一種愈創木烷型倍半萜化合物及其製備方法與應用與流程

2023-11-06 22:58:07 2

本發明涉及植物化學技術領域，具體涉及一種愈創木烷型倍半萜化合物及其製備方法與應用。

背景技術：
瓜馥木(Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.)，別名小香花藤、藤龍眼、降香藤，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬植物。該植物可做藥用，莖、葉可以治骨折水腫，全株可以治療風溼骨痛、手足麻木等。從瓜馥木分離得到的愈創木烷型倍半萜類化合物未見報導，也未見該類化合物在抑制類風溼關節炎滑膜細胞增殖中的應用中的報導。

技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種從瓜馥木中提取分離的愈創木烷型倍半萜化合物。本發明解決的技術問題是提供上述愈創木烷型倍半萜化合物的製備方法。本發明最後要解決的技術問題是提供上述愈創木烷型倍半萜化合物的應用。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下：一種愈創木烷型倍半萜化合物，其結構通式如下：其中R1、R2、R3、R4分別獨立選自為-OH或-CH2OH或-CH3或-H。上述愈創木烷型倍半萜化合物，優選結構式如下：上述優選愈創木烷型倍半萜化合物的製備方法，它包括如下步驟：(1)製備瓜馥木提取物將瓜馥木乾燥的莖用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是熱提，得到提取液，減壓濃縮成膏狀，即為瓜馥木提取物；(2)分離純化將上述瓜馥木提取物用水稀釋製成懸浮液後，依次用石油醚、乙酸乙酯進行萃取，將乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，經柱層析、薄層層析、分子篩層析分離得到，該化合物為新化合物且命名為FissistigmaterpeneA。步驟(1)中，減壓濃縮，溫度為30～70℃，壓力為-0.06～-0.15MPa，優選溫度為45℃，優選壓力為-0.095MPa。步驟(2)中，所述濃縮，溫度為30～70℃，壓力為-0.06～-0.15MPa，優選溫度為45℃，優選壓力為-0.095MPa。步驟(2)中，柱層析的條件為：用200～300目矽膠上柱，乙酸乙酯體積百分數為20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為洗脫劑。步驟(2)中，薄層層析條件為：以乙酸乙酯體積百分數為25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為展開劑。步驟(2)中，分子篩層析條件為：分子篩為SephadexLH-20，以氯仿體積百分數為40％的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫劑。上述愈創木烷型倍半萜化合物在製備抗類風溼關節炎藥物中的應用也在本發明的保護範圍之內。上述愈創木烷型倍半萜化合物在製備抑制類風溼關節炎滑膜細胞增殖藥物中的應用也在本發明的保護範圍之類。其中，所述的滑膜細胞為原代大鼠滑膜細胞。有益效果：本發明首次發現了愈創木烷型倍半萜化合物在抑制類風溼關節炎滑膜細胞增殖中的活性，可用於製備抗類風溼關節炎的藥物。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1：倍半萜類化合物的製備。瓜馥木乾燥的莖10Kg按常規用75％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，將提取液減壓濃縮成膏狀，得到瓜馥木提取物1200g。將提取物用蒸餾水(3L)稀釋成懸浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，將乙酸乙酯萃取液濃縮成浸膏(約250g)，進行矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按極性遞增進行矽膠柱層析，並按每次約400mL收集餾分。通過TLC檢測合併相似流分分成8個組分，即Fr.1―8。Fr.3用200～300目矽膠上柱，乙酸乙酯體積百分數為20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，以乙酸乙酯體積百分數為25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為展開劑進行薄層層析，根據層析效果合併流分得到3個組分Fr.3-1,Fr.3-2以及Fr.3-3。Fr.3-2以氯仿體積百分數為40％的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫劑進行分子篩SephadexLH-20柱層析除去色素後得到組分Fr.3-2-1，Fr.3-2-1用高效液相進行分析製備，洗脫劑為乙腈和水其體積配比為2:3得到愈創木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA。愈創木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA的結構鑑定結果如下：FissistigmaterpeneA：為淡黃色油狀物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛顯色顯紫紅色。旋光度為HR-ESI-MSm/z251.1642[M-H]-，結合1H-NMR和13CNMR可知分子式為C15H24O3，計算不飽和度為4。根據1H-NMR和DEPT可知化合物中含有3個甲基信號[δH0.79(d,J＝6.8Hz)、0.81(d,J＝6.8Hz)、0.83(s)]；根據13C-NMR和DEPT可知化合物中有3個甲基碳、6個次甲基，4個亞甲基2個季碳。因此，可知化合物1為倍半萜類化合物。根據1H-1HCOSY可知：H-2/H-3/H-4/H-5相關，H-4/H-12/H-13相關，因此，可以確定片段C-2-C-3-C-4--C-5,C-4-C-11-C-12,C-11-C-3；H-8/H-9-H-10相關，可以確定C-8-C-9-C-10片段。這兩個片段的連接是通過HMBC來確認的。在HMBC譜中，H-15與C-2/C-1/C-10/C-5相關，H-5與C-6/C-7相關說明這兩個片段分別通過C-1和C-6-C-7連接的。化合物的相對構型是通過NOESY確定以及耦合常數來確定的，H-5的最大耦合常數為9.2Hz，表明H-4與H-5處於反軸位置，NOESY譜中H-5與H-10相關說明這兩個氫處於同一側；H-4與H-15相關說明H-4與H-15處於同一側。至此，確定該化合物為愈創木烷型的新倍半萜化合物。表1化合物1的1H-NMR和13C-NMR數據實施例2：藥理活性實驗實驗材料細胞：滑膜細胞(原代大鼠滑膜細胞)。細胞培養液：原代大鼠滑膜細胞培養基。試劑：噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT，Sigma生產)。乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)試劑盒(購自碧雲天公司)。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX，上海信宜藥廠有限公司，批號20140307)。1.4儀器：96孔細胞培養板；infinite200Pro多功能酶標儀。實驗方法MTT法測定藥物對滑膜細胞的抑制作用取對數期的滑膜細胞接種至96孔培養板(1×104個細胞/孔)，設置為空白組(不給予藥物)、甲氨蝶呤組(給予1μg/mL的甲氨蝶呤)、給藥組(給予10、50、100μg/mL濃度的藥物)，培養孵育過夜後用於實驗。細胞給予不同濃度的藥物培養48h後，每孔加入10μL濃度為5mg/mLMTT，繼續培養4h後，小心吸棄培養上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓚結晶，室溫震搖5min，完全溶解後，用酶標儀在570nm處檢測光密度(OD值)。根據OD值計算細胞存活率。LDH活性檢測法測藥物對滑膜細胞細胞活力的影響取對數期的滑膜細胞接種至96孔培養板(1×104個細胞/孔)，設置為空白組(不給予藥物)、甲氨蝶呤組(給予1μg/mL的甲氨蝶呤)、給藥組(給予10、50、100μg/mL濃度的藥物)，培養孵育過夜，各組細胞培養結束後，取細胞上清液，LDH檢測試劑盒檢測LDH活性。LDH的活力按照下述公式計算。統計方法採用SPSS22.0統計軟體分析實驗數據。結果用均數±標準差表示，用單因素方差(one-wayANOVA)分析組間差異。以P<0.05認為具有統計學差異。實驗結果MTT法測定藥物對滑膜細胞的抑制作用使用不同濃度藥物培養48h後，MTT法檢測細胞增殖作用結果見下表2。結果表明FissistigmaterpeneA對滑膜細胞具有很好的抑制作用。表2各藥物對滑膜細胞的抑制作用註：與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。LDH活性檢測法測藥物對滑膜細胞細胞活力的影響使用不同濃度藥物培養48h後，LDH活性檢測法檢測細胞活力結果見下表3。結果顯示不同濃度的藥物處理後，升高了細胞培養液中LDH活性(P<0.05或P＜0.01)。表3各藥物對滑膜細胞LDH活性的作用註：與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。以上結果表明愈瘡木烷型倍半萜化合物FissistigmaterpeneA對滑膜細胞具有很好的抑制效果，能提高細胞培養液中LDH活性。實驗表明倍半萜化合物FissistigmaterpeneA具有良好的抗風溼藥效，可以用於抗風溼藥物的製備。