一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法

2023-10-26 00:47:47

專利名稱：一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法
技術領域：
本發明涉及鱉甲抗肝纖維化有效劑型的製備方法，具體涉及鱉甲微粉與鱉甲水煎
液抗肝纖維化有效劑型的製備方法。
背景技術：
肝纖維化是各種原因引起的一系列損傷_修復、導致細胞外基質(ECM)合成與降解失衡、合成沉積遠遠超過降解吸收、以及構成成分比例明顯改變的結果，大量ECM沉積於肝小葉內並逐漸形成纖維間隔，嚴重破壞了肝組織的正常結構和功能，可致肝竇毛細血管化，血流障礙，門脈高壓。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理學基礎，也是誘發肝硬化肝癌的必經途徑。肝纖維化治療主要包括去除病因與抗纖維化治療。公認徹底驅除原發病因後，肝纖維化仍可繼續進展，機理為活化的肝星狀細胞(HSC)通過自分泌或旁分泌再次激活HSC，是故有效的抗纖維化治療成為控制慢性肝病進展和預防肝硬化肝癌、改善預後不可或缺的重要環節。基因治療研究取得較大進展，目前存在的主要問題是基因導入的靶向性、表達效率、可調控性及安全性尚未完全解決，真正應用於臨床還待時日；目前部分用治肝纖維化的化學藥和生物藥存在一些毒副反應；許多以鱉甲為君藥組方的複方製劑如複方鱉甲軟肝片、鱉甲抗纖方、鱉甲煎丸等，抗肝纖維化療效較好，但價格較昂貴(主要原因是其中天然鱉甲資源有限)，難以滿足廣大患者尤其是農村和貧困地區的需求，據統計我國約1.3億人患有肝病，佔總人口的10%，針對國情，亟待開發價廉、有效且毒副作用小的抗肝纖維化藥物。 鑑於鱉甲"軟堅散結"、抗肝纖維化藥用的傳統劑型至今仍缺乏科學依據，臨床應用頗多爭議，其單方效用及藥效物質基礎更有待闡明，查新檢索結果表明該諸方面的研究尚未見報導。本發明旨在通過系統的體內、外藥理藥效學比較研究，明確鱉甲抗肝纖維化的有效劑型、並驗證其藥效學及物質基礎、作用機制，為藥食同源的傳統中藥鱉甲用於抗肝纖維化臨床醫療、中藥新藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發為肽類藥物奠定堅實基礎和提供科學依據。 鱉甲為常用傳統中藥，源於鱉科動物鱉(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，具有滋陰潛陽、軟堅散結、退熱除蒸等功效；主治陰虛發熱、勞熱骨蒸、虛風內動、癥瘕、久瘧瘧母等病症。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的不足，而提供一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法。 它通過對中藥"軟堅散結"、抗肝纖維化代表性藥物、複方中的常用"君藥"鱉甲之歷來存在爭議的劑型微粉與水煎液進行系統的體內、外藥理藥效學對比研究，為鱉甲用於臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統劑型提供科學依據，闡明其有效劑型、並驗證其藥效學與物質基礎、作用機制，從而為藥食同源的傳統中藥鱉甲用於抗肝纖維化臨床醫療、中藥新
3藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發為肽類藥物奠定堅實基礎和提供科學依據。 本發明的目的是通過如下技術方案來完成的；一種抗肝纖維化有效劑型的製備方
法，它包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉； (2)將上述超微粉與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。
或包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉；
(2)取鱉甲超微粉進行煎煮，煎煮1. 5-5個小時，收集混懸液；
(3)將上述混懸液與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。
或包括下列步驟 (1)稱取常規研磨的鱉甲粉81-—100份，加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5-30分 鍾，抽濾，濾渣再加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合併兩次產生的濾液，冷凍 乾燥後得凍乾粉； (2)用加蒸餾水O. l-5份溶解上述製得的凍乾粉，將水溶液裝於半透膜(3. 500 A )內，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-10°C;同法再透析一次，合併兩次膜外 透析液，真空冷凍乾燥，收集A型凍乾粉0. 2-10份； (3)取上述膜內液體，將膜袋置0.2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-l(TC; 同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內液體真空冷凍乾燥，收集B型凍乾粉l-20份；
(4)將上述A型凍乾粉或B型凍乾粉與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑 型。 A型凍乾粉為分子量小於6000的物質(鱉甲粗多肽成品)，B型凍乾粉為分子量 大於6000的物質。 本發明項目通過多學科交叉的研究方法，採用現代科學技術，對鱉甲進行了較系 統的抗肝纖維化有效劑型、藥效物質基礎及其作用機制研究，結果表明，鱉甲抗肝纖維化的 藥效物質基礎為小分子肽類物質、胺基酸；鱉甲水煎液抗肝纖維化的作用明顯優於鱉甲微 粉，認為鱉甲經煎煮後，對肝星狀細胞活化增殖膠原合成起負抑制效應的大分子蛋白變性， 變性蛋白質易受胃腸道內多種水解酶類的協同催化作用而被消化，轉變為簡單的小分子肽 類物質，符合發揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標準及胺基酸序列，與鱉甲中原本存在的 少量小分子肽類物質一起，共同發揮抑制肝星狀細胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作 用。從而為鱉甲用於臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統劑型提供了實驗依據，為鱉甲用於 抗肝纖維化臨床醫療、中藥新藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發為肽類藥物奠定堅實基 礎和提供科學依據。
具體實施例方式
以下通過實例來進一步詳細說明本發明。 本發明所述的一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法，它可以按照以下三種方法制 備； 第一種方法製備鱉甲微粉，包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉；
(2)將上述超微粉與藥學上可接受的、常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。 第二種方法製備鱉甲水煎液，包括下列步驟 (1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉； (2)取鱉甲超微粉進行煎煮，煎煮1. 5-5個小時，收集混懸液； (3)將上述混懸液與藥學上可接受的、常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。 第三種方法附設製備鱉甲粗提物質(用以藥理藥效學對比分析研究、藥效物質基
礎研究)，包括下列步驟 (1)稱取常規研磨的鱉甲粉81-—100份，加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5-30分 鍾，抽濾，濾渣再加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合併兩次產生的濾液，冷凍 乾燥後得凍乾粉； (2)用加蒸餾水0. 1-5份溶解上述製得的凍乾粉，將水溶液裝於半透膜(3. 500 A )內，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-10°C;同法再透析一次，合併兩次膜外 透析液，真空冷凍乾燥，收集A型凍乾粉0. 2-10份； (3)取上述膜內液體，將膜袋置0.2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-l(TC; 同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內液體真空冷凍乾燥，收集B型凍乾粉l-20份；
(4)將上述A型凍乾粉或B型凍乾粉與藥學上可接受的、常規的賦形劑一起製成各 種常規劑型。 A型凍乾粉為分子量小於6000的物質(鱉甲粗多肽成品)，B型凍乾粉為分子量 大於6000的物質。 本發明對鱉甲抗肝纖維化的傳統劑型進行了系統的體內、外藥理藥效學對比研 究，結果表明，鱉甲水煎液抗肝纖維化作用顯著，而鱉甲微粉無此作用，聯繫課題組同期研 究得出的鱉甲抗肝纖維化的藥效物質基礎為小分子肽類物質的結論，從而明確了鱉甲抗肝 纖維化的有效劑型與藥效物質基礎、作用機制。詳見下述試驗。
實施試驗例1 :本發明的"體外實驗鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清(附設鱉甲 粗提物質組分)對離體HSC-T6細胞增殖的影響"
1.材料與方法 動物健康雄性SD大鼠12隻，體重200g士20g，購自華中科技大學同濟醫學院實 驗動物中心。飼養溫度23°〇左右，相對溼度60.0% ±10.0%。 細胞系肝星狀細胞系HSC-T6購自上海中醫藥大學肝病研究所，為SV40轉 染的Sprague-Dauley大鼠星狀細胞，其表現型為活化的HSC，表達高水平的I型膠原、 TMP-lmRNA等。 主要試劑細胞培養試劑羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶(trypsin)、 L-穀氨醯胺等(美國Sigma公司)，DMEM培養基(高糖、低糖)(美國GIBCO公司)，小牛血 清(fetal calf serum， FCS)(武漢亞法生物技術公司)，青黴素、鏈黴素(華北製藥股份公 司)，碳酸氫鈉(湖北化工廠)，二氧化碳(C02)(武漢無機鹽廠)。細胞增殖檢測用試劑二 甲基亞碸(DMSO)、噻唑藍(MTT) (Sigma公司)。 主要儀器設備電熱恆溫水浴鍋(H. H. Sl 1-2型，上海醫療器械五廠)，水浴恆溫振 蕩器(SHZ-B，上海躍進醫療器械廠)，倒置顯微鏡(IMT-2B型，日本Olymplus公司)，高速臺 式離心機(L110，上海)，C02培養箱(18201R，美國Shel-Lab公司)，塑料培養板(24孔，96
5孔，丹麥Nunc公司)，塑料培養皿(lOOmm，丹麥Nunc公司)，超淨工作檯(GH02-2型，天津市 醫藥淨化設備廠)，高壓消毒鍋(Autoclave SM52，美國Yamatoscientif ic公司)，分析天平 (TG328A型，湘儀天平儀器廠)，-80。C低溫冰箱(ULT FREEZER725型，Forma Solentif ic)， 紫外分光光度計(753BI型，上海光學儀器廠)，多功能酶標儀(352型，芬蘭Labsystem公 司)。 試劑配製DMEM液1L的DMEM高糖及低糖培養基幹粉各 一 包，並稱取 2. 38gHEPES、2. 0g NaHC03溶於2L三蒸水中，調pH為7. 2，0. 22 y m濾膜抽濾除菌，分裝置 4。C備用，用前加入10% FCS，1% L-穀氨醯胺，100y/ml青黴素，即為完全培養基。MTT的 配製稱取MTT10mg， 37。C溫浴中溶解於2ml 0. Olmol/L PBS， PH7. 4，即為5mg/ml的MTT溶 液，0. 22 m過濾除菌，置棕色小瓶中，4t:冰箱保存。 鱉甲粗提樣品的製備(l)稱取鱉甲粉100g，加蒸餾水200ml，超聲提取二十分鐘， 抽濾，濾渣再加蒸餾水100ml，超聲提取十分鐘，抽濾；合併兩次濾液，冷凍乾燥，得凍乾粉；
(2)用加蒸餾水200ml溶解上述製得的凍乾粉，將水溶液裝於半透膜(3. 500 A ) 內(截留分子量6000)，置100ml蒸餾水中透析五小時(4t:，5min搖一次)；同法再透析一 次，合併兩次膜外透析液，真空冷凍乾燥，收集A型0. 4g凍乾粉。 (3)取膜內液體，將膜袋置500ml蒸餾水中透析三小時(4。C，磁力攪拌)；同法透 析三次，棄去膜外透析液，將膜內液體真空冷凍乾燥，收集B型3. 2g凍乾粉。
A型凍乾粉為分子量小於6000的物質(鱉甲粗多肽成品)，B型凍乾粉為分子量 大於6000的物質。 鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清的製備實驗用大鼠隨機分成三組，每組4隻。鱉 甲研粉，過80目篩，JGM-T50型氣流粉碎機處理，收集超微粉。取鱉甲超微粉及其煎煮混懸 液(煎煮1. 5h)分別按成人10倍劑量(即生藥含量27. 0g kg—1 d—0配成藥液(1. 35g/ ml)，以及生理鹽水，分別給大鼠灌胃，2ml，2/dX3。第3天給藥後lh，無菌無熱源汙染條件 下心臟採血，分離血清，56。C滅活30min，分裝凍存。 HSC_T6的培養及傳代HSC_T6培養於37°C、5% C02的含10%胎牛血清、100 ii /ml 青黴素、100mg/ml鏈黴素、l^L-穀氨醯胺的DMEM(低糖與高糖比例為l : l)培養液中，在 倒置顯微鏡下觀察細胞長到亞單層或細胞密度約80% 90%時，是HSC-T6傳代的標誌，吸 棄培養基，加入0. 25%胰蛋白酶4 5ml，以浸沒細胞為宜，37°C消化5 7min，待細胞回 縮，瓶壁有少量細胞脫落，即用含10X小牛血清培養基終止，收集細胞懸液於50ml消毒離 心管中，1700rpm，4t:離心7min，棄上清，加入含10%小牛血清的DMEM用吸管反覆吹打、分 散細胞，取10 yl細胞懸液光鏡下計數，完全培養基調整細胞濃度，以1X107ml傳代。
實驗分組及藥物處理待細胞長滿培養板底後，換用5% FCS的DMEM培養基， 培養24h後分別加入不同濃度的鱉甲粗提物質(以含5% FCS的匿EM培養基倍比稀釋 成14. 0000mg/ml、7. 0000mg/ml、3. 5000mg/ml、l. 7500mg/ml、0. 8750mg/ml、0. 4375mg/ml、 0. 2188mg/ml、0. 1094mg/ml，0. 45 y m濾膜過濾)以及不同濃度鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物 血清(分設2. 5%、5%、10%、15%、20%五個濃度)，4孔重複，設空白對照組(含5% FCS 的DMEM培養基)以及相應濃度生理鹽水對照血清組。 MTT比色法測定HSC-T6增殖傳代HSC_T6細胞按1 X 105的密度接種於96孔培養 板，每孔加100iil，細胞貼壁長滿孔底12h後，換含5% FCS的DMEM培養基，培養12h，加入鱉甲粗提物質(以含5XFCS的DMEM培養液倍比稀釋，0. 45ym濾膜過濾)和鱉甲微粉與鱉 甲水煎液藥物血清共同培養48h、72h，每一濃度設4復孔，另設空白對照組及生理鹽水血清 組，去培養基(翻板)，每孔加20 ii 1MTT溶液，2PBS，濃度為5mg/ml，過濾除菌，置棕色 小瓶中，4t:冰箱保存。孵育4h，每孔加入二甲基亞碸(匿SD)100iU，在微型混合器上振蕩 2min， 10min後於酶標儀上測定0D490值。存活率=(藥物組OD值/對照組OD值)X 100% 。 抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)X 100 % 。 統計學方法數據以X±S表示，進行方差分析和組間q檢驗，P < 0. 05為差異具
有顯著性意義。 2.試驗結果 傳代培養的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6與鱉甲粗提物質(分子量大於和小於6000 的物質)以及鱉甲微粉與鱉甲水煎液藥物血清分別共同培養48h、72h後，採用MTT比色法 測定各濃度組HSC增殖情況，見表1、2。結果顯示鱉甲分子量小於6000物質組MTT0D值低 於空白對照組(培養72h結果)和分子量大於6000物質組(培養48h、72h結果)，中位值 差異均非常顯著，P < 0. 01-0. 001。與空白對照組相比，中位抑制率(培養48h、72h結果)， 分子量大於6000物質組分別為-119. 76%、 -58. 91% ;培養72h結果，分子量小於6000物 質組在各實驗濃度均產生抑制效應(抑制率5. 89% 68. 74% )，中位抑制率51. 67%。
鱉甲水煎液藥物血清組MTTOD值低於相應濃度生理鹽水對照血清組和鱉甲微粉 藥物血清組，中位值差異均非常顯著，P < 0. 001。與相應濃度生理鹽水對照血清組相比，中 位抑制率(培養48h、72h結果)，鱉甲微粉藥物血清組分別為1. 36%、 -23. 21%，鱉甲水煎 液藥物血清組分別為51. 43% 、48. 76%。 實施試驗例2 :本發明的"體外實驗鱉甲提取物分子量小於6000的肽類物質對 TGF-P工剌激的LX-1細胞活化及膠原合成的影響 y-幹憂素(IFN-y)是目前已知的作用最強的抗肝纖維化細胞因子。以往的體外 及動物實驗均證實IFN-y可有效地改善日本血吸蟲、四氯化碳、二甲基亞硝胺等引起的肝 纖維化。本實驗通過Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品(分子量< 6000) 、IFN_ y等各作 用組、對照組對TGF-P :剌激的LX-1細胞I、III型膠原和a -平滑肌肌動球蛋白(a -SMA) 表達的影響，探討鱉甲中多肽類成分抗肝纖維化的活性和作用機制。
1.材料與方法 細胞系人肝星狀細胞系LX-1由美國Mount Sinai醫學院肝病科Friedman SL教
授惠贈。 主要試劑IFN-y、 TGF-h(美國R&D公司)，DMEM培養基、胎牛血清(美國 Hyclone公司)，P-肌動蛋白(P-actin)多克隆抗體、羊抗III型膠原多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)，小鼠抗a -SMA和I型膠原單克隆抗體(美國Sigma Aldrich公司)， IgG-HRP羊抗兔、兔抗羊和抗小鼠第二抗體(美國Santa Cruz公司)，SDS-PAGE蛋白電泳 及轉膜試劑，Western-blot試劑，PVDF膜，ECL顯色劑，Re-blot洗膜試劑。
LX-1細胞的培養按文獻的方法培養LX-1細胞系，於37t:、飽和溼度、體積分數 5% C02條件下，含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養。 膜透析法提取分離鱉甲分子量小於6000的肽類物質的製備方法同"發明內容"項 下"第三種方法"之"(l)、 (2)"。
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藥物處理、Western-blot法檢測將LX-1按1 X 106接種於10cm的培養皿，待細 胞貼壁，加入含不同濃度藥物的培養基(2XFCS-DMEM，培養時間48h)預處理2h後，加入 800pg/ml重組TGF-13 p37。C、5X C02培養72h。加200iil/dish的細胞裂解液，用機械法 收集細胞，冰浴30min， 10000rpm離心10min，收集上清液用BCA protein assay試劑盒進行 總蛋白定量。取40ug蛋白加上樣緩衝液煮沸10min變性，進行10% SDS-PAGE電泳後，電轉 移至醋酸纖維素膜，5X脫脂奶粉室溫封閉2h，加入相應的一抗(Santa Cruz)分別以封閉 液適當稀釋，將PVDF膜浸泡其中，搖床緩慢4t:反應過夜；洗膜4次每次10min，加辣根過氧 化物酶(HRP)標記的二抗(1 : 2000， Santa Cruz)，室溫反應2h ;洗膜5次後ECL化學發光 顯色、曝光，膠片作雷射密度掃描，結果以I型膠原、III型膠原、a-SMA與對應的P-肌動 蛋白(Actin)的密度積分比值來表示蛋白的相對表達量。實驗以Actin為內參照，作空白 對照、TGF-13!剌激對照和hIFN- y對照。
統計學方法同"實施試驗例1"項下"1."。
2.試驗結果 Western blot法檢測鱉甲粗多肽成品對TGF_ P工剌激的LX_1細胞活化及膠原合 成影響的試驗結果顯示TGF-P !剌激組LX-1細胞Col I、 Col III、 a -SMA表達顯著高於 空白對照組(P < 0. 01) ;LX-1細胞IFN-y及鱉甲粗多肽成品10、5、lmg/ml作用組三種蛋 白表達顯著低於TGF-P工剌激對照組(P < 0. 01);鱉甲粗多肽成品10、5mg/ml組三種蛋白 表達顯著低於IFN-y作用組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽成品10mg/ml組三種蛋白表達顯著 低於空白對照組(P < 0. 05);鱉甲粗多肽抑制TGF-P i剌激的LX-1細胞Col I、 Col III、 a -SMA蛋白表達在實驗濃度範圍呈現量效依賴關係。 採用Western blot法，以目前抗肝纖維化作用最強的藥物IFN_ y作為對照，檢 測鱉甲提取物中分子量小於6000的肽類物質對TGF-P i剌激的LX-1細胞I、 III型膠原 和a-SMA蛋白表達的影響。試驗結果表明，鱉甲提取物分子量小於6000的肽類物質能有 效抑制肝星狀細胞激活及膠原合成，從而阻抑肝纖維化的發展，其抑制效果呈現量效關係， 高中劑量的抑制效果明顯優於對照藥物IFN-y ，從而進一步確定了鱉甲提取物分子量小於 6000的肽類化合物為其抗肝纖維化的有效物質部位。
"實施試驗例1 、 2 "討論 肝纖維化是各種原因引起的一系列損傷-修復、導致ECM合成與降解失衡、合成沉 積遠遠超過降解吸收、以及構成成分比例明顯改變的結果，大量ECM沉積於肝小葉內並逐 漸形成纖維間隔，嚴重破壞了肝組織的正常結構和功能，可致肝竇毛細血管化，血流障礙， 門脈高壓。在肝纖維化形成發展過程中，HSC激活的啟動維持、增殖及大量合成ECM是中心 環節。HSC在各種損肝因子持續剌激下轉化為具有增生性、纖維原性及可收縮性的肌成纖 維樣細胞(MFB)，表達a -SMA(HSC活化的標誌，其表達面積、強度與HSC激活程度及肝纖維 化程度正相關)和多種細胞因子及其受體，並大量合成以I、III型膠原為主的多種ECM ;且 HSC還通過合成和分泌基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP》、抑制基質金屬蛋白酶(MMPS) 活性從而抑制ECM的降解。大量研究表明，許多因子參與了 HSC的激活，而其中TGF-P工為 最強剌激因子，通過激活HSC以及剌激肝竇內皮細胞、Kupffer細胞等使ECM過度形成與沉 積，剌激HSC等細胞合成分泌血小板衍生生長因子(PDGF)等細胞因子並增強PDGFR等細胞 因子受體表達進而促進PDGF等對HSC的增殖作用，活化Smad、 MAPK信號系統誘導膠原表達，抑制MMPS而促進TIMPS合成分泌以阻礙膠原降解，從而促進肝纖維化形成發展。
鱉甲為鱉科動物鱉Trionyx sinensis Wiegmann的背甲。鱉甲含有動物膠(以骨 膠原為主)、多糖、角質、蛋白、碘質、維生素D及鐵、銅、鋅、鎂、磷等10餘種微量元素，蛋白含 量為50%以上，組成蛋白質、多肽的胺基酸有17種，其中以脯氨酸和甘氨酸為主。
本發明實施試驗結果顯示，鱉甲小分子提取物(粗多肽成品，分子量 6000)對HSC活化、增殖則起負抑制效應； 給大鼠注射白蛋白或血清是免疫損傷性肝纖維化造模常用方法，其機理與III型變態反應 有關；作為異種抗原的白蛋白或血清進入大鼠體內後，剌激其產生相應抗體，當抗原再次進 入機體後，抗原抗體結合形成免疫複合物激活補體；由於抗原的反覆長期剌激，過量的循環 免疫複合物來不及被清除，沉積於肝小葉間微血管壁內外，使肝小葉周圍出現廣泛的進行 性的慢性炎症病變，導致肝細胞變性壞死、成纖維細胞增殖和膠原纖維病理性增生，形成肝 纖維化及至肝硬化。臨床上鱉甲研粉生用治療肝纖維化，效果不佳，認為未經煎煮的鱉甲因 其蛋白分子量大，而人體胃腸道消化功能所限，以致蛋白質雖經一定程度分解吸收，但仍未 能達到與符合抗肝纖維化的肽段分子量標準及胺基酸序列，因而難以顯效；而鱉甲經煎煮 後，起負抑制效應的大分子蛋白變性，變性蛋白質易受胃腸道內多種水解酶類的協同催化 作用而被消化，轉變為簡單的小分子肽類物質，符合發揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標 準及胺基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類物質一起，共同發揮抑制肝星狀細 胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作用。 本發明實施試驗為鱉甲用於臨床治療肝纖維化疾患用藥的傳統劑型提供了科學 依據，明確了鱉甲抗肝纖維化的有效劑型，並驗證了其藥效物質基礎為小分子肽類物質，從 而為鱉甲用於抗肝纖維化臨床醫療、中藥新藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發為肽類藥 物奠定堅實基礎和提供科學依據。
實施試驗例3 :本發明的"體內實驗鱉甲微粉與鱉甲水煎液抗大鼠肝纖維化的藥
理藥效學比較研究" 1.實驗材料 1. 1實驗動物雄性SD大鼠110隻，體重200g士20g，購自華中科技大學同濟醫學
院實驗動物中心。
1. 2實驗試劑 主要試劑一抗I、 III、 IV型膠原(Col I、Col III、Col IV)、層粘蛋白(LN)、 轉化生長因子-l^ (TGF-13》、血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB)、基質金屬蛋白 酶-13(匪P-13)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-l(TIMP-l)多克隆抗體(博士德公司產品， 編號BA0325、 BA0326、 BA2174、 BA1761、 BA0290、 BA0519、 BA2204、 BA0575) ， a -平滑肌肌 動球蛋白(a -SMA)、核因子-k B(NF-k B)p65單克隆抗體分別為博士德公司、Santa Cruz公司產品(克隆號c-20) ;a-SMA和NF-kb p65_抗為鼠抗，其餘為兔抗；a-SMA、 NF_ k b p65、匪P-13、TIMP-l的工作滴度為1 : 70，其餘為1 : 50。 主要試劑配方蘇木素液蘇木素2. 5g，硫酸鋁鉀50g，氧化汞1. 25g，無水乙醇 25ml ，冰醋酸25ml ，加雙蒸水500ml 。伊紅染液醇溶性伊紅2g， 95%酒精500ml 。天狼猩紅 染液天狼猩紅O. 25g，飽和苦味酸500ml。 1 %鹽酸酒精鹽酸lml， 75%酒精99ml。抗原修 復液0. 38g擰檬酸，2. 4g檸檬酸三鈉，加雙蒸水lOOOml。 PBS液:KC1 0. 20g， KH2P040. 2g， NaCl 8. OOg， Na2HP04 7H20 1. 56g，加雙蒸水lOOOml，調至PH 7.4。四氯化碳(CC14)分析 純購自武漢亞法生物技術有限公司，以食用色拉油配製成40%溶液。 1. 3實驗儀器切片機(德國Leca公司)，OLYMPUS CHK型生物顯微鏡， LeicaDLMB(MP60)顯微照相系統，63_5型電熱恆溫培養箱，格蘭氏微波爐，HPIAS-IOOO型高 清晰度彩色病理圖文報告分析系統，JOEL 100X100CXII型透射電鏡，日立7170型自動生 化分析儀，550nm、412nm的分光光度計，可調式恆溫水浴鍋，臺式離心機，可調式移液器，酶 標儀等。 1. 4供試藥物製備將鱉甲微粉加適量水煎煮1. 5h得混懸液。
2.實驗方法 2. 1動物實驗和分組將110隻大鼠隨機分為6組正常對照組10隻，CClJ莫型對 照組、鱉甲水煎液預防組和治療組、鱉甲微粉預防組和治療組各20隻。除正常對照組外，均 給予40% CC14 0. 30ml/100g體重背部皮下注射，2/周，共12周；正常對照組給予等量等滲 鹽水背部皮下注射。每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5隻觀察肝組織病理改變。實 驗第4周末，中等度肝纖維化形成(纖維隔形成並互相連接，深入小葉內，小葉結構保留或 紊亂，但無肝硬化)。藥物預防組於造模同期分別給以鱉甲微粉煎煮混懸液(煎煮1. 5h)、 鱉甲微粉混懸液2. 7g生藥/100g體重灌胃，1/日；藥物治療組於造模第5周開始給以上述 藥液灌胃。正常對照組與模型對照組給予生理鹽水lml/100g體重灌胃，1/日。實驗12周 末，各組隨機取10隻大鼠，2%戊巴比妥那麻醉後，心臟採血，分離血清備檢；冰等滲鹽水原 位洗滌肝臟，分別用中性10%甲醛、2.5%戊二醛固定及_701:凍存備檢。
2. 2病理檢查肝組織標本用中性10%甲醛固定，石蠟包埋，4咖連續切片，常規作 HE染色、天狼紅染色，觀察組織學變化，將肝纖維化分為0-4期；按2002中華肝臟學會肝 纖維化組《肝纖維化診斷與療效評估共識》進行肝纖維化組織學半定量計分系統(SSS)標 準計分；肝膠原含量測定參考Jimenez等報導的測試方法，計算方法如下膠原P g/切片 (cm2) = (A540nm-7. 78% A630nm) X 1000/37。 2. 3免疫組化肝組織石蠟切片，脫蠟至水，3% H202 (30min)阻斷內源性過氧化物 酶，PBS液洗3次，抗原修復液(0. 38g檸檬酸，2.4g檸檬酸三鈉，加雙蒸水1000ml)中微波 修復，封閉非特異性抗原。加一抗，溼盒內置37t:孵育2小時，加二抗PicTureTM(Zymed公 司)，37t:孵育1小時，PBS液洗3次，DAB (Zymed公司)顯色10分鐘，流水終止反應，蘇木 素復染，封片。每次實驗均設PBS空白對照和正常血清取代一抗的陰性對照，觀察各蛋白的 表達，蛋白表達的定量結果用HIPAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統在低倍 鏡下(100X)計算陽性面積百分比(％ )。匪P-13表達的定量結果在高倍鏡下(400X)計 數陽性細胞數。 2. 4肝組織氧化指標超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、穀胱甘肽過氧化物酶
10(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 肝組織SOD、 GSH-Px酶活力檢測將10 %的肝勻漿，用生理鹽水稀釋成0. 25 %的 濃度，嚴格按S0D、GSH-Px測定試劑盒提供的方法操作，雙蒸水調零，分別於550nm波長下比 色、412nm處測各管光密度值(OD值)，計算公式分別為
組織'I'SOD活力—對照管吸光度一測定管吸光度.5。。, ^反應液總體積.待測勻漿屮蚩白 L 」((〃附伊to,) = 對照管吸光度 t °X取樣量(W) ■含量(mgpro,/m/)
組織cs/z- 對照敦灘-測定tp施x標準管濃度x稀釋倍數二反應吋1￥>(待測樣本蛋白含暴取樣韻
*活力 —標準管OD值-空白管O灘(20戸o〃i) (5*) 肝組織MDA檢測將10%的肝勻漿，離心10分鐘，取上清，嚴格按MDA測定試劑盒
提供的方法操作，雙蒸水調零，532nm處測各管吸光度值，計算公式為
「M9W繩^屮MD力含量測定管吸光度一 對照管吸光度:標準品濃度 待測勻漿蛋白含量 0090 ("o//mgproO—標準管吸光度-空白管吸光度X (10"附o//附/)—gpro;/ w/) 2. 5血清肝功能、血脂、透明質酸指標自動生化分析儀檢測肝功能及血脂；放免 法檢測血清透明質酸，試劑盒購自上海海軍醫學研究所，方法嚴格按試劑盒操作程序進行。
2. 6透射電鏡檢查將新鮮肝組織切成lmm3小塊，用2. 5%戊二醛固定24小時，經 梯度酒精脫水至100%丙酮30分鐘，用90%丙酮/包埋劑(1 : l)包埋過夜後，用純包埋 劑包埋5小時，低粘度spurr包埋劑6(TC過夜，在Ultracut E型切片機下切成的超薄切片 經醋酸鈾和硝酸鉛染色，在JOEL 100X 100CXII型透射電鏡下觀察結果。
2. 7統計方法實驗數據以；± S表示，進行方差分析和組間q檢驗，計數資料採用 Ridit檢驗，P < 0. 05為差異具有顯著性意義。
3.實驗結果 3. 1大鼠一般情況、肝臟標本外觀 —般情況正常組大鼠生長良好，體重自然增加，被毛光滑潤澤緻密，二便如常。鱉 甲微粉預防組和治療組與模型組無顯著差異，精神萎糜，喜睡少動，或易怒好鬥，鬍鬚下垂， 被毛枯萎穢黯，食慾下降，體重增加減少，甚至較前下降，尿色黃，可有腹瀉，可有腹水出現。 鱉甲水煎液預防組和治療組一般情況介於兩者之間，近似正常組。
肝臟標本外觀正常組大鼠肝臟紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質地柔軟。鱉甲微粉
預防組和治療組與模型組無顯著差異，肝臟縮小，顏色較蒼灰，表面呈顆粒結節狀，油膩，邊
緣鈍，質地硬韌。鱉甲水煎液預防組和治療組肝臟外觀介於兩者之間，近似正常組，肝表面
未見明顯顆粒結節。 3. 2病理檢查結果 鱉甲微粉預防組和治療組與模型組無顯著差異，大鼠肝組織HE、天狼紅染色可見 大量肝細胞脂肪變性存在，正常肝小葉結構遭到破壞；匯管區和小葉間有大量粗大增生的 膠原纖維，組織切片中有大量假小葉形成；與正常組相比，纖維化分期、SSS計分顯著增高 (P < 0. 01)。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預防組和治療組大鼠肝細胞脂肪變 性程度減弱，匯管區擴張，有纖維隔，但多數尚未連接；纖維化分期、SSS計分顯著降低(P < 0. 01)。 3.3免疫組化結果 正常組肝臟匪P-13不表達，a-SMA、Col I、Col I工I、Co1 IV、LN、TGF-P !、NF kB 11p65、 PDGF-BB、 TIMP-1低水平表達，TGF_P工表達部位局限於肝細胞槳，PDGF-BB、 TIMP-1表 達部位局限於肝竇，其餘各蛋白表達部位局限於匯管區和肝竇。鱉甲微粉預防組和治療組 與模型組無顯著差異，上述各蛋白表達較正常組顯著增強(P < 0.05-0. 01) ， TGF-h主要 表達在變性的肝細胞漿；NFk B p65主要表達在肝細胞漿，肝竇旁細胞、血管內皮細胞、膽管 上皮細胞和肌成纖維細胞也有表達；PDGF-BB、 TIMP-1主要表達在肝細胞漿，肝竇旁細胞和 肌成纖維細胞也有表達；匪P-13主要表達在肌成纖維細胞，肝竇旁細胞少量表達；a -SMA、 Col I、Col III、 Col IV、 LN主要表達在纖維間隔、肝竇壁、血管內皮細胞和膽管上皮細 胞，肝細胞漿少量表達。鱉甲水煎液預防組和治療組表達特點同模型組及鱉甲微粉組，但 匪P-13陽性細胞表達數量呈不同程度減少，其餘各蛋白表達面積和強度顯著減少和減弱 (P < 0. 05-0. 01)。
3.4肝組織氧化指標 鱉甲微粉預防組和治療組與模型組無顯著差異，與正常組相比，S0D、 GSH-Px顯著 下降(P < 0. 05-0. 01) ， MDA顯著上升(P < 0. 01);與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎 液預防組和治療組SOD、 GSH-Px顯著上升(P < 0. 01) ， MDA顯著下降(P < 0. 05-0. 01)。
3. 5血清肝功能、血脂、透明質酸指標 鱉甲微粉預防組和治療組與模型組無顯著差異，與正常組相比，血清總膽紅 素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)、鹼性磷酸酶(AKP) 、 r-穀氨醯轉肽酶 (r-GT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、透明質酸(HA)顯著上升，白蛋白(ALB)下降(P < 0. 05-0. 01)。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預防組和治療組TBIL、ALT、AST、 AKP、 r-GT、 TC、 TG、 HA顯著下降(P < 0. 05-0. 01)。
3.6透射電鏡檢查結果 鱉甲微粉預防組和治療組與模型組無明顯差異，肝細胞內可見大小不等脂滴，大 時可擠壓整個胞漿；線粒體腫脹，部分外膜破裂和嵴斷裂；粗面內質網脫顆粒，嚴重時線粒 體、內質網和溶酶體等細胞器均溶解消失；肝竇區肝星狀細胞增生，膠原產生增加；Disse 間隙消失，肝竇內皮細胞下基底膜形成。與模型組及鱉甲微粉組相比，鱉甲水煎液預防組和 治療組肝細胞內脂滴較小、少，上述病變較輕微。 實施試驗例4 :本發明的"體內實驗鱉甲水煎液對兩種肝纖維化大鼠模型的實驗 研究" 1.材料與方法
1.1動物雄性SD大鼠330隻，體重200g士20g，購自浙江省醫科院實驗動物中心。
1.2實驗用藥物 鱉甲微粉煎煮混懸液(煎煮1.5h)。注射用重組人Y-幹擾素，上海克隆生物高技
術有限公司產品[(98)衛藥準字(滬克隆)S-01號]，批號970521， 100萬IU/支，臨用前
以lml注射用水溶解。扶正化瘀膠囊，上海中醫藥大學肝病研究所研製，上海現代中醫藥技
術發展有限公司出品，批號國藥準字Z20020073、 Z20020074， 0. 5g/粒。 1.3大鼠分組及實驗步驟 1. 3. 1四氯化碳(CC14)大鼠肝纖維化模型組 四氯化碳(CC14)分析純購自武漢亞法生物技術有限公司，以食用色拉油配製成40%溶液。 190隻大鼠隨機分為10組正常對照組10隻，CC^模型對照組、鱉甲水煎液高、低
劑量預防組和治療組、扶正化瘀膠囊預防組和治療組、IFN-y預防組和治療組各20隻。除
正常對照組外，均給予40%(1:14 0. 30ml/100g體重背部皮下注射，2/周，共12周；正常對照
組給予等量等滲鹽水背部皮下注射。每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5隻觀察肝組
織病理改變。實驗第4周末，中等度肝纖維化形成(纖維隔形成並互相連接，深入小葉內，
小葉結構保留或紊亂，但無肝硬化)。藥物預防組於造模同期分別給以鱉甲微粉煎煮混懸液
(煎煮1.5h)1.8g生藥/100g體重灌胃、1/日(低劑量組)、2/日(高劑量組)，扶正化瘀膠
囊(內置藥粉用生理鹽水溶解)O. 046g生藥/100g體重灌胃、1/日，IFN-Y2.5萬IU/100g
體重肌肉注射，1/日；藥物治療組於造模第5周開始每日給以上述劑量藥物。正常對照組
與模型對照組給予生理鹽水lml/100g體重灌胃，1/日。實驗12周末，各組隨機取10隻大
鼠，2%戊巴比妥那麻醉後，心臟採血，分離血清備檢；冰等滲鹽水原位洗滌肝臟，分別用中
性10%甲醛、2. 5%戊二醛固定及-7(TC凍存備檢。 1.3.2 二甲基亞硝胺(DMN)大鼠肝纖維化模型組 二甲基亞硝胺(DMN)分析純購自天津市化學試劑研究所。 150隻大鼠隨機分為8組正常對照組10隻，DMN模型對照組、鱉甲水煎液預防組 和治療組、扶正化瘀膠囊預防組和治療組、IFN-y預防組和治療組各20隻。除正常對照 組外，均給予1% DMN10mg/kg體重腹腔內注射，共13次，實驗第1周連續用藥3日，1/日； 後5周每周連續用藥2日，1/日，共6周，每周末處死造模而未用藥物處理的大鼠5隻觀察 肝組織病理改變，直至中度肝纖維化形成。實驗第4周末，中度肝纖維化模型建成。藥物 處理預防組於造模同期直至實驗結束，鱉甲按1. 3. 1高劑量組每日劑量給藥，扶正化瘀膠 囊、IFN-y組每日給藥劑量同1.3.1;治療組於造模第5周開始給藥4周，實驗共8周。實 驗結束標本採集同1.3. 1。
1.4檢測指標
1.4. l病理檢查 肝組織標本用10%福馬林液固定24h取材，常規石蠟切片，切片厚度5um，HE染 色、天狼紅染色，光鏡觀察。試劑天狼紅(DIRECT RED 80)購自SIGMA公司。參照2002年 中華肝臟病學會肝纖維化學組制定的《肝纖維化診斷與療效評估供識》，將肝纖維化程度分 為0-4期(HE切片觀察)，按肝纖維化組織學半定量計分系統(SSS)標準計分(天狼紅切片 觀察)。 1.4.2免疫組化 肝組織標本用10%福馬林液固定24h取材，常規石蠟切片，切片厚度5um，免疫 組化染色採用POWERVISION 二步法，光鏡觀察。 一抗Col I、Col IV、LN、TMP-l、Smad 2/3、Smad 7抗體購自博士德公司(BA0325、 BA2170、 BA1399、 BA1761、 BA0575、 BA1395) ， TGF-P工、NF-k B、 Bax、 Bcl-2抗體購自Santa Cruz公司(1ot.A031、lot.C2008、lot.F1008、)，Co1 III、 a-SMA、PDGF_BB抗體購自ABCAM 公司(AB-59436、 Lot. 150745、 AB-21234) ， a-SMA和NF-k B —抗為鼠抗，其餘為兔抗。 POWERVISION試劑購自北京中杉金橋公司。步驟切片脫蠟至水，3% H202 (10min)阻斷內源 性過氧化物酶，PBS洗5minX3，Co1 I、Col IV、 Smad 7組滴加0. 1 %胰酶，Col III組滴加樹膠封片。
每次實驗均設PBS空白對照和正常血清取代一抗的陰性對照，觀察各蛋白的表 達，蛋白表達的定量結果採用LEICA QWIN圖像分析系統，每張切片在100倍鏡下取5個視 野，計算陽性面積百分比(％ ) ;TGF-l^、PDGF-BB、TIMP-l、Bax、Bcl-2表達的定量結果，每 張切片在400倍視野下，計數陽性細胞數。
1. 4. 3肝組織氧化指標、羥脯氨酸 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、羥脯氨酸 (Hyp)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 肝組織SOD、 GSH-Px酶活力檢測將10 %的肝勻漿，用生理鹽水稀釋成0. 25 %的 濃度，嚴格按S0D、GSH-Px測定試劑盒提供的方法操作，雙蒸水調零，分別於550nm波長下比 色、412nm處測各管光密度值(0D值)，計算公式分別為 「 ，組織屮soz)活力_對照管吸光度一測定管吸光度.5|;/"::反應液總體積.待測勻漿中蛋白
("/zngp加) = 玩照管吸光虔 '°X取樣量(W)'含量(w朋to〃/w/)
「01321組織G訓—P, —M^l^i^^寧x標準管濃度x稀釋倍數二反應吋f^(待測樣木蛋白含S取樣韻 酶活力 標準管09但-空白管0￡>值(20/wo〃i) (5*) 肝組織MDA檢測將10%的肝勻漿，離心10分鐘，取上清，嚴格按MDA測定試劑盒 提供的方法操作，雙蒸水調零，532nm處測各管吸光度值，計算公式為
組,、中AfZ^含量—測定管吸光度一對照管吸光度x標準品濃度 待測勻漿蛋白含量
("腳〃，嚴o,)—標準管吸光度-空白管吸光度X (10鵬o〃m/)—砂ro〃附/) 肝組織HYP測定(樣本鹼水解法)嚴格按HYP測定試劑盒提供的方法操作，將 10%的肝勻槳，離心10分鐘，取上清，550nm處，lcm光徑，雙蒸水調零，測各管吸光度值，計 算公式為
羥脯氨酸含量^_測定管吸光度一空白管吸光度x標準管含量x水解液總體積(w/) (收/mg溼重)—標準管吸光度一空白管吸光度X (5Mg/m/) X 組織重量—g) ~ 1. 4. 4血清肝功能、血脂、透明質酸指標 自動生化分析儀檢測肝功能及血脂；放免法檢測血清透明質酸，試劑盒購自上海 海軍醫學研究所，方法嚴格按試劑盒操作程序進行。
1.4. 5統計方法 實驗數據以；±s表示，進行方差分析和組間q檢驗，計數資料採用Ridit檢驗，P
<0. 05為差異具有顯著性意義。 2.結果 2. l病理檢查結果 HE染色，正常組大鼠肝組織結構清晰，肝細胞無脂肪變性等病變，匯管區未見纖維 組織增生及炎症細胞浸潤；天狼紅染色，正常組僅在匯管區及中央靜脈見少量纖維組織。
CC14模型對照組大鼠肝組織HE、天狼紅染色可見肝細胞重度脂肪變性，正常肝小 葉結構遭到破壞；匯管區、中央靜脈和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，並有淋巴細胞浸 潤，組織切片中有大量大小不等的假小葉形成；DMN模型對照組大鼠肝組織小葉結構不清，
14肝細胞索排列紊亂，肝細胞輕度水腫及脂肪變性，間質有淋巴細胞浸潤，匯管區及肝細胞間 有纖維組織增生，部分區域呈網狀分布。模型對照組肝纖維化分期、SSS計分較正常組顯 著增高(P<0.01)。與相應模型對照組相比，各藥物處理組上述病變有不同程度減輕，肝 小葉結構趨向正常，纖維間隔明顯變薄，纖維化分期、SSS計分顯著降低(P < 0. 05-0. 01)。 藥物處理組間比較，肝纖維化分期CC14模型組中，鱉甲治療組高劑量預防組較之扶正化瘀 膠囊、y-幹擾素相應處理組顯著降低(P<0.05) ;D麗模型組中，鱉甲預防、治療組較之 y-幹擾素相應處理組顯著降低(P<0.05)。 SSS計分CCl4模型組中，鱉甲預防組較之相 應劑量治療組，鱉甲預防、治療組較之扶正化瘀膠囊相應處理組，鱉甲治療組較之y-幹擾 素治療組顯著降低，P < 0. 05-0. 01。
2.2免疫組化結果 Col I、Col III、 Col IV、 a-SMA、Smad 7，陽性物質定位於纖維組織內，部分肝細 胞胞漿也有陽性表達；正常鼠肝僅在匯管區及中央靜脈壁見少量Col I、Col III、C01IV、 a -SMA陽性纖維，模型對照組在假小葉周圍及匯管區見大量陽性纖維、部分區域肝細胞間 也可見陽性纖維、部分肝細胞也有陽性表達。LN、Smad 2/3，陽性物質定位於肝竇內襯細胞 及炎性細胞胞漿內。TGF-13 ^PDGF-BB、TIMP-1，陽性物質主要定位於肝細胞胞漿內。
正常組肝臟a-SMA、天狼紅膠原染色、Col I、 Col III、 Col IV、 LN、 TGF-P ^ PDGF-BB低水平表達，TMP-1未見表達；模型對照組上述各蛋白表達較正常組顯著增強(P <0.01);各藥物處理組上述蛋白表達面積和強度較相應模型對照組顯著減少和減弱(P < 0. 05-0. 01)。藥物處理組間比較，天狼紅膠原染色表達CC14模型組中，鱉甲預防、治療 組較之扶正化瘀膠囊、y _幹擾素相應處理組，鱉甲高劑量預防、治療組較之低劑量相應處 理組，顯著減少和減弱，P < 0. 05-0. 01 ;DMN模型組中，鱉甲治療組較之y-幹擾素治療組 顯著減少和減弱(P < 0. 05) 。 Col I表達CCl4模型組中，鱉甲高劑量預防組較之低劑量 組、扶正化瘀膠囊、y-幹擾素預防組，鱉甲高劑量治療組較之y-幹擾素治療組，顯著減少 和減弱，P < 0. 05 ;DMN模型組中，鱉甲預防組較之治療組、扶正化瘀膠囊預防組，顯著減少 和減弱，P〈0.05。 Col III表達CCh模型組中，鱉甲預防組較y-幹擾素預防組、鱉甲 高劑量治療組較y-幹擾素治療組，顯著減少和減弱，P < 0.05。 LN表達CCh模型組中， 鱉甲高劑量預防組較之高劑量治療組顯著減少和減弱，P < 0. 05。 a -SMA表達CC14模型 組中，鱉甲高劑量預防組較之扶正化瘀膠囊、y-幹擾素預防組，鱉甲治療組較之y-幹擾 素治療組，顯著減少和減弱，P<0. 05-0.01 ;D麗模型組中，鱉甲預防組較之治療組，鱉甲 治療組較之扶正化瘀膠囊、y-幹擾素治療組，顯著減少和減弱，P〈0.05。 TGF-I^表達 CC14模型組中，鱉甲高劑量預防組較之高劑量治療組、低劑量預防組、扶正化瘀膠囊、y -幹 擾素預防組，鱉甲高劑量治療組較之扶正化瘀膠囊、y-幹擾素治療組，顯著減少和減弱，P <0. 05-0. 01。TGF-P i下遊信號通道蛋白Smad表達正常肝組織內有一定量Smad 7表達而 Smad 3較少；模型對照組較正常組Smad 3表達顯著增強(P < 0. 01);各藥物處理組較相應 模型對照組Smad 3表達顯著減少和減弱(P < 0. 05) ;CC14模型組中，鱉甲治療組Smad 3表 達較之扶正化瘀膠囊、y-幹擾素治療組顯著減少和減弱(P<0.05) ;CCl4模型組中，扶正 化瘀膠囊治療組較之模型對照組Smad 7表達顯著增強，P〈0. 05。TIMP-1表達CClJ莫型組 中，鱉甲高劑量預防組較之低劑量組，鱉甲低劑量預防組較之治療組，鱉甲高劑量治療組較 之低劑量組、扶正化瘀膠囊、y-幹擾素治療組，顯著減少和減弱，P〈0. 05-0.01 ;D^a莫型
15組中，鱉甲預防組較之治療組、扶正化瘀膠囊、y-幹擾素預防組，鱉甲治療組較之y-幹擾 素治療組，顯著減少和減弱，P < 0. 05。 Bax表達正常組未見表達；模型組主要表達在肝細 胞漿，其次在纖維間隔、肝竇和中央靜脈，模型組較正常組表達顯著增強(P<0.01) ;Bcl-2 表達正常組在肝細胞漿、肝竇和中央靜脈低水平表達，模型組主要表達在纖維間隔、匯管 區，其次在肝細胞漿、肝竇和中央靜脈，模型組較正常組顯著增強(P<0.01);各藥物處理
組較相應模型對照組顯著減少和減弱(P< 0.05-0. 01) ;CCl4模型組中，鱉甲高劑量預防組 較之高劑量治療組、低劑量預防組、扶正化瘀膠囊、y -幹擾素預防組，鱉甲治療組較之扶正 化瘀膠囊、y-幹擾素治療組，顯著減少和減弱，P < 0. 05-0. 01 ;Bax/Bcl-2比值CClJ莫型 組中，鱉甲高劑量預防組較之高劑量治療組、低劑量預防組、扶正化瘀膠囊、y-幹擾素預防 組，鱉甲治療組較之扶正化瘀膠囊、y-幹擾素治療組，顯著增高，P < 0. 05-0. 01。
2. 3肝組織氧化指標、羥脯氨酸檢測結果 模型組較之正常組，GSH-Px顯著下降，MDA、Hyp顯著上升，P < 0. 01。各藥物處理 組較之相應模型對照組，SOD、GSH-Px顯著上升，MDA、Hyp顯著下降，P < 0. 05-0. 01。 CC14模 型組中，鱉甲高劑量預防組，較之高劑量治療組GSH-Px顯著上升，較之鱉甲低劑量預防組、 扶正化瘀膠囊預防組Hyp顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲低劑量預防組較之低劑量治療組 GSH-Px顯著上升，P < 0. 05 ;鱉甲高劑量治療組較之扶正化瘀膠囊治療組MDA顯著下降，鱉 甲治療組較之扶正化瘀膠囊、y _幹擾素治療組，Hyp顯著下降，P〈 0.05。 DMN模型組中， 鱉甲預防組較之治療組、扶正化瘀膠囊預防組，GSH-Px顯著上升，P < 0. 01 ;鱉甲治療組較 之扶正化瘀膠囊治療組SOD、 GSH-Px顯著上升，較之y _幹擾素治療組GSH-Px顯著上升，P < 0. 05。 2. 4血清肝功能、血脂、透明質酸指標 模型組較之正常組TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA顯著上升，CC14模型對照組 TC、TG及DMN模型對照組TC較之正常組顯著上升，P < 0. 05-0. 01。各藥物處理組較之相應 模型對照組，TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;CC14模型組中， 鱉甲、y-幹擾素處理組較之模型對照組TC顯著下降，鱉甲預防組及扶正化瘀膠囊、y-幹 擾素處理組較之模型對照組TG顯著下降，P < 0. 05 ;D麗模型組中，鱉甲預防組、y _幹擾 素處理組較之模型對照組TC顯著下降，P < 0. 05。藥物處理組間比較，CC14模型組中，鱉甲 高劑量預防組，較之高劑量治療組TBIL、AKP、r-GT、TBA顯著下降，較之低劑量預防組TBIL、 ALT、AST、r-GT、TBA、HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊預防組TBIL、ALT、r-GT、TBA顯著下降， 較之y-幹擾素預防組TBIL、ALT、AST、r-GT、TBA顯著下降，P < 0.05-0. 01 ;鱉甲低劑量預 防組，較之低劑量治療組TBIL、 ALT、 AKP、 r_GT、 TBA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊、y _幹擾 素預防組TBA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲高劑量治療組，較之低劑量治療組ALT、r-GT、 TBA、 HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊治療組r-GT、 TBA、 HA顯著下降，較之y _幹擾素治療 組ALT、AST、r-GT、TBA顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲低劑量治療組，較之扶正化瘀膠囊治 療組TBA顯著下降，較之y-幹擾素治療組AST、 TBA顯著下降，P < 0.05-0. 01。 D麗模型 組中，鱉甲預防組，較之治療組AST、AKP、r-GT、HA顯著下降，較之扶正化瘀膠囊預防組TBIL 顯著下降，較之y _幹擾素預防組TBIL、 ALT、 AST顯著下降，P < 0. 05-0. 01 ;鱉甲治療組， 較之扶正化瘀膠囊治療組TBIL、 ALT、 r-GT顯著下降，較之y _幹擾素治療組TBIL、 ALT顯 著下降，P < 0. 05-0. 01。
16例3、4"討論 在肝纖維化形成發展過程中，肝星狀細胞(HSC)的"持續性"活化、增殖及大量 合成細胞外基質(ECM)是中心環節。a-平滑肌肌動球蛋白(ci-SMA)是活化HSC的特 異性標誌，且其表達強度與HSC激活程度、肝纖維化程度明顯正相關。HSC的激活過程， 是多種細胞因子旁分泌和自分泌協同作用的結果，其中起關鍵作用的因子是轉化生長因 子-13 i (TGF-13》和血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB) 。 TGF- P :被認為是最重要的促肝纖 維化因子，TGF-13 i及其II型受體(TGF-13 311)、以及TGF- P :信號通道蛋白Smad在肝纖維 化形成進展中起著重要作用；肝內TGF-13工與TGF- P ^11結合後，繼而活化TGF- P ^1，活性 TGF-I^RI的激酶區直接使Smad 2、3自動磷酸化，與共同介質型Smad 4形成異源寡聚體復 合物，該複合物隨即轉移到細胞核，介導TGF-I3工的生物學效應；TGF-P J秀髮肝纖維化的機 制主要包括活化HSC，並剌激肝竇內皮細胞、Kupffer細胞以及肝細胞等合成ECM，剌激HSC 等細胞合成分泌PDGF-BB等細胞因子並增強PDGFR等細胞因子受體表達進而促進PDGF-BB 等對HSC的增殖作用，同時，TGF-13工抑制MMPS而促進TIMPS合成分泌以阻礙膠原降解，抑制 肝細胞再生和誘導肝細胞凋亡，影響肝功能；而抑制型Smad 6、7是細胞中TGF_|3 型受 體拮抗蛋白，能牢固地與TGF-P 型受體結合，使之無法將Smad 2、3磷酸化而阻斷信號 轉導過程。PDGF-BB作為最強有絲分裂原，有顯著的促進HSC活化、分裂、增殖、合成膠原等 作用；上調TMPS而抑制MMPS活性，減少ECM降解。TGF- P :與PDGF-BB都以正反饋方式作 用於HSC活化通路的信號傳導，形成級聯放大效應，導致HSC的不斷激活和肝纖維化的發生 發展。 肝纖維化發生的中心環節為肝星狀細胞的廣泛激活，肝纖維化逆轉機理之一為活 化的肝星狀細胞(肌成纖維細胞，MFB)凋亡加強。Bcl-2是抗凋亡蛋白，主要通過防止線 粒體內釋放出凋亡因子(AIF、 Cytochrome C、 pro-caspase-2、-3、 _9等)來發揮抗凋亡作 用，是阻遏細胞凋亡的核心分子；Bax為促凋亡蛋白，主要通過與Bcl-2形成異二聚體，以使 Bcl-2滅活，由此決定具有活性的Bcl-2分子數，實現對細胞凋亡的調節。實驗發現Bax、 Bcl-2在模型組表達均顯著高於正常組，Bax表達增強提示肝細胞凋亡有所增強。Bcl-2在 纖維間隔區表達高於其他區域符合應激情況下Bcl-2表達加強有助於促進肝細胞存活、再 生的觀點。有研究報導，y-幹擾素對整個肝組織和纖維間隔中的Bax、Bcl-2的作用不同， 能抑制整個肝組織Bax、Bcl-2的表達但對Bax/Bcl-2比值(此比值被認為是一重要的凋亡 消長決定因素)無明顯作用，能顯著抑制纖維間隔(其中的細胞主要為MFB)的Bcl-2表達 但對Bax表達無明顯影響由此Bax/Bcl-2比值有上升趨勢，從而促進MFB凋亡，推測y-幹 擾素對肝中不同細胞的凋亡起不同的作用。本實驗結果顯示出藥物處理組類似的對MFB凋 亡的調節效應。 核因子-k B p65(NF-k B p65)是真核細胞基因轉錄中重要的調控因子，經有毒物 質氧化應激產物誘導激活後，通過調節靶基因表達，剌激細胞因子釋放而促進HSC活化，並 抑制HSC凋亡。 肝臟ECM的代謝主要由mPs及其抑制因子TMPS調節，MMPS促進ECM降解，而TMPS 通過抑制匪Ps從而阻止ECM的降解。多項研究表明，匪Ps在肝纖維化形成過程中變化複雜， 與病程、檢測方法、酶原、活化與結合狀態等因素有關；研究發現，增加膠原酶的數量不是影 響ECM降解的最主要因素，提高膠原酶活性可能對ECM的降解更有意義。TIMP工是最重要的
17基質金屬蛋白酶組織抑制因子，它可與活化的匪P-9，匪P-1及匪P-13等以1 : l的比例形 成複合物，使後者活性下降，造成ECM主要成分I 、 111型膠原降解減少、沉積增加，促進肝纖 維化的發展。 肝纖維化形成的自由基機制還認為，單純肝細胞損傷不足以誘導肝纖維化，氧化 應激和脂質過氧化是諸多病因引起肝損傷向肝纖維化發展的中間必經環節。脂質過氧化反 應的一系列醛類產物如丙二醛(MDA)等不僅可活化Kupffer細胞、釋放多種細胞因子繼而 激活HSC，還可直接剌激HSC活化增殖，轉化為肌成纖維樣細胞並大量合成膠原。實驗證實， HSC胞內氧化物含量與HSC活化水平正相關，而抗氧化劑如過氧化物歧化酶(SOD)、穀胱甘 肽過氧化物酶(GSH-Px)等則能抑制HSC的活化、增殖和膠原的沉積。 抑制HSC活化和促進MFB凋亡、減少膠原合成和促進膠原降解是逆轉肝纖維化的 關鍵，保護肝細胞結構和功能、抗氧化應激等為防治肝纖維化重要環節。
本發明實施試驗，採用抗肝纖維化研究的常用模型，CC14、 DMN分別誘導大鼠肝纖 維化，旨在從不同視角了解鱉甲對不同原因引起肝纖維化的預防治療作用(在觀察肝纖維 化模型的形成過程中，於染毒後每周各解剖5隻大鼠觀察肝組織病理改變，結果發現CCl4 組大鼠在肝纖維化形成前，肝臟病變以脂肪變性為主，而D^a且大鼠則以出血、壞死為主要 病理改變)。研究結果顯示，與模型對照組相比，鱉甲水煎液處理組能顯著改善肝纖維化大 鼠肝組織病理，抑制a-SMA、Col I、Col III、Col IV、 LN等表達，降低Hyp及血清HA ;下調 TGF-P p PDGF-BB，並作用於TGF_|3工下遊信號通道蛋白，抑制Smad 3等因子表達，提升肝 內Smad 7，從而作用於TGFU勺正、負反饋環路，在各階段阻斷TGF-h發揮病理作用；通 過抑制TIMP-1蛋白表達，有利於改善膠原酶活性，促進ECM降解；顯著抑制主要定位於纖 維間隔的Bcl-2的表達，對Bax的表達無明顯影響，Bax/Bcl-2的比值升高，推測可能是促 進MFB凋亡的作用機制之一 ；通過抑制NF- k B含量和活性及其所調控的細胞因子釋放，間 接抑制HSC的活化和增殖，促進活化HSC的凋亡；同時具有保護肝細胞、改善肝功能、抗氧化 應激等作用，顯著降低肝組織MDA水平，提高SOD、 GSH-Px活性，對於CC14、 D麗兩種肝纖維 化大鼠模型均具有明顯的預防和治療綜合效應，作用相當或優於公認有效的抗肝纖維化藥 物Y-幹擾素、扶正化瘀膠囊，預防組及高劑量組效果尤佳。研究結果同時表明，鱉甲微粉 藥液無抗大鼠肝纖維化藥理藥效學作用。從而進一步為歷來存在爭議的鱉甲臨床用藥的傳 統劑型提供了科學依據，驗證了其有效劑型——鱉甲水煎液抗肝纖維化的藥理作用，結合 課題組同期研究證實的鱉甲抗肝纖維化的藥效物質基礎為小分子肽類物質，認為鱉甲經煎 煮後，對肝星狀細胞活化增殖膠原合成起負抑制效應的大分子蛋白變性，變性蛋白質易受 胃腸道內多種水解酶類的協同催化作用而被消化，轉變為簡單的小分子肽類物質，符合發 揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標準及胺基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類 物質一起，共同發揮抑制肝星狀細胞活化增殖膠原合成、抗肝纖維化的作用。從而為藥食同 源的傳統中藥鱉甲用於抗肝纖維化臨床醫療、中藥新藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發 為肽類藥物奠定堅實基礎和提供科學依據。
權利要求
一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉；(2)將上述超微粉與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型；或(2)取鱉甲超微粉進行煎煮，煎煮1.5-5個小時，收集混懸液；將上述混懸液與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。
2. —種抗肝纖維化有效劑型的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1) 稱取常規研磨的鱉甲粉81—100份，加蒸餾水O. l-5份，超聲提取5—30分鐘，抽濾，濾渣再加蒸餾水0. 1-5份，超聲提取5—15分鐘，抽濾；合併兩次產生的濾液，冷凍乾燥後得凍乾粉；(2) 用加蒸餾水O. l-5份溶解上述製得的凍乾粉，將水溶液裝於3.500A半透膜內，置0. 2-5份蒸餾水中透析I一IO小時，溫度為2-l(TC;同法再透析一次，合併兩次膜外透析液，真空冷凍乾燥，收集A型凍乾粉0. 2-10份；(3) 取上述膜內液體，將膜袋置0. 2-10份蒸餾水中透析l一6小時，溫度為2-10°C ;同法透析三次，棄去膜外透析液，將膜內液體真空冷凍乾燥，收集B型凍乾粉1-20份；(4) 將上述A型凍乾粉或B型凍乾粉與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型。
全文摘要
一種抗肝纖維化有效劑型的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)鱉甲研粉，過八十目篩，氣流粉碎機處理，收集超微粉；(2)將上述超微粉與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型；或(2)取鱉甲超微粉進行煎煮，煎煮1.5-5個小時，收集混懸液；將上述混懸液與藥學上常規的賦形劑一起製成各種常規劑型；鱉甲經煎煮後，大分子蛋白變性，變性蛋白質易受胃腸道內多種水解酶類的協同催化作用而被消化，轉變為簡單的小分子肽類物質，符合發揮抗肝纖維化作用的肽段分子量標準及胺基酸序列，與鱉甲中原本存在的少量小分子肽類物質一起，共同發揮抗肝纖維化的作用；從而為藥食同源的傳統中藥鱉甲用於抗肝纖維化臨床醫療、中藥新藥及保健品研發、鱉甲活性物質開發為肽類藥物奠定堅實基礎和提供科學依據。
文檔編號A61P1/16GK101703523SQ20091015479
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月8日 優先權日2009年12月8日
發明者劉焱文, 張赤志, 邵志華, 高建蓉 申請人:浙江衢化醫院;湖北中醫學院;巨化集團公司