用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn及其提純方法和用途的製作方法

2023-10-05 00:35:39 2

專利名稱：：用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn及其提純方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn及其提純方法和用途。主要採用一種來源於舟山眼鏡蛇(NajaatraCantor)毒的細胞毒素，適用鎮痛，尤其是涉及該細胞毒素用於治療急、慢性疼痛的製藥新用途。屬於生物製藥
技術領域：
。
背景技術：
：二十世紀70年代以來，NT在鎮痛的基礎研究方面已進行了較為深入地探討，其鎮痛機制可能與膽鹼能、內源性阿片肽等多種系統有關。與傳統鎮痛藥物嗎啡相比，NT的鎮痛作用具有用量少、止痛時間長、無成癮性等特點，對頑固性疼痛、神經性疼痛和惡性腫瘤痛均有效。鑑於NT的神經毒性較大，致死活性較強，故何時能在臨床上得到實際應用尚難以預測。與NT相比，CTX的毒性較低、安全性更大，在抗腫瘤應用方面已顯示出良好的前景。自1993年，HungChin-Chun首次(Hungetal，1993)從臺灣臺東地區產舟山眼鏡蛇毒中分離出一種新的CTX，並命名為CTXn。該毒素是一種強鹼性多肽(pI10.13)，相對分子質量為6699Da，有60個胺基酸殘基。進一步研究發現臺灣臺西地區所產的舟山眼鏡蛇毒中並不含此毒素(Chenetal，2005)。中國大陸其他地區的舟山眼鏡蛇毒中是否有CTXn，以及其是否有鎮痛的功能，至今未見相關報導。
發明內容本發明的第一個目的，是為了提供一種低毒性的、用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn及其提純方法和用途。本發明的第二個目的，是為了提供一種用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法。本發明的第三個目的，是為了提供一種用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的用途。本發明的第一個目的可以通過採取如下技術措施達到用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn，其特徵是1)所述CTXn的分子量為6697.429Da;2)所述CTXn的胺基酸序列如序列表SEQIDN2:1所述。本發明的第二個目的可以通過採取如下技術措施達到用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法，其特徵在於包括如下步驟1)外採集舟山眼鏡蛇毒樣本；2)對前述舟山眼鏡蛇毒樣本進行CTXn的分離、純化，(1)首先進行凝膠過濾採用S印hacrylS-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTAexplorer100快速純化工藝開拓系統進行分子篩過濾，獲得I、II及III個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPr印26/10Desalting脫鹽，凍幹，備用；(2)通過初篩，選取組分III進行下一步"離子交換";(3)離子交換採用CMS印haroseFF填料，組分III通過AKTAexplorer100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性多肽CTXn(圖1)，分別用G-50預裝柱脫鹽，凍幹，備用；3)測定CTXn的分子量及其胺基酸序列，測定CTXn的分子量為6697.429Da;測定CTXn的胺基酸序列如序列表SEQIDN2:l所述。本發明的第二個目的還可以通過採取如下技術措施達到實現本發明第二個目的的一種實施方案是第1)步採集舟山眼鏡蛇毒樣本來自中國大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優勢區域之一的江西宜春地區野外。實現本發明第二個目的的一種實施方案是凍2)步所用的AKTAe鄧lorerIOO快速純化工藝開拓系統為製備型高效液相色譜儀。實現本發明第二個目的的一種實施方案是第3)步採用質譜分析法(MALDI-TOF)測定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation測定CTXn的胺基酸序列。本發明的第三個目的可以通過採取如下技術措施達到用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的用途，其特徵在於1)用醋酸扭體法測定CTXn鎮痛作用，取體重20-25g的小鼠，經腹腔注射多組不同劑量CTXn作為實驗組、多組不同劑量嗎啡作為陽性對照組、多組不同劑量生理鹽水作為陰性對照組，經30min後，各組動物再經腹腔注射O.lml0.6%的醋酸aceticacid溶液，記錄出現典型扭體症狀的次數，分別對實驗組、陽性對照組及陰性對照組的結果測定，提示CTXn對醋酸所致小鼠內臟疼痛有明顯抑制作用；或者2)用熱板法測定CTXn鎮痛作用，取體重180220g的雄性大鼠，放置於UGO痛覺測試儀的金屬熱板上，開始記時，直至大鼠舔後足或縮爪，停止記時，這段時間為該只大鼠的痛反應潛伏期，實驗中，給藥前先測定大鼠基礎痛閾(潛伏期)，潛伏期大於30s則淘汰，各組大鼠在實驗中分別測定給藥後潛伏期，為了避免大鼠後足被燙傷，確定55s為中斷時；結果表明，CTXn高、中、低三個劑量組均可顯著提高大鼠對傷害性熱剌激的疼痛反應閾值，該結果提示CTXn對傷害性熱剌激所致的軀體痛有良好的鎮痛作用；或者3)用不同劑量CTXn對嗎啡成癮大鼠痛敏的影響，首先確定各組大鼠給藥前痛域無明顯差異，嗎啡組與CTXn各劑量組在連續8天嗎啡位置偏愛訓練後，嗎啡成癮的大鼠在痛覺測試儀上抬腳時間明顯縮短；dl0-dl8天，嗎啡組大鼠出現痛覺敏化，對痛覺反應強；而CTXn各組顯示了蛇毒對嗎啡成癮大鼠痛覺敏化有較強的鎮痛作用，有一定的劑量依賴性，連續8天給藥後鎮痛作用顯著；中、高劑量CTXn對嗎啡成癮後痛敏的鎮痛作用比低劑量CTXn;結果表明蛇毒CTXn對於嗎啡成癮後痛覺過敏有良好的鎮痛作用。本發明具有如下突出的有益效果1、CTXn鎮痛作用測定CTXn的LD50為16.60mg/kg，其鎮痛(醋酸扭體法)ED50為0.43mg/kg。在熱板及醋酸扭體實驗中，不同劑量CTXn(O.50、1.0和2.Omg/kg，ip)均能明顯提高動物對傷害性剌激的反應閾值，劑量效應關係明顯。52、不同劑量CTXn對嗎啡成癮大鼠痛敏的影響CTXn各組對嗎啡成癮大鼠痛覺敏化有較強的鎮痛作用，有一定的劑量依賴性，連續8天給藥後鎮痛作用顯著。高劑量CTXn(l-2mg/kg)對嗎啡成癮後痛敏的鎮痛作用較低劑量CTXn(O.5mg/kg)更強。3、以上研究表明，CTXn對傷害性剌激導致的軀體痛(somatalgia)、內臟痛(visceralpain)及嗎啡成癮後疼痛(疼痛症狀群)均有較強鎮痛作用，在治療疼痛方面有新用途。CTXn胺基酸序列清楚，成分單一，藥效顯著，質量標準可控，毒、副作用小，利於大規模的生產，在新的鎮痛藥開發方面有顯著的優點及廣泛的應用前景。圖1是CTXn在CMS印haroseFF離子交換色譜圖上的洗脫部位示意圖。圖2是用質譜分析法(MALDI-T0F)測定CTXn的分子量為6697.429Da示意圖。具體實施例方式以下的實施例均以CTXn鎮痛為例對本發明進行具體的闡述，但是本發明的保護範圍並不局限於此，本
技術領域：
的普通技術人員通過以上內容也能實現本發明的目的。實施例一醋酸扭體法測定CTXn鎮痛作用1)外採集舟山眼鏡蛇毒樣本；2)對前述舟山眼鏡蛇毒樣本進行CTXn的分離、純化，(1)首先進行凝膠過濾採用S印hacrylS-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTAe鄧lorer100快速純化工藝開拓系統進行分子篩過濾，獲得I、II及III個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPr印26/10Desalting脫鹽，凍幹，備用;(2)通過初篩，選取組分III進行下一步"離子交換"；(3)離子交換採用CMS印haroseFF±真料，組分III通過AKTAexplorer100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性多肽CTXn(圖1)，分別用G-50預裝柱脫鹽，凍幹，備用；3)測定CTXn的分子量及其胺基酸序列，測定CTXn的分子量為6697.429Da;測定CTXn的胺基酸序列為LKCNQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAPKVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN其中第1)步採集舟山眼鏡蛇毒樣本來自中國大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優勢區域之一的江西宜春地區野外。第2)步所用的AKTAe鄧lorerIOO快速純化工藝開拓系統為製備型高效液相色譜儀。第3)步採用質譜分析法(MALDI-TOF)測定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation測定CTXn的胺基酸序列。取小鼠(體重20-25g，雌雄均可)經腹腔注射不同劑量CTXn(實驗組)、嗎啡(陽性對照組)或生理鹽水(陰性對照組)，30min後，各組動物再經腹腔注射0.1ml0.6%的醋酸(aceticacid)溶液。醋酸溶液處理後，小鼠分別置於玻璃燒杯內使其適應5min，然後觀察10min，記錄該時段出現典型扭體症狀的次數。為了便於記錄，腹部和後肢因剌激而伸展一次定義為一次扭體反應。提前30min應用CTXn，高(2mg/kg)、中(lmg/kg)、低(0.5mg/kg)3個劑量組對醋酸所致小鼠扭體次數與生理鹽水對照組比較明顯減少，劑量-效應關係明顯(表l)。該結果提示CTXn對醋酸所致小鼠內臟疼痛有明顯抑制作用。表1扭體法測試4峰不同劑量的鎮痛效果(n=10)tableseeoriginaldocumentpage7*p<0.05，**p<0.01，與生理鹽水相比實施例二熱板法測定CTXn鎮痛作用取大鼠(雄性，體重180220g)放置於UGO痛覺測試儀的金屬熱板(表面溫度為55士0.5t:)上，開始記時，直至大鼠舔後足或縮爪，停止記時，這段時間為該只大鼠的痛反應潛伏期。實驗中，給藥前先測定大鼠基礎痛閾(潛伏期)，潛伏期大於30s則淘汰。各組大鼠在實驗中分別測定給藥後潛伏期。為了避免大鼠後足被燙傷，確定55s為中斷時。結果表明，CTXn高(2mg/kg)、中(lmg/kg)、低(0.5mg/kg)3個劑量組均可顯著提高大鼠對傷害性熱剌激的疼痛反應閾值(表2)，該結果提示CTXn對傷害性熱剌激所致的軀體痛有良好的鎮痛作用。表2熱板法測定不同劑量CTXn的鎮痛效果tableseeoriginaldocumentpage7*p<0.05，**p0.05)，嗎啡組與CTXn各劑量組在連續8天嗎啡位置偏愛訓練後，嗎啡成癮的大鼠在痛覺測試儀上抬腳時間明顯縮短。dl0-dl8天，嗎啡組大鼠出現痛覺敏化，對痛覺反應強；而CTXn各組顯示了蛇毒對嗎啡成癮大鼠痛覺敏化有較強的鎮痛作用，有一定的劑量依賴性，連續8天給藥後鎮痛作用顯著。中、高劑量CTXn(l-2mg/kg)對嗎啡成癮後痛敏的鎮痛作用比低劑量CTXn(0.5mg/kg)強(表3)。結果表明蛇毒CTXn對於嗎啡成癮後痛覺過敏有良好的鎮痛作用。表3:CTXn對嗎啡成癮大鼠痛敏的影響G±s，n=8)tableseeoriginaldocumentpage8#p<0.05vsN.Sgroup※p<0.01▲p1〈210>1〈211>720〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用於治療急、慢性疼痛的製藥新用途〈400>1LKCNQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAPKVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN8權利要求用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn，其特徵是1)所述CTXn的分子量為6697.429Da；2)所述CTXn的胺基酸序列如序列表SEQID№1所述。2.用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法，其特徵在於包括如下步驟1)外採集舟山眼鏡蛇毒樣本；2)對前述舟山眼鏡蛇毒樣本進行CTXn的分離、純化，(1)首先進行凝膠過濾採用S印hacrylS-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTAexplorer100快速純化工藝開拓系統進行分子篩過濾，獲得I、II及III個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPr印26/10Desalting脫鹽，凍幹，備用；(2)通過初篩，選取組分III進行下一步"離子交換";(3)離子交換採用CMS印haroseFF填料，組分III通過AKTAexplorer100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性多肽CTXn，分別用G-50預裝柱脫鹽，凍幹，備用；3)測定CTXn的分子量及其胺基酸序列，測定CTXn的分子量為6697.429Da;測定CTXn的胺基酸序列如序列表SEQIDN2:1所述。3.如權利要求2所述的用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法，其特徵在於第1)步採集舟山眼鏡蛇毒樣本來自中國大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優勢區域之一的江西宜春地區野外。4.如權利要求2所述的用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法，其特徵在於第2)步所用的AKTAe鄧lorer100快速純化工藝開拓系統為製備型高效液相色譜儀。5.如權利要求2所述的用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的提純方法，其特徵在於第3)步採用質譜分析法(MALDI-TOF)測定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation測定CTXn的胺基酸序列。6.用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn的用途，其特徵在於1)用醋酸扭體法測定CTXn鎮痛作用，取體重20-25g的小鼠，經腹腔注射多組不同劑量CTXn作為實驗組、多組不同劑量嗎啡作為陽性對照組、多組不同劑量生理鹽水作為陰性對照組，經30min後，各組動物再經腹腔注射O.lml0.6%的醋酸aceticacid溶液，記錄出現典型扭體症狀的次數，分別對實驗組、陽性對照組及陰性對照組的結果測定，提示CTXn對醋酸所致小鼠內臟疼痛有明顯抑制作用；或者2)用熱板法測定CTXn鎮痛作用，取體重180220g的雄性大鼠，放置於UGO痛覺測試儀的金屬熱板上，開始記時，直至大鼠舔後足或縮爪，停止記時，這段時間為該只大鼠的痛反應潛伏期，實驗中，給藥前先測定大鼠基礎痛閾(潛伏期)，潛伏期大於30s則淘汰，各組大鼠在實驗中分別測定給藥後潛伏期，為了避免大鼠後足被燙傷，確定55s為中斷時；結果表明，CTXn高、中、低三個劑量組均可顯著提高大鼠對傷害性熱剌激的疼痛反應閾值，該結果提示CTXn對傷害性熱剌激所致的軀體痛有良好的鎮痛作用；或者3)用不同劑量CTXn對嗎啡成癮大鼠痛敏的影響，首先確定各組大鼠給藥前痛域無明顯差異，嗎啡組與CTXn各劑量組在連續8天嗎啡位置偏愛訓練後，嗎啡成癮的大鼠在痛覺測試儀上抬腳時間明顯縮短；dl0-dl8天，嗎啡組大鼠出現痛覺敏化，對痛覺反應強；而CTXn各組顯示了蛇毒對嗎啡成癮大鼠痛覺敏化有較強的鎮痛作用，有一定的劑量依賴性，連續8天給藥後鎮痛作用顯著；中、高劑量CTXn對嗎啡成癮後痛敏的鎮痛作用比低劑量CTXn;結果表明蛇毒CTXn對於嗎啡成癮後痛覺過敏有良好的鎮痛作用。全文摘要本發明涉及用於鎮痛的蛇毒來源的細胞毒素CTXn及其提純方法和用途，其特徵是1)CTXn的分子量為6697.429Da；2)CTXn的胺基酸序列如序列表SEQID№1所述。製備方法是採用舟山眼鏡蛇毒樣本；對舟山眼鏡蛇毒樣本進行CTXn的分離、純化；通過初篩，選取組分III進行下一步「離子交換」；採用填料，組分III通過快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性多肽CTXn，分別用G-50預裝柱脫鹽，凍幹；測定CTXn的分子量及其胺基酸序列。本發明CTXn對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛及嗎啡成癮後疼痛均有較強鎮痛作用，並具有藥效顯著，毒、副作用小，利於大規模的生產的特點，在鎮痛藥開發方面有廣泛的應用前景。文檔編號A61K38/17GK101717441SQ20091021360公開日2010年6月2日申請日期2009年12月4日優先權日2009年12月4日發明者仲維高,信文君,劉先國,唐婭,孔天翰,崔超偉,崔躍,董偉華,黃紹申請人:廣州醫學院