由蛇毒腺分泌的肽的藥物組合物製劑的製作方法
2023-10-05 00:27:34
專利名稱：由蛇毒腺分泌的肽的藥物組合物製劑的製作方法
技術領域：
本發明以用於開發在慢性退行性病變中的應用和/或相關產品的、由蛇毒腺特別是巴西具竅蝮蛇(Bothrops Jararaca)分泌的肽即血管肽酶(vasopeptidase)抑制劑肽Evasins、其類似物、衍生物的藥物組合物及相關產品的製備方法為特徵。
本發明的特徵還在於包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥理學上可接受的載體和/或賦形劑中的血管肽酶抑制劑肽即Evasins肽及其結構和/或構象類似物和衍生物的藥物組合物和/或相關產品。本發明的另一個特徵在於包含或不包含在環糊精中的Evasins、其類似物及衍生物在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物及其混合物中的微囊化。
本專利中所主張的藥物組合物包括單獨或者混合或結合了至少一種藥理學活性製劑的、包含在環糊精或其衍生物中的Evasins、或者結合或包含在載體和/或藥理學上可接受的賦形劑中的Evasins；或者在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否的、包含或不包含在環糊精中的Evasins。
本發明也包括鑑定在慢性退行性病變的研究和治療中具有應用的Evasins的其它生物化學作用機制。
除Evasin 7a之外，Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物以對中性內肽酶(微摩爾級的Ki)和血管緊張素I轉換酶(納摩爾級的Ki)不同的抑制活性為特徵。其中，這些藥物組合物另一個特徵在於當包含在環糊精或其衍生物中時，Evasins效應的生物可處理性(biodisponibility)、持續時間和/或效力增大。
其中，當作為非限制性的實例通過口服或靜脈路徑給予時，所述藥物組合物提供了包含在環糊精或其衍生物中的Evasins增大的生物可處理性、持續時間和/或效力。
在世界上的多數國家中，15％到25％的成年人口經歷高血壓(MacMahon，S.等Blood pressure，stroke，and coronary heart disease，Lancet335765-774，1990)。心血管風險隨著血壓水平一起增加。血壓越高，中風和冠狀動脈事件的風險越高。高血壓被視作冠狀動脈、顱腦和腎臟血管病的主要風險因子，是導致成人死亡和傷殘的主要原因。
世界範圍內，心力衰竭是導致60到80歲年齡的患者入院的主要原因。人口自身老齡化構成了發生率增大的因素，儘管1％從25到54歲年齡的個體經歷心力衰竭，然而在年長的個體中，此發生率高得多，對於超過75歲的那些，達到了大約10％(Kannel，W.B.等Changingepidemiological features of cardiac failure，Br.Hear J 1994；72(suppl)S3-S9)。
依照其臨床性徵，心力衰竭為極限性的疾病；當惡化時，患者的生活質量下降，而在更為晚期的病例中，它具有惡性疾病的特徵，第一年的死亡率水平超出60％，甚至現今也是如此(Oliveira，M.T.Características clínicas e prognóstico de pacientes cominsuficência cardíaca congestiva avancada，Faculdade de Medicina，USP 1999)。據當前估計工業社會中多於1500萬的人患有此病；例如，僅在美國，據估計病例的數目自1973到1990年間增長了450％(Kannel，W.B.等Changing epidemiological features of cardiac failure，Br.Hear J 1994；72(suppl 3)S3-S9)。
高血壓是複雜、多因素並且是非常普遍的疾病，是造成多種毒副作用以及高發病率/死亡率的原因(Kaplan，N.M.Blood pressure as acardiovascular risk factorprevention and treatment.JAMA.2751571-1576，1996)。業已在一般人群和特定組別中進行了許多關於評價其控制效力的研究，旨在獲得更好的理解。沒有廣泛的相關風險因子(糖尿病、肥胖、吸菸)的非藥物和/或藥物幹預的血壓控制可能降低或者甚至消除通常由冠狀動脈疾病所致的血液高血壓長期治療的關乎死亡率減小的益處(Wilson，P.W.等Hypertension，the riskfactors and the risk of cardiovascular disease.Raven Press.94-114)。
高血壓是心血管動脈硬化症主要的促成因素(The fifth Report ofthe Joint National Committee on detection，evaluation，andtreatment of High Blood Pressure.National Institute of Health(VJNC).Arch.Intern.Med.153154-181，1994)。依據統計，每4個美國人中就有1人為或者將成為高血壓患者；據估計478萬人經歷心力衰竭。每年診斷出40萬個新病例，導致80萬人入院；治療花費178億美元。
在巴西，來自SUS[聯合衛生體系]的數據顯示1997年心力衰竭是導致心臟病住院治療的主因；政府在治療上花費R$1億5000萬，此金額相當於衛生開支的4.6％(Filho，Albanesi F.Insuficiênciacardíaca no Brasil.Arq.Bras.Cardiol，71561-562，1998)。
在生理和病理條件下，腎素-血管緊張素系統(RAS)都負責調節血壓、心血管穩態和水電解質平衡(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade，S.P.Angiotens in-(1-7)an update.RegulatoryPeptides，9145-62，2000)。血管緊張素II(Ang II)是RAS的主要效應肽，具有血管加壓、腎上腺類固醇合成刺激、增生(成纖維細胞、血管平滑肌)和肥大(心肌炎)作用。其形成路徑包括肝臟中血管緊張素原的產生以及justaglomerular系統中腎素的產生。這些物質釋放在血流中，在這裡血管緊張素為腎素水解，從而形成Ang I，當處於肺中時，其將經歷血管緊張素轉換酶(ACE)的作用並產生Ang II。Ang II反過來將作用於遠離其產生部位的靶器官(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade，S.P.Angiotensin-(1-7)anupdate.Regulatory Peptides，9145-62，2000)。
最近發現，除了產生循環Ang II的系統之外，不同的組織含獨立的Ang II產生RAS系統，顯然是局部作用的。組織RAS組分見於血管壁、子宮、胰腺的外分泌部分、眼睛、心臟、腎上腺皮質、睪丸、卵巢、腦下垂體前葉和間葉、松果體以及腦。這些組織SRA的功能尚不十分清楚(Ardaillou，R.；Michel，J.B.The relative roles of circulatingand tissue renin-angiotensin systems.Nephrol.Dial.Transplant.，14283-286，1999)。RAS的局部作用可能發生在產肽的細胞中(內部分泌和自分泌功能)、鄰近的細胞上(旁分泌功能)或在遠離產生部位的位置上(內分泌功能)。
近來的評論表明RAS重要的外圍和中心作用可由更小的血管緊張素肽序列介導，包括Ang III[Ang-(2-8)]、Ang IV[Ang-(3-8)]和Ang-(1-7)。我們可以認為Ang I[Ang-(1-10)]和Ang II[Ang-(1-8)]都可經歷生物轉化過程，從而產生了生物學活性的血管緊張素肽「家族」(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade，S.P.Angiotensin-(1-7)an update.Regulatory Peptides，9145-62，2000)。
Ang-(1-7)連同Ang II是主要的RAS效應因子。兩個重要的特點將Ang-(1-7)與Ang II區分開來第一個具有高度特異性的生物學作用，且其形成路徑不依賴於ACE(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade，S.P.Angiotensin-(1-7)an update.RegulatoryPeptides，9145-62，2000)。Evasins通過增大Ang I的濃度並通過抑制ACE減小其代謝，將有利於Ang-(1-7)的形成。
治療高血壓的首要目的不僅在於減小開支，而且在於通過改變生活質量以及需要時藥物的使用來預防靶器官的損傷(The Fifth Reportof The Joint National Committee on detection，evaluation，andtreatment of High Blood Pressure.National Institute of Health(VJNC).Arch.Intern.Med.153154-181，1994)。
萬一在為期3至6個月的生活方式改變之後無應答，還有萬一靶器官受損，則指示了藥物治療(左心室肥大、心肌局部缺血、中風或高血壓性視網膜病)。表現出收縮壓超出160mmHg或舒張壓超出100mmHg的所有患者都應當進行藥理學治療，而不論其它因素是否存在或不存在(Report the Canadian Hypertension Society.Consensus Conference.3.Pharmacological treatment of essential hypertension.Xan.Med.Assoc.J.149(3)575-584，1993)。
不過，在70年代和80年代期間，抗高血壓藥成為高血壓治療中的重要工具(Ménard，J.Anthology of renin-angiotensin systemA onehundred reference approach to angiotensin II antagonist.J.Hypertension 11(suppl 3)S3-S11，1993)。在最近的四十年間，藥理學研究產生了新型的治療高血壓的藥物60年代期間的利尿劑，70年代的β-阻滯劑，鈣通道阻滯劑，血管緊張素I I受體拮抗劑以及血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑。
利尿劑可劃分為三類噻嗪類、袢利尿劑以及瀦鉀利尿劑。噻嗪類等包括氯噻嗪和氫氯噻嗪，其在治療第一天內使血壓降低大約10到15％，此降低與二代胞外容積的下降以及利尿和利尿鈉的增強有關。然後，在6個月後，血漿容量和心搏量回復正常值，而血壓的下降與周圍血管阻力的下降有關(Frolich，E.Current approaches in thetreatment of hypertension，405-469)。它們常用作為單一療法，在黑人患者以及低劑量時在老年患者中表現出提高的應答。發現如下的副作用對胰島素的外周抗性增加、甘油三酸酯增加、LDL增加、低血鈣症、高尿酸血。速尿(Furosemide)、布美他尼(Bumetamide)和氨苯蝶啶(Trianterene)在袢利尿劑中表現出比噻嗪類利尿藥更高的效力。它們主要地作用於亨利氏袢的髓質和皮質部分。它們表現噻嗪類利尿劑相同的副作用。瀦鉀利尿劑是具有微弱利尿作用的藥物，很少單獨使用。其中，可舉出的有阿米洛利(Amiloride)、氨苯蝶啶(Trianterene)和螺內酯(Spirolactone)。
β-阻滯劑，包括阿替洛爾(Atenolol)和Naolol在內，被分類為β-1和β-2。抗高血壓作用的機制尚不完全清楚，不過，這基本上得到了β-阻滯劑抑制突觸前β受體，從而防止去甲腎上腺素的釋放的證據的支持。副作用包括通過降低腎流，對胰島素的應答改變，低血糖昏迷延長，甘油三酸酯增加以及肌酸酐增加。
鈣通道阻滯劑已用了至少25年(Frolich，E.D.CurrentApproaches in the Treatment of Hypertension，405-469，1994)。根據其藥理學作用，它們可被劃分為兩大類對於刺激傳導具有增強作用的那些阻滯劑如異搏定(Verapamil)和地爾硫卓(Diltiazem)，以及具有突出的血管擴張作用的那些阻滯劑如二氫吡啶衍生物(硝苯地平(Nifedipine)等)(Frolich，E.D.，Hypertension.Adult ClinicalCardiology Self Assessment Program(ACCSAP)，63-19，1995)。副作用包括下肢浮腫和心動過速。
轉換酶抑制劑主要地通過抑制血管緊張素I轉換為血管緊張素II而起作用。因而，本質上使得血管緊張素II的血管收縮作用最小化。初步研究表明第一個臨床使用的抑制劑壬肽抗壓素(Evasin-9a)當靜脈內給藥時具有抗高血壓活性，然而當口服給予時，它是無活性的，因此限制了其用途。我們目前已知ACE是具有多重作用的酶，也就是說，它作用於數個底物。除了作為二肽酶作用於血管緊張素I和緩激肽，它也能夠破壞利尿鈉肽的肽鏈，表明該酶能夠作用於若干組織。ACE在循環及組織Ang-(1-7)的失活中也具有重要作用。這種循環肽的濃度類似於Ang II的濃度並在ACE抑制後上升。這種上升可以是前體(Ang I)增加以及ACE降解下降的結果(Santos，R.A.S.；Campagnole-Santos，M.J.；Andrade，S.P.Angiotensin-(1-7)an update.RegulatoryPeptides，9145-62，2000)。
現有技術中找到如下涉及奧帕曲拉(omapatrilat)活性的專利US2002013307-A1，Kothari和Desai；US2002004500-A1(WO200174348-A2，AU200187289-A)，Bristol-Myers Squibb Co(BRIM)和Reeves等；US6166227-A(WO200003981-A2，AU9948528-A)，Bristol-Myers Squibb Co(BRIM)和Godfrey等。然而，該血管肽酶抑制劑化合物及其類似物因為對中性內肽酶(NEP)的高抑制活性而表現出相關副作用(血管性水腫和咳嗽)。
當作為單一療法給藥時，ACEI很出色，因為ACE抑制劑導致60到70％的高血壓患者血壓相對快速地降低(Ganong，W.Neuropeptides incardiovascular control.J.Hypertens 2(suppl 3)15-22，1984)。它們一般可被很好地耐受，然而其使用可能導致副作用和不良反應，其中有些相對嚴重，並且包括血管神經性水腫、皮疹和乾咳(8到10％)、血液不凝以及陽痿。
血管緊張素I轉換酶抑制劑或血管肽酶抑制劑業已用於或建議用於預防或治療許多疾病，包括腫瘤、急性心肌梗塞、中風、左心室肥大、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心肌梗死和動脈粥樣硬化後的心絞痛和漸進性心力衰竭、糖尿病和血管發生(Yasumaru M，Tsuji S，TsujiiM，Irie T，Komori M，Kimura A，Nishida T，Kakiuchi Y，Kawai N，Murata H，Horimoto M，Sasaki Y，Hayashi N，Kawano S，HoriInhibition of angiotensin II activity enhanced the antitumoreffect of cyclooxygenase-2inhibitors via insulin-like growthfactor I receptor pathway；Cancer Res.2003 Oct 15；63(20)6726-34；Kinuya S，Yokoyama K，Kawashima A，Hiramatsu T，Konishi S，ShukeN，Watanabe N，Takayama T，Michigishi T，Tonami N.Pharmacologicintervention with angiotensin II and kininase inhibitor enhancedefficacy of radioimmunotherapy in human colon cancerxenografts.J Nucl Med.2000 Jul；41(7)1244-9.；Volpert OV，WardWF，Lingen MW，Chesler L，Solt DB，Johnson MD，Molteni A，Polverini PJ，Bouck NP.Captopril inhibits angiogenesis and slowsthe growth of experimental tumors in rats.J Clin Invest.1996Aug1；98(3)671-9.；Kowalski J，Herman ZS.Captopril augmentsantitumor activity of cyclophosphamide in mice.Pol J Pharmacol.1996May-Jun；48(3)281-5.；Kowalski J，Belowski D，Madej A，Herman ZS.Effects of thiorphan，bestatin and captopril on theLewis lung carcinoma metastases in mice.Pol J Pharmacol.1995Sep-Oct；47(5)423-7.；Kowalski J，Belowski D，Wielgus J，GabryelB，Klin M，Herman ZS.Effect of captopril and thiorphan on theproliferation of human neoplastic cell lines and their influenceon cytostatic activity of interferon alpha or cytotoxic activityof doxorubicin.Arch Immunol Ther Exp(Warsz).1995；43(1)47-50。然而，現有技術中尚未發現任何要求保護應用於退行性變慢性病研究和治療的包含在環糊精中或否的、與藥理學上可接受的載體或賦形劑配製的Evasins的藥物組合物的專利。
開發Ang II拮抗劑的首次嘗試始於70年代初，且集中於Ang II-類似肽的開發。首先是肌丙抗增壓素(saralasin)，即1-肌氨酸，8-異亮氨酸血管緊張素II，然後是其它肽。然而，它們不為臨床所接受，因為它們表現出部分激動劑活性。1982年，開發出了頭兩個AT1受體和非肽拮抗劑(S-8307和S-8308)，但，儘管具有高特異性且無激動劑活性，表現出對Ang II受體的弱結合。在這兩個母體化合物的分子結構歷經數次改變旨在改善強度、保持選擇性和實現藥代動力學性能之後，開發出了新的強效且高特異性的口服產品即洛沙坦(Losartan)。自那以後，開發出了若干其它非肽拮抗劑，如坎地沙坦(landesartan)、依貝沙坦(Irbesartan)、纈沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan)、依普沙坦(Eprosartan)、他索沙坦(Tasosartan)和佐拉沙坦(Zolasartan)。本發明的藥物組合物和製劑以使用藥學上組合的且可接受的賦形劑、Evasins及類似物的混合物為特徵。製劑可用賦形劑或其混合物製備。賦形劑的實例包括水、生理鹽水、磷酸緩衝液、Ringer’s液、葡萄糖液、Hank’s液、含聚乙二醇與否的生物相容性鹽溶液。其它有用的製劑包括增粘劑，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。賦形劑液可以含有低量的添加劑，如提高等滲性和化學穩定性的物質或緩衝液。緩衝液的實例包括磷酸緩衝液、碳酸氫鹽緩衝液和Tris緩衝液；防腐劑的實例包括硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福馬林和苯甲醇。標準試劑可以是液體或固體。從而，在非液體製劑中，賦形劑可包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐劑等，給藥前可向其中加入水或無菌生理鹽水。
本發明還以製備含Evasins、其類似物及衍生物的控釋系統為特徵。滿意的控釋系統包括但不限於，環糊精、生物相容性的聚合物、生物可降解的聚合物、其它聚合物基質、膠囊、微膠囊、微粒、丸劑、滲透泵、擴散裝置、脂質體、脂球體以及經皮給藥系統。本發明的其它控釋組合物包括在向動物給藥後原位形成固體和凝膠的液體。
US4598070(CA1215359，DK356684，EP135044，ES8506757，GR82322，JP60025967)Mashiro，Kawahara等(1986)建立了涉及Tripudine(抗高血壓藥)和環糊精(α-環糊精及β-環糊精)之間的包含化合物的發明。曲帕胺在水中微溶，從而使用環糊精允許獲得更為可溶的化合物。該發明也採用了一些表徵技術，例如差異掃描量熱法(DSC)和X-射線衍射。
US 4666705De Crosta，Mark.T.等(1987)報導了基於高血壓藥控釋的發明。使用的是卡託普利，一種ACE抑制劑(非肽類活性定點ACE抑制劑)，因為該抑制劑表現出快速吸收和2小時的半壽期。為了延緩釋放，該發明建立在含卡託普利連同聚合物或共聚物的片劑的基礎上。所用的聚合物為聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，且技術為幹法制粒。所獲得的結果是藥物在體內的留置時間增長(4到16小時)。
US5519012Fercej-Temeljoov，Darja等(1996)建立了基於抗高血壓藥即1，4-二氫吡啶和甲基-(β-環糊精及其它衍生物如(羥基化β-環糊精)的新包含化合物的發明。
US 5728402Chen，Chih-Ming等(1998)公開了基於通過包含由卡託普利和水凝膠組成的內相以及另一外層胃中不可溶相的藥物組合物的方式控釋藥物的發明。該發明旨在提高藥物的吸收時間，當單獨給藥時，其為1小時。
US 5834432(AU5990796，CA2221730，EP0828505，WO09639164，JP115073625)Rodgers，Katlen Elizabeth等(1998)使用AT2受體激動劑以加速創傷治癒。
US6087386(WO9749392A1)Chen，Tzyy-Show H.等(2000)公開了存在於含依那普利(ACE抑制劑)和洛沙坦(AII拮抗劑)的藥物組合物中的發明，其包括一層洛沙坦鉀和另一層依那普利馬來酸鹽。該發明旨在改善藥理學作用，減小副作用以及提高吸收時間。
US6178349 Kieval，Roberts S.等(2001)建立了基於通過神經刺激釋放藥物用於治療心血管疾病的裝置。該裝置包括與神經相連的電極，可植入的脈衝發生器以及包含待給藥物的貯器。使用期間，電極和藥物釋放刺激神經，其反過來又影響對心血管系統的控制。
藥物可經化學修飾以釋放其性能，例如生物分布、藥代動力學和溶解度。業已使用多種方法來提高藥物的溶解度和穩定性，包括使用有機溶劑、乳化劑、脂質體、pH調整、化學變化以及藥物與合適膠囊劑如環糊精、脂質體的複合和在生物可降解聚合物中的微囊化。
環糊精由Vilers於1891年作為受軟化芽孢桿菌(Bacillusmacerans)澱粉酶作用的澱粉降解產物首次分離。1904年，Schardinger將其表徵為環狀寡糖。1938年，Frudenberg等報導環糊精包含通過(α1→4)鍵合相連的葡萄糖單位。1948年，Freudenberg及同事觀察到環糊精能夠形成包含化合物或複合物，並且後來如French等製備了純環糊精的合成方法。自1954年起，Cramer等對環糊精與其它化合物的複合物的形成進行了系統研究。從1955到1960年，進行了有關環糊精與藥物的包含化合物形成的首例研究。這些研究正在日本、匈牙利、法國、義大利及其它國家深入地持續著。
環糊精是通過澱粉的酶促降解獲得的。所述方法包括如下階段酶的生產和純化，澱粉的酶促轉化，以及環糊精的回收和分離。所涉及的酶為環糊精糖基轉移酶(CGT)。該酶是從數種微生物得到的，但主要是軟化芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stereothermophilus)以及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(Korolkovas，A. molecular e cyclodextrinaspropriedades e terapêuticas．ENLACE Farmalab，2/91，Ano 5，Vol.II，p.6-15)。
環糊精為包括6、7或者8個glucopiranose單位的環狀寡糖。由於空間相互作用，環糊精即CDs形成具有內部非極性腔的截頂圓錐體形狀的環狀結構。它包括可被區域選擇性地修飾的化學上穩定的化合物。環糊精(主體)與多種疏水分子(客體物質)形成複合物，完全或部分地將其包含在腔中。如Szejtli，J.，Chemica1 Reviews，(1998)，98，1743-1753.Szejtli，J.，J.Mater.Chem.，(1997)，7，575-587所述，CDs業已用於藥物、香水及芳香劑的增溶和封裝。根據[Rajewski，R.A.，Stella，V.，J.Pharmaceutical Sciences，(1996)，85，1142-1169]中描述的對環糊精詳細的毒性、誘變性、致畸性和致癌性研究，它們具有低毒性，尤其是羥丙基-(-環糊精，如Szejtli，J.CyclodextrinsProperties and applications.Drug Investig.，2(suppl.4)11-21，1990中所報導的那樣。要不是高濃度的有些衍生物破壞紅血球，這些產品一般不構成健康風險。將環糊精作為食品中添加劑使用已在諸如日本和匈牙利等國家中得到批准，而在法國和丹麥可用於更多的具體應用。所有這些特徵都意味著漸增的發現新應用的動機。
除環糊精之外，也使用生物可降解的聚合物，其通過控釋裝置降低體內的藥物吸收速度。在這些系統中，藥物被摻入到聚合物基質中，它是藥物在微球體或納米球體中封裝時建立起來的，所述微球體或納米球體在體內成日、成月或者甚至成年地以小且可控的日常劑量釋放藥物。
早已在控釋系統中試驗過多種聚合物。它們中有許多是其物理性能的函數，例如聚(氨基甲酸酯)是由於其彈性，聚(矽氧烷)或矽樹脂為良好的分離劑，聚(甲基-甲基丙烯酸酯)是由於其物理強度，聚(乙烯醇)是由於其疏水性和阻力，聚(乙烯)是因為其硬度和不滲透性(Gilding，D.K.Biodegradable polymers.Biocompat.Clin.Implat.Mater.2209-232，1981)。
然而，為用於人類，材料應當是化學惰性的且不含雜質。釋放系統中使用的有些材料包括聚(2-羥基-乙基甲基丙烯酸酯)，聚丙烯醯胺，基於乳酸的聚合物(PLA)和基於乙醇酸的聚合物(PGA)以及相應的共聚物(PLGA)，以及聚(酸酐)，例如基於癸二酸的聚合物(PSA)以及與疏水聚合物的共聚物。
現有技術涉及多個關於製備脂質體的專利[美國專利4,552,803，Lenk；美國專利4,310,506，Baldeschwieler；美國專利4,235,871，Papahadjopoulos；美國專利4,224,179，Schneider；美國專利4,078,052，Papahadjopoulos；美國專利4,394,372，Alfaiate；美國專利4,308,166，Marchetti；美國專利4,485,054，Mezei；以及美國專利4,508,703，Redziniak；Woodle和Papahadjopoulos，MethodsEnzymol.171193-215(1989)]。
單層脂質體具有單層膜，其含有水性容積[Huang，Biochemistry8334-352(1969)]，而多層脂質體具有若干層同心膜[Bangham et Col.，J.Mol.Biol.13238-252(1965)]。基於脂質體的載體被提出用於許多種藥理學活性的物質，包括抗生素、激素和抗腫瘤製劑[Medicalapplications of liposomes(D.D.Lasic，D.Papahadjopoulos Ed.)，Elsevier Science B.V.，Holland，1998]。
已在現有技術中找到脂質體的其它製備方法[有關綜述，參見例如Cullis等，inLiposomes，From Biophysics to Therapeutics(M.Ostro，ed.)，Marcel Dekker(New York)，1987，pp.39-72；Woodle和Papahadjopoulos，Methods Enzymol.171193-215(1989)；Liposome technology(G.Gregoriadis ed.)，CRC Press，Boca Raton，FL，1993]。
Bangham的方法[J.Mol.Biol.13238-252(1965)]產生「普通的多層脂質體」(MLVs)。該「普通」MLVs在水性區室間可具有不等的溶質分布，從而在所述區室間表現出滲透壓差異。Lenk et Col.(美國專利4,522,803；US 5,030,453和US 5,169,637)、Fountain等(美國專利4,588,578)、Cullis等(美國專利4,975,282)以及Gregoriadis等(專利WO99/65465)發現了用於製備在區室間具有基本上相等的溶質分布的多層脂質體的方法。不同區室間相等的溶質分布意味著更大的藥物封裝效率，以及更低的滲透壓差異，於是使得這些MLVs比普通MLVs更為穩定。
單層脂質體可通過MLVs的超聲處理[見Paphadjopoulos等(1968)]或通過經由聚碳酸酯膜擠出[Cullis et Col.(美國專利5,008,050)和Loughrey et Col.(美國專利5,059,421)]生產。例如，滿意的脂質包括磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、心磷脂、膽固醇、磷脂酸、鞘脂、糖脂、脂肪酸、固醇、磷脂醯乙醇胺、其公認的聚合或非聚合形式的可聚合磷脂、以及它們的混合物。
本發明的脂質體組合物以囊泡的修飾為特徵，從而提供針對器官或細胞的特異性。脂質體定向基於解剖學因素和所涉及的機制而分類。解剖學分類是建立在例如器官特異、細胞特異或細胞器特異的選擇性水平的基礎上的。從機制的觀點來看，定向可歸類為被動或主動。
被動定向利用了傳統脂質體為含竇狀毛細血管(sinusoidalcapillaries)的器官中網狀內皮系統的細胞所俘獲的天然傾向。本發明的脂質體是作為改善的藥物載體通過(LEE)法在空間上建立的(也稱之為「PEG-脂質體」)，這是因為其在血流中的清除速度下降[Lasic和Martin，Stealth Liposomes，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Fla.(1995)]。LEE為脂質體，其表面覆蓋有聚合物，該聚合物優選為聚乙二醇(PEG)，與其中一個磷脂共價綴合，並在囊泡雙層外側產生疏水雲團。該位阻屏障延緩了調理素對脂質體的識別，並允許LEE在血流中保留比傳統脂質體更長的時間[Lasic和Martin，Stealth Liposomes，CRCPress，Inc.，Boca Raton，Fla.(1995)；Woodle et Col.，Biochim.Biophys.Acta 1105193-200(1992)；Litzinger et Col.，Biochim.Biophys.Acta 119099-107(1994)；Bedu Addo，et Col.，Pharm.Res.13718-724(1996)]，且提高了封裝製劑的藥理學功效，如有些化療藥物[Lasic和Martin，Cautela Liposomes，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Fla.(1995)]以及生物活性肽[Allen T.M.InLiposomes，New Systems，New Trends in their Applications(F.Puisieux，P.Couvreur，J.Delattre，J.-P.Devissaguet Ed.)，Editions de la Santé， 1995，pp.125]所顯示的那樣。
該領域的研究證明不同的因素影響LEE的循環半壽期，並且理想地，囊泡直徑應當低於200nm，其中5％比例的PEG具有大約2,000Da的分子量[Lasic和Martin，Cautela Liposomes，CRC Press，Inc.，BocaRaton，Fla.(1995)；Woodle et Col.，Biochim.Biophys.Acta1105193-200(1992)；Litzinger et Col.，Biochim.Biophys.Acta119099-107(1994)；Bedu Addo et Col，Pharm.Res.13718-724(1996)]。
主動定向涉及通過其與結合劑如單克隆抗體、糖、糖脂、蛋白、聚合物的結合改變脂質體，或者通過改變脂質體的組成或大小以使之定向於不同於傳統脂質體積聚部位的器官和細胞。例如，參見Remington′sPharmaceutical Sciences，Gannaro，A.R.，ed.，Mack Publishing，18th edition，pp.1691-1693。
現有脂質體應用技術中見到的延長肽效應的實例是製備含Ang-(1-7)(LAng)的脂質體，單側微注射(到吻腹側髓質(RVLM))。自4天前起始到12天後結束，通過遙測每10分鐘對自由運動的鎮定大鼠測量血壓10秒鐘。LAng微注射在上午階段產生顯著的增壓效應，並維持5天。在第3天測量到最高的MBP(114±4mmHg)，其顯著有別於第0天所測量到的(100±3mmHg)。正如所預期的那樣，Lvaz中MBP並不顯著改變(第3天的94±5mmHg相對於第0天的90±5mmHg)。另外，在第1、2和3天，Lang組中的上午MBP顯著高於Lvaz組。與上午MBP相反，夜晚MBP並不顯著受LAng微注射的影響。早先的研究(Fontes MA，Pinge MC，Naves V，Campagnole-Santos MJ，Lopes OU，Khosla MC，Santos RAS Cardiovascular effects produced bymicroinjection of angiotensins and angiotensin antagonists intothe ventrolateral medulla of freely moving rats.Brain Res.1997Mar 7；750(1-2)305-10)確定在BRVL側微注射相似劑量(25到50ng)的游離Ang-(1-7)(未封裝)，導致大約10分鐘的15mmHg的增加。此效應的短時長度是由於肽在體內的高度代謝[Silva-Barcellos et Col.，Hypertension，38(6)1266-71(2001)。
本發明以使用見於巴西具竅蝮蛇毒液和組織中的至少21個緩激肽增強肽(通常稱為BPPs或緩激肽增強肽)為特徵，其胺基酸序列已通過質譜確定或已由在此蛇的非毒腺組織中表達的這些分子的母體化合物的cDNA推斷(稱為Evasins或內源血管肽酶抑制劑)。
命名序列ID 1EVASIN-5a＜EKWAPID 2EVASIN-5b＜EWPRP
ID 3EVASIN-5c ＜EKFAPID 4EVASIN-6a ＜ESWPGPID 5EVASIN-7a ＜EDGPIPPID 6EVASIN-9a ＜EWPRPQIPPID 7EVASIN-9b ＜ESWPGNIPPID 8EVASIN-10a＜ESWPGPNIPPID 9EVASIN-10b＜ENWPRPQIPPID 10 EVASIN-10c＜ENWPHPQIPPID 11 EVASIN-10d＜ESWPEPNIPPID 12 EVASIN-11a＜EWPRPTPQIPPID 13 EVASIN-11b＜EGRAPGPPIPPID 14 EVASIN-11c＜EGRAPHPPIPPID 15 EVASIN-11d＜EGRPPGPPIPPID 16 EVASIN-11eEARPPHPPIPPID 17 EVASIN-12a＜EGWAWPRPQIPPID 18 EVASIN-12b＜EWGRPPGPPIPPID 19 EVASIN-13a＜EGGWPRPGPEIPPID 20 EVASIN-13b＜EGGLPRPGPEIPPID 21 EVASIN-13c＜EGGWPRPGPQIPP這些肽多數具有C-末端PX1X2PP結構基序，其中X1可以是任何胺基酸，而X2典型地是異亮氨酸(I)殘基，且N-末端胺基酸通常是因焦穀氨酸(＜E)的存在而被封閉。相應的合成肽被測試為重組ACE的C位點和N位點抑制劑，並且是由豚鼠分離的迴腸中緩激肽收縮活性以及大鼠中降壓活性兩者的增強因子。作為由豚鼠分離的迴腸中緩激肽收縮作用以及大鼠中血壓降壓作用的增強因子，最具選擇性和有效的是含5到13個胺基酸殘基、具有在500和1700道爾頓之間的質量的那些肽。所述活性分子被化學修飾，從而得到在品質上具有相似特徵的其它肽。
其中以化學式表示的Evasins即5到13個胺基酸的寡肽，是下文所述的那些
化學式序列命名I ＜E1aa2aa3aa4P5Evasin-5a，b，…，nII ＜E1aa2aa3aa4aa5P6Evasin-6a，b，…，nIII ＜E1aa2aa3aa4aa5P6P7Evasin-7a，b，…，nIV ＜E1aa2aa3P4aa5aa6P7P8Evasin-8a，b，…，nV ＜E1aa2aa3aa4aa5aa6aa7P8P9Evasin-9a，b，…，nVI ＜E1aa2aa3aa4aa5P6aa7aa8P9P10Evasin-10a，b，…，nVII ＜E1aa2aa3aa4aa5aa6P7aa8aa9P10P11Evasin-11a，b，…，nVIII＜E1aa2aa3aa4aa5aa6aa7P8aa9aa10P11P12Evasin-12a，b，…，nIX ＜E1aa2aa3aa4aa5aa6aa7aa8P9aa10aa11P12P13Evasin-13a，b，…，n其中P總是脯氨酸。其它的可以是由三字母或一字母代碼表示的L-或D-胺基酸及衍生物。
天門冬氨酸(Asp，D) 穀氨酸(Glu，E)丙氨酸(Ala，A) 精氨酸(Arg，R)天門冬醯胺(Asp，D) 苯丙氨酸(Phe，F)甘氨酸(Gly，G) 穀氨醯胺(Gln，Q)組氨酸(His，H) 異亮氨酸(Ile，I)亮氨酸(Leu，L) 賴氨酸(Lys，K)脯氨酸(Pro，P) 絲氨酸(Ser，S)酪氨酸(Tyr，Y) 蘇氨酸(Thr，T)色氨酸(Trp，W) 纈氨酸(Val，V)氨基丁酸(Abu) 氨基異丁酸(Aib)二氨基丁酸(Dab)二氨基丙酸(Dpr)己酸(ε-Ahx) 異哌啶酸(Isonipecotic acid)(Isn)焦穀氨酸(Pyr，＜E)四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)丁基-甘氨酸環己基丙氨酸(Cha)瓜氨酸(Cit)抑制素和衍生物(Sta)
苯基甘氨酸(Phg)羥脯氨酸(Hyp)高絲氨酸(Hse) 正亮氨酸(Nle)正纈氨(Nva)鳥氨(Orn)青黴素丙氨(Pen)肌氨酸(Sar)iethylalanine(Thi)[SIC]＜E1焦穀氨酸為N-末端胺基酸；aa2是胺基酸，對於化學式I和II，典型地為W、S或K，對於化學式III，典型地為D，而對於化學式IV至IX，典型地為A、W、S、G或N；aa3對於化學式I至III，典型地為W、P、F或G，而對於化學式IV至IX，典型地為A、P、G、W或R；aa4是胺基酸，對於化學式I至III，典型地為P、A或R，而對於化學式IV至IX，典型地為P、L、Q、A、R或W；aa5是胺基酸，對於化學式II和III，典型地為G、R或I，而對於化學式IV至IX，典型地為T、P、G、H、R、W或E；aa6是胺基酸，對於化學式V、VII、VIII和IX，典型地為Q、N、P、T、H、R或G；對於化學式IV，其通常為I、A、T或Y；aa7是胺基酸，對於化學式VI、VIII和IX，典型地為P、N、Q、G或R，而對於化學式V，通常為I、A、T或Y；aa8是胺基酸，對於化學式VII和IX，典型地為Q、P或G；對於化學式VI，其通常為I、A、T或Y；aa9是胺基酸，對於化學式VIII，典型地為P、Q、N或G，而對於化學式VII，通常為I、A、T或Y；aa10是胺基酸，對於化學式IX，典型地為Q和E，而對於化學式VIII，通常為I、A、T或Y；aa11對於化學式IX通常為I、A、T或Y；本發明的另一個特點在於通過包括如下的化學改變來修飾既作為血管肽酶抑制劑、又作為對內皮細胞和血管平滑肌的有所作用的所有EVASINs分子的可能性，目的是改善其藥代動力學和對參與心血管病理學的不同靶分子的作用特異性性能1)局部構象改變通過用D-型胺基酸取代L-型胺基酸，導致引入反向β-「轉角」結構(「髮夾」)，或者通過引入α-取代的胺基酸，從而使得多肽鏈軸向於α-螺旋結構或延展構象或β-「轉角」，例如引入α-氨基異丁酸。也提供了α-胺基酸的N-甲基取代，從而限制醯胺鍵的行動，消除氫鍵的形成，影響主多肽鏈的扭轉角度，並允許形成順式肽鍵。另一種修飾是用非醯胺共價鍵取代肽醯胺鍵，從而保護此鍵抗蛋白酶的作用。
2)整體構象改變通過環化，從而穩定二級結構。選擇被半胱氨酸或其它含有例如各自帶有β，β-二甲基青黴素丙氨酸類似物的巰基的有機化合物取代的兩個胺基酸，可以是EVASINs序列或其類似物中的任何胺基酸殘基，它們彼此被至少兩個多肽鏈胺基酸殘基分隔開。例如，則兩巰基殘基之間有利於S-S鍵的形成，從而形成環肽。環化也可以通過在不含羧基和氨基的多肽之間形成內醯胺鍵或肽鍵，或者通過有利於肽環化的任何其它化學操作實現。
3)胺基酸側鏈的改變(χ-「約束」(χ-「constraints」))α-胺基酸側鏈扭轉角度的確定可能允許更好地調整多肽到其結合位點上的拓撲變化，例如，用β-甲基-2』，6』-二甲基酪氨酸(TMT)取代酪氨酸，其能夠限定針對互作位點的優選構象。建議的改變在Victor J.Hruby發表於Nature，1，847-858，2002上的綜述中談及並舉例說明。
本發明以利用減小胃腸道(GIT)降解的環糊精及其衍生物獲得寡肽釋放系統EVASINs為特徵，導致肽在生物系統中的生物利用度提高，口服製劑尤為如此。另外，存在其它施用形式象靜脈內、肌內、局部、肺部吸入、鼻內、口內或利用生物可降解的聚合物如PLA和PLGA或不加限制的這些實例的混合物作為控釋的反底片(diapositive)。
本發明還以使用提高肽生物利用度的脂質體的寡肽Evasins控釋系統為特徵。脂質體為脂質囊泡，其在此分子中包括內部水性區室，例如，藥物可封裝於其中，目的是在向個體給藥脂質體後實現緩慢的藥物釋放。
以前沒有描述過包含在環糊精或其衍生物中、微囊化到如PLA或PLGA的生物可降解的聚合物或其混合物中以及脂質體中的寡肽Evasins或其結構和/或構象類似物的應用。本發明以使用三種不同的技術為特徵，即寡肽Evasins及其類似物分子封裝到環糊精中、以及微囊化到生物可降解的聚合物或脂質體和/或其混合物中，當與未配製的相比時，口服組合物和製劑中Evasins的生物可處理性增加。
以前沒有描述過Evasins及其結構類似物和/或構象類似物的藥物組合物和/或製劑，其特徵在於利用Evasins 7a、10c、11e、12b及其各自的類似物和衍生物作為分子模型用於開發基於肽化合物和/或非肽化合物的藥物和/或藥物組合物或製劑。
本發明的另一個特點是根據研究和治療溫血(hot blood)動物高血壓、其它心血管疾病及其併發症(非限制性的實例急性心肌梗塞、中風、左心力衰竭、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心絞痛和心肌梗死後的漸進性心力衰竭和動脈粥樣硬化)、腫瘤、糖尿病、精子遊動性、精子發生的阻滯、腎病、陽痿、胃腸以及婦科疾病、血管發生、毛髮損失、血液病和血管成形術(血管成形術後的再狹窄、血管內protese)的用途，使用Evasins及其類似物和衍生物的藥物組合物和/或製劑，特徵在於在控釋系統如脂質體和生物可降解聚合物PLA、PLGA和/或混合物中微囊化與否的、Evasins及其類似物和衍生物與環糊精、其衍生物間的包含和/或結合化合物。
其中要求保護的藥物組合物包括包含在環糊精或其衍生物中的Evasins，或單獨或者至少混合或結合了一種藥理學活性製劑的、結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的Evasins、其類似物及衍生物，或者包含在環糊精中與否的、在控釋系統如脂質體和PLA、PLGA生物可降解聚合物和/或其混合物中微囊化與否的Evasins、其類似物及衍生物。本發明也包括鑑定在慢性退行性病變的研究和治療中具有應用的Evasins的其它生物化學作用機制。
除Evasin 7a之外的Evasins及其類似物和衍生物的藥物組合物，其中特徵在於提供對中性內肽酶(微摩爾級的Ki)和血管緊張素I轉換酶(納摩爾級的Ki)不同的抑制活性。這些藥物組合物和製劑的另一個特徵在於當包含在環糊精中時，例如是口服製劑，提高所述肽效應的生物可處理性、持續時間和/或效力。
根據如下非限制性的實施例，可更好地理解本發明。
實施例1EVASIN的合成、純化和表徵以及確定其對血管緊張素I轉換酶催化部位的選擇性抑制的酶促測定該實施例描述了Evasins的合成、純化、表徵及對ECA C或N-末端位點的選擇性抑制。寡肽根據方法學的現有技術合成。Boc策略是以Barany，G. Merrifield，R.B.(Gross，E. Meinhofer，J.，Eds.)(1980)，The PeptidesAnalysis，Synthesis and Biology，vol.II，1，Academic Press，New York.2-Stewart，J.M. Young，J.D.(1984)，Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford中描述的數據為基礎的。
寡肽根據現有技術的方法學修飾。建議的改變在Victor J.Hruby發表於Nature雜誌，1，847-858，2002上的綜述中談及並舉例說明。
合成的Evasins在HPLC系統中純化，且洗脫物質通過質譜分析。
純化中所用的溶劑都是HPLC等級的，且所用的水是通過在Milli-Q系統中蒸餾和過濾獲得的，其配備於濾筒上以保留鹽和有機化合物。
對來自純化的級分進行質譜分析，以確認純化後Evasins的摩爾質量。
用於重組ACE抑制的酶測定利用底物Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-DpaOH於25℃在50mM Hepes緩衝液(pH 6.8)、200mM NaCl和10μM ZnCl2中進行。反應通過在螢光計中測定λem＝390nm(λex＝340nm)處因ACE對底物的切割(S＝Km，40μM)提供的螢光增加予以持續監控。Evasins與酶在底物添加前預溫育。
表1Evasins對血管緊張素I轉換酶C和N-末端催化部位活性抑制的測定
Evasins對ACE抑制的Ki值結果為nM的數量級。多數Evasins為C-末端位點的選擇性抑制劑，例如Evasin-10c表現出0.5nM的Ki值，也就是說，對於此結構域的選擇性要高400倍。而其它Evasins對N-末端位點表現出選擇性抑制，例如利用Evasin-12b獲得的Kis值對於N-末端和C-末端位點分別為5nM和150nM。
考慮到現有技術，證明了具有血管緊張素I轉換酶遺傳缺失的小鼠是不育的((Esther CR Jr，Howard TE，Marino EM，Goddard JM，Capecchi MR，Bernstein KE.Mice lacking angiotensin-convertingenzyme have low blood pressure，renal pathology，and reduced malefertility.Lab Invest.1996May；74(5)953-65)且睪丸ACE對應於機體ACE的N-末端位點(Ramaraj P，Kessler SP，Colmenares C，Sen GCSelective restoration of male fertility in mice lackingangiotensin-converting enzymes by sperm-specific expression ofthe testicular isozyme.J Clin Invest.1998Jul 15；102(2)371-8)，Evasin、其類似物及衍生物的藥物組合物具有作為男性避孕藥使用的潛力。因而，本發明也以環糊精有機-水或固體溶液混合物、或者來自烷基(alquil)、羥烷基(hydroxialquil)、羥丙基(hydroxipropil)及醯基的具有交聯鍵的環糊精衍生物、或環糊精聚合物與待用作為男性避孕藥的Evasins和/或其類似物的有機-水或固體溶液的混合為特徵。在另一方面，對C-末端位點具有選擇性的Evasins可能代表了有別於非選擇性或對N位點選擇性的抑制劑所代表的獨特特徵。
實施例2用於確定EVASINS誘導的NEP抑制的酶測定用於重組NEP抑制的螢光測定利用底物Abz-RL-EDDnp於37℃在50mM Tris-HCl緩衝液，pH 7.5中進行。反應通過在螢光計中測定λem＝418nm(λex＝318nm)處因NEP對底物的切割(Km＝8.4μM)提供的螢光增加予以持續監控。Evasins與酶在底物添加前預溫育。
Evasins並非極強的NEP抑制劑，Evasins誘導的NEP抑制的Ki值結果為μM的數量級。最佳的抑制劑之一為Evasin-9a，其表現出86μM的Ki值。
表2Evasin作用對中性內肽酶活性抑制的測定
抑制常數(Ki)值通過表觀抑制常數(Ki(app))與底物Km之比確定(Salvesen and Nagase，1990).InProteolytic enzymes a praticalaproach.，Beynon和Bond編輯，Oxford University Press，England，87-88)。
上述結果證明所述物質對NEP的低親和力，提示與本技術領域相關的血管肽酶抑制劑(例如奧帕曲拉)相比，間接效應如血管性水腫和咳嗽可能減少。
實施例3EVASINS緩激肽增強活性試驗-豚鼠分離的迴腸中的生物學測定利用緩激肽誘導的平滑肌收縮活性測試了合成肽的增強活性，並利用豚鼠分離的迴腸製備物測定了UP值。UP相當於能夠將單次緩激肽劑量的應答效應轉變成等價的雙倍劑量的Evasin濃度(nmol/mL製備物)。
利用了雌性豚鼠。在開始測定之前，將迴腸保存在Tyrode溶液中。其次，於37℃將該迴腸節段的一端長1.5至2.0cm束緊，放至含Tyrode鹽水的玻璃杯底部所含的半環中，利用毛細管鼓入恆氧；另一端固定到事先校準過的槓桿上。維持壓為1g，並記錄豚鼠分離的迴腸的收縮。以便確定樣品對緩激肽的增強效應，繪製緩激肽作用於豚鼠分離的迴腸的對數劑量應答曲線。緩激肽活性通過測量豚鼠分離的迴腸的收縮測定，並且增強活性依據Shimuta等，Eur.J.pharmacol.70(4)，551-554(1981)就對標準緩激肽劑量的組織應答的增加表達。
在添加單次緩激肽劑量之前對Evasins單獨進行測試和摻合(spiked)。樣品稀釋液利用去離子水在用前製備。將所測的應答插入到對數劑效曲線的線性部分，從而獲得就對標準緩激肽劑量的製備物應答的增強而言的增強活性。TYRODE溶液貯液I 20mL，貯液II 40mL，二苯胺溶液(1mg/mL)1ml，阿託品溶液(1mg/mL)1mL，5.60mM D-葡萄糖和H2O q.s.1L。該測定中所用的所有試劑都是分析級試劑。
所有增強了緩激肽在豚鼠分離的迴腸中的收縮作用的Evasins，在從0.22到30nmols的濃度範圍內使緩激肽的收縮效應加倍。
實施例4EVASINs對麻醉大鼠血壓的作用在麻醉大鼠中測試了對緩激肽降壓效應的增強活性。利用戊巴比妥鈉(Hypnol_Cristália，50mg/kg，腹膜內)麻醉正常血壓的雄性大鼠(WKY)，並置於控溫板上，以維持體溫在36.5℃和37℃之間。利用了偶聯於生理學傳感器的多種波動描記器。血壓變動範圍數值通過對由基線血壓限定的面積進行積分獲得，並將其與由對照測定獲得的數值進行比較。在體內測定中，觀察了Evasins對麻醉大鼠血壓的緩激肽降壓效應的增強活性。確定兩個參數用於比較對麻醉大鼠血壓的緩激肽增強效應(n＝5)1)對麻醉大鼠血壓的緩激肽降壓活性的增強效應的強度此數值定義為在輸注200nmol的增強劑後，由單次劑量的緩激肽所致的低壓百分比(％)增長。2)增強效應時長使對單次劑量緩激肽的增強效應降低50％所需的時間。
在麻醉大鼠中，通過靜脈內注射穩定濃度的200nmole Evasin/大鼠，Evasins在40到340％的範圍內增強了緩激肽的降壓效應。觀察到10分鐘的最小時長，並且為將原始增強效應降低50％甚至要超過120分鐘。
表3Evasins對緩激肽作用於麻醉大鼠血壓的降壓效應的增強
實施例5β-環糊精及其衍生物與EVASINS及其類似物之間的包含化合物的製備該實施例代表了HP-β環糊精和比如非限制性的實例evasin 5a之間的包含化合物的特徵描述。製劑以摩爾比的β-環糊精及其衍生物和Evasins及其類似物的水溶液製備(1∶1和1∶2)。對溶液混合物進行持續攪拌，以完全溶出β-環糊精。隨後，在液氮溫度下冰凍混合物，並進行24小時的凍幹加工。利用物理化學技術描述如此獲得的固體的特徵。核磁共振是提供關於相互作用的主體/客體的相關信息的技術。
製劑以等摩爾比的環糊精和肽製備。下表顯示了這樣製備的包含化合物。對這些系統進行了生物學試驗。
表4進行生物學試驗的環糊精和Evasins之間的包含化合物
在HB-β-CD和肽的溶液製備和NMR1H及13C譜模擬後，是包含化合物HB-β-CD/BPP-5a以及游離BPP-5a和游離HB-β-CD的NMR表徵步驟。針對環糊精和主體分子BPP-5a的結構闡釋的氫-1H NMR；針對BPP-5a結構的結構闡釋的COSY、TOCSY、13C-DEPT135、HMQC；化學位錯的變量分析-δ；縱向弛豫的時間測量RMN T1及NOESY實驗(核磁歐氏效應光譜學)，旨在驗證包含。δ和T1研究僅利用主體分子的氫元素作為探針，因為環糊精的氫信號是重疊的。
為對戊肽BPP-5a進行RMN結構闡釋，採用特定游離胺基酸的RMN1H譜作為參照(THE SADTLER STANDARD SPECTRA.Sadtler ResearchLaboratories.1972)。由於分子以及其光譜的複雜性，有必要使用許多諸如一維諸如二維的RNM技術，也有必要使用400MHz的光譜儀。樣品被溶於D2O中，它們一經轉變為溶劑的氘原子，基於氫核磁共振的光譜作為羥基、醯胺基和氨基氫信號缺失的函數被極為簡化。
根據有關Evasin-5a的相應模擬，分析了純化合物的實際光譜，賦值(assign)如下1)由於氘化溶劑中雜質「H2O」的存在，NMR1H譜以及COSY，在4.8ppm處表現出強烈的信號。
2)「CH」基氫僅次於水信號；這些氫為肽鍵和官能團胺基酸之間的鏈鍵。
3)「CH2」基存在於包含在2.8-3.7ppm化學置換之間的區域內，這些基團與緊鄰肽鍵的「CH」基鍵合。
4)在大約1.3-2.5ppm之間，可見到涉及屬於若干官能團的「CH2」的多重譜。
5)在1.2ppm處，可見到涉及胺基酸丙氨酸片段的CH3基的雙重譜。利用COSY，可觀察到該基團與「CH」在4.6ppm處的標量耦合(四重譜)。
6)包含在從7.7到7.1ppm的範圍內的化學置換之間的區域被賦值為芳基自旋體系(對應於胺基酸色氨酸片段)。
HP-β-CD譜表現出高度複雜性，難以賦值，即使是根據模擬光譜的時候也是如此。不過，有可能對下文提及的某些信號賦值在3.3到4.3ppm處的化學置換之間，由於「CH」基的碳原子與羥基鍵合，看到複雜的多重譜。在1.1到1.8ppm之間的化學置換區間內，可發現涉及羥丙基的信號。
關於包含化合物的NMR測定，比較了純Evasin-5a譜，觀察到清晰分離的譜線，在芳基區(δ≈7.7-7.1)內具有必然的化學置換變化。這是HP-β-CD與此肽該區相互作用的強指徵。此現象是因無環糊精C1-01-C4氧原子配體的電子所致，其可導致肽中芳基電子分布的混亂。該結果提示芳基可能被封裝到HP-β-CD腔中。
至於Evasin-5a，示於表1和2中(T1值)，觀察到，一旦此核的T1變化比每次測量中所獲得的標準偏差大得多，則僅有氫16和19具有顯著變化。其它的氫分析提供的T1變化若與每次測量的標準偏差相比則是可疑的。
分析下表，觀察到主體分子芳基氫馳豫時間T1的減少。這種改變提示在主體分子包含在環糊精腔中之後，客體分子的可動性減小，對稱變化以及慢旋動力學。
表5於200MHz測量的純BPP-5a肽中某些1H核的縱向馳豫時間值
表6於200MHz測量的HP-β-CD/BPP-5a系統中某些1H核的縱向馳豫時間值
利用β-CD或BPP-5a/HP-β-CD NOESY實驗，與其它RNM數據相加，有可能確定客體分子在環糊精腔內部的空間排布。以D8＝650ms對BPP-5a進行NOESY實驗。此為獨特的觀察到表明HP-β-CD和作為非限制性實例的BPP-5a氫之間的空間鄰近性的交叉相互關係的D8值。
實施例6EVASINs對非麻醉高血壓大鼠血壓的影響在測定前一天，對動物進行股動脈和靜脈插管外科手術。用乙醚麻醉大鼠，並以仰臥位置於外科手術板上。切開小的皮膚切口，從而分離肌肉組織以定位股血管神經束。將插管通過股靜脈插入到下腔靜脈中以給藥藥物，並通過股動脈插入到腹動脈中以記錄心血管參數。插入後，利用手術線將插管繫到股血管神經束上。其次，藉助於套管針將插管在皮下定向於肩胛骨腰，此處將其從腹膜中取出，並用縫線系住。動脈插管用於記錄心血管參數而靜脈插管用於給藥藥物。
在股動脈和靜脈插管一天後記錄血壓和心率。測定用自由運動的非麻醉動物進行。通過計算機利用數據採集系統(BIOPAC)監控大鼠的脈搏動脈壓(PAP)、平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。在所有的實驗期間收集數據。
在藥物給藥前，監控大鼠的PBP、MBP和HR。在快速注射(bolusinjection)總量為0.2mL(0.9％NaCl液)的Evasin之後，監控所得的降壓效應和效應時長。在此測定法中，測試了每種肽的標準劑量(70nmol/100g體重)(n＝4)。Evasin-10c為最有效的肽，具有最佳的降壓效應，引起平均血壓降低-29.5±9.50mmHg，然後是Evasin-9a，MBP降低-27.0±1.50mmHg。Evasin-5a和Evasin-7a引起最高的MBP降低，分別為-19.17±4.36mmHg和13.00±2.78mmHg。
當比較效應時長時，觀察到Evasin-7a為表現出持續長於100分鐘的降壓效應的肽。Evasin-9a和Evasin-10c就分別為84和94分鐘的效應時長而言是類似的。Evasin-5a的效應時長短；給藥37分鐘後，MAP回復至基線值。
實施例7封裝在環糊精中的EVASINs對清醒高血壓大鼠血壓的影響本實施例描述了Evasin-5a和羥丙基-β-環糊精(HPβCD)之間的包含化合物對高血壓大鼠血壓的給藥效應。在測定前一天，對動物進行股動脈和靜脈插管外科手術。用乙醚麻醉大鼠，並以仰臥位置於外科手術板上。切開小的皮膚切口，從而分離肌肉組織以定位股血管神經束。將插管通過股靜脈插入到下腔靜脈中以給藥藥物，並通過股動脈插入到腹動脈中以記錄心血管參數。插入後，利用手術線將插管繫到股血管神經束上。其次，藉助於套管針將插管在皮下定向於肩胛骨腰，此處將其從腹膜中取出，並用縫線系住。
在股動脈和靜脈插管一天後記錄血壓和心率。測定用自由運動的非麻醉動物進行。通過計算機利用數據採集系統(BIOPAC)監控大鼠的脈搏動脈壓(PAP)、平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。在所有的實驗期間收集數據。
在藥物給藥前，為期60分鐘監控大鼠的PBP、MBP和HR。在快速注射總量為0.2mL(0.9％NaCl液)的Evasin之後，監控所得的降壓效應和效應時長。此測定中使用了0,071nmol/100g體重的標準劑量，n＝6。
當比較由游離Evasin-5a以及包含在HPβCD中的Evasin-5a給藥所獲得的結果時，在游離或封裝形式的戊肽給藥之間沒有觀察到最高降壓效應的差異，MAP降低分別為23±4.2mmHg和22±3.3mmHg。我們觀察到效應時長的顯著差異，其中封裝的Evasin-5a能夠使游離肽的效應時長比游離肽的持續時間提高大於4倍，分別為140和38分鐘。
實施例8EVASINS對清醒高血壓大鼠(SHR和TGR(mREN2)L27血壓的比較效應本實施例非限制性地描述了Evasin-5a對不同株系高血壓大鼠血壓的輸注效應。
在測定前一天，對動物進行股動脈和靜脈插管外科手術。用乙醚麻醉大鼠，並以仰臥位置於外科手術板上。切開小的皮膚切口，從而分離肌肉組織以定位股血管神經束。將插管通過股靜脈插入到下腔靜脈中以給藥藥物，並通過股動脈插入到腹動脈中以記錄心血管參數。插入後，利用手術線將插管繫到股血管神經束上。其次，藉助於套管針將插管在皮下定向於肩胛骨腰，此處將其從腹膜中取出，並用縫線系住。
在股動脈和靜脈插管一天後記錄血壓和心率。測定用自由運動的非麻醉動物進行。通過計算機利用數據採集系統(BIOPAC)監控大鼠的脈搏動脈壓(PAP)、平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。在所有的實驗期間收集數據。
在藥物給藥前，為期60分鐘監控大鼠的PBP、MBP和HR。在900μg/100g體重/小時溶於0.9％NaCl液的Evasin 5a輸注期間和之後(n＝6)，登記心血管參數。兩株系中evasin-5a的給藥都引起同樣的MAP下降，SHR和TGR(mREN2)L27分別為28±2.7mmHg和34±0.9mmHg。然而，觀察到輸注後時間持續效應中的相關差異，SHR中阻滯超過6小時，而TGR中僅為1小時。這些差異表明了Evasins 5a作用的生物化學機制的重要變化，具有不同程度的腎素血管緊張素系統激活。
實施例9通過遙測術系統測量的EVASINs急性給藥對SHR血壓的影響遙測術系統被用於測量收縮和舒張壓、平均血壓和心率。該監控系統包含可植入的射頻裝置、感受器面板、基質以及具有用於數據採集和分析的軟體的計算機(Braga等，2002)。
使用雄性SHR大鼠。在外科手術前動物保持禁食24小時。在2.5％2，2，2-三溴乙醇(1mL/100g體重)麻醉下，將大鼠以仰臥位置於外科手術板上，剪開腹側腹部區，並用碘酒無菌清洗。在中腹線處切開大約2cm的切口，以取得對髂骨(iliac)分叉區的良好視角。取出腸從而允許完全接近腹部血管。藉助於棉籤和紗布巧妙地取出沿血管床的脂肪和結締組織，直至腹主動脈能夠得以確認並從腔靜脈中適當地分離出來。用以生理鹽水弄溼的粗絲線繞住主動脈，從而防止血流，並用以90°角彎曲的針(25×8)切開小切口。其次，利用輔助鉗將接受生物相容性凝膠的聚乙烯導管裝置插入到動脈中。清洗並乾燥導管進口區，並施用微量的組織膠。在組織膠上方放置小塊纖維素紙，以將導管固定在主動脈中。用磁鐵開啟裝置電池，並利用AM收音機(未調製)記錄主動脈中導管位置的典型聲音。縫合腹部的肌肉組織，通過其矽樹脂卡固定裝置。其次，縫合皮膚。利用碘酒進行無菌處理，然後肌內給藥0.1mL的pentabiotic。將動物置於單個的籠內，並保持在溫暖條件下，直至完全由麻醉恢復。恢復後，將動物取到遙感間中適應25℃的氣候，並維持12hr/12hr的明/暗周期(白天6:00a.m.到6:00p.m.，而夜晚6:00p.m.到6:00a.m.)。隨意提供水和食物。
在進行測定前，將動物置於單個的籠(15cm×12cm×6cm)內，並保持8天，直至遙感圖表明血壓和心率恢復止。進行每10分鐘10秒/24小時的數據取樣。
封裝在β-環糊精中強飼的Evasin-7a和Evasin-10c口服給藥獲得結果證明這兩種肽在自發高血壓大鼠中發揮降壓活性。Evasin-7a表現出9小時的時長，5小時後MAP最高下降20mmHg，且在肽給藥後和第5小時分別在8mmHg之內。Evasin-10c具有5小時的最高降壓效應，且在給藥後兩小時最高下降13mmHg。
實施例10EVASINs的生物分布根據氯胺T法在小鼠中靜脈內給藥125I標記的Evasins證明這些肽引入注目地集中於腎中。例如非限制性地，靜脈內注射125I-Evasin10c顯示，在15分鐘後，此肽在腎中具有比在肺和肝中大約兩倍高(每克組織)的濃度。在其它組織及血液中，放射性肽的濃度顯著更低。當與其它組織比較時，腎中的這種差異增大，30分鐘後達到峰濃度，在組織中迅速下落，而在腎中要低得多，這裡在給藥3小時後觀察到它們維持在大約50％的峰濃度。當放射性肽與卡託普利以比肽濃度高10倍的摩爾濃度共同給藥時，看到相同的分布特徵，與不含卡託普利所達到的峰濃度相比，放射性肽所達到的峰濃度降低大約30％。
Evasins在腎臟中的生物分布和留置時間都表明它們對腎臟具有較大的選擇性，並且與卡託普利相比，在更長的時間階段內保持與該組織結合。在另一方面，下降30％的Evasins腎結合為血管緊張素轉換酶的配基。
權利要求
1.由蛇毒腺特別是巴西具竅蝮蛇(Bothrops Jararaca)分泌的肽即血管肽酶抑制劑Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於包含a)5-13個胺基酸的寡肽
其中P總是脯氨酸，其它的可以是由三字母和一字母代碼表示的L-或D-胺基酸及衍生物天門冬氨酸(Asp，D) 穀氨酸(Glu，AND)丙氨酸(Ala，A) 精氨酸(Arg，R)天門冬醯胺(Asp，D) 苯丙氨酸(Phe，F)甘氨酸(Gly，G) 穀氨醯胺(Gln，Q)組氨酸(His，H) 異亮氨酸(Ile，I)亮氨酸(Leu，L) 賴氨酸(Lys，K)脯氨酸(Pro，P) 絲氨酸(Ser，S)酪氨酸(Tyr，Y) 蘇氨酸(Thr，T)色氨酸(Trp，W) 纈氨酸(Val，V)氨基丁酸(Abu) 氨基異丁酸(Aib)二氨基丁酸(Dab) 二氨基丙酸(Dpr)己酸(ε-Ahx) 異哌啶酸(Isn)焦穀氨酸(Pyr，＜E)四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)丁基-甘氨酸環己基丙氨酸(Cha)瓜氨酸(Cit)抑制素和衍生物(Sta)苯基甘氨酸(Phg)羥脯氨酸(Hyp)高絲氨酸(Hse) 正亮氨酸(Nle)正纈氨酸(Nva) 鳥氨酸(Orn)青黴素丙氨酸(Pen) 肌氨酸(Sar)tiethylalanine(Thi)＜E1焦穀氨酸為N-末端胺基酸；aa2是胺基酸，對於化學式I和II，典型地為W、S或K，對於化學式III，典型地為D，而對於化學式IV至IX，典型地為W、S、G或N；aa3對於化學式I至III，典型地為W、P、F或G，而對於化學式IV至IX，典型地為P、G、W或R；aa4是胺基酸，對於化學式I至III，典型地為P、A或R，而對於化學式IV至IX，典型地為P、A、R或W；aa5是胺基酸，對於化學式II和III，典型地為R或I，而對於化學式IV至IX，典型地為T、P、G、H、R、W或E；aa6是胺基酸，對於化學式V、VII、VIII和IX，典型地為Q、N、P、T、H、R或G；對於化學式IV，其通常為I、A、T或Y；aa7是胺基酸，對於化學式VI、VIII和IX，典型地為N、Q、G或R，而對於化學式V，通常為I、A、T或Y；aa8是胺基酸，對於化學式VII和IX，典型地為Q、P或G；對於化學式VI，其通常為I、A、T或Y；aa9是胺基酸，對於化學式VIII，典型地為Q、N或G，而對於化學式VII，通常為I、A、T或Y；aa10是胺基酸，對於化學式IX，典型地為Q和E，而對於化學式VIII，通常為I、A、T或Y；aa11對於化學式IX通常為I、A、T或Y；b)單獨或者至少與另一種活性藥理學製劑混合或結合的Evasins、其類似物或衍生物在環糊精或其衍生物中的、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的包含化合物；c)在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或混合物中微囊化與否的、包含在環糊精中與否的Evasins、其類似物及衍生物。
2.Evasins、其類似物及衍生物的藥物化合物，特徵在於利用Evasins 7a、10c、11e、12b、其類似物及衍生物作為分子模型用於開發基於肽化合物和/或非肽血管肽酶抑制劑的藥物和/或製劑。
3.Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於利用Evasins 7a、10c、11e、12b、其類似物及衍生物作為分子模型用於開發基於結合於膜的血管緊張素轉換酶的肽化合物和/或非肽配基激動劑和拮抗劑的藥物和/或製劑。
4.根據權利要求1和2的除Evasin-7a之外的Evasins、其類似物及衍生物的組合物，特徵在於提供對中性內肽酶(微摩爾級的Ki)和血管緊張素I轉換酶(納摩爾級的Ki)不同的抑制活性。
5.根據權利要求1和2的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於提供對血管緊張素I轉換酶C-末端結構域的選擇性抑制活性，對C-結構域比對N-結構域強50到400倍。
6.根據權利要求1和2的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於提供對血管緊張素I轉換酶C-末端結構域的選擇性結合，對C-結構域比對N-結構域強50到400倍。
7.根據權利要求1和2的Evasin-7a、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於提供對中性內肽酶和血管緊張素I轉換酶類似的抑制活性。
8.Evasins 7a、10c、11e、12b、其類似物及衍生物作為分子模型用於開發基於肽化合物和/或非肽化合物的藥物和/或製劑的用途，特徵在於提供血管舒張和/或血管保護活性。
9.根據權利要求1至3的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，應用於動脈高血壓和其它心血管疾病及其併發症的研究和治療，特徵在於利用了在控釋系統例如象脂質體和生物可降解的聚合物和/或混合物中微囊化與否的Evasins、其類似物及衍生物與環糊精及其衍生物的包含化合物或結合。
10.根據權利要求1至6的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，可用於研究和治療溫血動物急性心肌梗塞、左心室肥大、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心絞痛、心肌梗死後漸進性的心力衰竭、動脈粥樣硬化症、腫瘤、糖尿病、精子遊動性、精子發生的阻滯、腎病、性機能障礙、胃腸以及婦科疾病、血管發生、毛髮損失、血液病、血管成形術(血管成形術後的再狹窄、endoluminal protese)，特徵在於利用了在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或混合物中微囊化與否的Evasins、其類似物及衍生物與環糊精及其衍生物的包含化合物或結合。
11.根據權利要求1和2的藥物組合物，特徵在於環糊精、或選自含烷基、羥烷基、羥烷基、羥丙基及醯基的組的環糊精衍生物、或具有交聯鍵的環糊精、或環糊精聚合物的有機-水性固體或溶液與Evasins、其類似物及衍生物的溶液1∶1或1∶2摩爾比的混合物。
12.Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於使用了環糊精或其它控釋體系，包括脂質體、生物可降解的聚合物、生物可降解聚合物的衍生物或者這些系統的混合物。
13.Evasins作為分子模型用於開發根據權利要求4的對中性內肽酶和血管緊張素I轉換酶具有不同抑制活性的藥物和/或製劑的用途，特徵在於對中性內肽酶提供更低的抑制活性，因此發生副作用如咳嗽以及血管神精性水腫的可能性更小。
14.用於研究和治療動脈高血壓和其它心血管疾病及其併發症的藥物組合物，特徵在於環糊精、或選自含烷基、羥烷基、羥丙基及醯基的組的環糊精衍生物、或具有交聯鍵的環糊精、或環糊精聚合物的有機-水性或固體溶液與Evasins、其類似物及衍生物的水性或固體溶液的混合物。
15.用於研究和治療溫血動物急性心肌梗塞、左心室肥大、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心絞痛、心肌梗死後漸進性的心力衰竭、動脈粥樣硬化症、腫瘤、糖尿病、精子遊動性、精子發生的阻滯、腎病、性機能障礙、胃腸以及婦科疾病、血管發生、毛髮損失、血液病、血管成形術(血管成形術後的再狹窄、endoluminal protese)的藥物組合物，特徵在於環糊精、或選自含烷基、羥烷基、羥丙基及醯基的組的環糊精衍生物、或具有交聯鍵的環糊精、或環糊精聚合物的有機-水性或固體溶液與Evasins、其類似物及衍生物的水性或固體溶液的混合物。
16.待用作為男性避孕藥的藥物組合物，特徵在於環糊精、或選自含烷基、羥烷基、羥丙基及醯基的組的環糊精衍生物、或具有交聯鍵的環糊精、或環糊精聚合物的有機-水性或固體溶液與Evasins、其類似物及衍生物的水性或固體溶液的混合物。
17.根據權利要求1、2和3的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins生物可處理性增大。
18.根據權利要求1和2的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，Evasins、其類似物及衍生物效應的持續時間和/或效力增大。
19.待用於高血壓緊急情況治療的根據權利要求1、2、3和4的Evasins、其類似物及衍生物的口服藥物組合物，特徵在於使用了與包括水、鹽溶液、緩衝液、Ringer液、葡萄糖溶液、Hank液、生物相容的鹽溶液在內的含或不含聚乙二醇的藥學上可接受的賦形劑的混合物。
20.口服的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins的生物可處理性增大。
21.口服的根據權利要求1和2的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，Evasins、其類似物及衍生物效應的持續時間和/或效力增大。
22.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的組合物和製劑，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins、其類似物及衍生物的生物可處理性增大。
23.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的組合物和製劑，特徵在於當在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或混合物中微囊化與否地、單獨或以混合物或者混合或結合了至少另一種藥理學活性的製劑地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins、其類似物及衍生物的生物可處理性增大。
24.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥以及作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的組合物和製劑，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins、其類似物及衍生物的持續時間和/或效力增大。
25.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的、用於研究和治療動脈高血壓和其它心血管疾病及其併發症的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的組合物和製劑，特徵在於使用了在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否的、單獨或以混合物形式結合了至少另外的藥理學活性製劑的、包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的Evasins、其類似物及衍生物。
26.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的、用於研究和治療溫血動物急性心肌梗塞、左心室肥大、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心絞痛、心肌梗死後漸進性的心力衰竭、動脈粥樣硬化症、腫瘤、糖尿病、精子遊動性、精子發生的阻滯、腎病、性機能障礙、胃腸以及婦科疾病、血管發生、毛髮損失、血液病、血管成形術(血管成形術後的再狹窄、endoluminalprotese)的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的組合物和製劑，特徵在於使用了在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否的、單獨或以混合物形式結合了至少另外的藥理學活性製劑的、包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的Evasins、其類似物及衍生物。
27.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1和2的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於當在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或混合物中微囊化與否地、單獨或者混合或結合了至少另外的藥理學活性製劑地、包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，所述Evasins、其類似物及衍生物的生物可處理性增大。
28.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物和製劑，特徵在於當單獨或者混合地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，Evasins、其類似物及衍生物效應的持續時間和/或效力增大。
29.肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)的或作為能夠植入或注射的裝置的根據權利要求1至4的Evasins、其結構和構象類似物的藥物組合物，特徵在於當單獨或混合了至少另外的藥理學活性製劑和/或在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否地包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中時，Evasins、其類似物及衍生物效應的持續時間和/或效力增大。
30.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的、用於研究和治療動脈高血壓和其它心血管疾病及其併發症的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於使用了單獨或以混合物形式結合了至少另外的藥理學活性製劑的、在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否的、包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的Evasins、其類似物及衍生物。
31.用於肌內、皮下、局部、吸入(肺部、鼻內、口內)給藥或作為能夠植入或注射的裝置的、用於研究和治療溫血動物急性心肌梗塞、中風、左心室肥大、糖尿病性血管病、周圍局部缺血、心絞痛、心肌梗死後漸進性的心力衰竭、動脈粥樣硬化症、腫瘤、糖尿病、精子遊動性、精子發生的阻滯、腎病、性機能障礙、胃腸以及婦科疾病、血管發生、毛髮損失、血液病、血管成形術(血管成形術後的再狹窄、endoluminalprotese)的根據權利要求1至4的Evasins、其類似物及衍生物的藥物組合物，特徵在於使用了單獨或以混合物形式結合了至少另外的藥理學活性製劑的、在控釋系統如脂質體和生物可降解的聚合物和/或其混合物中微囊化與否的、包含在環糊精或其衍生物中、或者結合或包含在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的Evasins、其類似物及衍生物
全文摘要
本發明以製備用於開發Evasins及其結構和/或構型類似物在慢性退行性病變中的應用的藥物組合物的方法為特徵。本發明還以利用環糊精、其衍生物、脂質體以及可生物降解的聚合物和/或這些系統的混合物製備Evasins肽及其結構和/或構象類似物的藥物組合物及相關產品的方法為特徵。本發明也以鑑定與作用於緩激肽新陳代謝以及血管緊張素II形成的效應無關的、促成了這些肽在慢性退行性紊亂中的作用機制的新的生物化學和生理藥理學機制為特徵。在現有技術中，還未見有使用包含在環糊精、脂質體、生物可降解聚合物及其衍生物中的Evasins及其類似物用於研究和治療的高血壓或其它心血管或慢性退行性病變的應用。這使得本發明表現出了作為用於研究和治療這些病理及其併發症的新的和更為有效的備選方案的特徵。本發明還以包含在環糊精中的這些肽及其類似物在向大鼠給藥時增強的效力為特徵。這表現出這些肽及其類似物利用本發明的組合物增強的生物可處理性。
文檔編號C07K17/00GK1820018SQ200380108187
公開日2006年8月16日 申請日期2003年12月9日 優先權日2002年12月9日
發明者A·卡瑪格, R·桑託斯, R·米蘭, D·安澤爾 申請人:生物實驗薩紐斯藥物有限公司