用秀麗線蟲生物模型對甾體類激素進行檢測的方法
2023-10-05 02:31:39 1
專利名稱:用秀麗線蟲生物模型對甾體類激素進行檢測的方法
技術領域：
本發明屬於食品安全檢測、飼料安全檢測等技術領域：
。
背景技術：
秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一種可以獨立生存的線蟲，其個體小，成體僅I. 5mm長，為雌雄同體，雄性個體僅佔群體的0. 2%，可自體受精或雙性生殖，在20°C下平均生活史為3. 5天，平均繁殖力為300-350個，但若與雄蟲交配，可產生多達1400個以上的後代。秀麗線蟲的基因組大小為97Mb，分布於6條染色體，預測有編碼基因19717個，基因組序列40%與人類同源，這就意味著它與更高等的生物體共有一些相似的細胞及分子結構以及控制通路；它是第一個基因體完全被定序的多細胞真核生物，且每 一個體細胞的發育情況都研究得較為清楚，這個細胞世系的規律在各個個體之間是幾乎不變的；其遺傳背景清楚、個體結構簡單、生活史短；並且標本便宜、在實驗室中容易掌控。因此在衰老與壽命、人類遺傳性疾病、動物的應急反應、環境生物學等領域得到廣泛應用。例如用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品的世代毒性的方法(公開號CN 101451983A)等。
留體類激素是眾多環境激素類物質的一類化合物，其特點是具有很高的穩定性，對人體內分泌有幹擾作用。近年來，有關學者研究表明留體類激素對野生生物造成的危害主要表現為生殖器官、生殖機能和生殖行為異常。例如通過PCB-60、-104、-190及雌激素17 3-雌二醇對斑馬魚的實驗研究表明，這些激素物質可以大大增加魚類胚胎和幼體死亡率；長期暴露於IOu g/L壬基酚環境中的片腳類動物，其種群密度和生長速度明顯降低；在英國海灣生活的雄性比目魚由於受環境激素的影響，其血液卵黃素濃度有升高的趨勢，繁殖行為異常；美國佛羅裡達州汙染湖泊中的鱷魚幼體，由於受環境激素的影響，它們體內性激素的調節和甲狀腺激素的濃度有所改變。留體類激素在動物體內的殘留，通過食物鏈進入人體，會使人的正常生理功能發生紊亂，使小孩性成熟加快，影響正常生長和發育。
食品中留體類激素主要來源於生產源頭動植物自身的留體類激素、作為動物飼料添加劑和植物生長調節劑過量使用的外源性留體類激素、以及為了預防、治療動植物疾病和促進產量時給動植物使用藥物中的留體類激素，導致食品中留體類激素水平呈顯著上升趨勢。國內奶粉促幼兒性早熟事件，使得國家到地方各級政府高度重視。因此利用多細胞真核生物秀麗線蟲建立食品及飼料中留體類激素汙染物安全性生物模型是非常必要的，為食品與飼料中留體類激素汙染物檢測提供新方法。
目前國內外對食品與飼料中留體類激素的研究方法主要有高效液相色譜法、放射免疫分析法、分光光度法、薄層層析法、氣相色譜-質譜(GC-MS)法等化學方法和生物方法，這些方法都是從定量的角度來研究留體類激素，並且成本高、周期長，對實驗人員的技術要求也較高。
發明內容
本發明的目的是提供一種用秀麗線蟲生物模型對留體類激進行檢測的方法，利用多細胞真核生物秀麗線蟲建立食品及飼料中留體類激素汙染物安全性生物模型，為人類的食品安全問題提供理論、技術基礎和新型檢測方法。
本發明的技術方案如下
用秀麗線蟲建立食品與飼料中留體類激素汙染物生物模型。
本發明的方法是
一、利用秀麗線蟲生物模型對甾體類激素純品進行安全性危害檢測的方法
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從NGM培養板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9緩衝液定容於容器內，並加入等體積裂解液,上下顛倒混勻3-5min後1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉澱。沉澱改用無菌的S-Medium 反覆清洗2-3次至pH值達到中性，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於生化培養箱內(16°C _25°C )培養8_12h。由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)，1500rpm離心3min收集幼蟲，備用。
2、將甾體類激素純品溶於體積百分濃度為1%的二甲基亞碸中。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素純品中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細胞培養板，每孔加入I步驟收集獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液及留體類激素純品，並混勻，留體類激素的終濃度為0. Ing/ml-20ng/ml ;第二組為空白對照組用無菌的細胞培養板，每孔加入I步驟收集獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液。將這兩組樣品放入生化培養箱(16°C -25°C )中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中。
4、分別向兩組樣品的離心管中加入M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，去上清液，再加入M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入M9緩衝液搖勻。將兩組樣品取出分別塗布於含有E. coli 0P50的NGM固體培養基上，在生化培養箱(16°C -25°C )中培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，分別放入新的含有E. coli 0P50的NGM固體培養基上，生化培養箱(16°C-25°C )中培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含E. coli 0P50NGM固體培養基上，直到產卵期結束。丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及「蟲袋」(worm bag)應從統計數據中排除。採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行錄像，進行如下指標的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產卵時所需要的時間。
B、後代數目後代數目即整個產卵期的所有卵數。
C、世代時間P0代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線蟲在Imin內頭部擺動的次數(當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20 s內身體彎曲的次數。假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重複1、2、3、4步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項 生理指標的影響結果。
6、採用軟體0rigin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
二、利用秀麗線蟲生物模型對食品中留體類激素汙染物進行安全性危害檢測的方法
I、重複技術方案一中的步驟I獲得的同步化秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液。
2、將新鮮的實驗用食品清洗乾淨，用不鏽鋼手術刀切片，用濾紙濾幹水分，取適量置於均質器中絞成泥狀，置於離心管中，加入體積百分濃度為I %的二甲基亞碸中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩lmin，置於55°C水浴中保溫20min，取出漩渦振蕩20min，以3000rpm離心20min，吸出上清液為留體類激素提取液，並濃縮到濃度為80%以上。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素提取液中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液及留體類激素提取液，並混勻；第二組為空白對照組用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液。將這兩組樣品放入生化培養箱(16°C -25°C )中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中。
4、重複技術方案一中的步驟4、5、6。
三、利用秀麗線蟲生物模型對飼料中甾體類激素汙染物進行安全性危害檢測的方法
I、重複技術方案一中的步驟I獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液。
2、取飼料於具塞離心管中，加入氯仿，劇烈振搖並進行自然蒸發。再加入100%酒精溶解留體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至於通風櫥內將其風乾，用體積百分濃度為I %的二甲基亞碸溶解殘留物，並濃縮到濃度為80%以上。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素提取液中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液及留體類激素提取液，並混勻；第二組為空白對照組用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液。將這兩組樣品放入生化培養箱(16°C-25°C)中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中。
4、重複技術方案一中的步驟4、5、6。
本發明的有益效果是
I、秀麗線蟲是第一個基因體完全被定序的多細胞真核生物，有編碼基因19717個，大約35%的基因在人體中具有同系物，可作為研究 人的各種生命活動、生命現象的優秀模型生物，敏感性高，對研究留體類激素對人類健康的影響具有重大意義。
2、實驗過程周期短、高效、簡潔、方便、對儀器要求少(體視顯微鏡)，成本低，應用價值大；實驗結果的觀測直觀，暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在甾體類激素中的秀麗線蟲的生理指標具有顯著性差異，從不同側面真實的反映了留體類激素對秀麗線蟲生殖系統及生長發育的影響。
3、以往利用秀麗線蟲評價樣品毒性的實驗是對處於幼蟲第四期(L4期)的秀麗線蟲進行樣品暴露，本實驗是對處於幼蟲第一期(LI期)的秀麗線蟲進行留體類激素的暴露，測定秀麗線蟲從幼蟲第一期(LI期)到開始產卵的這段時間及世代時間，來鑑定在留體類激素影響下的生物早熟現象；測定秀麗線蟲的後代數目，來鑑定留體類激素對生物體生殖機能的危害；測定秀麗線蟲其他生理指標的變化，來鑑定留體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響。
具體實施方式
實施例I :用秀麗線蟲建立雌二醇純品生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從90mm NGM培養板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9緩衝液定容至500 ii I於I. 5ml EP管內。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min後1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉澱。沉澱改用無菌的S-Medium反覆清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於20°C培養8_12h。由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在幼蟲第一期，1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、將雌二醇純品溶於體積百分濃度為I %的二甲基亞碸中。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於雌二醇中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250iU，液體NGM培養液49iU，雌二醇溶液liil，並混勻。將幼蟲暴露於四個不同濃度的雌二醇中，雌二醇終濃度分別為0. lng/ml、l. Ong/ml>IOng/ml>20ng/ml共四個樣品，每個樣品設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，每個樣品的四個平行置入同一個15ml離心管中，得到四個不同濃度的樣品。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 u I E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養液50 yl。設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。[0050]4、分別向離心管中加入4ml M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩衝液搖勻。每個樣品中取出100 ill塗布於含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，20°C培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，此時的每個樣品再設四個平行，每個平行中挑入十隻線蟲，20°C培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養基上，直到產卵期結束。丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及「蟲袋」(worm bag)應從統計數據中排除。採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行3min的錄像，進行如下指標的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)幼蟲到開始產卵時所需要的時間。
B、後代數目即整個產卵期的所有卵數。
C、世代時間P0代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線蟲在Imin內頭部擺動的次數(當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20s內身體彎曲的次數。假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重複1、2、3、4步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果。
6、採用軟體0rigin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例2 :用秀麗線蟲建立豬肉中甾體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從90mm NGM培板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9緩衝液定容至500 ii I於I. 5ml EP管內。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min後1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉澱。沉澱改用無菌的S-Medium反覆清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於20°C培養8_12h。由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、肉類的處理將新鮮的實驗用肉類清洗乾淨，用不鏽鋼手術刀切取可食肌肉部分，用濾紙濾幹水分，取適量於均質器中絞成肉糜狀，稱取IOg置於離心管中，加入體積百分濃度為1%的二甲基亞碸中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩lmin，置於55°C水浴中保溫20min，取出漩渦振蕩20min，以3000rpm離心20min，吸出上清液為甾體類激素提取液，並濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素提取液中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養液49 yl，留體類激素提取液I U 1，並混勻。共設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液IOOii 1，E. coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養液50 y I。設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。4、分別向離心管中加入4ml M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩衝液搖勻。每個樣品中取出100 ill塗布於含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，20°C培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，此時的每個樣品再設四個平行，每個平行中放入十隻線蟲，20°C培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養基上，直到產卵期結束。丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及「蟲袋」(worm bag)應從統計數據中排除。採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行3min的錄像，進行如下指標的測定(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產卵時所需要的時間。
B、後代數目即整個產卵期的所有卵數。
C、世代時間P0代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線蟲在Imin內頭部擺動的次數(當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20 s內身體彎曲的次數。假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重複1、2、3、4步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果。
6、採用軟體0rigin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例3 :用秀麗線蟲建立奶粉中留體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從90mmNGM培養板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9緩衝液定容至500 ii I於I. 5ml EP管內。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min後1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉澱。沉澱改用無菌的S-Medium反覆清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於20°C培養8_12h。由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、準確稱取5g(精確到0. Ig)奶粉於50mL具塞離心管中，加入50mL氯仿，劇烈振搖並進行自然蒸發。再加入ImL 100%酒精溶解甾體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至於通風櫥內將其風乾，用體積百分濃度為I %的二甲基亞碸溶解殘留物，並濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素提取液中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到 0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養液49 yl，留體類激素提取液I U 1，共設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E.coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養液50 y I。設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。
4、分別向離心管中加入4ml M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩衝液搖勻。每個樣品中取出100 ill塗布於含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，20°C培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，此時的每個樣品再設四個平行，每個平行中放入十隻線蟲，20°C培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養基上，直到產卵期結束。丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及「蟲袋」(worm bag)應從統計數據中排除。採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行3min的錄像，進行如下指標的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產卵時所需要的時間。
B、後代數目即整個產卵期的所有卵數。
C、世代時間P0代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線蟲在Imin內頭部擺動的次數(當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20 s內身體彎曲的次數。假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲 生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重複1、2、3、4步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果。
6、採用軟體0rigin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例4 :用秀麗線蟲建立雞飼料中留體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從90mm NGM培養板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9緩衝液定容至500 ii I於I. 5ml EP管內。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min後1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉澱。沉澱改用無菌的S-Medium反覆清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於20°C培養8_12h。由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、準確稱取5g(精確到0. Ig)飼料於50mL具塞離心管中，加入50mL氯仿，劇烈振搖並進行自然蒸發。再加入ImL 100%酒精溶解甾體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至於通風櫥內將其風乾，用體積百分濃度為I %的二甲基亞碸溶解殘留物，並濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露於留體類激素提取液中
秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養液49 yl，留體類激素提取液I U 1，共設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處於幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E.coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養液50 y I。設四個平行，20°C暴露培養6h後分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。
4、分別向離心管中加入4ml M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩衝液搖勻。每個樣品中取出100 ill塗布於含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，20°C培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養基上，此時的每個樣品再設四個平行，每個平行中放入十隻線蟲，20°C培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養基上，直到產卵期結束。丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及「蟲袋」(worm bag)應從統計數據中排除。採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行3min的錄像，進行如下指標的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產卵時所需要的時間。
B、後代數目即整個產卵期的所有卵數。
C、世代時間P0代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線 蟲在Imin內頭部擺動的次數(當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20s內身體彎曲的次數。假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重複1、2、3、4步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果。
6、採用軟體0rigin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
權利要求
1.一種用秀麗線蟲生物模型對留體類激素進行檢測的方法，其方法是 A、利用秀麗線蟲生物模型對留體類激素純品進行安全性危害檢測的方法 a、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液，將正在產卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩衝液從NGM培養板中洗下，1500rpm離心Imin，棄去上清；如上法再用M9緩衝液清洗一次後將含秀麗線蟲的M9bufTer溶液定容於容器內，並加入等體積裂解液，上下顛倒混勻3-5min後1500rpm離心3min,棄去上清，收集底部沉澱；沉澱改用無菌的S-Medium反覆清洗2-3次至pH值達到中性，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好；將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放於生化培養箱內16°C _25°C培養8_12h ;由於沒有食物，蟲卵孵化以後會全部停止在秀麗線蟲幼蟲第一期，1500rpm離心3min收集幼蟲，備用； b、將留體類激素溶於體積百分濃度為1%的二甲基亞碸中； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露於留體類激素純品中 秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細胞培養板，每孔加入a步驟收集獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液及留體類激素純品，並混勻，留體類激素的終濃度為0. lng/ml-20ng/ml ;第二組為空白對照組，用無菌的細胞培養板，每孔加入a步驟收集獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液；將這兩組樣品放入生化培養箱16°C -25°C中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中； d、分別向兩組樣品的離心管中加入M9緩衝液，搖勻後靜置IOmin，去上清液，再加入M9緩衝液，搖勻後靜置lOmin，再去上清液，再加入M9緩衝液搖勻；樣品中取出塗布於含有E.coli 0P50的NGM固體培養基上，在生化培養箱16°C _25°C中培養直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有E. coli 0P50的NGM固體培養基上，生化培養箱160C _25°C中培養，每隔一天將線蟲挑出到新的含E. coli 0P50NGM固體培養基上，直到產卵期結束；丟失的線蟲、因爬到培養皿壁而死亡的線蟲以及蟲袋應從統計數據中排除；採用體視顯微鏡所帶的成像軟體對秀麗線蟲進行錄像，進行如下指標的測定 (1)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統的影響 (A)、從秀麗線蟲幼蟲第一期幼蟲到開始產卵時所需要的時間； (B)、後代數目，後代數目即整個產卵期的所有卵數； (C)、世代時間，PO代成蟲產卵到其Fl代成蟲產卵的時間間隔； (2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響 (A)、頭部擺動頻率，將已發育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經過Imin的恢復，記錄線蟲在Imin內頭部擺動的次數，當身體彎曲達到體長的一半作為I次頭部擺動； (B)、身體彎曲頻率，將已發育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養基上，記錄下20s內身體彎曲的次數，假定沿著咽泵的方向為y軸，那麼線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲； (3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發育的影響 (A)、壽命，以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應記為線蟲生命終止；線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間； (B)、體長的測定，線蟲身體僵直，無彎曲時的體長； e、重複a、b、C、d步驟，並將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h;獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標的影響結果； f、採用軟體Origin7. 5對數據進行顯著性分析，如果暴露後秀麗線蟲的生理指標與暴露前的生理指標具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明留體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害； B、利用秀麗線蟲生物模型對食品中留體類激素汙染物進行安全性危害檢測的方法 a、重複技術方案A中的步驟a獲得的同步化秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液； b、將新鮮的實驗用食品清洗乾淨，用手術刀切片，用濾紙濾幹水分，置於均質器中絞成泥狀，置於離心管中，加入體積百分濃度為I %的二甲基亞碸中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩Imin,置於55°C水浴中保溫20min,取出鏇潤振蕩20min,以3000rpm離心20min,吸出上清液為留體類激素提取液，並濃縮到濃度為80%以上； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露於留體類激素提取液中 秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液及留體類激素提取液，並混勻；第二組為空白對照組，用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液，將這兩組樣品放入生化培養箱16°C _25°C中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中； d、重複技術方案A中的步驟d、e、f。
C、利用秀麗線蟲生物模型對飼料中留體類激素汙染物進行安全性危害檢測的方法 a、重複技術方案A中的步驟a獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液； b、取飼料於具塞離心管中，加入氯仿，劇烈振搖並進行自然蒸發，再加入100%酒精溶解留體化合物濃縮1000倍，取出上清溶液，為留體類激素提取液；將所提取的液體放至於通風櫥內將其風乾，用體積百分濃度為I %的二甲基亞碸溶解殘留物，並濃縮到濃度為80%以上； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露於留體類激素提取液中 秀麗線蟲採用液體暴露方法進行暴露，設置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli0P50及液體NGM培養液及甾體 類激素提取液，並混勻；第二組為空白對照組，用無菌的細胞培養板，每孔加入獲得的處於秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養液，將這兩組樣品放入生化培養箱16°C _25°C中暴露培養6h後分別用移液槍將樣品取出，置於離心管中； d、重複技術方案A中的步驟d、e、f。
專利摘要
一種用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素汙染物生物模型及方法，屬於食品、飼料安全檢測技術領域：
，其模型是用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素汙染物生物模型。其方法是用秀麗線蟲建立甾體類激素純品生物模型，用秀麗線蟲建立食品中甾體類激素生物模型，用秀麗線蟲建立飼料中甾體類激素生物模型。有益效果是1、對研究甾體類激素對人類健康的影響具有重大意義。2、實驗過程周期短、高效、簡潔、方便、對儀器要求少，成本低，應用價值大。3、對處於幼蟲第一期的秀麗線蟲進行甾體類激素的暴露，測定秀麗線蟲從幼蟲第一期到開始產卵的這段時間及世代時間，來鑑定在甾體類激素影響下的生物早熟現象。
文檔編號A01K67/033GKCN101982075 B發布類型授權 專利申請號CN 201010276272
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月9日
發明者於化東, 於源華, 姚健, 宋禹, 張昊, 張淑華, 徐任, 李金海, 楊佳新, 林銘燕 申請人:長春理工大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),