凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因及其編碼蛋白的製作方法

2023-10-10 18:35:19 4

凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因及其編碼蛋白的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因及其編碼蛋白。所述的凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼的鈉鈣交換子LvNCX蛋白的胺基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明首次從凡納濱對蝦中克隆出鈉鈣交換子LvNCX基因，並通過實驗證明該基因能夠維持細胞體內鈉、鈣離子的平衡，為進一步深入分析NCX影響下生物抗逆能力，為NCX基因在凡納濱對蝦抗逆研究中的應用打下理論基礎。
【專利說明】凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因及其編碼蛋白
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程【技術領域】，具體涉及凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvVCX基因及其編碼蛋白。
【背景技術】
[0002]鈉鈣交換子(Sodium/calcium exchanger, NCX),為維持細胞體內鈉、鈣離子的平衡方面起著重要的作用，其是一種可逆膜轉運蛋白，NCX在細胞膜或者細胞器的膜上都有發現，其功能是將2個Na+移出細胞，I個鈣離子帶入細胞，也可以以相反方向進行。NCX的功能是鈣離子排出，以4:1:1 (Na+/Ga2+/K+)之比例排出，故為Na+/K+依存，是保持細胞內離子
穩定的一類重要通道。 [0003]凡納濱對蟲下(Litopenaeus vannamei),又稱白腳對蟲下、萬氏對蟲下、太平洋白蟲下，英文俗稱Pacific White Shrimp (太平洋白蟲下)(McGraw et al.，2002),我國俗稱「南美白對蝦」。該對蝦原產於西半球，主要分布於中南美洲從墨西哥西南沿海，經瓜地馬拉、薩爾瓦多、宏都拉斯、尼加拉瓜、哥斯大黎加、巴拿馬、哥倫比亞、厄瓜多至秘魯西部的太平洋沿岸。由於凡納濱對蝦具有繁殖期長；廣鹽性；廣溫性；可以密養產量高；抗病力較強；耐乾性較強；肉質鮮美；個體較大等優點目前已經成為是全世界產量最大的養殖對蝦，也是我國對蝦養殖的主導品種。在我國，養殖區域遍布於全國沿海的海水養殖區和內陸的淡水養殖區，養殖面積約25萬公頃，年產量超過100萬噸，海水養殖區和淡水養殖區產量各約佔50%，從2001年以來，我國養殖凡納濱對蝦麵積和產量一直居於對蝦養殖的首位。2009年凡納濱對蝦養殖產量約110萬噸，佔對蝦總產量的87%，其中廣東養殖產量超過四十萬噸，所佔比例接近40%。2010年我國蝦類產品的生產總量126萬噸，蝦類出口 21.6萬噸，出口值近
11.4億美元，年產值300~400億元人民幣，是我國水產養殖的支柱性產業。我國凡納濱對蝦養殖每年的種苗需求量超過5000億尾。
[0004]凡納濱對蝦在高低鹽環境中都可以養殖，這與該對蝦體內存在很強的鹽度調節機制以適應外界環境鹽度的變化是分不開的。鈉鈣交換子作為重要的離子通道基因在凡納濱對蝦遺傳育種研究中應用潛力很大，然而凡納濱對蝦的NCX基因篩選報導較少，且NCX基因的鑑定、表達分析及聚類情況研究至今未有報導。

【發明內容】

[0005]本發明第一個目的是提供一種凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvVCX基因及其編碼蛋白。
[0006]本發明的凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvVCX基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼的凡納濱對蝦鈉鈣交換子蛋白LvVCX的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。考慮到密碼子的簡併性，在不改變胺基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進行修改，也屬於本發明的保護範圍內。
[0007]凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因的分離過程包括以下步驟:
[0008]1、構建凡納濱對蝦抗低鹽脅迫抑制縮減雜交文庫；[0009]2、經過NCBI資料庫分析，篩選到LvNCX基因的部分序列；
[0010]3、逐級設計3』和5』 RACE (快速擴增cDNA末端)引物；
[0011]4、提取凡納濱對蝦腮組織的RNA反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板，採用步驟3中的引物進行PCR擴增出LvNCX基因的3』和5』序列，採用瓊脂糖凝膠電泳回收片段，連接於pMD18-T載體上，測序分析之後利用DNAStar軟體對序列進行拼接,其序列如SEQ IDN0.1所示，將此序列命名為凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因，其編碼蛋白具有861個胺基酸殘基，其序列如SEQ ID N0.2所示，將該蛋白命名為凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX蛋白。將 LvNCX 基因編碼的蛋白質在 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中米用 Blastx 程序進行序列比對之後，發現該蛋白和Nasonia vitripennis的鈉鈣交換子序列有72%的同源性(如圖1所示)，說明LvNCX基因所編碼的蛋白具有鈉鈣交換子的結構特徵。經Blastx比對，LvNCX基因所編碼的蛋白序列不與任何先前已公布的蛋白序列完全一致，說明其是一個新發現的蛋白序列。
[0012]提取凡納濱對蝦在高鹽脅迫和低鹽脅迫下的鰓、消化腺、肝胰腺、上皮組織及肌肉組織，利用實時定量螢光PCR技術分析LvNCX基因在不同組織的表達情況，研究結果表明凡納濱對蝦的各個組織在低鹽度脅迫表達量都明顯高於對照組，然後在高鹽度脅迫中的上皮組織的表達量稍低。與此同時高鹽度脅迫下，LvNCX在肝胰腺組織和肌肉組織中明顯高於低鹽度脅迫下的表達；反之鰓組織和消化腺組織中LvNCX表達量在低鹽度脅迫下明顯高於高鹽度脅迫的表達；利用生物學軟體做LvNCX基因的系統進化樹，結果表明LvNCX基因是凡納濱對蝦的鈉鈣交換子基因。
[0013]本發明首次從凡納濱對蝦中克隆出凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因，為進一步深入分析NCX影響下生物抗逆能力，為NCX基因在凡納濱對蝦抗逆研究中的應用打下理論基礎。本發明通過對N CX基因cDNA表達調控規律的研究進一步驗證LvNCX基因在鹽度脅迫下的作用機理，提供了下一步探索和提高凡納濱對蝦抗逆選育的分子標記。同時還可以利用LvNCX基因的表達情況來有針對性的對凡納濱對蝦的抗逆選育提供理論指導。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是LvNCX基因編碼的蛋白的Blastx對比結果圖；
[0015]圖2是凡納濱對蝦腮組織RNA電泳圖，其中M為DL2000的Marker，I為凡納濱對蟲下腿組織RNA ；
[0016]圖3是首次3』 RACE結果，其中M為DL2000的Marker，I為3』 RACE產物；
[0017]圖4是首次5』 RACE結果，其中M為DL2000的Marker，I為5』 RACE產物；
[0018]圖5是重組載體pMD18-LvNCX5』 RACE轉化大腸桿菌後的菌落PCR檢測電泳圖，其中M為DL2000的Marker, I~24為陽性菌落PCR擴增產物；
[0019]圖6 是第二輪 3 『RACE 結果，其中 M 為 DL2000DNA 的 Marker，I 為 3』 RACE PCR 產物I用M3-3和UPM引物擴增結果，2為3，RACE PCR產物2用M3-4和UPM引物擴增結果，3為3，RACE PCR產物3用M3-5和UPM引物擴增結果；
[0020]圖1 是第二輪 5 『RACE 結果，其中 M 為 DL2000 的 Marker，I 為 5』 RACE PCR 產物；
[0021]圖8是LvNCX基因的組織特異表達分析步驟中RNA提取結果，其中M為DL2000DNA的Marker，I~5分別為凡納濱對蝦鰓組織、消化腺組織，肝胰腺組織、上皮組織和肌肉的RNA。
[0022]圖9是LvNCX基因的組織特異表達分析步驟中cDNA合成結果，其中M為DL2000DNA的Marker，I~5分別為凡納濱對蝦鰓組織、消化腺組織，肝胰腺組織、上皮組織和肌肉的cDNA。 [0023]圖10是LvNCX基因的組織表達特異性表達結果；
[0024]圖11是LvNCX蛋白的進化樹分析；
[0025]圖12是LvNCX的全長cDNA擴增結果，M為DL15000，I為全長cDNA擴增結果。
[0026]圖13是原核重組表達載體pET-32a_LvNCX誘導表達的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白Marker，I為未經IPTG誘導的原核表達載體pET_32a，2為IPTG誘導2.5小時的原核重組表達載體pET-32a-LvNCX，3為經IPTG誘導5個小時的原核重組表達載體pET-32a-LvNCX。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，所採用的技術手段通常為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0028]實施例1:
[0029]一、凡納濱對蝦鈉鈣交換子基因LvNCX的克隆及測序
[0030]1、引物的設計
[0031]以經淡水應激6h後的個體為Tester，鹽度30培育的個體為Driver，構建鹽度抗性性狀相關的縮減cDNA文庫，從文庫隨機挑選24個菌落PCR鑑定，插入片段的長度介於200~599bp。文庫的庫容量為2500個克隆，隨機挑選500個克隆進行測序分析，共獲得325個高質量的表達序列標籤(ESTs)，得到275個Unigenes (104個Contags和171個Singletons)。經與GenBank資料庫進行BLASTx和BLASTn同源性比較，其中79.1%為已知功能基因，與鹽度抗性性狀相關的基因包括Na-Ca交換子，根據EST序列設計5』和3』 RACE引物，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。
[0032]2、RNA 的提取
[0033]以凡納濱對蝦腮組織為材料，使用Trizol法提取總RNA，具體操作如下:
[0034]在養殖場，取凡納濱對蝦腮組織放入離心管中馬上放入液氮中速凍。加入ImLTrizol提取液(購自invitrogen公司，貨號為15596-026)用小的碾磨棒碾碎，室溫放置5min，使其充分裂解，再加入500ml氯仿，上下振蕩混勻15min，室溫放置15min，4°C 12000g離心15min，取上清，上清中加入Iml無水乙醇混勻，_20°C冷凍10_20min，4°C 12000g離心IOmin,再加入lmL75%乙醇,溫和振蕩離心管,懸浮沉澱,4°C 8000g離心5min,室溫晾乾,再加入50 u IDEPC處理水待溶解充分後測OD值定量RNA濃度。RNA電泳結果如圖2所示。
[0035]3、cDNA 的合成
[0036]以提取的凡納濱對蝦腮組織的RNA為模板，用Superscript? III反轉錄酶(購自invitrogen 公司，貨號為 18080-051)合成 cDNA，具體步驟為:RNA2u 1(約 5 y g)、01igo(dT)20lu l、10mM dNTPl u I，DEPC水補足總體積至13 y I ;65°C處理5min後，轉至冰上IOmin ;再加入5X第一鏈緩衝液4iil、0.1MDTTl ill、RNA酶抑制劑liil，liil反轉錄酶，25°C反應5min,然後50°C反應60min ;70°C處理15min使反轉錄酶失活,得到cDNA序列。[0037]4、RACE 反應
[0038]具體操作步驟如下:
[0039]對ESTs序列進行測序，依據ESTs序列設計5』和3』RACE引物M5_1，M5_2和M3-1，M3-2，引物序列如下:
[0040]M5-1:TTCCCGACGGCGAGGTCCGCTACATCAA
[0041]M5-2: CTCCGTGTTCGCCTACATCTGGCTCTAT
[0042]M3-1:AGAGCCAGATGTAGGCGAACACGGAGAA
[0043]M3-2:GATGTAGCGGACCTCGCCGTCGGGAATG
[0044]Gene Racer 按照 Invitrogen 的 Geiu'Racer? Kit with AMV RT and TOPOTA Cloning? kit for Sequencing說明書進行。5，和3，RACE的反應體系分別為20 u L,其中包含 2 u LlOXAdvantage PCR 緩衝液，I y LlOmM dNTPs，I y LlO y M 引物 M5-1/M3-1，
Iy L Advantage?〗 polymerase mix (Clontech, JAP), 5 u LlO u M 通用引物 UPM (具體序列參照說明書)，I U L cDNA (IOng)，加ddH20補齊至Ij 20 u L。PCR反應程序如下:進入27個循環，94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 2min。第二輪巢式擴增反應體系包括:5 y LlO X Advantage PCR緩衝液，2 u LlOmMdNTPs, 2 y LlO y M 引物 M5-2/M3-2，I u L Advantage? 2 polymerase mix,
IU L第一輪擴增產物，5 ii LlO ii M通用引物NUP (具體序列參照說明書)再加ddH20補齊到20ii L，反應程序是 94°C 2min,30 個循環 94°C 30s, 65°C 30s, 68°C 2min ;最後 72 度延伸 10分鐘。將PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3和圖4所示。使用瓊脂糖凝膠回收試 劑盒(購自天根生化科技有限公司，貨號為DP209)對瓊脂糖凝膠電泳中的目的條帶進行回收，具體操作步驟參照產品說明書。
[0045]採用pMD18-T vector kit (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號為D101A)對LvNCX基因進行TA克隆，具體步驟為:向1.5mL離心管中分別加入上述第二輪巢式擴增反應產物2.5111、口]\?18-1'載體1111 (50ng/ill)、Ligation Solution I 3.5yl，用封口膜封好，置於金屬浴中16°C過夜連接獲得連接產物。
[0046]使用熱激法將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞(購自天根生化科技有限公司，貨號為CB101)，具體步驟為:將7iU上述連接產物加入到100 ill大腸桿菌E.coli DH5 a感受態細胞中，混合，再將混合液冰浴20min，42°C熱刺激45s，再冰浴2min，加入900 u I SOC液體培養基，370C、150rpm搖床培養60min ;在超淨臺上吸取300 U I菌液於含有Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養基平板上，用無菌三角玻璃棒塗布均勻，37 °C過夜培養。
[0047]在上述過夜培養的LB固體培養基平板上挑取白色菌落，接種到帶有Amp抗性的LB液體培養基中培養12h，用pMD18-T vector kit載體引物M13-47和RV-M (具體序列見pMD18-Tvector kit說明書)進行菌落PCR檢測重組情況，PCR擴增體系和條件與之前擴增LvNCX基因相同。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示，由此得到含有重組載體pMD18-LvNCX的陽性克隆，該陽性克隆是將pMD18-T載體與基因LvNCX相連接。委託英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。在測序結果的基礎上再設計第二輪5』和3』 RACE引物，具體操作步驟和上述5』和3』 RACE反應相同，第二輪RACE產物再做克隆測序，圖6所示為第二輪3』 RACE電泳結果。[0048]第二輪5』 RACE所用引物如下:
[0049]M5-3: CGCCGATGAAGAGCCGCACCATAGCCAC
[0050]M5-4:GCCGCACCATAGCCACGAAATAAACGAT
[0051 ] 以M5-3和M5-4分別結合UPM及NUP引物做巢式擴增的結果如圖7所示。
[0052]第二輪3』 RACE所用引物如下:[0053]M3-3:ATCACTTCCTTCTTCTCCGTGTTCG
[0054]M3-4:GTACGGAGTGGTGGAGTTCTGGGAGG
[0055]M3-5:GAGCAAGGAGTACCGTCTGAACAGG
[0056]進行第二次3『RACE，分別用M3-3，M3_4，M3_5引物結合UPM引物擴增，擴增結果用上述方法克隆測序。把所有的測序結果利用DNAStar軟體進行拼接，最終獲得LvNCX的全長cDNA序列，長度是為3274bp,其中開放閱讀框位於166~2672位核苷酸,這一閱讀框編碼861個胺基酸殘基,包含一個Na-Ca-ex結構域,證明這個蛋白質是鈉鈣交換子，該胺基酸具有SEQ ID N0.2所示的序列。拼接後序列進行比對之後發現與Pseudopodoces humilis胺基酸序列有72%的同源性(如圖1所示)。
[0057]二、LvNCX基因的組織特異表達分析
[0058]1、RNA 的提取
[0059]在養殖場，取經淡水(3ppt)、高鹽度(40ppt)應激6h後的凡納濱對奸個體的組織，包括肌肉、鰓組織、肝胰腺組織、上皮組織和消化腺組織，以及對照的各個組織分別放入1.5ml離心管中，然後放入液氮速凍，以保證RNA不被降解。所有組織拿回實驗室之後，使用Trizol法提取總RNA,具體步驟為:加入ImL Trizol提取液(購自invitrogen公司，貨號為15596-026)用小的碾磨棒碾碎，室溫放置5min，使其充分裂解，再加入500ml氯仿，上下振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min，4°C 12000g離心15min，取上清，上清中加入Iml無水乙醇混勻，_20°C冷凍110-20min，4°C 12000g離心lOmin，再加入lmL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉澱，4°C 8000g離心5min，室溫晾乾，再加入50 u I DEPC處理水待溶解充分後測OD值定量RNA濃度。RNA電泳結果如圖8所示。
[0060]2、cDNA 的合成
[0061]分別以提取的凡納濱對蝦肌肉、鰓組織、肝胰腺組織、上皮組織和消化腺組織的RNA為模板，用Superscript? m反轉錄酶(購自invitrogen公司，貨號為18080-051)合成cDNA，具體步驟為:RNA2iU(約 g)、01igo(dT)2Clliil、10mM dNTPl yl，DEPC 水補足總體積至13iU ;65°C處理5min後，轉至冰上IOmin ;再加入5X第一鏈緩衝液4iU、0.1MDTTl U 1、RNA酶抑制劑liil，liil反轉錄酶，25°C反應5min，然後50°C反應60min ;70°C處理15min使反轉錄酶失活，得到cDNA序列。cDNA電泳結果如圖9所示。
[0062]3、螢光定量PCR擴增
[0063]利用SYBR? Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, JAP)試劑盒和根據已經拼接的LvNCX基因的核心序列設計螢光定量PCR引物。NCX-real F:
[0064]ATCGTTTATTTCGTGGCTATGG, NCX-real R:GCACCACAATAATCTGCGTCTC。(引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成)。在RotorGene3000 (Corbett Research, Australia)進行螢光定量PCR擴增，擴增程序如下:95°C 2min，進入40個循環95°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s。以設計好的凡納濱對蝦P -actin作為內參(P -actin F:ACCATCCAGGCTGTGCTTTC ；3-actin R: ACCTTCATAAACGGGGACCA ) ? 反應體系是 20 y L，其中包含上下遊引物 0.2, IOu Lof2><SYBR? Premix Ex Taq?, IuL cDNA。每一個反應做三個重複。數據利用 Rotor-geneversione.0進行分析。LvNCX基因的相對表達量利用2_AACT進行統計。所有的數據都利用SPSS Statisticsl7 (Chicago, USA)中的單項方差統計，P〈0.05。最終的表達結果如圖10所示。研究結果表明凡納濱對蝦的各個組織在低鹽度脅迫表達量都明顯高於對照組，然後在高鹽度脅迫中的上皮組織的表達量稍低。與此同時高鹽度脅迫下，LvNCX基因在肝胰腺組織和肌肉組織中明顯高於低鹽度脅迫下的表達；反之鰓組織和消化腺組織中LvNCX基因表達量在低鹽度脅迫下明顯高於高鹽度脅迫的表達。
[0065]三、LvNCX的系統進化樹構建
[0066]用本發明得到的凡納濱對蝦LvNCX基因全長cDNA及其編碼的蛋白質序列，在GeneBank的資料庫中進行BLAST程序進行Blastx比對。LvNCX蛋白質的系統進化樹依據下載的部分LvNCX蛋白質序列利用MEGA5軟體Maximum Likelihood method來構建,結果如圖11所示，結果表明所分析的12條蛋白質序列包括凡納濱對蝦的LvNCX蛋白，清晰地按照系統進化順序歸為兩類，一類是脊椎動物門包括Xenopus laevis CAA62345,Mus musculusAAL18847, Pseudopodoces humilis XP005525436.1, Squalus acanthias AAZ08577, Homosapiens AAN60792, Meleagris gallopavoXP0032065, Oreochromis niloticusXP00345,Anolis carolinensis XP0032294。另外一類是節肢動物門包括 Ixodes scapularisXP002400531, Aedes aegypti XP001663976, Nasonia vitripennis XP001600652.1, Apismellifera XP393309,Harpegnathos saltator EFN81923,以及依據本專利獲得的核酸序列推導出的LvNCX蛋白。因此，LvNCX序列是凡納濱對蝦的鈉鈣交換子基因。
[0067]四、原核重組表達載體pET-32a_LvNCX的誘導表達
[0068]根據LvNCX 的全長 cDNA 設計上遊引物(5，-ACGGGATCCGCCACCATGGTGYGGCTCTTC-3』)(下劃線表示酶切位點BamHI) 和下遊引物(5』 -AGCAAGCTTTAGAGAGGGGATG-3，)(下劃線表示酶切位點Hindlll)，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，利用PrimeSTAR? Max DNA Polymerase (TaKaRa)的擴增全長cDNA序列。PCR 擴增反應體系共 20ii 1:PrimeSTAR Max Premix(2X) 10 y 1、cDNA 模板 I y 1、IOiiM上遊引物IiUUOiiM下遊引物liil，使用ddH20補足至20 ill。反應條件為:94°C 30,35個循環，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C有延伸lmin30s。將PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖12所示。
[0069]使用BamHI限制性內切酶和HindIII限制性內切酶對原核表達載體pET_32a (購自天根生化科技有限公司，貨號為V1078)分別進行雙酶切獲得LvNCX基因片段和線型的pET-32a雙酶切片段，具體步驟為:向0.5mL離心管中分別加入全長cDNAlO yl、BamHI限制性內切酶0.5iil、HindIII限制性內切酶0.5iil、10XK buffer2iil，使用ddH20補足至20iU，37°C反應8h。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收LvNCX基因和原核表達載體pET-32a，將回收的片段進行連接，具體步驟為=LvNCX基因片段
2u I (約 lOOng)、原核表達載體 pET_32al u I (50ng/U I)、Ligation Solution I5iil,加ddH20補足lOiil，金屬浴中16°C連接過夜，將原核表達載體pET-32a和LvNCX基因連接，得到原核重組表達載體pET-32a-LvNCX。用熱激發轉化BL21感受態細胞(購自天根生化科技有限公司，貨號CB106)具體步驟同上述熱激轉化法。[0070]取500 ill原核重組表達載體pET-32a_LvNCX的BL21菌液和原核表達載體pET-32a菌液置於20mL LB液體培養基中，37°C、200rpm搖床培養2h，培養結束後，分別取出lml，測定菌液0D600值，當0D600達到0.6，再分別取出2管(2ml/管)菌液，作為未經IPTG誘導的樣品和未經IPTG誘導的陰性對照，再分別向剩餘的兩種菌液中加入終濃度為1.0mM的IPTG進行誘導，30°C、180rpm搖床培養2.5h和5.0h,分別取出2管(2ml/管)菌液，作為經IPTG誘導的樣品。
[0071 ] 未經IPTG誘導的陰性對照、經IPTG誘導2.5h的樣品、經IPTG誘導5.0h樣品各取一管(2ml/管),用於總蛋白分析。具體步驟如下:4°C、12000rpm離心2min,棄上清,加入IOOiU細菌蛋白抽提緩衝液，再加入25iU5X蛋白上樣緩衝液(Loading Buffer)，然後煮沸 5min，-20°C保存。
[0072]對上述2種樣品和I種對照進行SDS-PAGE電泳檢測分析。具體步驟如下:製備分離膠、濃縮膠，各上樣10 yl，電泳後，取出分離膠，置於固定液中，搖床固定30min，棄固定液，加入染色液染色30min，棄染色液，加入脫色液，脫色60min ;棄脫色液，加入ddH20，搖床45rpm過夜，取出膠體，置於膠板上掃描，結果如圖13所示。[0073]由此可見，經IPTG誘導2.5h和5h的樣品均誘導出LvNCX蛋白，其中2.5h的表達量明細高於5h的表達量，而經IPTG誘導的陰性對照則沒有誘導出LvNCX蛋白。
【權利要求】
1.一種凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種由權利要求1所述的凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX基因編碼的凡納濱對蝦鈉鈣交換子LvNCX蛋白， 其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C12N15/12GK103614383SQ201310573692
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】王豔紅, 任春華, 胡超群, 張呂平, 羅鵬 申請人:中國科學院南海海洋研究所