疊氮胸苷治療白血病的新用途的製作方法

2023-10-10 20:39:24 1

專利名稱：：疊氮胸苷治療白血病的新用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種疊氮胸苷的新用途，本發明特點涉及一種疊氮胸苷治療白血病的新用途。
背景技術：
：白血病是造血組織的惡性疾病，又稱"血癌"。其特點是骨髓及其他造血組織中有大量白血病細胞無限制地增生，並進入外周血液，而正常血細胞的製造被明顯抑制。白血病是造血系統的惡性腫瘤，是我國最常見的惡性腫瘤之一。根據回顧調査，各地區白血病的發病率在各種腫瘤中佔第六位，該病居年輕人惡性疾病中的首位。疊氮胸苷(AZT)是一種核苷類逆轉錄酶抑制劑，在世界範圍內已被廣泛使用治療愛滋病，它能有效清除愛滋病患者體內的病毒。但疊氮胸苷(AZT)用於治療白血病的報導還不曾見到。
發明內容本發明的目的在於公開疊氮胸苷用於治療白血病的新用途。藥效實驗表明，疊氮胸苷具有抑制人白血病細胞Jukat及鼠白血病細胞L615生長的作用；可以抑制小鼠L615白血病模型外周血、骨髓及肝脾組織的侵潤，顯著延長白血病小鼠的生存期；有效減低小鼠Friend病毒感染後脾臟中病毒載量，對治療Friend鼠白血病病毒誘發的急性紅白血病有顯著作用。圖l:AZT對白血病細胞增值的影響；圖2:模型組的外周血塗片，瑞氏染色X1000;圖3:AZT組的外周血塗片，瑞氏染色X1000圖4:模型組的骨髓塗片，瑞氏染色X1000圖5:AZT組的骨髓塗片，瑞氏染色X1000圖6:模型組的肝組織切片，HE染色X1000圖7:AZT組的肝組織切片，HE染色X1000圖8:模型組的脾組織切片，HE染色X1000圖9:AZT組的脾組織切片，HE染色X1000圖10:MuLV感染28天後脾臟病毒mRNA表達凝膠電泳圖；本發明目的是通過如下實驗例實現的實驗例l疊氮胸苷抑制白血病細胞增值實驗1、實驗材料(1)藥品與試劑疊氮胸苷(AZT);RPMI1640購於GIBIC0;胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司產品；二甲基亞碸(DMS0):北京化學試劑公司；MTT購於SIGMA.。(2)腫瘤細胞株鼠白血病細胞L615及人白血病細胞Jukat。(3)主要儀器倒置顯微鏡日本OLYMPAS公司產品。酶標儀美國BIO-RAD公司550型。2、MTT比色法檢測細胞增殖抑制率將處於對數生長期細胞配製成濃度為12X104個/ml的細胞懸液，按10002000個細胞/孔接種於96孔板，每孔加lOOul。次日加含不同濃度化合物及相應溶劑對照的新鮮培養基，每孔加100u1(DMSO終濃度〈0.1%)，受試化合物設510個劑量組，以10mg/ml為最大終濃度依次向下5倍稀釋(陽性藥以5mg/ml為最大終濃度依次向下2倍稀釋)，每組設5個平行孔，於37。C繼續培養48h後，每孔加無血清培養基新鮮配製的0.5mg/mlMTT100^1，繼續培養4h，然後，每孔加200ylDMSO溶解甲臢顆粒，用微型振蕩器振蕩混勻後，於酶標儀上測定光密度值(OD)(參考波長655nm，檢測波長570nm)，以溶劑對照處理腫瘤細胞為對照組，數據處理以T/C表示，T/C9^100X0D值處理組/OD值對照組，通過回歸計算，可求出T/C二50。/o的藥物濃度，即IC50值，並按下述公式計算化合物對腫瘤細胞的抑制率4對照組0D均值一給藥組0D均值抑制率(％)=-X100%對照組OD均值3、統計分析使用EXCEL統計學軟體進行分析，進行多組t檢驗，P〈0.05時，具有統計學意義。4、結果結果如附圖l所示，不同濃度AZT對人白血病細胞Jukat及鼠白血病細胞L615的生長抑制作用呈劑量依賴性，實驗組與對照組進行比較，差異具有顯著性(P<0.01)。通過直線回歸計算，IC50值為2.924mg/ml、0.028mg/ml。由此說明AZT可以明顯抑制白血病細胞的生長。實驗例2疊氮胸苷對小鼠L615白血病細胞生長的抑制實驗1、實驗材料(1)藥品及試劑克度(AZT，齊多夫定片)，東北製藥總廠產品，購自中國醫藥保健品進出口總公司；環磷醯胺(CTX，上海華聯製藥有限公司生產；RPMI1640培養基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，瑞氏染液。(2)實驗儀器及器械C02培養箱，倒置顯微鏡，光學顯微鏡，celltacMEK-6318K血細胞分析儀。(3)細胞株L615白血病細胞株由中國醫學科學院天津血液病研究所病理細胞庫提供。(4)動物615近交系小鼠36隻，SPF級，810周齡，體重2528g，雄性，由中國醫學科學院血液研究所提供。2、實驗方法(1)細胞培養L615白血病細胞株在含10%胎牛血清的RPMI-1640中，於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養，取對數生長期細胞進行造模。(2)小鼠模型的建立及給藥將小鼠隨機分為3組，每組12隻，即模型對照組、AZT組和CTX組。取對數生長期L615細胞，調整細胞終濃度為1.0X106/ml，給小鼠腹腔接種L615細胞0.2ml/只，造成L615白血病模型[2]。接種細胞後第3d開始給藥，每日l次，連續5天，模型組以生理鹽水灌胃，0.4ml/d;AZT組以AZT90mg/kg—1cT灌胃；CTX組腹腔注射環磷醯胺200mg/kg—1d—、以上各組動物每組取6隻於接種後第7d(給藥第5d)處死，餘下動物進行生存期觀察。(3)觀測指標①一般情況觀察小鼠精神、食慾、毛色及體重變化；②生存期觀察生命延長率用公式(治療組平均生存天數/模型組平均生存天數-l)X10(F。得出；③外周血血常規分析及細胞塗片；④骨髓塗片及骨髓白細胞分類；⑤肝脾臟器指數計算及病理學檢查肝(脾)指數二肝(脾)質量/體質量xiooy。(4)統計學處理實驗結果以^士S表示。用單因素方差分析進行統計處理，分析組與組之間的差異。以代O.05作為差異顯著性標準，以屍〈0.01作為差異極顯著性標準。3、實驗結果(1)一般情況接種L615細胞的小鼠發病後均出現精神狀態差、食慾下降，活動減少以及毛皮光澤度降低，體重不增或下降。(2)生存時間AZT組和CTX組與模型組相比，生存時間顯著延長(屍<0.01)，其延長時間及生命延長率見表l。表l各組小鼠生存時間比較(；±S)組別只數生存時間(d)生命延長率(％)模型68.1±0.22AZT611.2±0.27**38.27CTX618.7±0.45**130.8與模型組比較林P〈0.01(3)外周血血常規分析及細胞塗片接種細胞的小鼠都於34d後發病，血塗片找到L615細胞即證實小鼠發病。各組小鼠在病程早、中期血小板數量逐漸升高，進入白血病晚期隨之下降，模型組下降更為顯著；與模型組相比，AZT能明顯降低患病小鼠的WBC及RBC數，差異具有統計學意義(代O.05或代0.01);與CTX組相比，AZT對正常血細胞的破壞性較小(見表2)。鏡下可觀察到AZT和CTX組的白血病細胞出現核固縮、碎裂、溶解等細胞壞死的徵象(附圖2，附圖3)，CTX組細胞壞死的尤為明顯，甚至部分正常血細胞也發生壞死。表2小鼠外周血WBC、PLT計數(X109/L)及RBC計數(X1012/L)比較(〗±s)組給藥前(n-12)給藥第3天(n-12)給藥第5天(n42)瀕死期(n-6)別tableseeoriginaldocumentpage7與模型組比較*P〈0.05，**P<0.01;同組間與給藥前比較，9P<0.05，e9p〈o.oi(4)骨髓塗片鏡下可見L615細胞侵潤骨髓，低倍鏡下明顯可見AZT和CTX組小鼠骨髓內L615細胞要少於模型組，高倍鏡下可觀察到同外周血較為一致的L615細胞破壞的跡象，細胞核表現為固縮，碎裂，部分細胞核出現溶解的現象(圖4，圖5)。(5)肝脾指數計算及病理學檢査小鼠發病後肝脾明顯腫大，AZT和CTX組小鼠肝脾腫大不如模型組，指數也明顯低於模型組，與模型組相比具有統計學差異(代O.01)(表3)。肝脾病理切片可看出AZT和CTX組中L615細胞的浸潤程度明顯輕於模型組小鼠，AZT和CTX組中能見到肝臟中有未被破壞的肝臟動靜脈、門靜脈、肝管以及脾臟中的小梁，較為清晰明顯的脾臟白髓質分界，肝臟血管周圍的白血病細胞較少。而模型組小鼠的肝脾正常結構被破壞，整個肝臟脾臟中絕大部分可見白血病細胞浸潤，肝臟血管周圍完全被白血病細胞包圍(圖6-9)。表3各組小鼠肝脾指數比較(^士s)(n=12)tableseeoriginaldocumentpage7與模型組比較**P〈0.01實驗例3疊氮胸苷對Friend鼠白血病病毒的影響實驗1、實驗材料(1)病毒株Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)購自ATCC，在BALB/c小鼠體內傳代，-7(TC保存。(2)動物BALB/c小鼠，SPF級，雌雄各半，體重(18土l)g。(3)藥物疊氮胸苷(AZT)，東北製藥總廠產品，購自中國醫藥保健品進出口總公司。2、實驗方法(1)小鼠模型的建立及給藥將感染Fr.MuLV的發病小鼠的脾臟無菌取出，研磨，用DMEM製成質量體積比為1:10的懸液，4°C2.0X103r*min—工離心10min，取其上清腹腔感染小鼠。感染後2h,AZT以90mgkg-1c^的劑量灌胃給藥，正常對照組、模型對照組以生理鹽水灌胃，每日l次，連續28d。(2)脾臟病毒載量的測定用TRIzol試劑提取脾細胞中病毒RNA，參照試劑盒說明進行逆轉錄反應，製備cDNA，反應總體積為20pl，反應在42。C孵育60min，95°C5min終止反應。參照試劑盒說明進行PCR反應，反應體系總體積為25ul，PCR反應循環參數設置為變性溫度94'C，30s;退火溫度55X:，30s;延伸溫度72。C，1min。共30個循環，72。C保溫5min。PCR產物的定量採用瓊脂糖凝膠電泳，AlphaInnotechCorporation凝膠成像儀記錄圖像並分析。(3)外周血血常規分析白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hbg)、血小板(PLT)計數。(4)白血病類型的診斷外周血及骨髓塗片，瑞氏-姬姆薩染色，鏡檢計數有核細胞並觀察細胞形態。3、實驗結果計算與統計分析以各樣本Fr.MuLV/P-actin的值作為Fr.MuLV相對病毒載量進行統計。實驗結果以^±S表示。用單因素方差分析，繼以Dunnet雙側檢驗進行統計處理，分析組與組之間的差異。以代0.05作為差異顯著性標準，以屍〈0.01作為差異極顯著性標準。4、實驗結果(1)外周血塗片及骨髓塗片支持Fr.MuLV誘發急性紅白血病的診斷小鼠外周血塗片有核紅細胞約佔O.60(0.560.67)，其中以早幼和中幼紅細胞為主，少數為原始細胞和晚幼紅細胞，並可見病理性核分裂。骨髓檢查骨髓增生明顯活躍，粒系、紅系均增生;NEOO.30(0.330.75)，原始粒細胞多為圓形，形態較規則，染色質細緻，核仁明顯，胞質量較少，著色深淺不一，無顆粒；早幼粒細胞多不規則，核畸形、褶疊，漿呈藍色或紫紅色，可見嗜天青顆粒，粒系核漿發育不平衡，可見核分葉過多現象，以中、晚幼紅細胞為主；有核紅細胞》0.50(0.540.82)，紅系可見雙核、多核及芽狀核細胞，以中、晚幼紅細胞為主。符合急性紅白血病的診斷標準。(2)AZT降低脾臟病毒載量結果顯示，模型組脾臟病毒載量較高，條帶較亮；AZT組病毒載量明顯減弱；而正常對照組未檢出病毒RNA(附圖10:1:marker;2:正常對照組；3:模型對照組；4:AZT治療組)。定量分析結果見表4。表4Fr.MuLV感染28天後脾臟病毒載量的比較組別病毒載量正常對照組0模型對照組1.31±0.14AZT治療組0.43±0.15**與模型對照組比較7".w(3)AZT降低外周血白細胞和血紅蛋白表5顯示，模型組外周血WBC及Hbg明顯升高，與正常對照組相比差異有顯著性(代O.Ol)，PLT略有升高(無統計學意義)；與模型組相比，AZT能明顯降低患病小鼠的WBC及Hbg(屍〈0.01)，基本恢復至正常水平。9表5Fr.MuLV感染後各組WBC、Hbg和PLT計量tableseeoriginaldocumentpage10與正常對照組比較##戶".W，與模型對照組比較*7\%W下述實施例均能實現上述實驗例的效果。具體實施例方式實施例l:片劑取疊氮胸苷，加入常規輔料，按照常規工藝製備成片劑，用於治療白血病。實施例2:膠囊劑取疊氮胸苷，加入常規輔料，按照常規工藝製備成膠囊劑，用於抑制白血病細胞的生長。實施例3:注射劑取疊氮胸苷，加入常規輔料，按照常規工藝製備成注射劑，用於抑制人白血病細胞Jukat及鼠白血病細胞L615的生長。實施例4:滴丸取疊氮胸苷，加入常規輔料，按照常規工藝製備成滴丸，用於抗白血病病毒。實施例5:緩釋劑取疊氮胸苷，加入常規輔料，按照常規工藝製備成緩釋劑，用於治療白血病。權利要求1、疊氮胸苷在製備治療白血病藥物中的應用。2、如權利要求1所述的應用，其特徵在於其中所述的治療白血病是指抑制白血病細胞的生長。3、如權利要求2所述的應用，其特徵在於其中所述的白血病細胞是指人白血病細胞Jukat及鼠白血病細胞L615。4、如權利要求1所述的應用，其特徵在於其中所述治療白血病是指抗白血病病毒。全文摘要本發明公開疊氮胸苷治療白血病的新用途，通過藥效學實驗表明疊氮胸苷具有抑制人白血病細胞Jukat及鼠白血病細胞L615生長的作用，而且可以抑制小鼠外周血、骨髓及肝脾組織的侵潤，顯著延長白血病小鼠的生存期，有效減低Friend鼠脾臟白血病病毒載量，對治療Friend鼠白血病病毒誘發的急性紅白血病有顯著作用。文檔編號A61K31/7072GK101559068SQ200910084339公開日2009年10月21日申請日期2009年5月21日優先權日2009年5月21日發明者崔曉蘭,王意忠申請人:王意忠;崔曉蘭