一種簡易的植物人工microRNA構建方法
2023-12-09 09:25:31 1
專利名稱：一種簡易的植物人工microRNA構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，主要是一種簡易的植物人工microRNA構建方法。
背景技術：
microRNA是真核生物體內的一種小分子，它能夠調控與其互補的靶基因表達下 調，它是由其前體pre-miRNA經Dicer酶切割產生。目前人們利用miRNA產生的原理和特 點開展了人工miRNA沉默目的靶基因的研究，就是將pre-miRNA內產生天然miRNA的區域 替換成其他序列(人工miRNA序列)，該序列經Dicer酶切割後就能產生出人工miRNA並發 揮與天然miRNA相似的功能，沉默與人工miRNA互補的目的靶基因，從而有助於研究靶基因 功能。在該技術中，根據靶基因序列設計出人工microRNA序列後，要通過4次PCR將植物 本身的miRNA前體骨架中的miRNA和miRNA*序列替換成人工miRNA和miRNA*序列(如圖 1)，最後連入植物表達載體，完成植物人工microRNA的載體構建，上述過程費時費力。
發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種簡易的植物人工microRNA構建方 法，通過1次PCR即可完成構建，極大簡化了植物人工microRNA載體的構建過程。本發明解決其技術問題採用的技術方案本發明提供一種簡易的植物人工 microRNA構建方法，根據miRNA前體骨架序列和預測獲得的人工miRNA序列設計1對引物 (圖2)，通過1次PCR即可完成植物人工miRNA載體構建。一種簡易的植物人工microRNA構建方法，包括1)用於植物人工microRNA構建的植物天然miRNA前體克隆在目前的植物人工miRNA研究中，人們已經利用miR156、miR172、miR390和miR528 前體進行了人工miRNA的構建工作。理論上每一種miRNA前體都能作為構建人工miRNA的 骨架。本方法中，首先要根據實驗需要確定利用哪一個植物miRNA前體序列作為構建人 工miRNA的骨架。選定miRNA前體後，在其莖環結構的上、下遊IOObp處設計上遊引物Pf 和下遊引物Pu。以植物總DNA為模板，擴增miRNA前體。擴增體系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1， 無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 lm，35個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化後，利用Promega T-vector 進行 PCR 片段的 TA 克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR回收片段2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水lul，混勻後4°C反應16h。反應完 畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕輕混勻冰上放 置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養基890ul。將離 心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有lOOmmol/L氨苄青黴素、 lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後選擇白色的菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. O軟體進行核酸序列的比對分析，選擇 與已報導miRNA前體序列一致的克隆進行後續試驗。2)用於植物人工microRNA構建的人工miRNA序列預測利用各種有效公用方法設計針對某一靶序列的人工miRNA序列；靶序列上與人工 miRNA序列配對的相應序列即為miRNA*序列。本方法中選用http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ page = Designer ；project = stdwmd 網站的預測禾呈序預測。 首先將人工miRNA要沉默的靶基因序列以FASTA格式放入Target genes欄，genomes 一欄 選定植物基因組種類，Description 一欄輸入任務名稱，Email-address 一欄輸入有效的電 子郵箱，然後點擊submit遞交。1天後網站將會向電子郵箱發送針對靶基因的、預測的人工 miRNA序列。將預測的人工miRNA序列與靶基因序列比對，靶基因序列上與人工miRNA序列 互補的序列即是後續構建工作中的miRNA*序列。3)用於植物人工microRNA構建的引物設計合成根據miRNA前體序列和人工miRNA序列設計具有如下特徵的引物對(圖2)Primer F :sequenceA-sequencel_artificial miRNA sequence_sequnce2Primer R :sequenceB-sequence3_artificial miRNA*RC sequence_sequnce4該序列中，sequncel為前體中miRNA區域外側序列，長度為0_50nt ；aritificial miRNAsequence為人工miRNA序列；sequence2為前體中miRNA區域內側序列，長度 為5-50nt ；sequence3為前體中miRNA*區域外側序列的反向互補序列，長度為0_50nt ； aritificial miRNA*RC sequence為人工miRNA*序列的反向互補序列；sequence4為前體中 miRNA*區域內側序列的反向互補序列，長度為5_50nt ；sequence A和B為用於酶切連接的 核酸內切酶識別序列或者是用於拓撲連接的重組序列；根據實驗需要sequnceA和B也可沒 有。根據不同miRNA前體的結構不同，miRNA和miRNA*的位置可能有交換，在這種情況下， 則上述特點描述中將miRNA與miRNA*相互交換即可。在引物末端還可以添加數個起保護 作用的鹼基。4)用於植物人工microRNA構建的PCR擴增體系及反應條件以5ng含有miRNA前體序列的質粒為模板，在如下條件下進行擴增反應10XPCR 擴增緩衝液5 μ 1,15mM MgCl2IOy l,10mM dNTPs 2 μ 1, IOmM primer F禾口primer R各3 μ 1， Taq酶(5υ/μ 1)1μ 1，無菌水補足50μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C 退火30s，72 °C延伸30s，30個循環；72°C延伸IOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒 純化後，利用Promega T-vector進行PCR片段的TA克隆，條件如下2XPromega Iigase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻 後4。C反應16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離 心管中，輕輕混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB 液體培養基890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有 100mmol/L氨苄青黴素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後 選擇白色的菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. 0軟體進行測 回序列與人工miRNA序列、測回序列與人工miRNA*序列、測回序列與miRNA前體序列的核 酸比對分析，同時含有miRNA前體序列和人工miRNA序列、人工miRNA*序列的測回序列即 是構建好的植物人工miRNA序列(T-amiRNA)。
5)應用植物人工microRNA的後續工作利用Promega質粒抽提試劑盒(Promega公司)抽提T-amiRNA質粒，用分別識別 sequenceA和B的核酸內切酶A (Promega公司)和核酸內切酶B (Promega公司)進行酶切 反應，反應條件如下10X酶切緩衝液5ul，20ul T-amiRNA質粒，2ul核酸內切酶A(Promega 公司)，2ul核酸內切酶B (Promega公司)，無菌水2Iul，混勻後在核酸內切酶A和B所需最 適溫度酶切2h。反應完畢後，利用Qiagen凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收酶切片段。 將回收片段與同樣酶切和回收的植物表達載體片斷連接，連接反應如下ιοχ連接緩衝液 (Promega)，2ul植物表達載體片段；6ul回收片段，Iul T4-連接酶(Promega)，混勻後放置 4V反應16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管 中，輕輕混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體 培養基890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取全部培養液塗布於含有50mmol/ L卡那黴素的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後挑選3個長出的菌斑送上海Invitrogen 公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. O軟體進行測回序列與T-amiRNA序列的比對分析， 與T-amiRNA序列完全匹配的克隆即是含有植物人工miRNA表達載體的克隆，可以用於人工 miRNA的沉默靶基因試驗。本發明有益的效果是本發明的方法，可用於植物miRNA構建。與傳統方法相比， 本發明具有的技術優勢是操作簡便快捷，省去了原來需要4次PCR才能完成的構建過程。
圖1 傳統構建人工miRNA的方法示意2 本發明構建人工miRNA方法示意具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明實施例1 沉默GFP的植物人工miRNA構建與應用①植物天然miR528前體克隆選定擬南芥miR528為前體骨架進行人工miRNA構建；因此根據其前體序列，在其 莖環結構的上、下遊IOObp處設計上遊引物Pf和下遊引物Pu。Pf CCACCCTTCACCAATGGATPu TTTACAACGGCATACGCCC以擬南芥總DNA為模板，擴增miR528前體。擴增體系如下10 XPCR buffer 5 μ 1， 15mMMgCl2 10 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1，總 DNA Iul，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55 °C退火30s，72°C 延伸lm，35個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化後，利用 PromegaT-vector 進行 PCR 片段的 TA 克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻後 4°C 反應 16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕輕 混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養基 890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有lOOmmol/L氨苄青黴素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後選擇白色的菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. O軟體進行核酸序列的比 對分析，選擇與miR528前體序列一致的克隆進行後續試驗。②針對GFP的人工miRNA序列預測米用 http //wmd3. weiRelworld. ors/CRi-bin/webapp. cri ？ pare = DesiRner proiect = stdwmd網站上的預測程序預測菸草16c體內GFP序列的潛在人工miRNA靶位點。 首先打開網頁，在Targetgenes欄輸入GFP的FASTA序列格式，genomes 一欄選定擬南芥基 因組，Description —欄輸入任務名稱GFP，Email-address —欄輸入有效的電子郵箱，然後 點擊submit遞交。1天後網站向電子郵箱發送來針對GFP的、預測的人工miRNA序列。選定 自由能最高的TTAAGGGTAAGTTTTCCGCAT為人工miRNA序列，將該序列與GFP序列比對，與人 工miRNA序列互補的序列即是後續構建工作中的miRNA*序列，為ATACGGAAAACTTACCCTTAA。③構建人工miRNA的引物設計根據擬南芥miR528前體序列和GFP人工miRNA序列設計構建人工miRNA的引物，
在引物末端添加酶切位點以用於後續真核表達載體的克隆。引物如下
Primer F GG^rCCCAGCAGCAGTTAAGGGTAAGTTTTCCGCATCAGGAGATACAGTTTG Primer R: 04GCrCCAGCAGGAATTAAGGGTAAGTTTTCCGTATAGAGAGGCAAAAGTGAPrimer F中，依次斜體為技術方案中的sequenceA，是核酸內切酶BamHI的識別 位點；下劃線序列為技術方案中的sequencel，是miR528前體中miRNA外側序列，長度為 9nt ；粗體序列為技術方案中的artificial miRNA sequence，是預測獲得的針對GFP的人 工miRNA序列；下劃線序列是技術方案中的sequence2，是miR528前體中miRNA內側序列， 長度為16nt。Primer R中，依次斜體為技術方案中的sequenceB，是核酸內切酶SacI的識 別位點；下劃線序列為技術方案中的seqUenCe3，是miR528前體中miRNA*外側序列，長度為 9nt ；粗體序列為技術方案中的artificial miRNA*sequence，是預測獲得的針對GFP的人工 miRNA的互補序列；下劃線序列是技術方案中的sequenced是miR528前體中miRNA*內側 序列，長度為16nt。④構建針對GFP的人工miRNA以5ng含有miR528前體序列的質粒為模板，在如下條件下進行擴增反應10 X PCR buffer5 μ 1,15mM MgCl2IO μ 1，IOmM dNTPs 2 μ 1，IOmM primer F 禾口 primer R 各 3 μ 1，Taq 酶(5υ/μ 1)1 μ 1，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸IOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化 後，利用 Promega T-vector進行PCR片段的TA克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul, T-vectorIul, PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻後 4°C反 應16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕 輕混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養基 890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有lOOmmol/L 氨苄青黴素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後選擇白色的 菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. 0軟體進行測回序列與GFP 人工miRNA序列、測回序列與GFP人工miRNA*序列、測回序列與miR528前體序列的核酸比對分析，同時含有miR528前體序列和GFP人工miRNA序列、GFP人工miRNA*序列的測回序 列即是構建好的針對GFP的植物人工miRNA載體(T-GFP amiRNA)④應用GFP人工miRNA沉默菸草16c體內的GFP表達將T-GFP amiRNA質粒中的人工miRNA片段經BamHI和SacI酶切後連入同樣酶切的pBI 121中，構建pBGami載體並轉入農桿菌EHA105後，應用瞬時表達系統注射表達有GFP 的菸草16c，3天後觀測菸草葉片GFP螢光變化，並通過real-time PCR檢測GFP表達情況， 表達有GFP amiRNA的區域GFP螢光減弱，紫外光下變成葉片本底的紅色，而對照不含有GFP amiRNA的區域，在紫外光下仍呈綠色。real-time PCR的結果也表明，GFP的表達在amiRNA 存在的條件下下降70%。實施效果利用本發明構建針對GFP的人工miRNA，僅用1個PCR反應即可，而用傳統方法要 需要4次PCR，因此極大地縮短了實驗時間、節省了財力。同時，利用本發明構建的針對GFP 的人工miRNA能夠有效地沉默目的基因GFP的表達。實施例2 沉默upfl基因的植物人工miRNA構建與應用①植物天然miR319前體克隆選定miR319前體序列為骨架進行人工miRNA構建；因此根據其前體序列，在其莖 環結構的上、下遊IOObp處設計上遊引物Pf和下遊引物Pu。Pf :ACCCTCACTATTCTCGTCTCCAPu GATAAAGCACTGTTGATGACAAGC以擬南芥總DNA為模板，擴增miR319前體。擴增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mMMgCl210y 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1，總 DNA lul，無菌水補足50μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lm，35個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化後，利用 PromegaT-vector 進行 PCR 片段的 TA 克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector lul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻後 4°C 反應 16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕輕 混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養基 890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有lOOmmol/L 氨苄青黴素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後選擇白色的 菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. 0軟體進行核酸序列的比 對分析，選擇與miR319前體序列一致的克隆進行後續試驗。②針對菸草upfl的人工miRNA序列預測米用 http //wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ page = Designer ； proiect = stdwmd網站上的預測程序預測菸草upfl序列的潛在人工miRNA靶位點。首先打 開網頁，在Target genes欄輸入upfl的FASTA序列格式，genomes—欄選定擬南芥基因組， Description 一欄輸入任務名稱upfl，Email-address —欄輸入有效的電子郵箱，然後點擊 submit遞交。1天後網站向電子郵箱發送來針對upfl的、預測的人工miRNA序列。選定自 由能最高的TTTGAATTAAACTGATGGGCC為人工miRNA序列，將該序列與upfl序列比對，與人 工miRNA序列互補的序列即是後續構建工作中的miRNA*序列，為AGCCCATCAGTTTAATTCAAG。
③構建人工miRNA的引物設計根據擬南芥miR319前體序列和upfl人工miRNA序列設計構建人工miRNA的引物，
在引物末端添加酶切位點以用於後續真核表達載體的克隆。引物如下
Primer F: GGyirCCGAATATATATGTAGAAGCCCATCAGTTTAATTCAAGTCACAGGTCGTGATA Primer R: G^GCrCAATACAAAAGAGAGAGGCCCATCAGTTTAATTCAAATCAAAGAGAATCAAT由於miR319前體骨架與miR528不同，因此Primer F中，斜體、下劃線、粗體、下劃 線標示的鹼基依次是技術方案中的sequenceA、sequencel (前體中miRNA*區域外側序列)、 artificial miRNA*sequence 和 sequence2 (前體中 miRNA* 區域內側序列)；Primer R 中，依 次斜體、下劃線、粗體、下劃線標示的鹼基依次是技術方案中的sequenceA、sequence〗(前 體中 miRNA 區域外側序列)、artificial miRNA sequence 禾口 sequence4 (前體中 miRNA 區 域內側序列)。
④構建針對upfl的人工miRNA以5ng含有miR319前體序列的質粒為模板，在如下條件下進行擴增反應10 X PCR buffer5 μ 1,15mM MgCl2IO μ 1，IOmM dNTPs 2 μ 1，IOmM primer F 禾口 primer R 各 3 μ 1，Taq 酶(5υ/μ 1)1 μ 1，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸IOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化 後，利用 Promega T-vector進行PCR片段的TA克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul, T-vectorIul, PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻後 4°C反 應16h。反應完畢後，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中， 輕輕混勻冰上放置30m後，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養 基890ul。將離心管放於37°C搖床上震動培養Ih後，取300ul培養液塗布於含有IOOmmol/ L氨苄青黴素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之後選擇白色 的菌斑送上海Invitrogen公司測序。序列測回後，通過DNAMAN 6. 0軟體進行測回序列與 upfl人工miRNA序列、測回序列與upfl人工miRNA*序列、測回序列與miR319前體序列的 核酸比對分析，同時含有miR319前體序列和upfl人工miRNA序列、upfl人工miRNA*序列 的測回序列即是構建好的針對upfl的植物人工miRNA載體(T_upfl amiRNA)④應用upfl人工miRNA沉默本氏煙體內的upfl基因表達將T-upfl amiRNA質粒中的人工miRNA片段經BamHI和SacI酶切後連入同樣酶 切的PBI121中，構建pBUami載體並轉入農桿菌EHA105後，應用瞬時表達系統注射本氏煙 葉片，3天後抽提注射區域的RNA，翻轉後進行半定量RT-PCR檢測，葉片內的upfl基因在其 人工miRNA存在條件下表達量大幅下降。實施效果利用本發明構建針對upfl基因的人工miRNA，僅用1個PCR反應即可，而用傳統方 法要需要4次PCR，因此極大地縮短了實驗時間、節省了財力。同時，利用本發明構建的針對 upfl的人工miRNA能夠有效地沉默目的基因upfl的表達。除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形 成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。
權利要求
一種簡易的植物人工microRNA構建方法，其特徵是該方法的步驟如下(1)、用於植物人工microRNA構建的植物天然miRNA前體克隆；(2)、用於植物人工microRNA構建的人工miRNA序列預測；將預測的人工miRNA序列與靶基因序列比對，靶基因序列上與人工miRNA序列互補的序列即是後續構建工作中的miRNA*序列；(3)、用於植物人工microRNA構建的引物設計合成；根據miRNA前體序列和人工miRNA序列設計具有如下特徵的引物對Primer FsequenceA-sequence1-artificial miRNA sequence-sequnce2Primer RsequenceB-sequence3-artificial miRNA*RC sequence-sequnce4該序列中，sequnce1為前體中miRNA區域外側序列，長度為0-50nt；aritificial miRNAsequence為人工miRNA序列；sequence2為前體中miRNA區域內側序列，長度為5-50nt；sequence3為前體中miRNA*區域外側序列的反向互補序列，長度為0-50nt；aritificial miRNA*RC sequence為人工miRNA*序列的反向互補序列；sequence4為前體中miRNA*區域內側序列的反向互補序列，長度為5-50nt；sequence A和B為用於酶切連接的核酸內切酶識別序列或是用於拓撲連接的重組序列；(4)、用於植物人工microRNA構建的PCR擴增體系。
2.根據權利要求1所述的簡易的植物人工microRNA構建方法，其特徵是在步驟(3) 中，根據不同miRNA前體的結構不同，對miRNA和miRNA*的名稱進行相互交換。
3.根據權利要求1或2所述的簡易的植物人工microRNA構建方法，其特徵是在步驟 (3)中，在引物末端添加數個起保護作用的鹼基。
全文摘要
本發明涉及一種簡易的植物人工microRNA構建方法，該方法的步驟如下(1)用於植物人工microRNA構建的植物天然miRNA前體克隆；(2)用於植物人工microRNA構建的人工miRNA序列預測；(3)用於植物人工microRNA構建的引物設計合成；根據miRNA前體序列和人工miRNA序列設計具有如下特徵的引物對Primer FsequenceA-sequence1-artificial miRNA sequence-sequnce2；Primer RsequenceB-sequence3-artificial miRNA*RC sequence-sequnce4；(4)用於植物人工microRNA構建的PCR擴增體系。本發明有益的效果是可用於植物miRNA構建，本發明具有的技術優勢是操作簡便快捷，省去了原來需要4次PCR才能完成的構建過程。
文檔編號C12N15/10GK101824410SQ20101013289
公開日2010年9月8日 申請日期2010年2月25日 優先權日2010年2月25日
發明者林林, 燕飛, 程曄, 鄭紅英, 陳劍平, 魯宇文 申請人:浙江省農業科學院