用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法
2023-10-18 09:52:49
專利名稱：用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法
用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法樣品(如來自人的樣品、食物樣品或環境樣品)的微生物汙染可 以歸因於許多不同類型的微生物。微生物可以作為單一菌落或者多種 類型的微生物菌落存在，並且(例如)細菌和真菌可以相等的或不同 的量存在於待測試樣品中或待測試樣品上。目前檢測微生物汙染的方法涉及三磷酸腺苷(在此稱為ATP)的 檢測，因為它存在於所有的生活物質中。生活物質中ATP的存在意味 著這種化合物提供了存在生物(例如微生物)的良好指示。最經常用於定量檢測ATP的方法之一是讓該化合物與熒火蟲螢光 素酶反應。ATP的熒火蟲螢光素酶反應採用純化的酶(螢火蟲螢光素 酶)、底物(D-螢光素)、鎂離子和氧。用光度計測量通過ATP與D-螢光素及氧的反應而產生的光。在合適的條件下，由該反應產生的光 的強度與樣品中存在的ATP的量成比例。該反應中產生的光是作為連 續發光發出，這使得該分析更可靠，因為就分析員而言，它減少了對 精確選擇時間以觀察結果的依賴。當測量包括活微生物(其也稱作活細胞生物量或活微生物細胞) 的樣品時，該樣品中存在其他細胞和有機物質汙染物。這種另外的有 機物質(其也含有ATP)也可通過包括螢火蟲螢光素酶反應在內的己 知分析方法檢測。如果也檢測到這種"細胞外"ATP (其由於樣品中的 汙染物而存在)，則這可能會導致不正確地測量樣品中的活細胞生物 量的水平。這是因為檢測到了來自汙染物的ATP以及來自活微生物的 ATP。事實上，檢測到細胞外ATP水平，這會因為比預期讀數高而給 出對活細胞生物量水平的錯誤指示。這在分析(例如)食物樣品或將 用於保健的產品時是非常不期望的，因為在食物樣品和保健產品中，對可存在於要使用的物品上的微生物水平有嚴格的限制。如果超出了 這些限制，則必須丟棄該物品，這導致了高水平的損耗和花費。因為 已知的分析檢測到細胞外物質，所以常常給出對活細胞生物量的錯誤 指示，並因而是已知的分析的一個嚴重缺陷。諸如保健品之類的產品 可能會在不必將它們扔掉時而被扔掉，因為事實上，如果給出正確的 測量，則真實的活細胞生物量是在期望的限度之內。因此，有效除去不歸因於活性生物量的ATP的方法是期望的。已經開發了用以從樣品除去ATP的方法。當評估樣品(如食物樣 品、冷卻塔水樣品或流出物樣品)中存在的活性生物量的量時，通常 會在從微生物細胞提取ATP之前除去位於活微生物細胞外的ATP (細 胞外ATP或外來ATP)。該步驟使得能將那些微生物細胞中的ATP 與大量的細胞外ATP或外來ATP區分開來，這些細胞外ATP或外來 ATP與樣品中的有機物質和源自待檢測的食物樣品或其他類型樣品中的有機物質的非微生物細胞(所謂的"體"細胞)相關。已知ATP降解酶可用於在提取細胞ATP之前除去細胞外ATP。 其中所使用的合適的酶通常是胞外ATP酶，並且特別是腺苷三磷酸雙 磷酸酶。腺苷三磷酸雙磷酸酶是催化ATP水解生成二磷酸腺苷(ADP) 和無機磷酸鹽的酶。在第二個步驟中，它們可以進一步使ADP降解成 一磷酸腺苷(AMP)和無機磷酸鹽。對於最佳活性，它們需要諸如鈣 或鎂之類的二價陽離子。腺苷三磷酸雙磷酸酶可以從包括馬鈴薯、豌豆和細菌在內的一系 列來源獲得。來自各種來源的腺苷三磷酸雙磷酸酶顯示出較大程度的 同源性，特別是對於酶的活性位點。獲自馬鈴薯的腺苷三磷酸雙磷酸酶已經廣泛用於在用熒火蟲螢光 素酶反應分析微生物ATP之前除去細胞外ATP。檢測和統計體液中的 細菌的方法已經在美國專利No.3,745,0卯中有所討論。另外，馬鈴薯腺苷三磷酸雙磷酸酶己經在許多針對(例如)水、啤酒、軟飲料、酒、 食品和多種其他產品中的活微生物細胞的分析中起到了重要作用。
然而，存在三個與除去ATP樣品的方法相關，並且尤其是與用腺 苷三磷酸雙磷酸酶除去與微生物細胞不相關的ATP相關的主要問題。
第一，通過腺苷三磷酸雙磷酸酶除去ATP不是一個快速的過程。 通常它是整個生物量評估過程中最慢的步驟，對於高通量的取樣這是 不期望的。提取和ATP測量步驟可以以秒為時間尺度進行，而用腺苷 三磷酸雙磷酸酶除去細胞外ATP則需要以分鐘作為時間尺度。5-30分 鍾範圍內的處理時段是典型的。
已經作了很多嘗試通過採用更長的反應時間和高溫來克服與用腺 苷三磷酸雙磷酸酶除去ATP的速度相關的困難。例如， 一些市售的基 於ATP檢測的生物量分析試劑盒採用15分鐘的腺苷三磷酸雙磷酸酶處 理步驟並建議釆用超過室溫的溫度來加速反應。然而，該分析對於高 通量分析來說仍然太慢並且另外需要熱源。
已經設計出這樣的分析方法，在該方法中將腺苷三磷酸雙磷酸酶 固定在固體載體上以提供局部濃度的酶，這使得能夠減少腺苷三磷酸 雙磷酸酶和細胞外ATP之間的接觸時間。雖然如此，仍然需要數分鐘 來除去ATP。另外，增加酶濃度可能會產生另外的問題，因為在提取 步驟過程中可能會存在殘餘的腺苷三磷酸雙磷酸酶活性。這導致樣品 不穩定，使整個分析既對時間敏感又取決於操作者。補充策略是使用 另外的酶來幫助三磷酸腺苷雙磷酸酶破壞ATP。這樣的酶可包括腺苷 磷酸脫氨酶、己糖激酶和腺苷三磷酸酶。然而，這個附加的步驟可能 會增加分析時間，並且因為使用另外的試劑而增加實施該分析的成本。
與已知技術相關的第二個問題是腺苷三磷酸雙磷酸酶從測試樣品 除去ATP的能力常常低於在模型溶液的情況下所觀察到的能力。這是由於測試樣品中存在抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的物質。
已經使用若干策略來處理一些樣品抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶活性 這一事實。例如，已經嘗試在用無ATP的緩衝液洗滌過濾器之前，通 過將存在於樣品中的酵母或細菌捕獲於薄膜過濾器上來從分析基質中 除去樣品殘餘物。就諸如啤酒、酒和軟飲料之類的可過濾飲料而言， 這在一定程度上是有用的。然而，對不採用額外的處理來增加產品過 濾性(例如使用蛋白水解酶和高溫)就不能過濾的產品而言，應用該 方法很困難，並且有時是不可能的。存在過濾困難的產品的實例包括 牛奶和相關的奶製品，以及果汁和相關產品。另外， 一些食物和飲料 樣品(如啤酒、酒和軟飲料)由於其pH值低而抑制了腺苷三磷酸雙磷 酸酶的活性。
第三，在從活細胞提取時留下的殘餘腺苷三磷酸雙磷酸酶活性可
以降解一些從細胞釋放的ATP。這可能會導致低估存在於樣品中的活
細胞數量。
己經嘗試採用腺苷三磷酸雙磷酸酶活性抑制劑來防止ATP的這種 喪失。在將啤酒樣品進行腺苷三磷酸雙磷酸酶處理之後且在ATP提取 之前測量剩下的細胞外ATP的濃度時，將原釩酸鈉用於抑制腺苷三磷 酸雙磷酸酶的活性。然而，原釩酸鈉具有缺點，因為它對使用者和待 分析的微生物細胞兩者來說都是高毒性的，因此可導致錯誤讀數。
釓已經顯示可抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性。然而，這種元素 具有抗微生物特性並因此不適用於在微生物測試中抑制馬鈴薯腺苷三 磷酸雙磷酸酶。
已經考慮用於ATP分析以在ATP提取之前抑制腺苷三磷酸雙磷酸 酶活性但被淘汰的其他化合物包括但不限於去氧膽酸鈉、氟化鈉、 疊氮化鈉和多種其他小分子抑制劑。雖然這些物質中的一些是相對較
10好的腺苷三磷酸雙磷酸酶抑制劑，但就它們在活微生物測試中的使用 而言，全部都有缺點。 一些對微生物細胞代謝有抑制性； 一些對使用 者有危害性；而其他則強效地抑制熒火蟲螢光素酶活性。還使用了包 括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白 酶在內的蛋白水解酶。
還嘗試在提取步驟的同時使腺苷三磷酸雙磷酸酶失活，例如利用 高氯酸提取。這種提取方法非常強烈，腺苷三磷酸雙磷酸酶會在它與 提取劑接觸時被破壞。然而，由於它們對熒火蟲螢光素酶有抑制作用， 用這種提取劑產生的提取物必須在測試之前被充分稀釋，這也可能導 致錯誤讀數。
發明內容
本發明涉及用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法。具體地講 (但非排他性地)，本發明涉及評估表面的清潔度並精確測量各種類 型(包括固體、液體和氣體)樣品中的活微生物(活微生物細胞/活細 胞生物量，這些表述形式是可互換的)數量。術語微生物包括細菌、 酵母、真菌或藻華。
本發明提供使用腺苷三磷酸雙磷酸酶抑制劑的分析，該抑制劑
i) 對抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶活性來說是有效的；
ii) 對進行ATP分析的材料使用者來說具有低風險的毒性、致癌 性和致畸毒性；
iii) 對微生物細胞來說是無毒性的，對ATP蓄積水平無影響-這是 必要的，因為在從活細胞提取ATP之前腺苷三磷酸雙磷酸酶抑制劑必 須存在於分析中；
h0對螢光素酶活性無抑制性，否則後續分析會變得不能實行。
本發明提供了對樣品中的活性生物量水平的快速、有效且準確的指示。已經發現，在除去細胞外ATP時，需要將除去細胞外ATP的最佳 胞外ATP酶作用與精確中斷該胞外ATP酶作用組合在一起。最佳的胞 外ATP酶作用防止損壞活的微生物同時使得能準確地定量分析微生 物。
出人意料地發現，含磷物質可抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性。 由含磷/磷酸鹽的物質抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶活性是出人意料的，因 為涉及腺苷三磷酸雙磷酸酶使用的分析傳統上是將對磷酸鹽產物的檢 測用作對酶活性的測量。為了避免分析幹擾，這基本上排除了含磷緩 衝液或化合物在測試溶液中的使用。
根據本發明的第一個方面，提供了用於檢測樣品中活微生物細胞 的分析方法，該分析方法包括以下步驟-
i) 將ATP降解酶加入到樣品中，以充分降解樣品中的細胞外
ATP;
ii) 將含磷酸鹽的化合物加入到樣品中，以基本上中斷ATP降解 酶的作用；和
iii) 讓樣品接受分析以確定樣品中的未降解ATP水平，用以提供 對樣品中活生物細胞水平的指示。
在一個實施例中，該方法包括這樣的步驟首先分離懷疑含有具 有細胞外ATP的活微生物細胞和具有細胞外ATP的外來材料的樣品。
優選地，在分析未降解的ATP水平之前將提取劑加入到樣品中， 以便從樣品提取未降解的ATP。
優選地，ATP降解酶是胞外ATP酶。
優選胞外ATP酶是腺苷三磷酸雙磷酸酶。在大多數實施例中，將ATP降解酶例如腺苷三磷酸雙磷酸酶進行
緩衝。優選地，將腺苷三磷酸雙磷酸酶試劑緩衝成pH值基本為6.5。 可以使用標準緩衝液例如HEPES緩衝液。pH的範圍可以基本為9至5、 8至6或7.5至6.2。
優選的是腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度範圍是lmL腺苷三磷酸雙磷 酸酶比10u 10-7]VI的ATP。
腺苷三磷酸雙磷酸酶反應通常在室溫下進行並且典型的反應時間 是l-30分鐘，更典型為15分鐘。
優選地，將二價陽離子加入到含腺苷三磷酸雙磷酸酶的試劑中。 優選的是二價陽離子是鈣離子和/或鎂離子。二價陽離子的加入是有利 的，因為腺苷三磷酸雙磷酸酶在存在可結合二價陽離子的物質時具有 低的活性，因此它需要鈣離子(或其他二價陽離子)來達到最大活性。 通常，使用典型濃度為5mM的氯化鎂溶液。
優選的是含磷酸鹽的化合物選自磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉、三 磷酸五鈉或多磷酸鈉中的一種或多種。
設想提取劑是用於從活細胞提取ATP的表面活性劑。
優選的是表面活性劑包括季銨化合物、二垸基銨鹽和二雙胍中的 一種或多種。
更優選地，提取劑選自N-N-二甲基十二垸-l-胺(GENAMIN)、 chloroprozamine、液體溶胞產物(LL1) 、 二氯化鎵(III) ^二酮基衍 生物二氯化鎵(BDK)及其組合中的一種或多種。這些只是使用的提 取劑的舉例說明並非意圖進行限制。
13通常使用濃度為0.05-50g/L並且更典型為0.1-5g/L的提取劑。
設想提取時段進行3-10分鐘、更典型地為4-8分鐘並且最優選為 大致5分鐘的時段。
通常，在室溫下提取ATP，這降低了活細胞被高溫殺死的風險。
在大多數實施例中，將一種或多種中和劑加入到含提取劑的樣品 中。特別是加入表面活性劑，這具有使試劑失活的有益效果，以便它 們不會對樣品中的活性微生物具有破壞性效果。
優選地，分析為發光分析。
優選的是用以監控ATP水平的發光分析是螢光素酶分析。
在一個優選的方法中，在進行腺苷三磷酸雙磷酸酶反應之前使樣 品中的含磷酸鹽的物質沉積。
作為選擇，在對活微生物細胞的分析中，通過將一種或多種含磷 酸鹽的物質摻入在腺苷三磷酸雙磷酸酶處理步驟之後加入樣品基質的 試劑中來抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶的殘餘活性。
在大多數實施例中，將第二種試劑加入到樣品中。加入的第二種 試劑是設計成通過操縱細胞代謝來增加細胞內ATP水平的試劑、ATP 提取劑或含有螢光素酶和螢光素的ATP檢測劑。這些是對可使用的材 料的說明並且並非意圖進行限制。
根據本發明的第二個方面，提供了用於檢測樣品中活微生物細胞 的分析試劑盒，該分析試劑盒包括裝有ATP降解酶的容器、具有含磷酸鹽的化合物和用以摻混酶和含磷酸鹽的化合物的裝置的容器，以實 施包括以下步驟的分析方法
i) 將ATP降解酶加入到懷疑含有活微生物細胞的樣品中，以充 分降解樣品中的細胞外ATP;
ii) 將含磷酸鹽的化合物加入到樣品中，以基本上中斷ATP降解 酶的作用；
iii) 讓含磷酸鹽的化合物與ATP降解酶反應；和
v)讓樣品接受檢測分析以確定樣品中的未降解ATP水平用以提 供對樣品中活微生物細胞水平的指示。
優選地，分析試劑盒包括在分析未降解的ATP水平之前將提取劑 加入到樣品中，用以從樣品提取未降解的ATP。
優選的是ATP降解酶是胞外ATP酶。通常，胞外ATP酶是腺苷
三磷酸雙磷酸酶。
優選地，將諸如腺苷三磷酸雙磷酸酶之類的ATP降解酶作為pH 值重複範圍基本為6.5的緩衝液提供。
優選的是腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度範圍是lml腺苷三磷酸雙磷 酸酶比lO^L 10— M的ATP。典型的值是每毫升0.96個單位。然而，當 反應受到所使用的組合物和反應溫度的強烈影響時，可以針對具體的 反應來調節腺苷三磷酸雙磷酸酶的適宜量。
優選地，將二價陽離子包含於含腺苷三磷酸雙磷酸酶的試劑中。
優選的是二價陽離子是典型濃度為5mM的鈣離子和/或鎂離子。
優選的是含磷酸鹽的化合物選自磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉、三
磷酸五鈉或多磷酸鈉中的一種或多種。
15提取劑可以是用於從活細胞提取ATP的表面活性劑。優選的是表 面活性劑包括季銨化合物、二垸基銨鹽和二雙胍中的一種或多種。更
優選地，提取劑選自(例如)N-N-二甲基十二垸-l國胺(GENAMIN)、 chloroprozamine、液體溶胞產物(LL1) 、 二氯化鎵(III) 、二酮基衍 生物二氯化鎵(BDK)中的一種或多種。
通常，使用濃度為0.05-50g/L、更典型為0.1-5g/L的提取劑。
在大多數實施例中，分析試劑盒包括加入到含提取劑的樣品中的 中和劑。
現在將結合附圖和實驗來描述(僅以舉例的方式)本發明的實施 例，其中
圖1.1、 2.1、 3.1和4.1示出了由使用不同提取劑的樣品提供的相 對光單位(RLU)， 一個樣品加入了磷酸鹽化合物，而另一個樣品為 其中未加入磷酸鹽的對照；
圖1.2、 2.2、 3.2和4.2示出了在5分鐘和IO分鐘後從使用了不同 提取劑的樣品釋放的ATP的量，兩份有磷酸鹽而另外兩份無磷酸鹽； 和
圖1.3、 2.3、 3.3和4.3示出了在70-80秒的時間內由含有各種提 取劑的樣品發出的光，提取劑具有磷酸鹽和無磷酸鹽。
上述圖涉及下面源自實驗1至4的實驗數據。現在將依次描述每 個實驗。
實驗1
方法
l丄通過將珠劃線至大豆胰蛋白腖肉湯瓊脂上使珠復活來培育明 串珠菌屬(Leuconostoc) MD110用作原種(放置在30°C的孵育器中過夜)。
1.2. 從該板取出一接種環的原種並將其轉移至10ml的大豆胰蛋白 腖肉湯中，讓其在3(TC下培育整40小時。
1.3. —旦混濁(表明細胞處於早靜止期)，就將培養物放置在冰 箱內2小時。將細胞在離心機(4500rpm， IO分鐘)中用冰冷的反滲水 洗滌兩次、再懸浮於10mL冷的反滲水中並在冰箱中保存。
1.4. 在室溫下用葡萄糖(10g/l)和MgC12 (5mM)的無菌溶液將 這種原種進行100倍稀釋來製備用於該實驗的細胞。在開始每個實驗 之前，將細胞在上述溶液中稀釋至少20分鐘以讓其適應新條件。葡萄 糖為細胞提供能量，而鎂鹽有利於後續分析中的腺苷三磷酸雙磷酸酶 活性。
2. 將lml上述細胞懸浮液加入到比色皿中。
3. 然後用lml的重組腺苷三磷酸雙磷酸酶(每mL10.96個單位) 處理該懸浮液，加入lOpL的ATP (10-7M)並在室溫下保留15分鐘。
4. 將4X100pL等分試樣的處理過的懸浮液轉移至潔淨的比色皿中。
5. 將100pL無菌反滲水加入到兩個比色皿中。
6. 然後將100pL螢光素酶加入至裝有水的比色皿中的一個並將 其在光度計中讀數。
7. 將100pL含有30mM磷酸鹽的長鏈脂肪酸乙基化物(lg/L) 加入至剩下的兩個比色皿中的每個並開始計時。實例1至4中利用的長鏈脂肪酸乙基化物是N-N-二甲基十二院-l-胺(GENEMIN)。
8. 立刻將lOOpL螢光素酶(利用用17.5mLHEPES緩衝液重組的 抗去垢劑-螢光素酶(Promega，Ultraglo)配製的螢光素酶/螢光素試劑) 加入至其中一個比色皿中並在光度計中讀數。
9. 將比色皿從光度計中移出並加入10-7M的ATP來用ATP 進行標準化。
10. 將溶液在光度計中再次讀數並進行連續的五次以檢驗反應的 最終動力學，結果作為對相對光單位(RLU)的測量給出。
11. 5分鐘後，對第二個比色皿重複步驟6-9。
12. 對於對照而言，重複步驟4-10，使用無磷酸鹽的長鏈脂肪酸 乙氧基化物溶液(lg/L)。
圖1.1示出了在用各種提取劑提取5分鐘後剩下的百分比RLU。 從T-5到T-IO，具有與提取劑混合的30mM磷酸鹽的分析中RLU上升 了38%。從T-5到T-10，在不含磷酸鹽的分析中RLU減少了 9%。
在含有磷酸鹽的分析中所觀察到的RLU增加可以用長鏈脂肪酸乙 氧基化物溶液的緩慢的提取時間來解釋。隨著時間推移更多的ATP被 提取，同時腺苷三磷酸雙磷酸酶的作用由於磷酸鹽的存在而降低。
在不含任何磷酸鹽的分析中，據推測RLU水平下降是因為腺苷三 磷酸雙磷酸酶分解ATP比ATP被長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液提取更迅速。
這也可以解釋在含有磷酸鹽的分析中每次分析的ATP量都增加而在無磷酸鹽的分析中ATP分析量下降(圖1.2)。
從對2個分析的動力學研究(圖1.3)來看，顯然30mM磷酸鹽抑 制了腺苷三磷酸雙磷酸酶的作用，因為ATP的量沒有下降。
實驗2 方法
1. 通過將珠劃線至ManRogosa Sharpe瓊脂上使珠復活來培育明 串珠菌屬MD110用作原種(放置在3(TC的孵育器中過夜)。
a. 從該板取出一接種環的原種並將其轉移至10ml的大豆胰蛋白 腖肉湯中，讓其在30'C下培育整40小時。
b. —旦混濁(指示細胞處於早靜止期)，就將培養物放置在冰 箱中2小時。將細胞在離心機(4500rpm， IO分鐘)中用冰冷的反滲水 洗滌兩次、再懸浮於10mL冷的反滲水中並在冰箱中保存。
c. 在室溫下用葡萄糖(10g/l)和MgCl2 (5mM)的無菌溶液將 這種原種進行100倍稀釋來製備用於該實驗的細胞。在開始每個實驗 之前，將細胞在上述溶液中稀釋至少20分鐘以讓其適應新條件。
d. 將用抗去垢劑螢光素酶(Promega，Ultraglo)(液體溶胞產物) 配製的螢光素酶/螢光素試劑在pH為7.75的17.5mH粦酸鹽緩衝液中重 組。
2. 將lml上述細胞懸浮液加入到比色皿中。
3. 然後將該懸浮液用lml的重組腺苷三磷酸雙磷酸酶(每升0.96 個單位)處理，加入10plATP (10-7M)並在室溫下保留15分鐘。
4. 將兩份10(^1等分試樣的處理過的懸浮液轉移至潔淨的比色 皿中。
5. 將用lOOpl抗去垢劑螢光素酶(Promega,Ultmglo) /磷酸鹽熒
19光素酶配製的螢光素酶/螢光素試劑加入到上述比色皿的每個中。
6. 將lOO^ll長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液(提取劑)加入到剩下的
2個比色皿中並開始計時。
7. 在5分鐘的提取時間後將比色皿1在光度計中讀數。
8. 將比色皿1從光度計中移出並加入10^1 10-7MATP用以標準化。
9. 將樣品放回光度計中並再次讀數，然後連續進行5次連續的 讀數以便確定最終的反應動力學。
10. 在另外的5分鐘後，對比色皿2重複步驟9-11。
11. 對於對照而言，重複步驟4至13，但是使用用在25mMHEPES 緩衝液(pH7.75)中重組的抗去垢劑螢光素酶(Promega,Ultraglo)配
制的螢光素酶/螢光素試劑。
如圖2.1所示，在含有磷酸鹽的分析中，在T-10分鐘時仍然保留 了 73.7%的在提取5分鐘後所產生的RLU。
在不含磷酸鹽的分析中，在10分鐘時僅保留了 43.5%的在5分鐘 後所產生的RLU信號。
基於在每個時間點存在的ATP的量(圖2.2)來直接比較兩個不 同的分析是困難的。在T40時，含有磷酸鹽的分析具有比對照分析更 大量的剩餘ATP (0.029皮摩爾對0.00163皮摩爾)。然而，在T=5時 分析i具有比對照分析更多的ATP (0.035皮摩爾對0.00163皮摩爾)。磷酸鹽抑制腺苷三磷酸雙磷酸酶的效力由在T=10時剩下的ATP 百分比(與T-5時存在的ATP相比)來指示。因此，對於分析l，在 T=10時ATP的量是T=5時存在的ATP量的81.3%。對於對照分析， 在T=10時ATP的量是T=5時存在的ATP的量的47%。
兩個分析的動力學(圖2.3)提供了磷酸鹽抑制腺苷三磷酸雙磷酸 酶的明顯證據。對照分析中的信號在50秒內下降到了 IO分之一，而 含有磷酸鹽的分析在這個時間內僅下降了 10%。
實驗3 方法
1. 通過將珠劃線至ManRogosaSharpe瓊脂上使珠復活來培育明 串珠菌屬MD110用作原種(放置在3(TC的孵育器中過夜)。
l丄從該板取出一接種環的原種並將其轉移至10ml的大豆胰蛋白 腖肉湯中，並讓其在3(TC下培育整40小時。
1.2. —旦混濁(指示細胞處於早靜止期)，就將培養物放置在冰 箱中2小時。將細胞在離心機(4500rpm， IO分鐘)中用冰冷的反滲水 洗滌兩次、再懸浮於10mL冷的反滲水中並在冰箱中保存。
1.3. 在室溫下用葡萄糖(10g/l)和MgC12 (5mM)的無菌溶液將 這種原種進行100倍稀釋來製備用於該實驗的細胞。在開始每個實驗 之前，將細胞在上述溶液中稀釋至少20分鐘以讓其適應新條件。
1.4. 製備用抗去垢劑螢光素酶(Promega，Ultraglo)配製的特殊熒 光素酶/螢光素試劑。將其在17.5ml的30mM磷酸鹽/10g/1長鏈脂肪酸 乙氧基化物溶液中重組。
2. 將lml上述細胞懸浮液加入到比色皿中。3. 然後將該懸浮液用lml的重組腺苷三磷酸雙磷酸酶(每升0.96 個單位)處理，加入10plATP (10-7M)並在室溫下保留15分鐘。
4. 將兩份100nl等分試樣的處理過的懸浮液轉移至潔淨的比色 皿中。
5. 將lOOpl用抗去垢劑螢光素酶(Promega, Ultraglo) Ultraglo/
磷酸鹽/長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液配製的螢光素酶/螢光素試劑加入 到這兩個比色皿中。
6. 在5分鐘的提取時間後，將比色皿l在光度計中讀數。
7. 將比色皿1從光度計中移出並加入10|il 10-7M的ATP以使標準化。
8. 將樣品放回光度計中並再次讀數，隨後連續進行5次連續的 讀數以便確定反應的最終動力學。
9. 在另外的五分鐘後，將第二個裝有水的比色皿在光度計中讀數。
10. 對比色皿2重複步驟7-11。
11. 對於對照，重複步驟4至13，但使用用在25mM具有長鏈脂 肪酸乙氧基化物溶液(10g/l)的HEPES緩衝液(pH7.75)中重組製備 的抗去垢劑螢光素酶(Promega, Ultraglo)配製的螢光素酶/螢光素試劑。
對於使用用抗去垢劑螢光素酶(Promega， Ultraglo) /磷酸鹽/長鏈 脂肪酸乙氧基化物溶液配製的螢光素酶/螢光素試劑進行的分析，在T=10時RLU信號竟然比T-5時高57%。對於不含磷酸鹽(用抗去垢 劑螢光素酶(Promega, Ultraglo) /HEPES/長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液 配製的螢光素酶/螢光素試劑)的分析，在T-10時RLU信號比T-5時 低15% (圖1)。
對於含有磷酸鹽的分析，在T=10時每一分析中ATP的量(皮摩 爾)比在T=5時高42% (T=10時的0.0074皮摩爾對T=5時的0.0052 皮摩爾)。當分析物中不含磷酸鹽時，ATP的量從T=5到T=10下降 了 14%(由T=5時的0.0016皮摩爾降至T=10時的0.0014皮摩爾)(圖 2)。
用抗去垢劑螢光素酶(Promega, Ultraglo) /磷酸鹽/長鏈脂肪酸乙 氧基化物溶液分析物配製的螢光素酶/螢光素試劑的動力學比用抗去垢 劑螢光素酶(Promega, Ultraglo) /HEPES/長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液 分析物配製的螢光素酶/螢光素試劑的動力學穩定很多(圖3)。
對於用抗去垢劑螢光素酶(Promega, Ultraglo)/HEPES/長鏈脂肪 酸乙氧基化物溶液分析物配製的螢光素酶/螢光素試劑，RLU值在75 分鐘內降低了 97.4%，而對於用抗去垢劑螢光素酶(Promega, Ultraglo)
/磷酸鹽/長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液分析物配製的螢光素酶/螢光素試 劑，RLU值在該時間內增加了 13%。
實驗4
方法
1.通過將珠劃線至ManRogosaSharpe瓊脂上使珠復活來培育明 串珠菌屬MD110用作原種(放置在3(TC的孵育器中過夜)。
l丄從該板取出一接種環的原種並將其轉移至10ml的大豆胰蛋白 腖肉湯，並讓其在3(TC下培育整40小時。1.2. —旦混濁(指示細胞處於早靜止期)，就將培養物放置在冰
箱中2小時。將細胞在離心機(4500rpm， IO分鐘)中用冰冷的RO水 洗滌兩次，將其再懸浮於lOmL冷的反滲水中並在冰箱中保存。
1.3. 在室溫下用葡萄糖(10g/l)和MgC12 (5mM)的無菌溶液將 這種原種進行100倍稀釋來製備用於該實驗的細胞。在開始每個實驗 之前，將細胞在上述溶液中稀釋至少20分鐘以讓其適應新條件。
1.4. 將lml上述細胞懸浮液加入到比色皿中。
2. 將該懸浮液用lml的重組腺苷三磷酸雙磷酸酶(每ml 0.96個 單位)處理，加入l(Hd的ATP (10-7M)並在室溫下保留15分鐘。
3. 將2份lO(Hd等分試樣的處理過的懸浮液加入到潔淨的比色皿中。
4. 將20|il 100mMpH為7.75的磷酸鹽溶液加入到這2個比色皿中。
5. 加入100Hl提取劑(長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液)並開始計時。
6. 在5分鐘的提取時間後，將比色皿1在光度計中讀數。
7. 將比色皿1從光度計中移出並加入lOpl 10-7M的ATP以使標準化。
8. 將樣品放回光度計中並再次讀數，隨後連續進行5次連續的 讀數以便確定反應的最終動力學。
9. 在另外的五分鐘後，將第二個裝有水的比色皿在光度計中讀
24數。
10. 對比色皿2重複步驟7-11。
11. 對於對照，重複步驟4至13，但使用20^1反滲水而不是20ial
磷酸鹽。
在包含磷酸鹽的分析中，在5分鐘後保留了 100%的在5分鐘提取 後所產生的RLU。
在不含磷酸鹽的分析中，在10分鐘時僅保留31.25%的在5分鐘 後產生的RLU信號。(圖4.1)
結果表明，磷酸鹽確實抑制了腺苷三磷酸雙磷酸酶並且在5分鐘 內減少了分解的ATP量。(圖4.2)
結果還表明，含磷酸鹽的分析中存在的ATP水平事實上增加了。 據信第二次分析中觀察到的高的值是將每一分析的ATP量通過如下公 式計算的偽值
(具有標準ATP的樣品的活性-在ATP提取後樣品的活性)=每一 分析的ATP量(皮摩爾)。
由於標準ATP產生的光信號在T-10時比T-5時低(據信是由於 隨時間推移長鏈脂肪酸乙氧基化物溶液損壞了螢光素酶)，則由從細 胞提取的ATP產生的RLU值被分成了小的量。該效果，結合在T-IO 時比預期的RLU值稍高，表現為ATP量的增加了。
分析的動力學再次表明磷酸鹽對腺苷三磷酸雙磷酸酶的抑制。對 照分析的RLU在46秒內下降至大約12,000RLU，而含有磷酸鹽的分 析的RLU值在這個期間下降至大約1,400RLU。所示的曲線圖表明，磷酸鹽抑制了腺苷三磷酸雙磷酸酶的作用。 這對提供可用於分析活細胞生物量水平的方法具有驚人的技術影響。 在除去細胞外ATP之後，通過含磷酸鹽的物質中止該反應以使得由於
活細胞生物量而存在的ATP水平可隨後用於測量樣品中的微生物水
平。存在除去細胞外物質的階段，之後為其中這種除去作用被中斷以 便可獲得對活細胞生物量水平的更準確的指示這一階段。
增加5分鐘的提取時段是有利的，因為長鏈脂肪酸乙氧基化物溶 液看起來在這些分析中存在的條件下提取ATP時相當慢。在這五分鐘 期間，待提取的ATP仍然會被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解，但是磷酸鹽 的存在會使這種作用最小化。這可以通過不存在對腺苷三磷酸雙磷酸 酶的磷酸鹽抑制的對照分析以及由對照分析產生的弱的信號看出來。
本發明旨在不僅涵蓋本發明的各個實施例或方面而且還涵蓋它們 的組合。另外，對本領域技術人員來說將顯而易見的是，本發明涵蓋 了權利要求所涵蓋的具體實施例的所有等價形式。
權利要求
1.一種用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法，所述分析方法包括如下步驟i)將ATP降解酶加入到懷疑含有活微生物細胞的樣品中，以充分降解所述樣品中的任何細胞外ATP；ii)將含磷酸鹽的化合物加入到所述樣品中，以基本上中斷所述ATP降解酶的作用；並且iii)讓所述樣品接受檢測分析以確定樣品中未降解的ATP水平，以提供對樣品中活微生物細胞水平的指示。
2. 根據權利要求1所述的分析方法，其中在分析未降解的ATP 水平之前將提取劑加入所述樣品中，以從所述樣品提取未降解的ATP。
3. 根據權利要求1或權利要求2所述的分析方法，其中所述ATP 降解酶是胞外ATP酶。
4. 根據權利要求3所述的分析方法，其中所述胞外ATP酶是腺苷三磷酸雙磷酸酶。
5. 根據權利要求6所述的分析方法，其中所述腺苷三磷酸雙磷 酸酶試劑被緩衝成pH值在選自9至5、或8至6、或7.5至6.2的範圍內。
6. 根據權利要求5所述的分析方法，其中所述腺苷三磷酸雙磷 酸酶的濃度是0.005單位/ml至最多10單位/ml樣品溶液，並且優選為 0.5單位/ml至1單位/ml溶液。
7. 根據前述任一項權利要求所述的分析方法，其在室溫下進行 並且反應時間從1-60分鐘，並且優選從1至30分鐘。
8. 根據前述任一項權利要求所述的分析方法，其中將二價陽離子與所述ATP降解酶一起加入。
9. 根據權利要求8所述的分析方法，其中所述二價陽離子是鈣 離子和/或鎂離子。
10. 根據前述任一項權利要求所述的分析方法，其中所述含磷酸 鹽的化合物選自磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉、三磷酸五鈉或多磷酸鈉 中的一種或多種。
11. 根據權利要求2所述的分析方法，其中所述提取劑是用於從 活細胞提取ATP的表面活性劑。
12. 根據權利要求ll所述的分析方法，其中所述表面活性劑包括 季銨化合物、二烷基銨鹽和二雙胍中的一種或多種。
13. 根據權利要求2所述的分析方法，其中所述提取劑選自N-N-二甲基十二垸-1 -胺(GENAMIN) 、 chlor叩rozamine 、液體溶胞產物(LL1) 和二氯化鎵(III) 、二酮合衍生物GaCb (BDK)中的一種或多種。
14. 根據權利要求11至13任一項所述的分析方法，其中所述提 取劑的使用濃度為0.05-50g/l。
15. 根據權利要求14所述的分析方法，其中讓所述提取劑反應l 秒至最多10分鐘或3-10分鐘的時段。
16. 根據前述任一項權利要求所述的分析方法，其中將中和劑加 入到含有所述提取劑的樣品中。
17. 根據權利要求1至16任一項所述的分析方法，其中在進行腺苷三磷酸雙磷酸酶反應之前將含磷酸鹽的物質沉澱。
18. 根據權利要求1至16任一項所述的分析方法，其中在所述腺 苷三磷酸雙磷酸酶反應之後將一種或多種含磷酸鹽的物質加入到所述 樣品中。
19. 根據前述任一項權利要求所述的分析方法，其中將第二種試 劑加入到所述樣品中，所述第二種試劑能夠通過如下手段提高所述樣 品中的ATP水平通過操縱細胞代謝來增加細胞內ATP水平，或通過 增強螢光素酶和螢光素檢測ATP的活性。
20. 根據權利要求19所述的分析方法，其中所述第二種試劑選自 磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫銨、三磷酸五鈉和多磷酸鈉中的一種或多 種。
21. 根據前述任一項權利要求所述的分析，其中所述檢測分析是 發光分析。
22. —種用於檢測樣品中活微生物細胞的分析試劑盒，所述分析 試劑盒包括ATP降解酶和含磷酸鹽的化合物，所述試劑盒包括摻混裝 置使得能進行包括如下步驟的分析方法i) 將ATP降解酶加入到懷疑含有活微生物細胞的樣品中，以充 分降解所述樣品中的細胞外ATP;ii) 將所述含磷酸鹽的化合物加入到所述樣品中，以基本上中斷 所述ATP降解酶的作用；和iii) 讓所述樣品接受分析以確定樣品中未降解的ATP水平，以提 供對樣品中活微生物細胞水平的指示。
23. 根據權利要求22所述的分析試劑盒，包括在分析未降解的ATP水平之前將提取劑加入所述樣品中，用於從所述樣品提取未降解 的ATP。
24. 根據權利要求21所述的分析試劑盒，其中所述ATP降解酶是 胞外ATP酶。
25. 根據權利要求24所述的分析試劑盒，其中所述胞外ATP酶是 腺苷三磷酸雙磷酸酶。
26. 根據權利要求25所述的分析試劑盒，其中將所述腺苷三磷酸 雙磷酸酶作為pH值基本為6.5的緩衝液提供。
27. 根據權利要求26所述的分析試劑盒，其中所述腺苷三磷酸雙 磷酸酶的濃度是0.005單位/ml至最多10單位/ml樣品溶液，並且優選 為0.5單位/ml至1單位/ml溶液。
28. 根據權利要求22至27任一項所述的分析試劑盒，其中將二 價陽離子與ATP降解酶一起加入。
29. 根據權利要求28所述的分析試劑盒，其中所述二價陽離子是 典型濃度為5mM的鈣離子和/或鎂離子。
30. 根據權利要求22至29任一項所述的分析試劑盒，其中所述 含磷酸鹽的化合物選自磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉、三磷酸五鈉或多 磷酸鈉中的一種或多種。
31. 根據權利要求23所述的分析試劑盒，其中所述提取劑是選自 包括季銨化合物、二烷基銨鹽和二雙胍的一種或多種的表面活性劑。
32. 根據權利要求23所述的分析試劑盒，其中所述提取劑選自N陽N-二甲基十二烷-l-胺(GENAMIN) 、 chloroprozamine、液體溶胞產 物(LL1)和二氯化鎵(III) 、二酮合衍生物GaCl2 (BDK)中的一種 或多種。
33. 根據權利要求31或權利要求32所述的分析試劑盒，其中將 所述提取劑作為濃度為0.05-50g/l、更典型為0.1-5g/l的試劑提供。
34. 根據權利要求33所述的分析試劑盒，包括至少一種中和劑， 用於中和所述提取劑的活性。
35. —種基本上按照本文結合附圖描述的分析方法。
36. —種基本上按照本文結合附圖描述的分析試劑盒。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測樣品中活微生物細胞的分析方法，所述分析方法包括如下步驟i)將ATP降解酶加入到懷疑含有活微生物細胞的樣品中，以充分降解所述樣品中的任何細胞外ATP；ii)將含磷酸鹽的化合物加入到所述樣品中，以基本上中斷所述ATP降解酶的作用；和iii)讓所述樣品接受檢測分析以確定所述樣品中的未降解ATP水平，以提供對所述樣品中活微生物細胞水平的指示。
文檔編號C12Q1/66GK101578374SQ200780035554
公開日2009年11月11日 申請日期2007年8月1日 優先權日2006年8月1日
發明者凱薩琳·瑪麗·拉姆賽, 威廉·約翰·辛普森, 傑拉爾德·約翰·比格勒, 馬克·伯納德·德裡斯科爾 申請人:3M創新有限公司