樟芝子實體苯類化合物、製備與分析方法

2023-12-12 13:33:07

專利名稱：樟芝子實體苯類化合物、製備與分析方法
技術領域：
本申請涉及一種樟芝子實體萃取物，本申請尤其涉及一種樟芝子實體的苯類組合物、製備與分析方法。
背景技術：
樟芝(Androdia cinnamomea)又稱樟菇、牛樟菇、牛樟芝等，為臺灣特有的真菌菌種，生長於海拔400至2000公尺特有的牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)樹幹腐朽的心材內壁，或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮溼的表面。因此，要尋找到野生的樟芝子實體或確認此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外觀並不容易，也由於其生物活性成分具潛在的醫藥價值，因此樟芝的價格居高不下。由於樟芝子實體不易被發現及以人工方式培養，目前市面上多為樟芝菌絲體 (mycelia)產品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的症狀及其他副作用。此外，樟芝菌絲體產品也被發現具有抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果(Liu等人，2007)。這些產品宣稱具有與樟芝子實體相似的主要成分，包括具有細胞毒性效果的三萜類(triterpenes)、類固醇 (steroid)及具有免疫刺激性的多糖體等(Chen等人，1995 ；Yang等人，1996)。傳統上，樟芝被應用於健康食品，以避免發炎、過敏、皮膚癬、肝癌的發生，因此，樟芝菌絲體及子實體萃取物被認為是具有潛力的化學治療藥物，以對抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌細胞等(Chen 等人，2007 ；Hsu 等人，2007 ；Peng 等人，2007 ；Shetty 等人，2005 ；Wu 等人，2006)，但各類有效成分的活性機制與抑制癌症能力並未被完全理清及探討。此外，中華民國專利號U99665揭露了樟芝萃取物及其製備方法，其是以乙醇萃取樟芝菌絲體獲得多糖體，用以抑制基質金屬蛋白酶的活性，但並非以樟芝子實體進行萃取，其產物也未能抑制癌細胞的生長；中華民國專利號1279439揭露了以樟芝菌絲體進行培養，通過調整培養時的酸鹼值獲得到培養物，並未揭露萃取方法；而中華民國專利號 591110揭露了由樟芝菌絲體萃取出Y-氨基丁酸，其先冷凍乾燥樟芝菌絲體，再以水或有機溶劑萃取。上述這些發明皆未以樟芝子實體進行有機溶劑或水的萃取，而且未鑑定出其所內含的指標性二次代謝化合物。本申請申請人鑑於現有技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並以鍥而不捨的精神，最終構思出本申請「樟芝子實體的苯類組合物、製備與分析方法」，能夠克服現有技術的不足，以下為本申請的簡要說明。

發明內容
本發明從樟芝子實體中萃取較低極性分層，但具有活性萃取物，並確定其所包含的新穎苯類化合物。通過該萃取方法，本發明可應用於檢驗樟芝保健食品、藥物或樟芝子實體的苯類化合物的種類及含量，可作為產業上用途。本發明提出一種樟芝子實體的正己烷萃取物的製備方法，包括下列步驟提供樟芝子實體；以乙醇溶液萃取樟芝子實體，獲得樟芝子實體的乙醇萃取物；及以正己烷溶液萃取樟芝子實體的乙醇萃取物，獲得樟芝子實體的正己烷萃取物。其中樟芝子實體的正己烷萃取物包括至少一種苯類化合物。該至少一種苯類化合物包括4，7- 二甲氧基-5- (3-甲基丁 -3-烯炔基)_6_甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯(4，7-dimethoxy-5-(3-methylbut-3-en-l-ynyl)-6-m ethyl-l，3-benzodioxole)、4，7-二甲氧基 _5_ 甲基 _1，3-苯並間二氧雜環戊烯(4， 7-dimethoxy-5-methyl-l, 3-benzodioxole)及 / 或安卓凱因 A (antrocamphine A)。而該製備方法還包括將樟芝子實體研磨為細粉的步驟。本發明另提出一種以前述製備方法所製備的樟芝子實體的正己烷萃取物，包括至少一種苯類化合物，當溶於C5D5N時，其1H核磁共振圖譜於δ 6. 4至6. 6之間具有芳香環上單個氫的信號，於S 5. 8至6.1之間具有亞甲二氧基信號，於δ 5. 4至5. 6之間具有雙鍵信號，於δ 3. 7至4.1之間顯示出甲氧基信號，於δ 2.1至2. 6之間顯示出芳香環上甲基的信號。該樟芝子實體的正己烷萃取物以乙醇溶液及正己烷溶液依序萃取樟芝子實體所獲得。而所包括的至少一種苯類化合物的種類也如前所述。本發明另提供一種樟芝子實體的正己烷萃取物，包括至少一種苯類化合物，當該樟芝子實體的正己烷萃取物溶於⑶Cl3時，其屯核磁共振圖譜於δ 6. 2至6. 4之間具有芳香環上的單個氫的信號，於S 5. 8至6.0之間具有亞甲二氧基信號，於δ 5. 2至5. 5之間具有雙鍵信號，於S 3. 6至4.1之間具有甲氧基信號，於δ 2.1至2. 4之間顯示出芳香環上甲
基的信號。本發明另提供一種方法，用以檢測樟芝子實體中至少一種苯類化合物的含量，該方法包括下列步驟以乙醇溶液萃取樟芝子實體，獲得樟芝子實體的乙醇萃取物；以正己烷溶液萃取樟芝子實體的乙醇萃取物，獲得樟芝子實體的正己烷萃取物；以1H核磁共振圖譜儀檢測樟芝子實體的正己烷萃取物中是否具有至少一種苯類化合物；當樟芝子實體的正己烷萃取物中具有至少一種苯類化合物時，以高效液相色譜儀檢測樟芝子實體的正己烷萃取物中苯類化合物的含量。前述檢測方法還包括以1H核磁共振圖譜分析儀檢測苯類化合物的信號，信號選自由芳香族信號、雙鍵信號、甲氧基信號及甲基信號及其組合組成的組之一。當樟芝子實體的正己烷萃取物溶於C5D5N溶液時，在1H核磁共振圖譜上所出現的信號的化學偏移如上所述。同理，當溶於CDCl3溶液時，其在屮核磁共振圖譜上所出現的信號的化學偏移亦如上所述。根據上述構想，實驗所使用的高效液相色譜儀包括檢測器，該檢測器包括全波長檢測器、單波長檢測器及/或電噴霧離子化質譜儀。而單波長檢測器的波長設定為254nm 和 270nm。本發明另提出一種以1H核磁共振圖譜檢測含苯類化合物的樟芝子實體的正己烷萃取物的方法，該1H核磁共振圖譜以吡嗪(pyrazine)為內標，該方法包括下列步驟檢測樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有甲氧基信號於δ 3. 9至4. 0之間；檢測樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有第一甲基信號於δ 2. 1至2. 2之間；以及檢測樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有第二甲基信號於δ 2. 3至2. 4之間。而出現甲氧基信號、第一甲基信號及第二甲基信號分別表示樟芝子實體的正己烷萃取物具有4，7- 二甲氧基-5-(3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A。再者，當出現甲氧基信號時，以內標為基礎計算甲氧基信號的第一強度。同理，當出現第一甲基信號和/或第二甲基信號時，以內標為基礎計算第一甲基信號的第二強度和 /或第二甲基信號的第三強度，並且由第一、第二及第三強度依序計算樟芝子實體的正己烷萃取物中4，7- 二甲氧基-5- (3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A的含量。本發明另提出一種自樟芝子實體中萃取出的苯類化合物，其化學式如前一段所述的化合物及其組合。本發明另提出一種檢測方法，是以高效液相色譜儀同時檢測4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁-3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7_ 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A的含量。本發明另提出一種檢測方法，是以屯核磁共振質譜儀同時檢測4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁-3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7_ 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A至少其中之一的含量。


圖1為本發明的樟芝子實體的正己烷萃取物的製備方法流程圖。圖2為正己烷萃取物溶於C5D5N在400MHz的 核磁共振圖譜。圖3為本發明的化合物1的NOESY關係示意圖。圖4為本發明的化合物1的HMBC關係示意圖。圖5(a)至圖5(d)分別為(a)樟芝子實體的正己烷萃取物、(b)化合物1、(c)化合物2及(d)化合物3溶於⑶Cl3在400MHz的屮核磁共振圖譜。圖6(a)至圖6(c)分別為(a)樟芝子實體的正己烷萃取物與內部標準品吡嗪溶於 CDCl3在400MHz的屯核磁共振圖譜、(b)化合物1標的特徵信號放大圖、(c)化合物2與化合物3標的特徵信號放大圖。圖7(a)及圖7(b)分別為(a)樟芝子實體的正己烷萃取物以及(b)化合物1 3 於254nm波長的高效液相色譜圖譜。圖8 (a)及圖8 (b)分別為(a)樟芝子實體的正己烷萃取物及(b)化合物1 3於 270nm波長的高效液相色譜圖譜。
具體實施例方式本申請所提出的「樟芝子實體的苯類組合物、製備與分析方法」將可由以下的實施例說明而得到充分了解，使得本領域技術人員可以據以完成本發明，然而本申請的實施並非由下列實施例限制其實施方案，本領域技術人員仍可依據示例性實施例的精神推演出其他實施例，該實施例都應該屬於本發明的範圍。實驗1、樟芝子實體的正己烷萃取物的製備請參閱圖1的製備方法10，將乾燥樟芝子實體磨成細粉(步驟12)，以1 10比例(重量/體積)置於75°C的乙醇溶液回流2小時(步驟14)。冷卻萃取物，再置於4°C進行過夜沉澱。進一步以濾紙過濾該萃取物的上清液，以3，OOOrpm離心30分鐘以去除沉澱物，將萃取物冷凍乾燥並儲存於-70°C，此即為樟芝子實體的乙醇萃取物(步驟16)。再將樟芝子實體的乙醇萃取物以正己烷萃取，獲得樟芝子實體的正己烷萃取物(簡稱正己烷萃取物，FNH,步驟18)及樟芝子實體殘留物(步驟20)。為了在正己烷萃取物中探尋新穎的化合物，且為證實該化合物僅存在於正己烷萃取物而不存在於樟芝子實體的其他萃取物中，發明人參照中華民國專利申請號098104772 所公開的方法，將前述的樟芝子實體殘留物依序以乙酸乙酯及乙醇進行萃取，分別獲得乙酸乙酯萃取物以及乙醇再萃取物，將本發明的正己烷萃取物與前述兩種萃取物進行比較。實驗2、樟芝子實體的正己烷萃取物的核磁共振圖譜分析將正己烷萃取物(FNH)溶於C5D5N溶液，濃度為11. 6mg/0. 75ml,以解析度400MHz 進行屯核磁共振圖譜實驗。請參閱圖2，其於δ 6. 48、5. 93顯示出FNH具有芳香族成分的主要特徵信號(S 6. 48為芳香環上單個氫的信號，δ 5. 93為亞甲二氧基的信號)，於δ 5. 50 顯示出雙鍵結構的特徵信號，於δ 3. 87、3. 78顯示出甲氧基的特徵信號。然而，在相同實驗條件下，乙酸乙酯萃取物以及乙醇再萃取物則無上述特徵信號(結果未顯示)。而且FNH在高磁場區並未顯示三萜類的甲基特徵信號，僅於δ1.27、0.88出現長鏈結構信號。因此，由上述實驗分析可確定正己烷萃取物為苯類化合物的濃縮層。實驗3、樟芝子實體的正己烷萃取物的成分分離本發明萃取出化合物1 3，在此先將化合物1 3對應的結構式(式I至式III) 詳列如下。
權利要求
1.一種樟芝子實體的正己烷萃取物的製備方法，包括下列步驟 提供樟芝子實體；以乙醇溶液萃取該樟芝子實體，獲得樟芝子實體的乙醇萃取物；及以正己烷溶液萃取該樟芝子實體的乙醇萃取物，獲得該樟芝子實體的正己烷萃取物， 其中該樟芝子實體的正己烷萃取物包括至少一種苯類化合物。
2.如權利要求1所述的製備方法，其中該至少一種苯類化合物選自由4，7-二甲氧基-5-(3-甲基丁-3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7_ 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、安卓凱因A及其組合組成的組之一。
3.如權利要求1所述的製備方法，還包括步驟將該樟芝子實體研磨成細粉。
4.一種樟芝子實體的正己烷萃取物，包括至少一種苯類化合物，當該樟芝子實體的正己烷萃取物溶於C5D5N時，其1H核磁共振圖譜於δ 6. 4至6. 6之間具有芳香環上的單個氫的信號，於S 5. 8至6.1之間具有亞甲二氧基信號，於δ 5. 4至5. 6之間具有雙鍵信號，於 δ 3. 7至4. 1之間顯示出甲氧基信號，於δ 2.1至2. 6之間顯示出芳香環上的甲基的信號。
5.如權利要求4所述的樟芝子實體的正己烷萃取物，其由乙醇溶液及正己烷溶液依序萃取樟芝子實體所獲得。
6.如權利要求4所述的樟芝子實體的正己烷萃取物，其中該至少一種苯類化合物選自由4，7- 二甲氧基-5- (3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4， 7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、安卓凱因A及其組合組成的組之一。
7.一種樟芝子實體的正己烷萃取物，包括至少一種苯類化合物，當該樟芝子實體的正己烷萃取物溶於⑶Cl3時，其1H核磁共振圖譜於δ 6. 2至6. 4之間具有芳香環上的單個氫的信號，於S 5. 8至6.0之間具有亞甲二氧基信號，於δ 5. 2至5. 5之間具有雙鍵信號，於 δ 3. 6至4. 1之間具有甲氧基信號，於δ 2. 1至2. 4之間顯示出芳香環上的甲基的信號。
8.一種用以檢測樟芝子實體中至少一種苯類化合物的含量的方法，該方法包括下列步驟以乙醇溶液萃取該樟芝子實體，獲得樟芝子實體的乙醇萃取物； 以正己烷溶液萃取該樟芝子實體的乙醇萃取物，獲得樟芝子實體的正己烷萃取物； 以 核磁共振圖譜儀檢測該樟芝子實體的正己烷萃取物中是否具有該至少一種苯類化合物；及當該樟芝子實體的正己烷萃取物中具有該至少一種苯類化合物時，以高效液相色譜儀檢測該樟芝子實體的正己烷萃取物中該苯類化合物的含量。
9.如權利要求8所述的方法，還包括以1H核磁共振圖譜分析儀檢測該苯類化合物之一的信號，該信號選自由芳香族信號、雙鍵信號、甲氧基信號及甲基信號及其組合所組成的組之一。
10.如權利要求9所述的方法，在C5D5N溶液條件下，其中該芳香族信號於δ6. 4至6. 6 之間以及S 5.8至6. 1之間，該雙鍵信號於δ 5. 4至5. 6之間，該甲氧基信號於δ 3. 7至 4. 1之間，且該甲基信號於δ 2.1至2. 6之間。
11.如權利要求9所述的方法，在⑶Cl3溶液條件下，其中該芳香族信號於δ6. 2至6. 4 之間以及S 5. 8至6.0之間，該雙鍵信號於δ 5. 2至5. 5之間，該甲氧基信號於δ 3. 6至 4. 1之間，且該甲基信號於δ2.1至2.4之間。
12.如權利要求8所述的方法，其中該高效液相色譜儀包括檢測器，該檢測器選自由全波長檢測器、單波長檢測器及電噴霧離子化質譜儀及其組合組成的組中之一。
13.如權利要求12所述的方法，該單波長檢測器的波長設定為2Mnm以及270nm。
14.一種以屯核磁共振圖譜檢測含苯類化合物之一的樟芝子實體的正己烷萃取物的方法，該1H核磁共振圖譜以吡嗪為內標，該方法包括下列步驟檢測該樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有甲氧基信號於δ 3. 9至4. 0之間；檢測該樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有第一甲基信號於δ 2. 1至2. 2之間；以及檢測該樟芝子實體的正己烷萃取物是否具有第二甲基信號於δ 2. 3至2. 4之間。
15.如權利要求14所述的方法，其中出現該甲氧基信號、該第一甲基信號及該第二甲基信號分別表示該樟芝子實體的正己烷萃取物具有4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A。
16.如權利要求14所述的方法，其中當出現該甲氧基信號時，以該內標為基礎計算該甲氧基信號的第一強度，當出現該第一甲基信號時，以該內標為基礎計算該第一甲基信號的第二強度，以及當出現該第二甲基信號時，以該內標為基礎計算該第二甲基信號的第三強度，並且由該第一、該第二及該第三強度計算該樟芝子實體的正己烷萃取物中4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A的含量。
17.一種自樟芝子實體中萃取出的苯類化合物，其化學式選自由4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁-3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7_ 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、安卓凱因A及其組合組成的組之一。
18.—種檢測方法，以高效液相色譜儀同時檢測4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A的含量。
19.一種檢測方法，以1H核磁共振質譜儀同時檢測4，7_ 二甲氧基-5-(3-甲基丁 -3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7- 二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯及安卓凱因A中至少一種的含量。
全文摘要
本申請公開一種樟芝子實體的正己烷萃取物的製備方法，是按次序以乙醇溶液和正己烷溶液萃取樟芝子實體，獲得樟芝子實體的正己烷萃取物。該樟芝子實體的正己烷萃取物包括至少一種苯類化合物，經過色譜法、核磁共振圖譜及高效液相色譜法確定出至少一種苯類化合物內含4，7-二甲氧基-5-(3-甲基丁-3-烯-1-炔基)-6-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、4，7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並間二氧雜環戊烯、安卓凱因A及其組合的含量。此外，本申請也可應用於檢測樟芝保健食品或藥品或樟芝子實體中的苯類化合物的含量，具有產業上的價值。
文檔編號C07C41/38GK102584777SQ20111007877
公開日2012年7月18日 申請日期2011年3月28日 優先權日2011年1月10日
發明者呂美津, 吳東穎, 吳永昌, 張芳榮, 杜英齊, 許育銘 申請人:高雄醫學大學