選擇性硫酸化的蛋白質在真細菌中的遺傳編程表達的製作方法

2023-10-18 09:42:54 2

專利名稱：選擇性硫酸化的蛋白質在真細菌中的遺傳編程表達的製作方法
選擇性硫酸化的蛋白質在真細菌中的遺傳編程表達 相關申請的交叉引用本申請要求以下申請的優先權2006年9月21日提交的美國臨時申請序 列號60/846,519;和2006年10月28日提交的美國臨時申請序列號60/855,210; 兩篇申請的內容通過引用全文納入本文。對聯邦資助研發下所作發明的權利的聲明本發明在國立衛生研究院資助號GM62159的政府支持下做出。政府對本 發明享有一定權利。發明領域本發明屬於翻譯生物化學領域。本發明涉及製備和利用正交(orthogonal) tRNA、正交氨醯基-tRNA合成酶和它們的配對將非天然胺基酸摻入蛋白質 的組合物和方法。本發明還涉及用這種配對在細胞中產生蛋白質的方法以 及用這種方法產生的蛋白質。發明背景酪氨酸硫酸化是分泌蛋白和膜結合蛋白的常見翻譯後修飾(Kehoe和 Bertozzi，酪氨酸硫酸化胞外蛋白-蛋白相互作用的調節物(Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein-protein interactions) ， CTzem 5/o/ 7:R57-61 (2000))。儘管對於磺基酪氨酸生物學功能的了解程度剛剛起步，但在數種蛋白-蛋白相互作用複合物中已發現它。例如，酪氨酸硫酸化在趨化因子與趨化因子 受體結合中扮有決定性作用，所述趨化因子受體包括CCR2(Preobrazhensky等， "單核細胞趨化蛋白-l受體CCR2B是一種在保守胞外區N末端區域酪氨酸硫 酸化的糖蛋白"(Monocyte chemotactic protein-1 receptor CCR2B is a glycoprotein that has tyrosine sulfation in a conserved extracellular N-terminal region) ■//mm柳o/ 165:5295-5303 (2000))、 CCR5 (Farzan等，"CCR5氨基末端的酪氨酸 硫酸化有助於HIV-1進入"(Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry) Ce〃 96:667-676 (1999))、 CXCR4 (Farzan等，"CXCR4 氨基末端翻譯後修飾在基質衍生因子1 a結合和HIV進入中的作用"(The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino terminus in stromal-derived factor 1 alpha association and HIV-1 entry) ^z'o/ CTzem 277:29484-29489 (2002); Veldkamp等，"趨化因子基質細胞起源因子 la(SDF-la/CXCL12)識別CXCR4磺基酪氨酸"(Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-lalpha/CXCLl2)) /Mo/ 359:1400-1409 (2006))和CX3CRl(Fong等， "CX3CR1酪氨酸硫酸化增強flk分形素(fractalkine)-誘導的細胞黏附" (CX3CR1 tyrosine sulfation enhances fractalkine-induced cell adhesion) / 5z'o/ Ozem 277:19418-19423 (2002))。同樣，在水流剪切力下白細胞的翻滾也需要 PSGL-1的硫酸化以進行正確的結合和粘附(Somers等，"與SLe(X)和PSGL-1 結合的P-和E-選擇素結構揭示的白細胞系鏈和翻滾的分子基礎探密"(Insights into the molecular basis of leukocyte tethering and rolling revealed by structures of P-and E國selectin bound to SLe(X) and PSGL-1) Ce〃 103:467-479 (2000))。酪氨酸 硫酸化也參與了凝血級聯繫統，發現於數種凝集因子以及天然凝血酶抑制劑 中，如水蛭分泌的抗凝蛭素(Dong等，"糖蛋白Ib-IX複合物的酪氨酸硫酸化 識別硫酸化殘基以及對配體結合的影響"(Tyrosine sulfation of the glycoprotein Ib-IX complex: identification of sulfated residues and effect on ligand binding) 33:13946-13953 (1994); Bagdy等，"蛭素"(Hirudin) M"/w& 五w矽mo/ 45:669-678 (1976))。此外，近來發現抗體可變環狀區的酪氨酸硫酸化 在CD4誘導的HIV-1抗體中負責中和活性，因此證明磺基酪氨酸增加抗體-抗 原親和力的能力(Choe等，"人抗體的酪氨酸硫酸化在識別HIV-1 gpl20的 CCR5結合區的作用"(Tyrosine sulfation of human antibodies contributes to recognition of the CCR5 binding region of HIV-1 gpl20) Ce// 114:161-170 (2003); Xiang等，"通過中和單克隆抗體模擬I型人體免疫缺陷病毒功能"(Functional mimicry of a human immunodeficiency virus type 1 coreceptor by a neutralizingmonoclonal antibody) / 79:6068-6077 (2005》。
測定硫酸化在超過60種已知的和超過2100種預測(基於小鼠蛋白序列的 研究)的含磺基酪氨酸蛋白中的功能的主要障礙是選擇性合成硫酸化蛋白的能 力(Moore，"蛋白質酪氨酸O-硫酸化的生物學及酶學"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation) / CTzem 278:24243-24246 (2003))。當前的方法依賴於肽合成或體外酶硫酸化(Veldkamp等，"通過趨化 因子基質細胞衍生因子la (SDF-la/CXCL12)識別CXCR4磺基酪氨酸" (Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-lalpha (SDF-lalpha/CXCL12)) J M / 359:1400-1409 (2006); Kirano 等，"牛膽囊收縮素-33 (CCK-33)的全合成"(Total synthesis of porcine cholecystokinin-:33 (GCK陽"))CTzew. Soc., Ozem. Gomww". 323-325 (1987); Muramatsu等，"用來自真細菌A -44的硫酸轉移酶對酪氨酸殘基進行酶的O-硫酸化"(Enzymic O-sulfation of tyrosine residues in hirudins by sulfotransferase from Eubacterium A-44)五"r /5/oc/^w 223:243-248 (1994); Young和Kiessling ，"硫酸化肽的合成策略"(A strategy for the synthesis of sulfated peptides) C/2ew/"/^/Eng/ 41:3449-3451 (2002));然而，兩者都缺乏普遍性前者受限 於長度限制以及酸性條件下磺基酪氨酸有去硫酸化的趨勢；後者受限於附加 硫酸轉移酶的可用性以及其相關識別序列的限制。
在蛋白的已知位點直接摻入遺傳編碼的非天然胺基酸磺基酪氨酸可克 服上述限制。直接摻入磺基酪氨酸將極大地利於研究生物學調節過程中的 硫酸化事件，並可創造具有顯著多樣性的硫酸化抗體和肽庫。而且，生產 蛋白蛭素的硫酸化形式的能力具有直接的臨床應用，可作為改良的抗凝劑 (相對於非硫酸化形式的改良)。本領域需要能將非天然胺基酸磺基酪氨酸摻 入蛋白質的新方案。
現己開發了在原核和真核生物中將各種非天然胺基酸體內位點特異性地 摻入蛋白質的通用方法。這些方法依賴於正交蛋白質翻譯組分，所述組分識別 合適的選擇者密碼子(selector codon)從而能在體內多肽翻譯期間將所需的非天 然胺基酸插入限定位置。這些方法利用識別選擇者密碼子的正交 tRNA(O-tRNA)，而相應的特異性正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然胺基酸加載該O-tRNA。這些組分不與宿主生物體內的任何內源性tRNA、 RS、 胺基酸或密碼子交叉反應(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對 可能遺傳編碼大量結構各異的非天然胺基酸。
本領域普遍知道利用適合於製備含一個或多個非天然胺基酸的蛋白質的 正交翻譯系統，例如產生正交翻譯系統的通用方法。例如，參見國際公布號 WO 2002/086075，其名為"METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL 簡A-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS(產生正交tRNA-氨醯基-tRNA合成酶配對的方法和 組合物)"；WO 2002/085923，其名為"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(非天然胺基酸的體內摻入)"；WO 2004/094593 ， 其名為"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE(擴展真核遺傳密碼)"；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624;和2005年10月27日提交的WO 2006/110182，其名為 "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(體內摻入非天然氨基 酸的正交翻譯組分)"。這些申請各自通過引用全文納入本文。摻入非天然 胺基酸的正交翻譯系統及它們的產生和使用方法的其它討論還可參見 Wang和Schultz, "Expanding the Genetic Code(擴展遺傳密碼)"，CTzem. Co畫肌fC謹6.) 1:1-11 (2002); Wang禾口 Schultz "Expanding the Genetic Code(擴展遺傳密碼)"，J"genw^/e CAew/e/"A ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code(擴展遺傳密碼)"，M"/zo出 36(3):227-238 (2005); Xie禾口 Schultz， "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire(將胺基酸力Q入遺傳庫)"Ct^r. CAem/ca/ 9(6):548-554 (2005); Wang等，"Expanding the Genetic Code(擴展遺傳密 碼)"，j國.5—B,omo/. 35:225-249 (2006; 2006年1月
13日電子公開)；Xie禾卩Schultz， "A chemical toolkit for proteins - an expanded genetic code(蛋白質的化學工具箱-擴展的遺傳密碼)"，A^. i ev. Mo/. CW/5/o/.， 7(10):775-782 (2006; 2006年8月23日電子公開)。本領域需要開發能將非天然胺基酸磺基酪氨酸慘入蛋白質的正交翻譯組 分，其中所述非天然胺基酸摻入在任何指定位置。縱覽下文後可明白本文描述 的本發明滿足了這些和其它需求。
發明概述
儘管酪氨酸硫酸化是多細胞真核生物中普遍的翻譯後修飾(Moore，"蛋 白酪氨酸O-硫酸化的生物學和酶學"(The biology and enzymology of protein 的翻譯後修飾，酪氨酸硫酸化進行進一步研究和應 用。
本發明提供在體內(例如在宿主細胞內)對選擇者密碼子，如琥珀終止密 碼子起反應而將非天然胺基酸磺基酪氨酸摻入延伸中的多肽鏈的組合物和 方法。這些組合物包含不與宿主細胞翻譯機制相互作用的正交-tRNA (O-tRNA)和正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)配對。即，內源性宿主細胞氨 醯基-tRNA合成酶不會用胺基酸(天然或非天然)加載O-tRNA(或加載水平 不明顯)。類似地，本發明提供的0-RS不以顯著或可檢測的水平用氨甚酸(天 然或非天然)加載內源性tRNA。這些新組合物能夠產生含有翻譯摻入的磺 基酪氨酸的大量蛋白質。
在一些方面，本發明提供翻譯系統。這些系統包含第一正交氨醯基 -tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA (O-tRNA)和第一非天然胺基酸，即 磺基酪氨酸，其中所述第一 O-RS用所述第一非天然胺基酸磺基酪氨酸優先 氨醯化所述第一 O-tRNA。在一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸優先氨醯
10化所述O-tRNA，其效率至少為包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或lO所示胺基酸序列的氨醯基-tRNA合成酶的翻譯系統 效率的50%。
該翻譯系統可使用衍生自各種來源的組分。在一個實施方式中，所述 第一 O-RS衍生自詹氏甲垸球菌(Me^7"ococc^ y'朋"wc/n7)氨醯基-tRNA合 成酶，例如野生型詹氏甲烷球菌酪氨醯-tRNA合成酶。用於該系統的O-RS 可包含SEQ ID NO: 4、 6、 8或10所示胺基酸序列及該序列的保守變體。 在一些實施方式中，所述O-tRNA是琥珀抑制子tRNA。在一些實施方式中， 所述O-tRNA包含SEQ ID NO:l或由其編碼。
在一些方面，翻譯系統還包含編碼感興趣蛋白質的核酸，其中所述核 酸具有O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子。
在一些方面，翻譯系統包括利用第二非天然胺基酸的第二正交配對(即 第二O-RS和第二O-tRNA)，現在該系統能在多肽的不同所選位置摻入至少 兩個不同的非天然胺基酸。在這種雙重系統中，第二O-RS用不同於第一非 天然胺基酸的第二非天然胺基酸優先氨醯化第二 O-tRNA，而第二 O-tRNA 識別不同於第一 O-tRNA所識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。
在一些實施方式中，翻譯系統位於宿主細胞中(包括該宿主細胞)。所用 的宿主細胞不作具體限定，只要O-RS和O-tRNA在它們的宿主細胞環境中 能保留其正交性。所述宿主細胞可以是真細菌細胞，如大腸桿菌。所述宿 主細胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或O-tRNA在內的翻譯系統組分的 多核苷酸。在一些實施方式中，編碼0-RS的多核苷酸包含SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。
本發明還提供產生在所選位置含有一個或多個非天然胺基酸的蛋白質 的方法。這些方法利用上述翻譯系統。這些方法通常始於提供含有以下組 分的翻譯系統的步驟(i)第一非天然胺基酸，即非天然胺基酸磺基酪氨酸； (ii)第一正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS); (iii)第一正交tRNA (O-tRNA)， 其中所述O-RS用所述非天然胺基酸優先氨醯化所述O-tRNA;和(iv)編碼 蛋白質的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA識別的至少一個選擇者密碼子。 然後在所述蛋白質的翻譯過程中該方法對選擇者密碼子起反應而將所述非天然胺基酸慘入所述蛋白質的所選位置，從而產生在所選位置含有所述非 天然胺基酸的蛋白質。在這些方法的一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸優
先氨醯化所述O-tRNA，其效率至少為包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含 有SEQIDNO: 4、 6、 8或10所示胺基酸序列的氨醯基-tRNA合成酶的翻 譯系統效率的50%。在一些方面，使用這些方法產生硫酸化形式的蛭素。
可利用各種試劑和步驟廣泛實施這些方法。在一些實施方式中，提供 編碼O-RS的多核苷酸。在一些實施方式中，提供衍生自詹氏甲烷球菌氨醯 基-tRNA合成酶的O-RS，例如可以提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨醯-tRNA 合成酶。在一些實施方式中，該提供步驟包括提供含有SEQIDNO:4、 6、 8或10所示胺基酸序列及其保守變體的O-RS。
在這些方法的一些實施方式中，提供翻譯系統的步驟包括通過定點誘 變使野生型氨醯基-tRNA合成酶的胺基酸結合袋(bindingpocket)發生突變， 選擇用所述非天然胺基酸優先氨醯化所述O-tRNA的所得O-RS。所述選擇 步驟可包括定點誘變後從得到的氨醯基-tRNA合成酶分子庫正選擇和負選 擇所述O-RS。在一些實施方式中，提供步驟提供編碼O-tRNA的多核苷酸， 例如，O-tRNA是琥珀抑制子tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO:l所示 多核苷酸或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有翻譯系統 所用的琥珀選擇者密碼子的核酸。
還可改進這些方法以在蛋白質中摻入一個以上非天然胺基酸。在那些 方法中，聯用第二正交翻譯系統與第一翻譯系統，其中第二系統具有不同 的胺基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二 O-RS 和第二 O-tRNA，其中第二 O-RS用不同於第一非天然胺基酸的第二非天然 胺基酸優先氨醯化第二 O-tRNA，且第二 O-tRNA識別核酸中不同於第一 O-tRNA所識別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。
還可在宿主細胞環境中實施產生含非天然胺基酸的蛋白質的方法。在 這些情況中，提供的宿主細胞含有非天然胺基酸、O-RS、 O-tRNA和編碼 蛋白質的含至少一個選擇者密碼子的核酸，而培養該宿主細胞可導致非天 然胺基酸的摻入。在一些實施方式中，提供步驟包括提供真細菌宿主細胞 (例如，大腸桿菌)。在一些實施方式中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQ ID NO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些實施方式中，通過提供細胞提取物實現 提供翻譯系統的步驟。
本發明還提供包含核酸和蛋白質的各種組合物。除了組合物含有所述 核酸或蛋白質外，對該組合物的性質不作具體限制。本發明組合物可含有 任何數量、任何性質的其它組分。
例如，本發明提供含有O-RS多肽的組合物，其中所述多肽含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或IO所示胺基酸序列或其保守變體。在一些方面，所述保守 變體多肽用非天然胺基酸氨醯化關聯(cognate)正交tRNA (O-tRNA)的效率 至少為含有該O-tRNA、該非天然胺基酸和含有SEQIDNO: 4、 6、 8或10 所示胺基酸序列的氨醯基-tRNA合成酶的翻譯系統所觀察到的效率的50M。 本發明還提供編碼上述任何多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，這些多 核苷酸可含有SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些實施方式 中，多肽在細胞中。
本發明還提供含有SEQ IDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列的多核苷 酸組合物。在一些實施方式中，本發明提供含有所述多核苷酸的載體，如 表達載體。在一些實施方式中，本發明提供含有上述載體的細胞。
定義
在詳細描述本發明前，應該知道本發明不局限於具體的生物系統，本
發明當然可以有各種變化。還應知道本文所用的術語只是為了描述具體的
實施方式，而非限制性的。除非另有明確指出，本說明書和隨附的權利要
求書中使用的單數形式"一個"、"一種"和"該"也包括複數對象。因
此，例如述及"一個細胞"包括兩個或多個細胞的組合；"一個多核苷酸"
實際上包括該多核苷酸的多份拷貝。
除了此處和說明書以下其餘部分所定義的，本文所用的所有技術和科 學術語都與本發明所屬領域普通技術人員常規理解的意義相同。
正交:本文所用的術語"正交"指與某細胞或翻譯系統的內源性相應分 子相比，某分子(例如，正交tRNA(0-tRNA)和/或正交氨醯tRNA合成酶(O-RS))
13與該細胞內源性組分起作用的效率降低，或不能與該細胞的內源性組分起作
用。就tRNA和氨醯基-tRNA合成酶而言，正交指與和內源性tRNA合成酶起 作用的內源性tRNA相比，正交tRNA不能與內源性tRNA合成酶起作用或起 作用的效率降低；或者與和內源性tRNA起作用的內源性tRNA合成酶相比， 正交氨醯tRNA合成酶與內源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效 率降低例如，小於20%的效率，小於10%的效率，小於5%的效率，或小於1% 的效率。正交分子缺乏細胞中功能正常的內源性互補分子。例如，與內源性 RS氨醯化內源性tRNA相比，細胞的任何內源性RS氨醯化細胞中正交tRNA 的效率降低或者甚至為0。在另一例子中，與內源性RS氨醯化內源性tRNA 相比，正交RS氨醯化感興趣細胞中任何內源性tRNA的效率降低或者甚至為 0。可將能與第一正交分子起作用的第二正交分子引入細胞。例如，正交 tRNA/RS配對包括引入的互補組份，與對照，例如相應的tRNA/RS內源性配 對或活性正交配對(如酪氨醯正交tRNA/RS配對)相比，它們在細胞中共同起作 用的效率是，例如45%效率、50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80% 效率、卯％效率、95%效率或99%效率，或更高。
IH交酪氨醯-tRNA:本文所用的正交酪氨醯-tRNA(酪氨醯-O-tRNA)是 與感興趣翻譯系統正交的tRNA，其中所述tRNA是(1)與天然酪氨醯 -tRNA相同或基本類似；(2)通過天然或人工誘變衍生自天然酪氨醯tRNA;
(3) 由考慮了(l)或(2)的野生型或突變型酪氨醯tRNA序列的任何方法產生；
(4) 與野生型或突變型酪氨醯tRNA同源；(5)與圖7中稱為酪氨醯tRNA 合成酶底物的任何示例性tRNA同源；或(6)圖7中稱為酪氨醯tRNA合成 酶底物的任何示例性tRNA的保守變體。酪氨醯tRNA可加載有胺基酸，或 處於非負載狀態。還應知道"酪氨醯-O-tRNA"任選被關聯(cognate)合成酶 分別加載(氨醯化)除酪氨酸以外的胺基酸，例如非天然胺基酸。應該知道， 實際上優選利用本發明酪氨醯-O-tRNA在翻譯期間對選擇者密碼子起反應 而基本上可將任何胺基酸(無論天然或非天然的)摻入延伸的多肽內。
TH交酪氨醯胺基酸合成酶:本文所用的正交酪氨醯胺基酸合成酶(酪氨 醯-O-RS)是在感興趣翻譯系統內用胺基酸優先氨醯化酪氨醯-O-tRNA的 酶。酪氨醯-O-RS加載到酪氨醯-04RNA上的胺基酸可以是任何胺基酸，無論是天然的、非天然的還是人工的，並且不限於本文所述的。該合成酶 任選與天然酪氨醯胺基酸合成酶相同或同源，或者與圖7中稱為O-RS的合
成酶相同或同源。例如，所述O-RS可以是圖7的酪氨醯-O-RS的保守變體， 和/或與圖7中O-RS的序列至少有50%、 60%、 70%、 80%、卯％、 95%、 98%、 99%或以上相同。
關聯(cognate):術語"關聯"指共同起作用或彼此具有一定特異性的組分， 例如正交tRNA和正交氨醯基-tRNA合成酶。這些組分也可互稱為"互補的"。
優先氨醯化:對於本文所用正交翻譯系統而言，當某表達系統中O-RS使 O-tRNA帶上胺基酸的效率高於其使任何內源性tRNA帶上胺基酸的效率時， 該O-RS"優先氨醯化"關聯O-tRNA。即，當翻譯系統中存在摩爾比大致相等 的O-tRNA與任何給定的內源性tRNA時，O-RS加載O-tRNA的頻率高於它 加載內源性tRNA的頻率。當翻譯系統中存在等摩爾濃度的O-tRNA與內源性 tRNA時，由O-RS加載的O-tRNA與由O-RS加載的內源性tRNA的相對比例 優選較高，最好導致O-RS僅加載或幾乎僅加載O-tRNA。當存在等摩爾濃度 的O-tRNA與O-RS時，O-RS加載的O-tRNA與內源性tRNA的相對比例大於 1:1，優選至少約2:1，更優選5:1，更優選10:1，更優選20:1，更優選50:1， 更優選75: 1，更優選95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500: 1、 1,000: 1、 5,000: 1 或更高。
當(a)與內源性tRNA相比，O-RS優先氨醯化O-tRNA，和(b)與O-RS 用任何天然胺基酸氨醯化O-tRNA相比，氨醯化對非天然胺基酸特異時，稱 O-RS "優先用非天然胺基酸氨醯化O-tRNA"。艮卩，當包含O-RS和O-tRNA 的翻譯系統中存在等摩爾量的非天然和天然胺基酸時，O-RS用非天然胺基酸 加載O-tRNA的頻率高於用天然胺基酸加載的頻率。加載有非天然胺基酸的 O-tRNA與加載有天然胺基酸的O-tRNA的相對比例優選較高。O-RS最好使 O-tRNA僅加載，或者幾乎僅加載有非天然胺基酸。當翻譯系統中存在等摩爾 濃度的天然和非天然胺基酸時，使O-tRNA帶上非天然胺基酸與使O-tRNA帶 上天然胺基酸的相對比例大於1: 1，優選至少約2:1，更優選5:1，更優選10: 1，更優選20:1，更優選50:1，更優選75:1，更優選95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500:1、 1,000:1、 5,000: 1或更高。
15選擇者密碼子:術語"選擇者密碼子"指翻譯過程中為O-tRNA所識別而
不為內源性tRNA所識別的密碼子。O-tRNA反密碼子環識別mRNA上的選擇 者密碼子並在多肽的此位置摻入其胺基酸，例如非天然胺基酸。選擇者密碼子 可包括，例如無義密碼子，如終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)；四 鹼基或四鹼基以上密碼子；罕用密碼子；衍生自天然或非天然鹼基對的密碼子， 等等。
抑制子tRNA:抑制^JRNA是在多肽翻譯期間通常對終止密碼子起反應 而摻入胺基酸(即，"連讀")來改變給定的翻譯系統中信使RNA(mRNA)閱讀 的tRNA。在一些方面，本發明的選擇者密碼子是抑制子密碼子，例如，終止 密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)、四鹼基密碼子、罕用密碼子等。
抑制活性:本文所用的術語"抑制活性"總體上指tRNA(例如，抑制^JRNA) 能翻譯連讀在其它情況中可導致翻譯終止或錯譯(例如，移碼)的密碼子(例如， 作為選擇者密碼子的琥珀密碼子或四個或以上個鹼基的密碼子)的能力。抑制 itRNA的抑制活性可表示為與第二抑制itRNA，或與對照系統，例如缺乏 O-RS的對照系統相比，觀察到的翻譯連讀活性的百分比。
本發明提供定量測定抑制活性的各種方法。特定O-tRNA和O-RS對感興 趣選擇者密碼子(例如，琥珀密碼子)的抑制百分比指，在感興趣的翻譯系統中， 在編碼表達測試標記的核酸中含有選擇者密碼子的該給定表達測試標記(例 如，LacZ)的活性與陽性對照構建物相比的百分比，所述感興趣的翻譯系統包 含O-RS禾B O-tRNA，所述陽性對照沒有O-tRNA、 O-RS和選擇者密碼子。因 此，例如，如果在給定翻譯系統中觀察到不含選擇者密碼子的活性陽性對照標 記構建物的活性為X(其單位與所述標記試驗相關)，則含有選擇者密碼子的測 試構建物的抑制百分比是在與陽性對照標記的表達基本相同的環境條件下(除 了該測試標記構建物在也含有O-tRNA和O-RS的翻譯系統中表達外)，該測試 標記構建物顯示的X百分比。表達該測試標記的翻譯系統一般也包含O-RS和 O-tRNA識別的胺基酸。可任選通過將測試標記與"背景"或"陰性"對照標 記構建物比較來校正抑制百分比的測量值，所述"背景"或"陰性"對照標記 構建物含有與測試標記相同的選擇者密碼子，但其所在的系統不含O-tRNA、 O-RS和/或O-tRNA和/或O-RS識別的相關胺基酸。該陰性對照可用於標準化抑制百分比測定值以補償感興趣的翻譯系統中標記的背景信號的影響。
可通過本領域已知的許多試驗測定抑制效率。例如，可採用y5-半乳糖苷酶
報導試驗，如可將衍生的lacZ質粒(該構建物在lacZ核酸序列中含有選擇者密 碼子)連同含有本發明的O-tRNA的質粒引入合適生物(例如，可利用正交組分 的生物)的細胞。還可引入關聯合成酶(可以是多肽或表達時能編碼該關聯合成 酶的多核苷酸)。細胞在培養基中生長至所需密度，例如至OD6oo約為0.5，進 行(3-半乳糖苷酶試驗，例如用諾瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM p-半乳糖苷 酶試驗試劑盒。可將抑制百分比計算為樣品相對於可比較對照，例如，衍生的 lacZ構建物的觀察值的活性百分比，該構建物在所需位置具有相應的有義密碼 子而非選擇者密碼子。
翻譯系統:術語"翻譯系統"指將胺基酸摻入延伸中的多肽鏈(蛋白質)的 各組分。翻譯系統的組分可包括，例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。 本發明的O-tRNA和/或O-RS可加入體外或體內翻譯系統或是其一部分，例如 存在於非真核細胞，如細菌(如大腸桿菌)中，或存在於真核細胞中，如酵母菌、 哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞等。
非天然胺基酸:本文所用的術語"非天然胺基酸"指不在20種常見天然 胺基酸或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸(pyrrolysine)之列的任何胺基酸，修飾的 胺基酸和/或胺基酸類似物。例如，本發明可使用非天然胺基酸磺基酪氨酸(參 見

圖1)。
衍生自:本文所用的術語"衍生自"指分離自特定分子或生物，或是用特 定分子或生物的信息製得的某組份。例如，衍生自第二多肽的多肽含有與該第 二多肽的胺基酸序列相同或基本上類似的胺基酸序列。以多肽為例，可通過， 例如天然產生的誘變、人工定向誘變或人工隨機誘變獲得衍生的種類。用於衍 生多肽的誘變可以是有意定向或有意隨機的，或混用兩種方法。誘變多肽以產 生衍生自第一(多肽)的不同多肽可以是隨機的(例如，聚合酶失真所致)，可通 過合適的篩選方法，例如本文所述的方法鑑定衍生的多肽。誘變多肽通常需要 對編碼該多肽的多核苷酸進行操作。
正選擇或篩選標記:本文所用的術語"正選擇或篩選標記"指當存在該標
記時(例如被表達或激活等)可從不具有特徵的細胞中鑑定出具有特徵的細胞，
17例如具有正選擇標記的細胞。
負選擇或篩選標記:本文所用的術語"負選擇或篩選標記"指當存在該標 記時(例如被表達或激活等)可鑑定不含有所選特性或特徵的細胞(例如，與確實 具有該特性或特徵的細胞相比)。
報導分子:本文所用的術語"報導分子"是指可用於鑑定和/或選擇感 興趣系統的靶組分的組分。例如，報導分子可以包括蛋白質，如能賦予抗 生素抗性或敏感性的酶(如P-內醯胺酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)等)、螢光 篩選標記(如綠色螢光蛋白(如GFP)、 YFP、 EGFP、 RFP等)、冷光標記(如 螢火蟲螢光素酶蛋白)、親和力篩選標記，或者可選擇的正或負標記基因如 lacZ、 p-gal/lacZ(P-半乳糖苷酶)、ADH(乙醇脫氫酶)、his3、 ura3、 leu2、 lys2 等。
真核生物:本文所用的術語"真核生物"指屬於真核生物界(Kingdom Eucarya)的生物。真核生物通常因其以下特徵而區別於原核生物典型的多細 胞組織(但不都是多細胞，例如酵母)，存在膜限制的核與其它膜限制的細胞器， 線形遺傳物質(S卩，線形染色體)，不存在操縱子，存在內含子、信使(RNA)加 帽和聚-AmRNA，以及其它生物化學特徵，如不同的核糖體結構。真核生物包 括，例如動物(如哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥等)，纖毛蟲，植物(如單子葉 植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母菌、鞭毛蟲類、微孢子蟲、原生動 物等。
原核生物:本文所用的術語"原核生物"指屬於原核生物界(也稱為原核 生物(Procarya))的生物。原核生物通常因其以下特徵而區別於真核生物單細 胞組織，通過出芽或分裂的無性生殖，缺乏膜限制的核與其它膜限制的細胞器， 環狀染色體，存在操縱子，不存在內含子、信使(RNA)加帽和聚-AmRNA，以 及其它生物化學特徵，如不同的核糖體結構。原核生物包括真細菌和古細菌 (Archaea)(有時稱為"古細菌(Archaebacteria)")亞界。在原核生物界有時將 藍細菌(藍綠藻)與支原體分為不同類別。
細菌:本文所用的術語"細菌"和"真細菌"指不同於Mm的原核生物。 類似地，古細菌指不同於真細菌的原核生物。可根據許多形態和生物化學標準 區分真細菌和古細菌。例如，可採用核糖體RNA序列、RNA聚合酶結構的差異，內含子的存在與否，抗生素敏感性，細胞壁肽聚糖和其它細胞壁組分的存 在與否，膜脂質的分枝與不分枝結構，存在/不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白而將 某生物指定為真細菌或古細菌。
真細菌的例子包括大腸桿菌C&c/ en'c/ /a co//)、嗜熱棲熱菌(77zenm^ Aermc^/w7w力、枯草芽孢桿菌(5a"7/M w6"7&)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Sac/〃w
Aerwo; /2//^)等)。古細菌的例子包括詹氏甲烷球菌(M"/7a"ococc^ ya""(xyc/n7)(A^)、梅氏甲烷乂V疊球菌(Af"/wf"oyorc/"a maze/)(A/w)、嗜熱石鹹甲烷 t幹菌(A/e^za"o6a"en'wrw Ae/-moaw/c^ro; /2/cMm)(AfiO 、 海 S 甲院球菌 (A/e^a/70cocc船manj^/Mofe)、 甲烷嗜熱菌(A/^/wfwopyrwj1 A:fl"cZ/en')、 鹽細菌 C/7a/oZ^"en'wm)(例如沃氏富鹽菌(i/a/o/erax vo/cam7)和鹽細菌種A^ C-7)、閃爍 古生球菌C^c/wfeog/o6z^/w/g/i^s)(4/)、激烈火球菌CP"ococcws/wnVww力CP力、極 端嗜熱古菌(屍3^"ococcw5 /zor汰oy/z/,)(屍/z)、好氧火球菌(屍少ro6acw/wm aera; /n7"m)、 深海火球菌(屍戸coccus fl—w')、硫磺礦硫化葉菌(5W/o/oZms soZ/flton'cus)(&)、 超嗜熱泉古菌0 "//0/。6^ totoc/a//)、嗜熱泉生古細菌/ em/x)(JP)、 嗜酸熱原體(T7^r附o/j/a5w" ac/c/o/ /n7ww)禾口火山熱原體(77^rwop/<xsmaf
保守性變體:就翻譯組分而言，本文所用的術語"保守性變體"指某翻譯
組份，例如保守性變體O-tRNA或保守性變體O-RS，其所執行的功能與與其 相似的基本組分(例如O-tRNA或O-RS)相類似，但與參比O-tRNA或O-RS 相比序列中有變異的。例如，O-RS或該O-RS的保守性變體可用非天然氨 基酸，例如磺基酪氨酸氨醯化關聯O-tRNA。在該例子中，所述O-RS及保 守性變體O-RS的胺基酸序列不相同。所述保守性變體在序列中可具有例如 一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或更多處變異，只要該保守 性變體仍與關聯的相應O-tRNA或O-RS互補(例如，與之起作用)。
在一些實施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一 個或多個保守性胺基酸取代。在一些實施方式中，保守性變體O-RS與衍生 其的O-RS相比，含有一個或多個保守性胺基酸取代，此外還保留了O-RS 的生物學活性；例如，保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至 少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40。/。的生物學活性。在一些優選實施方式中，所述保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少 50n/。的生物學活性。保守性變體O-RS的保守性胺基酸取代可出現在該O-RS 的任何結構域內，包括胺基酸結合袋。
選擇或篩選試劑:本文所用的術語"選擇或篩選試劑"指當存在時可從某
群體中選擇/篩選某些組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可以是但不限於，如 營養物、抗生素、某波長的光、抗體、表達的多核苷酸等。選擇試劑可因例如 濃度、強度等而有所不同。
起反應:本文所用的術語"起反應"指本發明的O-tRNA識別選擇者密碼 子並介導與該tRNA偶聯的非天然胺基酸摻入延伸中的多肽鏈的過程。
編碼:本文所用的術語"編碼"指用多聚大分子或序列鏈中的信息來指導
不同於該第一分子或序列鏈的第二種分子或序列鏈產生的任何過程。本文所用 的該術語應用廣泛，可用於各領域。在一些方面，術語"編碼"描述了半保留
DNA複製的過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈用作模板，藉助依賴DNA的 DNA合成酶來編碼新合成的互補姊妹鏈。
在另一方面，術語指用一種分子的信息來指導產生化學性質不同 於該第一分子的第二種分子的任何過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例 如，包含依賴DNA的RNA聚合酶的轉錄過程)。RNA分子也可編碼多肽，例 如翻譯過程。當術語"編碼"用於描述翻譯過程時，其含義也延伸至編碼氨基 酸的三聯密碼子。在一些方面，RNA分子可編碼DNA分子，例如通過包含依 賴RNA的DNA合成酶的逆轉錄過程。在另一方面，DNA分子可編碼多肽， 應該知道該情況用"編碼"同時包括轉錄和翻譯過程。
附圖簡述
圖1提供了非天然胺基酸磺基酪氨酸的化學結構。
圖2顯示了考馬斯亮藍染色的變性PAGE凝膠，展示了磺基-蛭素和磺基-蛭素的遷移。由於蛭素的非典型帶電因此無法通過分子量標準品判斷其分子 裡。
圖3A和3B提供了凝血酶抑制的代表性圖示，分別在原始數據點上擬合 了過程曲線。在含聚乙二醇6000和HAS的Tris-HCl鹽水緩衝液中用50 螢光底物、40 pM人a-凝血酶和100 pM表達蛭素進行酶實驗。圖3A顯示了無 抑制(對照)、脫磺基-蛭素抑制及磺基-蛭素抑制的螢光強度隨時間變化圖。圖 3B顯示對脫磺基-蛭素和磺基-蛭素的放大圖以便比較。
圖4A和4B顯示了 Z-結構域的磺基酪氨酸依賴性表達。圖4A提供了表 達7位具有琥珀密碼子的Z-結構域的細胞的Ni-NTA純化細胞裂解物經考馬斯 亮藍染色的變性PAGE凝膠。只有使用磺基酪氨酸補充培養基表達時產生全長 Z-結構域。圖4B提供了 Ni-NTA純化細胞裂解物(濃縮並對水透析)正-離子線 性模式MALDI-TOF譜(用THAP基質產生)，顯示了含單一磺基酪氨酸並缺少 甲硫氨酸的全長Z-結構域對應的峰。也觀察到從質譜分析條件中導致硫酸基團 丟失所對應的峰。
圖5A、 5B和5C顯示了不同的MALDI-TOF譜。圖5A所示純磺基-蛭素 正離子線性模式MALDI-TOF譜(用THAP基質產生)，顯示完整[M+H]磺基-蛭 素峰(7059 Da)和質譜分析中硫酸基團丟失所對應的峰(6979 Da)。注意主峰右側 的小峰是鈉加合物。它們以22Da的間隔出現。圖5B所示MALDI-TOF譜(用 芥子基質產生)記錄了樣品的純度。為了增強對可能雜質的檢測，使用更嚴苛 的導致[M+H-80]峰突顯的芥子基質。13964 Da的峰歸因於磺基-蛭素二聚化。 未觀察到其它雜質。圖5C顯示了相關區域的放大圖，以顯示[M+H-80]和完整 磺基-蛭素峰的存在。因為使用了更嚴苛的芥子基質，完整的磺基-蛭素是較小 的峰。主峰右側的小峰是鈉加合物。
圖6A和6B顯示了不同的MALDI-TOF譜。圖6A顯示了在磺基酪氨酸不 存在時表達對應的未純化磺基-蛭素表達培養基的MALDI-TOF譜(使用芥子基 質產生)。僅發現截短蛭素的峰；未觀察到全長蛋白。圖6B顯示了在磺基酪氨 酸存在時表達對應的未純化磺基-蛭素表達培養基的MALDI-TOF譜(使用芥子 基質產生)，顯示了截短與全長磺基-蛭素的峰比例。因為需要更嚴苛的條件更 好地檢測粗樣品混合物，所以僅清晰觀察到磺基-蛭素的離子化形式。
圖7提供核苷酸和胺基酸序列。
發明詳述
儘管酪氨酸硫酸化是多細胞真核生物中普遍的翻譯後修飾(Moore，"蛋
21白酪氨酸O-硫酸化的生物學和酶學"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation)， J5/o/C/zem 2003))，但其生物學功能大部分未知。部 分因為合成選擇性硫酸化蛋白的困難。本發明提供了在細菌中通過響應琥 珀無義密碼子TAG而遺傳編碼修飾胺基酸，從而將磺基酪氨酸摻入蛋白質 中。而且顯示了用此策略可使以前無法通過重組方法得到的磺基蛭素在大 腸桿菌中直接表達。如本文所述，動力學分析顯示磺基-蛭素對人凝血酶的 親和力比脫磺基-蛭素增強10倍以上，這個發現為磺基-蛭素作為抗凝劑提 供了臨床優勢(DiNisio等，"直接凝血酶抑制劑"(DirecUhrombin inhibitors) JV五"g/JMW353:1028-1040 (2005))。這個生物合成硫酸化蛋白的通用方法 有利於對出現的翻譯後修飾，酪氨酸硫酸化進行進一步研究和應用。
作為蛋白位點特異性硫酸化的一般方法，本發明描述了正交tRNA/氨 醯基-tRNA合成酶(aaRS)對的演化，以便在真核生物如大腸桿菌中響應於琥 珀無義密碼子而有效和選擇性地將磺基酪氨酸摻入蛋白質中。使用獨特的 抑制子tRNA/aaRS對，可直接表達蛭素的天然硫酸化形式，證明其對人凝 血酶的親和力比脫磺基-蛭素強10倍以上，這與此前文獻報導一致(Stone 和Hofsteenge，"蛭素對凝血酶抑制的動力學"(Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin) Aoc/z謹'腳25:4622-4628 (1986》。
本發明提供能在大腸桿菌中對選擇者密碼子(例如琥珀終止密碼子TAG) 起反應而將磺基酪氨酸(參見圖l)體內選擇性引入蛋白質的正交tRNA7氨醯基 -tRNA合成酶配對。本發明提供用非天然胺基酸磺基酪氨酸特異性加載相關的 正交tRNA(O-tRNA)的新正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)多肽。
在某些方面，為證明(但不是限制)本發明，本文內容證明可將非天然氨基 酸部分摻入各種模型蛋白質。摻入非天然胺基酸不必局限於任何特定的蛋白 質。從本發明可以明白，將非天然胺基酸磺基酪氨酸摻入感興趣的特定蛋白質 對於各種目的是有利的。
本文還描述了開發能在真細菌中起作用而對選擇者密碼子起反應，從 而位點特異性地摻入非天然胺基酸磺基酪氨酸(如圖1所示)的新型正交 tRNA/氨醯基-tRNA合成酶配對的方法。簡言之，本發明提供了在大腸桿菌 宿主細胞中用非天然胺基酸磺基酪氨酸選擇性加載抑制iRNA的詹氏甲烷球菌酪氨醯-tRNA合成酶的新型突變體。
可利用這些開發的tRNA-合成酶配對將非天然胺基酸磺基酪氨酸位點特 異性地慘入蛋白質。可通過工程改造編碼感興趣蛋白質的多核苷酸序列使之含 有能發出慘入非天然胺基酸信號的選擇者密碼子，從而能將非天然胺基酸編程 摻入任何所需位置。
本文所述發明提供在真細菌，例如大腸桿菌中將非天然胺基酸磺基酪氨酸 遺傳編碼並摻入蛋白質的正交配對，其中所述正交組分不與宿主細胞翻譯機制 的內源性大腸桿菌組分交叉反應，但能識別所需的非天然胺基酸並對選擇者密 碼子(例如，琥珀無義密碼子，TAG)起反應而將其摻入蛋白質。本發明提供的 正交組分包括衍生自詹氏甲垸球菌酪氨醯tRNA-合成酶的正交氨醯基-tRNA合 成酶，和突變型酪氨醯tRNAojA琥珀抑制子，二者在真細菌宿主細胞中用作正 交配對。
本發明提供鑑定和產生其它正交tRNA-氨醯基-tRNA合成酶配對，例如 O-tRNA/0-RS配對的組合物和方法，所述配對可用於將磺基酪氨酸摻入蛋白 質。本發明的O-tRNA/0-RS配對能介導磺基酪氨酸摻入多核苷酸編碼的蛋白 質，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的選擇者密碼子。所述O-tRNA 的反密碼子環識別mRNA上的選擇者密碼子，進而將非天然胺基酸摻入多肽 中的該位點。本發明的正交氨醯基-tRNA合成酶通常只用一種特定的非天然氨 基酸優先氨醯化(或加載)其O-tRNA。
正交tRNA/氨醯基-tRNA合成酶技術
理解與正交tRNA和正交氨醯基-tRNA合成酶配對有關的活性有助於 理解本發明的新型組合物和方法。為在遺傳密碼中加入額外的非天然氨基 酸，需要含有氨醯基-tRNA合成酶和適當tRNA的新正交配對，它們可在 宿主翻譯機制中有效起作用，但對於所述翻譯系統是"正交"的，這意味 著它可不依賴於翻譯系統的內源性合成酶和tRNA而起作用。正交配對的所 需特徵包括能解碼或識別不由任何內源性tRNA解碼的僅一種特定密碼子(例 如選擇者密碼子)的tRNA，和只能用一種特定非天然胺基酸優先氨醯化(或"加 載")其關聯tRNA的氨醯基-tRNA合成酶。內源性合成酶通常不氨醯化 O-tRNA(或氨醯化，即加載不佳)。例如，在大腸桿菌宿主系統中，正交配對包括不與任何內源性tRNA(例如，大腸桿菌中有40種)交叉反應的氨醯基-tRNA 合成酶和不被任何內源性合成酶(例如，大腸桿菌中有21種)氨醯化的正交 濯A。
本領域已知適於製備含有一個或多個非天然胺基酸的蛋白質的正交翻譯 系統的通用原則，例如製備正交翻譯系統的通用方法。例如，可參見國際公開 號WO 2002/086075，名為"METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL畫tRNA SYNTHETASE PAIRS"(產生正交tRNA-氨醯基-tRNA合成酶配對的方法和 組合物)；WO 2002/085923 ，名為"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS "(非天然胺基酸的體內摻入)；WO 2004/094593 ，名為"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE" (擴展真核遺傳密碼)；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7 月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624; 2005年10月27日提交的WO 2006/110182，名為"ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"(用於體內摻入非天然胺基酸的正交翻譯組 分)和2007年3月7日提交的WO 2007/103490，名為"SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS(在真細菌宿主細胞中表達正交翻譯組分的 系統)"。這些申請各自通過引用全文納入本文。摻入非天然胺基酸的正交 翻譯系統和它們的產生及使用方法的討論還可參見Wang和Schultz， "Expanding the Genetic Code (擴展遺傳密碼)"，^wge冊m^e C7zem/e. 五d ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code (擴 展的遺傳密碼)"，M"Ws 36(3):227-238 (2005); Xie和Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire (將胺基酸加入遺傳庫)"，C釘. Op/m'o"〖"C/zem,ca/ 5,o/ogy 9(6):548-554 (2005);禾卩Wang等，"Expanding the Genetic Code (擴展遺4專密碼)"，Jwww. i ev. 5fowo/, S&m".，
35:225-249 (2006);這些文獻的內容通過引用全文納入本文。正交翻譯系統
正交翻譯系統一般包括含有正交tRNA(O-tRNA)、正交氨醯tRNA合成酶 (O-RS)和非天然胺基酸的細胞(可以是原核細胞，例如大腸桿菌)，其中所述 O-RS用所述非天然胺基酸氨醯化所述O-tRNA。本發明的正交配對可以包括 O-tRNA，例如抑制itRNA、移碼tRNA等和關聯O-RS。本發明的正交系統 通常包含處於宿主細胞環境中或無宿主細胞的O-tRNA/O-RS配對。除多組分 系統外，本發明還提供新型單組分，例如，新型正交氨醯基-tRNA合成酶多肽 (例如，SEQIDNO:4、 6、 8或IO)和編碼那些多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:5、 7、 9或11)。
當正交配對識別選擇者密碼子並對該選擇者密碼子起反應而加載胺基酸 時，通常稱該正交配對"抑制"該選擇者密碼子。即，不被翻譯系統的(例如， 細胞的)內源性機制識別的選擇者密碼子通常不被加載，從而阻斷了多肽產生， 否則可自核酸翻譯該多肽。在正交配對系統中，O-RS用特定的非天然胺基酸 氨醯化O-tRNA。加載的O-tRNA識別選擇者密碼子並抑制選擇者密碼子所致 的翻譯阻斷。
在一些方面，與包含本文序列表所示多核苷酸序列或由其編碼的 O-tRNA的抑制效率相比，本發明的O-tRNA識別選擇者密碼子並在關聯合 成酶存在下對選擇者密碼子起反應而具有至少約，例如，45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高的抑制效率。'
在一些實施方式中，聯用O-RS和O-tRNA的抑制效率是缺乏O-RS的 O-tRNA的抑制效率的約，例如5倍、10倍、15倍、20倍或25倍或更高。 在一些方面，聯用O-RS和O-tRNA的抑制效率是本文序列表所示正交合成 酶配對的抑制效率的至少約，例如35%、 40°/。、 45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高。
宿主細胞利用O-tRNA/0-RS配對將非天然胺基酸摻入延伸中的多肽鏈， 例如經由包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述 O-tRNA識別的選擇者密碼子。在某些優選方面，細胞可包含一種或多種其它 O-tRNA/0-RS配對，其中玩述其它O-RS用不同的非天然胺基酸加載所述其它 O-tRNA。例如，O-tRNA之一可識別四鹼基密碼子，其它O-tRNA可識別終止密碼子。或者，多個不同的終止密碼子或多個不同的四鹼基密碼子可用於同一 編碼核酸。
應注意，在一些實施方式中，細胞或其它翻譯系統中可存在多個
0-tRNA/0-RS配對，從而能將多個非天然胺基酸摻入多肽。例如，細胞還可包 含額外的不同O-tRNA/0-RS配對和第二非天然胺基酸，其中該額外的O-tRNA 識別第二選擇者密碼子，該額外的O-RS用該第二非天然胺基酸優先氨醯化該 額外的0- tRNA。例如，包含O-tRNA/0-RS配對的細胞(其中所述O-tRNA識 別，例如琥珀選擇者密碼子)還可包含第二正交配對，其中該第二O-tRNA識別 不同的選擇者密碼子，例如乳白密碼子、四鹼基密碼子等。不同的正交配對優 選衍生自不同來源，從而有助於識別不同的選擇者密碼子。
在某些實施方式中，系統包含例如大腸桿菌細胞等細胞，這些細胞含有正 交tRNA(O-tRNA)、正交氨醯tRNA合成酶(O-RS)、非天然胺基酸和包含編碼 感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA識別的選 擇者密碼子。翻譯系統還可以是無細胞系統，例如與本文所述O-tRNA/0-RS 配對和非天然胺基酸組合的各種市售可得"體外"轉錄/翻譯系統。
0-tRNA和/或0-RS可以是天然產生的，或者可以是，例如天然tRNA和 /或RS經突變衍生，例如，通過產生各種生物的tRNA文庫和/或RS文庫和/ 或採用各種可用的突變方案。例如，產生正交tRNA/氨醯基-tRNA合成酶配對 的一種方案包括將，例如得自除宿主細胞外的來源或多個來源的異源(對宿主 細胞而言)tRNA/合成酶配對輸入宿主細胞。候選異源合成酶的特性包括，例如 不加載任何宿主細胞tRNA，候選異源tRNA的特性包括，例如不被任何宿主 細胞合成酶所氨醯化。此外，異源tRNA對於所有宿主細胞合成酶是正交的。 產生正交配對的第二種方案包括產生用於篩選和/或選擇O-tRNA或O-RS的突 變體文庫。也可聯用這些方案。
正交tRNA(O-tRNA)
本發明的正交tRNA(O-tRNA)優選在例如體內或體外介導將非天然氨 基酸摻入蛋白質內，所述蛋白質由含選擇者密碼子的多核苷酸編碼，而這 種選擇者密碼子可被該O-tRNA識別。在某些實施方式中，與包含本文序
26列表中O-tRNA序列所示多核苷酸序列或由其編碼的O-tRNA相比，本發明的O-tRNA在關聯合成酶存在下，對選擇者密碼子起反應而具有至少45%、 50%、 60%、 75%、 80%、卯％或更高的抑制效率。
可通過本領域己知的多種試驗測定抑制效率。例如，可採用P半乳糖苷酶報導分子試驗，例如，將衍生的lacZ質粒(該構建物在lacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)和含有本發明O-tRNA的質粒一起導入合適生物(如可利用正交組分的生物)的細胞內。還可導入關聯合成酶(多肽或表達時可編碼關聯合成酶的多核苷酸)。將細胞在培養基內培養到所需密度，如OD,約0.5時，採用例如諾瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM P-半乳糖苷酶檢測試劑盒進行P半乳糖苷酶試驗。抑制百分率可以計算為樣品相對於可比較對照(如衍生的lacZ構建物的觀察值，所述構建物在所需位置上含有相應的有義密碼子而不是選擇者密碼子)的活性百分數。
本發明O-tRNA的例子見本文序列表，例如參見圖7和SEQIDNO:l。本文內容還提供了設計其它等價O-tRNA的指導。在RNA分子(例如O-RSmRNA或O-tRNA分子)中，與給定序列(或對編碼DNA而言反之亦然)或其互補序列相比，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)取代。還可存在鹼基的其它修飾以大量產生功能等價分子。
本發明還包括對應於本文具體O-tRNA的O-tRNA保守性變體。例如，O-tRNA保守性變體包括功能與具體O-tRN A(例如本文序列表中的)相似的，和因合適的自身互補性而保留了 tRNA的L-形結構但不具有與例如序列表或圖7所示那些(序列)相同的序列並且最好也不是野生型tRNA分子的那些分子。
含O-tRNA的組合物還可包含正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS用非天然胺基酸優先氨醯化O-tRNA。在某些實施方式中，含有O-tRNA的組合物還可包含(例如體外或體內)翻譯系統。細胞中也可存在含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸或這些物質中一個或多個的組合，其中所述多核苷酸含有O-tRNA能識別的選擇者密碼子。
產生正交tRNA(O-tRNA)的方法也是本發明的特徵之一。通過該方法產生的正交tRNA(0-tRNA)也是本發明的特徵之一。在本發明的某些實旅方式中，可通過構建突變體文庫來產生O-tRNA。可採用本領域已知的各種誘變技術構建突變體tRNA文庫。例如，可通過位點特異性突變、隨機位點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變(recursive mutagenesis)方法、嵌合體構建、或者這些技術的任何組合產生突變體tRNA，例如SEQ ID NO:1所示O-tRNA。
也可將其它突變引入特定位置，例如tRNA的所需環或區域(如反密碼子環、接納莖、D臂或環、可變環、TPC臂或環、tRNA分子的其它區域或其組合)中一個或多個非保守位置、保守位置、 一個或多個隨機位置或者二者的組合位置。tRNA中的突變通常包括使突變型tRNA文庫內各成員的反密碼子環突變以使其能識別選擇者密碼子。該方法還可包括給O-tRNA加上額外序列。與起始材料(例如多種tRNA序歹i」)相比，O-tRNA通常提高了對所需生物的正交性，同時保留其對所需RS的親和力。
這些方法任選包括分析tRNA和/或氨醯基-tRNA合成酶序列的相似性(和/或所推斷的同源性)以確定顯示與特定生物正交的潛在候選O-tRNA、0-RS和/或其配對。可利用本領域己知和本文所述的電腦程式進行這種分析，例如可用BLAST和堆積(pileup)程序。在一個實施例中，為篩選用於大腸桿菌的可能的正交翻譯組分，可選擇與真細菌生物不顯示接近的序列相似性的合成酶和/或tRNA。
通常可通過，例如負選擇第一物種的細胞群以獲得O-tRNA，其中所述細胞含有多種潛在O-tRNA的某成員。負選擇可去除含有被細胞內源性氨醯基-tRNA合成酶(RS)氨醯化的潛在O-tRNA文庫某成員的細胞。這樣就可以得到第一物種細胞的正交tRNA庫。
某些實施方式在負選擇中將選擇者密碼子引入編碼負選擇標記(例如能賦予抗生素抗性的酶如P內醯胺酶；能得到可檢測產物的酶如|3半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)，所述產物例如是毒性產物，如芽孢桿菌RNA酶)的多核苷酸的非必須位置(例如，仍能產生功能性芽孢桿菌RNA酶)等。還任選在選擇性試劑(比如抗生素，如氨苄青黴素)存在下培養細胞群來進行篩選/選擇。在一個實施方式中，選擇性試劑的濃度不同。
例如，為檢測抑制itRNA的活性，可利用基於選擇者密碼子的體內抑制的選擇系統，例如將無義(如終止)或移碼突變引入編碼負選擇標記的多
核苷酸(如編碼P-內醯胺酶的基因(W"))中。例如，構建在某位置(如，A184)
含有選擇者密碼子的多核苷酸變體，如變體。用這些多核苷酸轉化細胞，
如細菌。以不能被內源性大腸桿菌合成酶有效加載的正交tRNA為例，抗生素抗性(例如氨苄青黴素抗性)應約為或小於未用質粒轉化的細菌的抗生素抗性。如果tRNA不是正交的，或者能加載該tRNA的異源合成酶在此系統內共同表達，應可觀察到更高水平的抗生素(如氨苄青黴素)抗性。選出那些在抗生素濃度與未用質粒轉化的細胞大致相等的LB瓊脂平板上不能生長的細胞，如細菌。
以毒性產物(如核糖核酸酶或芽孢桿菌RNA酶)為例，當多種潛在的tRNA中的成員被內源性宿主(如大腸桿菌)合成酶(即與宿主如大腸桿菌合成酶不是正交的)氨醯化時，選擇者密碼子被抑制，所產生的毒性多核苷酸產物導致細胞死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的細胞可存活。
然後，在一個實施方式中，對與所需生物正交的tRNA庫進行正選擇，其中將選擇者密碼子置於正選擇標記中(例如抗藥性基因(如p內醯胺酶基因)編碼的標記)。對以下細胞進行正選擇含有編碼與該細胞正交的tRNA庫某成員的多核苷酸或包含該成員的多核苷酸、含有編碼正選擇標記的多核苷酸和含有編碼關聯RS的多核苷酸。在某些實施方式中，第二群細胞含有不能通過負選擇除去的細胞。該多核苷酸在胞內表達，細胞在有選擇試劑(如氨苄青黴素)存在下生長。然後選擇能被共同表達的關聯合成酶氨醯化以及對此選擇者密碼子起反應而插入胺基酸的tRNA。與一種或多種含有非功能性tRNA或不能被感興趣合成酶有效識別的tRNA的細胞相比，這些細胞通常顯示抑制效率升高。含有非功能性tRNA或不能被感興趣合成酶有效識別的tRNA的細胞對該抗生素敏感。因此在兩次選擇中能保留下的tRNA是(i)不是內源性宿主(如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii)能被感興趣的合成酶氨醯化；以及(iii)能在翻譯過程中起作用。
因此，取決於篩選所處的環境，同一標記可以是正或負標記。即，如果為了篩選該標記，則它是正標記，但如果為了抵禦該標記則它是負標記。
上述方法中，篩選，如正選擇、負選擇或者正負選擇的嚴格性任選包括改變選擇的嚴格性。例如，由於芽孢桿菌RNA酶是毒性極高的蛋白質，可通過將不同數目的選擇者密碼子引入到芽孢桿菌RNA酶基因內和/或使
用可誘導啟動子來控制負選擇的嚴格性。在另一實施例中，選擇或篩選試劑的濃度(如氨苄青黴素的濃度)可以不同。在本發明的一些方面，因為在前幾輪中所需活性較低，嚴格性可以不同。因此，前幾輪適用較低的嚴格性篩選標準，而後幾輪選擇適用更嚴謹的標準。在某些實施方式中，負選擇、正選擇或者正負選擇可重複多次。也可使用多個不同的負選擇標記、正選擇標記或正負選擇標記。在某些實施方式中，正選擇標記和負選擇標記可以相同。
其他類型的選擇/篩選方法也可用於本發明以製備正交翻譯組分，如
O-tRNA、 O-RS和能對選擇者密碼子起反應而加載非天然胺基酸的0-tRNA/0-RS配對。例如，負選擇標記、正選擇標記或正負選擇標記可包括發螢光的或在合適反應物存在下能催化發光反應的標記。在另一實施方式中，可通過螢光激活細胞分選(FACS)或發光檢測標記的產物。標記任選可包括親和篩選標記。也參見Francisco, J. A.等(1993)， "iVo<ii/c"ow awt/y7womyce"ce-fl"/v她t/
exfema/ wr/ace (在外表面表達功能性抗體片段的大腸桿菌的製備與螢光激活細胞分選)"，Proc Natl Acad Sci USA.， 90: 10444-8。
製備重組正交tRNA的其它方法可見，例如名為"METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS (製備正交tRNA-氨醯基-tRNA合成酶配對的方法和組合物)"的國際申請
發明者C·C·劉, P·G·舒爾茨 申請人:斯克利普斯研究院