雙子葉植物而改變。導入DNA構建體的合適的方法包括微注射(Crossway 等人(1986) Biotechniques4:320-334 ;和美國專利 6, 300, 543)，性雜交，電穿孔(Riggs 等人(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606),農桿菌屬菌介導的轉化(Townsend等人，美國專利5，563，055 ;和美國專利5，981，840)，直接基因轉移(Paszkowski 等人(1984) EMBO J.3:2717-2722)，和彈道離子加速(參見例如 Sanford 等人，美國專利4，945，050 ；Tomes等人，美國專利5，879，918 ；Tomes等人，美國專利5，886，244 ;Bidney 等人,美國專利 5,932, 782 ;Tomes 等人(1995) 「Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microproj ectile Bombardment,，，in Plant Cell,Tissue,andOrgan Culture-Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag,Berlin)；和 McCabe 等人(1988)Biotechnology6:923-926)。還參見 Weissinget 等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477 ;Sanford 等人(1987)Particulate Science andTechnology5:27-37(洋蔥)；Christou 等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆);Finer 和 McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182 (大豆)；Singh 等人(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta 等人(I99O)Biotechnology8:736-740(稻)；Klein 等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (玉米)；Klein等人(1988) Biotechnology6:559-563 (玉米)；Tomes,美國專利 5, 240,855 ；Buising 等人，美國專利 5，322，783 和 5，324，646 ；Klein 等人(1988) Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm 等人(1"0) Biotechnology8:833-839 (玉米)；Hooykaas_Van Slogteren 等人(1984) Nature (London) 311:763-764 ；Bowen 等人，美國專利 5, 736, 369 (穀類)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349(百合科)；De Wet 等人(1985)，TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman 等人(Longman, New York),第 197-209 頁(花粉);Kaeppler 等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418 和 Kaeppler等人(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566 (頸鬚介導的轉化);D' Halluin 等人(1992)Plant Cell4:1495-1505(電穿孔)；Li 等人(1993)Plant Cell R印ortsl2:250-255 和Christou 和 Ford (1995) Anbals of Botany75:407-413 (稻);0sioda 等人(1996) NatureBiotechnologyl4:745-750 (經由根癌土壤桿菌的玉米);和美國專利5，736，369 (分生組織轉化)，所有這些文獻都引入本文以供參考。
[0100]可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來將核苷酸構建體導入植物內。通常，這樣的方法包括將本發明的核苷酸構建體整合進入病毒DNA或RNA分子內。此外，應當認識到，有用的啟動子包括用於通過病毒RNA聚合酶轉錄的啟動子。涉及病毒DNA或RNA分子的用於將核苷酸構建體導入植物內並且表達其中編碼的蛋白的方法是本領域已知的。參見例如美國專利公開 5,889,191,5,889,190,5,866, 785,5,589, 367 和 5,316, 931 ;這些專利引入本文以供參考。
[0101]在某些實施方案中，瞬時表達可能是期望的。在這些情況下，可使用標準瞬時轉化技術。這樣的方法包括但不限於病毒轉化方法，和DNA或RNA的微注射，以及本領域眾所周知的其他方法。
[0102]可根據常規方法，將得自已經穩定摻入核苷酸序列的植物的細胞生長成植物。參見例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5:81_84。然後可讓這些植物生長，並且用相同的轉化株或不同的株授粉，所得雜交體具有所希望的表型特徵的組成型表達，所述表型特徵是由包含在靶位點或轉移盒內的所關注核苷酸序列盒/或遺傳標記賦予的。可以生長兩代或多代以保證所希望的表型特徵的表達穩定地保持和遺傳，然後收穫種子以保證所希望的表型特徵的表達已經實現。
[0103]實施例
[0104]實施例1
[0105]分離基因組微RNA前體基因
[0106]如Zhang B 等人所述(2006) FEBS Lett.580:3753-62),俥用編碼玉米微 RNA 某閔的序列作為查詢序列進行BLAST分析,使用表達序列標記的Pioneer Unicorn6.0集合。在Unicorn6.0集合中大約30%的查詢序列具有完全匹配。設計以下引物(購自MWG-BIOTECHInc.)擴增在這些序列中選擇的五個序列(參見表1)。
[0107]表1:用於擴增基因組微RNA前體的引物
[0108]
【權利要求】
1.用於減少玉米細胞中靶序列表達的核酸片段，其中(i)SEQID NO: 15的核苷酸83至103被第一可變核苷酸亞序列置換，取決於要減少表達的靶序列，所述第一可變核苷酸亞序列的大小在19至30個核苷酸的範圍內，(ii)SEQ ID NO: 15的核苷酸172至192被第二可變核苷酸亞序列置換，所述第二可變核苷酸亞序列的大小在19至30個核苷酸的範圍內，所述第二可變核苷酸亞序列能夠與第一可變亞序列雜交，並且(iii)由所述核酸片段產生的前體miRNA與由內源性SEQ ID NO: 15產 生的前體miRNA具有相同的莖結構，並且所述第一和第二可變核苷酸亞序列不同於被置換的序列。
2.包含權利要求1的核酸片段的重組構建體，所述核酸片段與至少一種調控序列可操作地連接。
3.減少玉米細胞中靶序列表達的方法，所述方法包括: (a)用權利要求2所述的核酸構建體轉化至少一種玉米細胞；以及 (b)選擇那些轉化的玉米細胞，所述轉化的玉米細胞的靶序列的表達水平與野生型玉米細胞中的靶基因的表達水平相比被減少。
【文檔編號】A01H5/00GK103898114SQ201410102903
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年12月17日 優先權日:2007年12月18日
【發明者】B.麥戈尼格爾 申請人:納幕爾杜邦公司