尿液鐵蛋白輕鏈和重鏈的應用的製作方法

2023-10-10 15:41:19

尿液鐵蛋白輕鏈和重鏈的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種尿液鐵蛋白及其輕鏈和重鏈的應用，具體為尿液鐵蛋白在製備用於診斷或檢測前列腺增生和前列腺癌的製劑中的應用。本發明通過研究證實與前列腺增生組相比，鐵蛋白輕鏈在前列腺癌組患者的尿液中特異表達下調，鐵蛋白重鏈在前列腺癌組患者的尿液中特異表達上調，從而提出檢測尿液鐵蛋白輕鏈及重鏈可用於前列腺增生和前列腺癌的鑑別診斷及前列腺癌的診治。本發明發揮了尿液標本獲取無創、可大規模重複取樣、保存方便等獨特的優勢，利用隨機尿標本檢測前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的鐵蛋白及其輕鏈和重鏈。
【專利說明】尿液鐵蛋白輕鏈和重鏈的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及尿液鐵蛋白的新用途，尤其涉及尿液鐵蛋白及其輕鏈和重鏈在前列腺 增生和前列腺癌的鑑別診斷以及前列腺癌的診治中的應用。

【背景技術】
[0002] 前列腺癌是發生於男性前列腺組織中的惡性腫瘤，是前列腺腺泡細胞異常無序生 長的結果，是老年男性泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤之一。隨著我國經濟發展、生活水平 提高、飲食結構歐美化以及人口老齡化等因素影響，前列腺癌的發病率呈現上升趨勢。
[0003]目前前列腺癌及前列腺增生確診的金標準是前列腺穿刺活檢組織病理檢查，但該 檢查有創、費用相對昂貴、技術要求高，不合時宜的前列腺穿刺不僅使患者承擔發生併發症 的風險，增加患者的心理負擔和醫療成本，而且陰性的活檢結果並不能完全排除惡性腫瘤 的可能。前列腺特異性抗原（PSA)是目前公認的最有價值的前列腺癌的腫瘤標誌物，在多年 的臨床檢驗工作中，研究者發現PSA升高特別是在4ng/ml至lOng/ml之間時，前列腺增生 和前列腺癌難以鑑別，且沒有比較好的鑑別診斷化驗指標。臨床上，當患者PSA大於4.Ong/ ml時高度懷疑為前列腺癌，需要進行前列腺穿刺活檢確診，但有研究表明約有25%的前列 腺增生患者PSA大於4.Ong/ml，這部分患者接受了不必要的穿刺活檢以及治療手段，造成 很大的精神及經濟負擔；約15. 2%的前列腺癌患者PSA小於4.Ong/ml，這部分患者因此而 延誤了腫瘤治療的最佳時期。因此PSA在前列腺增生與前列腺癌鑑別診斷方面存在著灰 區。
[0004] 鐵蛋白（Ferritin)是一種分子量較大的含鐵蛋白，由球形外殼和鐵核心構成。它 是一個由24個多肽亞基圍繞一個含有4000多個鐵原子的核心組成的複合分子，相對分子 質量為4.5X105。鐵蛋白分子的外殼即去鐵蛋白，鐵蛋白的亞基以重鏈（H鏈）和輕鏈（L 鏈）兩種方式存在。H鏈和L鏈的結構相似，都是由5個a-螺旋組成，位於整個亞基長 軸的一端。H鏈和L鏈以不同比例聚合而成的純聚合體或雜合體稱為同工鐵蛋白。鐵蛋白 是機體細胞內鐵儲存蛋白，血清、肝、脾組織中的鐵蛋白大多含L鏈，與礦化及鐵貯存有關； 而腫瘤細胞中的鐵蛋白大多為H鏈，含鐵量低，鐵儲存作用很小，在胞內外鐵運輸和快速解 毒中起主要作用。研究表明，鐵和鐵蛋白的紊亂是包括腫瘤在內的許多疾病的重要病因之 一，在多數腫瘤組織中，鐵蛋白水平高於正常組織，可存在於腫瘤相關的巨噬細胞內，抑制 巨噬細胞和單核細胞對腫瘤的殺傷力。鐵蛋白重鏈可抵制免疫反應，有助於癌細胞的生長 和擴散，電鏡下發現乳腺癌的惡性上皮細胞內鐵蛋白豐富，而良性中則很少。ffia(雙鏈高 分子量激肽原）是M(高分子量激肽原）的降解產物，可以通過分解內皮細胞中的緩激肽而 抑制血管再生，鐵蛋白與HKa有高度的親和力，從而促進血管再生及炎症反應，增強腫瘤細 胞的遷移。有研究表明，鐵蛋白在前列腺癌患者體內的作用可能與該機制有關。
[0005] 尿液作為人體代謝產物之一，富含了蛋白質的各種剪切、修飾、翻譯等生命活動過 程中的產物，其獲取具有無創性、大規模重複取樣性、保存方便等特點使其在動態的監測疾 病過程和判斷療效等方面有獨特的優勢，其組成與性狀反映機體的代謝狀態，更直接反映 了整個泌尿系統疾病發生、發展及預後的各種信息，奠定了其在臨床檢驗尤其在分析泌尿 生殖系統疾病方面的重要地位。目前存在希望通過尿液檢查建立一種對前列腺增生和前列 腺癌患者進行鑑別診斷及前列腺癌診治的無創性檢查的試劑盒及方法的需要，以彌補PSA 在前列腺增生與前列腺癌鑑別診斷方面的灰區，對前列腺癌的早期篩查、診斷、預防及治療 均具有極其重要的意義。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是針對現有技術中存在的難題和需求，提供尿液鐵蛋白在製備用於 診斷或檢測前列腺增生和前列腺癌的製劑中的應用。
[0007] 優選地，在上述應用中，所述尿液鐵蛋白的輕鏈的胺基酸序列如SEQIDNO: 1所 示，所述尿液鐵蛋白的重鏈的胺基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0008] 優選地，所述製劑是一種試劑盒，其包括已包被兔抗人鐵蛋白輕鏈或重鏈的多克 隆抗體的固相載體。
[0009] 優選地，所述酶為辣根過氧化物酶（HRP)。
[0010] 優選地,所述試劑盒還包括鐵蛋白輕鏈或重鏈標準品溶液、鼠抗人鐵蛋白輕鏈或 重鏈單克隆抗體濃縮液、酶標記的羊抗鼠IgG濃縮液、顯色液A、顯色液B、終止液和濃縮洗 滌液。
[0011] 優選地，所述試劑盒還包括盒體，所述固相載體為設置在所述盒體內的酶標板。
[0012] 優選地，所述酶標板由外框支撐架和放置在所述外框支撐架上的可拆的12條酶 標反應微孔條組成，所述每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔。
[0013] 優選地，所述試劑盒還包括蓋板膜、放置試劑的下凹瓶位和自封袋。
[0014] 優選地，所述下凹瓶位共13個，且由塑料泡沫製成。
[0015] 優選地，所述酶標板由聚苯乙烯製成。
[0016] 本發明的目的還涉及檢測尿液鐵蛋白的製劑在製備用於診斷或檢測前列腺增生 和前列腺癌的製劑中的應用。特別是可以採用兔抗人鐵蛋白輕鏈或重鏈的多克隆抗體製備 用於診斷或檢測前列腺增生和前列腺癌的製劑。該製劑可以是一種試劑盒。
[0017] 發明人首先收集了泌尿外科病理診斷明確的前列腺增生和前列腺癌患者的清潔 晨尿標本，離心後取上清，利用乙醇萃取尿蛋白，經雙向電泳、考馬斯亮藍染色及脫色液脫 色後用掃描儀獲取凝膠圖像，roQuest2D軟體分析掃描後的圖像，將兩組相差3倍以上界 定為差異點。然後發明人對具有統計學意義的差異性多肽經酶切及乙腈處理後點靶，進行 基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜（Matrix-assistedlaserdesorptionionization timeofflightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)鑑定，採集數據獲得由不同質荷比 的蛋白峰構成的質譜多肽圖。應用MASCOT搜尋引擎及swiss-prot資料庫進行檢索，檢索 條件：肽指紋圖中的肽片段質量控制在700?4000。肽片段分子量最大容許誤差控制在 ±0.IDa。酶解片段不完全選擇為1個，離子選擇[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段規定 為5。HomoSapiens默認，masstolerance0.2Da，MS/MStolerance0.6Da。從資料庫檢索 得到前列腺增生和前列腺癌組間差異表達的鐵蛋白輕鏈（ferritin,Iightpolypeptide, HTL，蛋白號：P02792,胺基酸序列：mssqirqnystdveaavnslvnlylqasytylslgfyfdr ddvalegvshffrelaeekregyerllkmqnqrggralfqdikkpaedewgktpdamkaamalekklnqa IldlhalgsartdphlcdfIethfldeevklikkmgdhltnlhrlggpeaglgeylferltlkhd)和鐵 蛋白重鏈（ferritin,heavypolypeptidel，FTHl，蛋白號：P02794，mttastsqvrqnyhqdseaa inrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyfIhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpd cddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmg apesglaeylfdkhtlgdsdnes)，並且與前列腺增生相比，鐵蛋白輕鏈和重鏈均在前列腺癌 患者的尿液中呈高表達。
[0018] 本發明通過研究證實與前列腺增生組相比，鐵蛋白輕鏈和重鏈在前列腺癌組患者 的尿液中特異表達上調，從而提出檢測尿液鐵蛋白輕鏈及重鏈可用於前列腺增生和前列腺 癌的鑑別診斷及前列腺癌的診治。
[0019] 本發明發揮了尿液標本獲取無創、可大規模重複取樣、保存方便等獨特的優勢，利 用隨機尿標本檢測前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的鐵蛋白及其輕鏈和重鏈。
[0020] 為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 並配合附圖，作詳細說明如下。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是前列腺增生和前列腺癌的雙向電泳圖譜。A為前列腺增生患者的電泳圖，B 為前列腺癌患者的電泳圖。
[0022] 圖2是鐵蛋白輕鏈在圖1的前列腺增生和前列腺癌的雙向電泳圖譜中的點。A中 箭頭所指為鐵蛋白輕鏈在前列腺增生的雙向電泳圖譜中的點，B中箭頭所指為鐵蛋白輕鏈 在前列腺癌的雙向電泳圖譜中的點。
[0023] 圖3是鐵蛋白重鏈在圖1的前列腺增生和前列腺癌的雙向電泳圖譜中的點。A中 箭頭所指為鐵蛋白重鏈在前列腺增生的雙向電泳圖譜中的點，B中箭頭所指為鐵蛋白重鏈 在前列腺癌的雙向電泳圖譜中的點。
[0024] 圖4是鐵蛋白輕鏈質譜圖。
[0025] 圖5是鐵蛋白重鏈質譜圖。
[0026] 圖6是鐵蛋白/肌酐在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的表達。
[0027] 圖7是WB(WesternBlot)驗證鐵蛋白輕鏈在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中 的表達。
[0028] 圖8是WB(WesternBlot)驗證鐵蛋白重鏈在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中 的表達。
[0029] 圖9是免疫組化驗證鐵蛋白輕鏈在前列腺增生和前列腺癌患者組織中的表達。A 為鐵蛋白輕鏈在前列腺增生患者組織中的表達，B為鐵蛋白輕鏈在前列腺癌患者組織中的 表達。
[0030] 圖10是免疫組化驗證鐵蛋白重鏈在前列腺增生和前列腺癌患者組織中的表達。A 為鐵蛋白重鏈在前列腺增生患者組織中的表達，B為鐵蛋白重鏈在前列腺癌患者組織中的 表達。
[0031] 圖11是設置在本發明所述的試劑盒的盒體內的酶標板的示意圖，其中1為酶標反 應微孔條，2為酶標板的外框支撐架，3為包被有鐵蛋白輕鏈或重鏈融合蛋白多克隆抗體的 孔。

【具體實施方式】
[0032] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不 用於限定本發明。
[0033]實施例1尿蛋白的提取
[0034] 分別收集首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院體檢中心2010年3月份9名（平均年 齡32歲）體檢健康的正常人的新鮮晨尿；泌尿外科2010年11月份至2012年3月份32名 (平均年齡73歲)病理確診為前列腺增生患者和9名（平均年齡76歲)病理確診為前列腺癌 患者的新鮮晨尿。每份標本50ml，置於乾燥潔淨的250ml容器中，2小時內離心1500rpm， 5min，取上清，在顯微鏡下確認尿沉渣與上清尿液分離完全，將上清與預冷無水乙醇I:3體 積比混勻，4°C靜置30min，-20°C過夜，4°C離心12000rpm，15min，去上清留取沉澱並將樣品 溶於裂解液中。超聲50Hz、7秒，冷卻9. 9秒，循環17次，4°C離心12000rpm，20min，去沉澱 取上清，分裝50iil/EP，-80°C凍存備用。應用BCA試劑盒測定各蛋白濃度，日立7080-ISE 生化分析儀測定尿液標本肌酐含量，BeckmancoulterUnicelDXI800Access免疫分析儀 測定尿液鐵蛋白含量。
[0035] 前列腺增生和前列腺癌患者尿液中鐵蛋白/肌酐比值見圖6,從圖6中很明顯看出 鐵蛋白/肌酐在前列腺癌患者尿液中顯著高表達。
[0036]實施例2尿蛋白雙向凝膠電泳
[0037] 從_80°C冰箱取出凍存蛋白，室溫下復溶，根據蛋白濃度取適當體積的蛋白溶液， 使蛋白上樣量達到2mg，將蛋白溶液與水化上樣緩衝液混勻，總上樣體積600yl，沿著聚焦 盤槽中的邊緣從左至右線性加入樣品，加完樣後，用鑷子去掉預製膠條上的保護層，將膠條 膠面朝下放置於聚焦盤中樣品溶液上，其中膠條的正極對應聚焦盤的正極，蓋上聚焦盤的 蓋子，室溫放置1小時後，將聚焦盤放入電泳儀中進行一向等電聚焦，具體參數參見表1。聚 焦結束的膠條，立即進行平衡、二向SDS-PAGE電泳。
[0038] 表1等電聚焦參數

【權利要求】
1. 尿液鐵蛋白在製備用於診斷或檢測前列腺增生和前列腺癌的製劑中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述尿液鐵蛋白的輕鏈的胺基酸序列如 SEQIDNO: 1所示，所述尿液鐵蛋白的重鏈的胺基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於，所述製劑是一種試劑盒，其包括已包 被兔抗人鐵蛋白輕鏈或重鏈的多克隆抗體的固相載體。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述酶為辣根過氧化物酶。
5. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述試劑盒還包括鐵蛋白輕鏈或重鏈標 準品溶液、鼠抗人鐵蛋白輕鏈或重鏈單克隆抗體濃縮液、酶標記的羊抗鼠IgG濃縮液、顯色 液A、顯色液B、終止液和濃縮洗滌液。
6. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述試劑盒還包括盒體，所述固相載體為 設置在所述盒體內的酶標板。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述酶標板由外框支撐架和放置在所述 外框支撐架上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，所述每個可拆裝酶標反應微孔條有8個 反應孔。
8. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述試劑盒還包括蓋板膜、放置試劑的下 凹瓶位和自封袋。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述下凹瓶位共13個，且由塑料泡沫制 成。
10. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述酶標板由聚苯乙烯製成。
【文檔編號】G01N33/531GK104515847SQ201310447273
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】張曼, 趙旭宏, 蘇強 申請人:張曼