真核細胞培養基的製作方法
2023-10-17 18:43:19 1
專利名稱：真核細胞培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於培養真核細胞，尤其是動物細胞的培養基的製備，以及由此製備的細胞培養基和所述培養基在體外培養真核細胞，尤其是動物細胞的用途。
背景技術：
通過培養哺乳動物、植物或昆蟲細胞來製備有價值的生化製品和生物藥品例如抗體和抗生素需要適合的培養基。細胞培養基的構成需要加入一系列添加剤，包括不明確的成分如胎牛血清(FCS)，若干動物源蛋白和/或牛源的蛋白質水解產物。用於動物細胞培養的血清或血清源物質，如白蛋白、轉鐵蛋白或胰島素可能含有不必要的成分，這些成分會汙染由它們所製成的培養基和生物藥品。此外，牛源蛋白產物如牛肉類或膠原蛋白水解產物具有受BSE汙染的風險。而且，來源於人血清的添加劑必須接受對所有已知病毒的檢測，包括可以經血清傳播的肝炎和HIV。總之，所有血清來源的產品都能夠被不明物汙染。對於細胞培養中源自人或其它動物源的血清或蛋白質添加剤，會發生許多問題(如不同批次之間質量和成分不同，以及病毒、支原體或BSE的汙染風險)。因此，植物蛋白水解產物或植物蛋白腖被廣泛用於不應含有動物成分的培養基。然而，在不含動物來源的細胞培養添加劑的培養基中，動物細胞的生長有時並不理想。常見的是體外培養中動物細胞的成團塊狀生長。原因可能是非最佳生長條件，因為在團塊中心的細胞營養被奪去並死亡。還有試管或過濾器在下遊處理時發生堵塞的風險。可以通過細胞外形對細胞生存能力的下降進行評估。生存能力下降的細胞呈現不規則狀如非圓形，另外還有呈「顆粒樣」 的細胞內容物，這與具有完全透明細胞內容物的健康細胞相漢。W02006/123926涉及ー種用於生長和/或培養微生物和/或細胞的肽組合物，其基於優選自油菜籽、小麥或藏茴香的至少ー種植物蛋白來源。小麥水解產物的作用在實施例中。W02006/128764公開了用於培養生產複雜蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中一個或多種植物來源的蛋白腖被供給於細胞培養物。示例為植物源大豆、棉籽和豌豆。大豆水解產物對CHO細胞培養的作用在附例中說明。W02009/020389公開了向日葵屬(Helianthus)物種的蛋白質水解產物作為培養真核細胞，尤其是動物細胞的培養基成分的作用。US5, 534，538涉及N-醯化ニ肽如N-こ醯丙氨醯穀氨醯胺在包含胎牛血清(FCS)細胞培養基中的應用，其比無醯化ニ肽的培養基在熱滅菌下更穩定。與無醯化ニ肽和游離胺基酸等價物相比，未觀察到對細胞生長的影響。W02009/033024A1公開了對動物源蛋白腖進行分餾獲得的包含精氨酸的ニ肽和三肽的細胞培養基的作用。EP2154244A1涉及細胞培養基，其中胺基酸絲氨酸和半胱氨酸和/或酪氨酸的濃度保持在至少ImM。US2003/0203448A1闡述了無蛋白質且無血清的細胞培養基，其包含大豆水解產物和可選加入的游離胺基酸。US2002/0039787公開了體外培養微血管內皮細胞的方法，所述方法包括在有效量人血清存在下培養富集的微血管內皮細胞群。植物蛋白水解產物的功能由它的化學成分決定。它受多方面因素影響，如原料，カロエ條件，過程控制和儲存條件。因此，它導致至今仍欠缺研究的現象，即「批次間差異」。這是這些水解產物的客戶，即生物製藥產業表露出的主要憂慮，因為其意味著產品收益率在10%-25%間變化，因此會直接導致經濟後果。本發明的目的就在於減輕這些憂慮。
發明內容
已經發現某些低分子量胺基酸衍生物對真核細胞，尤其是動物細胞的體外細胞培養具有很強的生長和生產促進作用。存在最低水平的所選衍生物導致一致的且因此具有商業引人注意的產品性能。包含這些衍生物的培養基特別適用於培養真核細胞，尤其是動物細胞。因此本發明提供了ー種包含這些特定胺基酸衍生物的細胞培養基，以及生產這些培養基的方法和使用包含這些胺基酸衍生物的組合物作為培養基組分來培養動物細胞的方法。
具體實施例方式本發明適用於製備用於培養真核細胞，尤其是動物細胞的培養基的方法，包括使用ー種或多種胺基酸衍生物作為促 生長或改進生產的成分，所述胺基酸衍生物選自選自N-こ醯胺基酸、Y-谷醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、和含穀氨酸或脯氨酸的ニ肽、氧代胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯甘氨酸。本發明同樣適用於培養真核細胞，尤其是動物細胞的培養基，其包含至少0.02ppm(0.02mg/kg),優選至少0.2mg/kg,更優選至少2mg/kg,更優選至少20mg/kg,最優選至少50ppm(50mg/kg)的上述胺基酸衍生物中的ー種或多種，以乾重計。無論本發明細胞培養基成分以乾重計的含量是多少，液體培養基的最終濃度可以由任取的固體含量的5%(50g/l)推算出來,反之亦然。因此，IOOmg姆公斤的乾物質量相當於(為獲得優選水平)5mg每升的最終液體培養基。這並不意味著液體培養基中的幹固體含量應為5%。根據特定的細胞培養濃度，可選擇的固體含量水平為例如0.5-30wt.%，優選0.5-15wt.%，更優選l-15wt.%且最優選l_5wt.%。液體培養基中蛋白質含量(包括胺基酸和胺基酸衍生物)通常為0.05-20wt.%，優選0.1-1Owt.%，更優選0.1-7.5wt.%，更優選0.1-1.0wt.%，最優選 0.15-0.75wt.%。用於本發明的胺基酸衍生物包含至少1-3個胺基酸殘基。除1-2個胺基酸殘基之夕卜，其還可能含有官能團，尤其是こ醯基或甲氧基。胺基酸衍生物是相對小的分子，優選具有100-500Da的分子量，更優選120-400Da的分子量。優選的胺基酸衍生物包括:(a) N-こ醯胺基酸，優選單胺基酸，尤其是較大的胺基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、瓜氨酸和精氨酸。優選的N-こ醯胺基酸是N-こ醯-蛋氨酸、N-こ醯-苯丙氨酸和N-こ醯-鳥氨酸；(b) Y-谷醯基胺基酸，尤其是較大的芳香族胺基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。Y-穀氨酸衍生物通過Y羧基與其他胺基酸結合。優選的Y-谷醯基胺基酸是Y-谷醯基-酪氨酸和Y-谷醯基-苯丙氨酸；(C)焦穀氨醯胺基酸如焦穀氨醯-穀氨醯胺和焦穀氨醯-甘氨酸。焦穀氨醯基團是這樣的谷醯基團，其中谷醯基團的a-氨基與Y-羧基縮合形成環狀基團，因此焦穀氨醯基團是5-氧代批咯燒~2~基擬基氨基；(d)含有穀氨酸或脯氨酸的ニ肽，如纈氨酸-穀氨酸和甘氨醯脯氨酸；也包括環ニ肽，如環-甘氨醯-穀氨酸。(e)氧代胺基酸，如5-氧代脯氨酸和S-氧代蛋氨酸(蛋氨酸亞碸)；(f)同型-胺基酸，其中「同型」是指把ー個亞甲基團加入規則的胺基酸主鏈(通過遺傳密碼子翻譯可直接獲得的20種 胺基酸之一)，如3 -丙氨酸、同型絲氨酸和2-氨基-丁酸鹽(「同型丙氨酸」)。最優選的胺基酸衍生物是Y -谷醯基-酪氨酸和Y -谷醯基-苯丙氨酸，環-甘氨醯-穀氨酸，纈氨醯穀氨酸，5-氧代脯氨酸和3 -丙氨酸。本發明的胺基酸衍生物可如此使用。大部分組分在市場上有售。或者，它們能夠通過已知的合成或半合成步驟製備。大部分的衍生物還能從適當的蛋白片段或水解產物中分離出來，尤其是植物源蛋白質如大豆、豌豆、扁豆、小麥(麩質)、棉籽、大米、向日葵、紅花等。它們還可以從蛋白片段，或更易從蛋白質水解產物中提取或富集。這些方法是現有技術已知的，例如 Sato, Nisimura et al., Journal of Agriculturaland Food chemistry46(9):3403-3405 (1998) ;Higaki_Sato, Sato, et al.Journalof Agricultural and Food chemistry51:8-13, (2003)；和 Morris and ThompsonBiochemistryl(4):706-709(1962) 因此本發明涉及製備細胞培養基的方法，其通過向所述培養基成分中進ー步加入一定量的ー種或多種胺基酸衍生物，所述胺基酸衍生物選自N-こ醯胺基酸、Y-谷醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、和含穀氨酸或脯氨酸的ニ肽、氧代胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸，使得單個胺基酸衍生物在培養基中的終濃度為至少0.001mg/l，優選至少0.0lmg/I，更優選至少0.lmg/1,最優選至少lmg/1,這將在下面進ー步闡述。培養基的單個胺基酸衍生物的最終濃度優選為最多50g/l,優選最多lg/1,更優選最多100mg/l。加入的衍生物的形式可為例如純化和/或提純產品，或濃縮物，即通過濃縮或富集蛋白質的物質(proteinaceous matter)為至少Iwt.%,優選至少2wt.%,更優選至少5wt.%,最優選至少IOwt.%或甚至至少25wt.%的水平所獲得的產物。進ー步，本發明涉及通過此方法獲得的細胞培養基。更具體地，本發明涉及用於培養真核細胞的培養基，其包含以最終液體培養基濃度計為至少0.001mg/l、優選至少
0.01mg/l、更優選至少0.lmg/1、更優選至少lmg/1、最優選至少5mg/l的一種或多種胺基酸衍生物，所述胺基酸衍生物選自N-こ醯胺基酸、Y-谷醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或脯氨酸的ニ肽、氧代胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸，其中所述濃度是每個胺基酸衍生物的濃度。優選地培養基中每個胺基酸衍生物的最終濃度為最多50g/l、優選最多lg/1、更優選最多100mg/l。根據本發明細胞培養基的乾重，其包含以乾物質計至少0.02mg/kg、優選至少0.2mg/kg、更優選至少2mg/kg、更優選至少20mg/kg、最優選至少250mg/kg,和以乾物質計最多1000g、優選最多20g、更優選最多2g/kg的一種或多種胺基酸衍生物，所述胺基酸衍生物選自N-こ醯胺基酸、Y-谷醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或脯氨酸的ニ肽、氧代胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸。在本發明的優選實施方式中，細胞培養基包含ー種或多種上述胺基酸衍生物，其濃度為5mg/l-30g/l、或100mg-600g,優選250mg_150g/kg,以乾物質計。更優選的濃度為10mg/l-lg/l 或 200mg-100g,優選 500mg_50g/kg,更優選 20mg/l_500mg/l 或 lg_25g/kg,以乾物質計。對於N-こ醯胺基酸、Y -谷醯胺基酸和環-甘氨醯-穀氨醯胺，在培養真核細胞的培養基中的含量至少為0.01mg/l、優選至少5mg/l或至少0.2mg、優選至少lOOmg、優選250mg/kg,以乾物質計，更優選10mg/l-10g/l、更優選lOmg/1-lg/l、最優選20_400mg/I (0.2-50和l_2g/kg乾物質)。對於焦穀氨醯胺基酸、甘氨醯-脯氨酸和甘氨醯-甘氨酸，優選濃度水平為 0.03mg/l-30g/l (0.6mg/kg-600g/kg 乾物質)、優選 30mg/l_30g/l、更優選30mg/l-3g/l (0.6-600，優選 1.5_150g/kg 乾物質)、更優選 50mg/l_lg/l (2.5_50g/kg)。而對於纈氨醯-穀氨酸、3 -丙氨酸、2-氨基丁酸、氧代胺基酸和同型胺基酸，優選濃度水平應為 0.02mg/l-20g/l (0.4mg/kg-400g/kg乾物質)、優選 20mg/l_20g/l、更優選 20mg/l_2g/l、最優選 50-500mg/l (400mg-400g/kg，優選 l-100g/kg 和 2.5_25g/kg 乾物質)。在本發明特別優選的實施方式中，胺基酸衍生物可用作ー種或多種植物蛋白水解產物的部分。蛋白水解產物可通過現有技術已知的方法製備，例如通過加工豆類，豆科植物，種子等，通過壓榨、研磨、脫殼和/或粉碎，若需要還要進行脫脂，如使用有機溶劑如己烷。優選地，脫脂的種子原料包含至少20wt%蛋白質。脫脂的種子原料優選具有少於10wt%的脂肪含量。
蛋白質水解產物(protein hydrolysate)通常通過酶促蛋白水解來獲得，因此也可被稱為蛋白質水解物(proteolysate)。(脫脂的)植物種子,可選地被粉碎,經歷從細菌、真菌、植物或動物來源或混合來源獲得的內切和/或外切蛋白酶水解作用；然而酶製劑優選不是來源於動物。酶可使用基因重組技術生產。優選的酶是內切蛋白酶。更優選地，酶包括鹼性蛋白酶。適合的蛋白酶包括枯草桿菌蛋白酶(Alcalase)，絲氨酸內切蛋白酶。特別適合的酶包括來自Novozymes的Alcalase和/或來自Merck的木瓜蛋白酶。其他適合的酶包括如中性蛋白酶(Neutrase)。水解作用的條件包括30分鐘至30小時的反應時間，優選1-6小時，最優選2_4小時 ，溫度為20-65°C，優選40-60°C，這些都取決於特殊的蛋白來源和需要的水解度。pH值應調整至6.0-8.5，優選6.6-8.0，最優選7.0-8.0。溶液中待水解的蛋白質濃度為l-10wt%,優選2-8wt%，最優選3-6wt%。基於底物，所用的酶量為0.5-10wt%,優選l_5wt%，最優選
1.5-3.5wt%。水解優選進行至水解度達到5%_50%、優選10%_40%，最優選10%_30%。水解反應通過熱處理來終止。優選地，熱處理包括在80-100で下加熱15-90分鐘(分批熱處理)，或者在100-120°C下加熱1-5分鐘。水解度的測定可採用常規甲醛滴定法，在示例中已有闡述。終止水解反應後，反應產生的混合物可經加工以去除不溶部分，例如採用本領域已知的離心或助濾器如硅藻土(如Celite' Dicalire』 Hyflo")0優選地，在乾物質的基礎上，水解產物包含少於10wt%、更優選少於5wt%、最優選少於2wt%的水不溶性物質。水解產物可以通過例如噴霧乾燥法或冷凍乾燥來乾燥。水解產物可直接使用或可經進ー步分餾。在總蛋白質基礎上，水解產物優選包含20_80wt%，特別是20_60wt%分子量為100-500Da的肽，和/或10-30wt%分子量為500_1000Da的肽。對於肽的長度，水解產物優選包含至少15wt%、更優選至少25wt%、最優選至少35wt%、至多如85wt%、更優選至多65wt%、最優選至多55wt%的ニ -五肽，8-30wt%的六-九肽，至少8wt%、尤其是15_60wt%的更長肽，和0.l-30wt%、優選0.5-10wt%的游離胺基酸，以總蛋白質計。在優選實施方式中，水解產物可優選使用5或IOkDa的截留分子量來超濾。水解產物還可能含有諸如碳水化合物，可溶纖維，多價金屬鹽等成分。優選地，蛋白質含量(全部蛋白質的物質，包括游離胺基酸)為30-90wt%，更優選45-85wt%。這些含量均以幹總量計。水解產物可以與培養基中的其它常見成分組合，如植物或動物細胞因子和/或生長因子(前提是這些都不是動物來源的)、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖類包括葡萄糖、抗生素等。植物激素包括生長素、赤黴素、脫落酸及它們的組合。同樣，在市場上可購買到的基礎培養基也可與本發明的胺基酸衍生物和蛋白質水解產物聯合使用。可使用動物細胞系如CH0_l、Lonza的PowerCHO-lO)、Irvine Scientific的IS CHO-CD或SAFC的Excell325PF CH0。對於植物細胞，可使用SAFC的Murashige和Skoog基礎培養基。水解產物也可為不同蛋白質來源的水解產物，如來源於任何比例的小麥和大豆、大豆和豌豆、大米和棉籽的水解產物，前提是此比例能夠使得胺基酸衍生物以上述含量存在。細胞培養基優選不包含血清如胎牛血清，或血清來源的成分，以完全再生同時避免汙染。優選地，細胞培養基中不含動物成分，例如動物來源的蛋白質和/或動物蛋白水解產物，如牛來源的。因此，在優選實施方式中，本發明涉及用於培養如上真核細胞的無血清培養基，和製備此無血清培養基的方法。
實施例部分提供了涉及所要求保護的胺基酸衍生物的選擇的化合物分析，此胺基酸衍生物存在於添加有公知大豆蛋白水解產物的化學成分明確的可商購培養基中。從這個分析中可清楚得知現有技術中常用的在水解產物基或富含水解產物的培養基中這些特定胺基酸的濃度比發明中的細胞培養基濃度至少低2個數量級。本發明的細胞培養基和培養方法能夠支持真核細胞，尤其是動物細胞的培養，其中此能力是指它至少能維持細胞的生存、繁殖和/或分化，和優選地體外通過細胞表達產物。還設想進行分批培養、補料培養、連續或灌注反應器。細胞生長曲線可分為細胞大量繁殖生長的實質增長期，和細胞處於相對穩定的狀態但開始產生如抗體的目標代謝物的生產階段。本發明的胺基酸衍生物能夠支持動物或其他真核細胞生長期和生產期。所述細胞培養基可以作為液體或以粉末、乾燥形式的提供。所述液體培養基中(基本可溶於水的)水解產物的量可以由本領域技術人員確定，但優選包含0.01-10.0wt/vo 1%,更優選 0.01-4.0wt/vol%,更優選 0.05-2.0wt/vol% 或 0.05-1.0wt/vol%,更優選
0.1-1.0wt/vol%，最優選為 0.2-0.6wt/vol%0可以用水復溶的乾燥培養基中的水解產物的量取決於培養基的成分，但是通常在2-80w/w%範圍內，優選5-50w/w%。所述細胞培養基還優選包含糖類，尤其是葡萄糖，優選葡萄糖與水解產物的乾重比率在10-0.1之間，更優選2.5-0.4之間，所述細胞培養基還包含上述其他成分。此外，本發明涉及所述細胞培養基用於培養真核細胞的應用。真核生物包括真菌(包括酵母菌)，原生生物，藻類，植物和後生動物(動物)。本發明還涉及用於培養如大米，菸草和玉米的植物細胞的應用，特別是用於培養動物細胞的應用，優選體外培養。所培養的細胞可來自天然來源或是轉基因的。特別地，動物細胞包括脊椎動物和非脊椎動物細胞，包括哺乳動物細胞，如人類細胞，如PER C6細胞 ，齧齒動物細胞，尤其是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，鳥類，魚類，爬行動物，兩棲動物或昆蟲細胞。特別地，通過本發明方法培養的細胞用於表達蛋白產品，其可在生物製藥エ業中進行進一步的純化。有利地，能夠在本發明的培養基中生產的蛋白質產品的非限定實例包括促紅細胞生成素(用於治療血液病)，依那西普(用於治療風溼性疾病和痛風的TNF-a抑制劑)，a-鏈道酶(用於治療囊性纖維化的脫氧核糖核酸酶)，P -幹擾素(用於治療多發性硬化症)，和多種治療性的單克隆抗體。可通過本領域中已知的方法回收期望的蛋白產品，如從所述培養基中分離出細胞，從沒有細胞的液體(上清液)分離所述蛋白產品，如採用分餾法，親和色譜法(吸附-解吸附)或其組合。此外，本發明還涉及試劑盒，其包含含有所述胺基酸衍生物的餾分，和ー種或多種培養基成分，其選自植物或動物細胞因子和/或生長因子、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、植物激素、核苷酸、糖類和抗生素。所述成分可在試劑盒中作為ー種或多種組合物存在。例如，所述胺基酸衍生物可以乾燥或溶解的形式単獨存在，所述培養基的部分或全部其他成分，如植物或動物細胞因子和/或生長因子、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖類和抗生素，則可以単獨的組合存在。或者，可以將所述胺基酸衍生物與例如其他胺基酸和/或肽類和/或糖類預先混合，任何其他成分都可單獨存在或存在於ー種或多種組合物中。優選所述成分中的至少ー種是液體，有利地，所述液體是經滅菌的。在使用培養基前，將所述試劑盒的成分混合。因此，現已發現本發明的胺基酸衍生物及其應用具有多種重要優點。其具有促進生長的作用，超過由普通蛋白質成分提供的生長速度。其使產出增加，產品和/或生長的變動更低，並且成本效益好。在體外培養的動物細胞不成團塊或成簇生長，而是作為單細胞存在。其次，可以從細胞完美的圓形和清亮透明的細胞內容物評判細胞的生存能力極好。再次，與本領域現有細胞培養基，例如基於非血清蛋白，尤其是大豆蛋白的培養基相比，可獲得更高的細胞密度，而不影響期望細胞產品的表達水平。第四，水解產物可以與任何基礎培養基組合用來體外培養動物細胞，從而能夠生產出具有上述優勢的廣泛多樣的細胞培養基。可在較長的時期中持續培養，從而產生更高的產量。實施例實施例1:從大豆中分離Y-谷醯基肽根據Morrisand Thompson, (1962)Biochemistryl (4): 706-709 的方法進行:黃豆(25kg)粉化，使用70%こ醇在 室溫下徹底提取。將提取物冷卻至5°C，在5°C保持數日後，使澄清上清通過DOWex50柱(氫形式，5°C)。因為大豆在提取之前沒有進行脫脂，樹脂柱上由大量的沉澱材料。不使用醇類或水清洗除去這些材料，而在使用2N氨水洗脫期間將其復溶。將洗脫液在40°C的真空蒸發，將殘留物溶於水，並通過在PH4.0下沉澱除去汙染物。使部分純化的胺基酸吸附到5.8*127cm的DowexlAc柱(200-400目)，用去離子水徹底清洗以去除中性和鹼性胺基酸。最初的洗脫液是0.1N醋酸，在3.5ml/分鐘的流速下收集21ml餾分。在餾分900時，將醋酸的規定濃度(normality)變為0.3，在餾分為1400時變為1.0，在餾分2400時向柱中加入2.0N的醋酸。將來自順次餾分的一滴溶液成行排列在大濾紙頁上，乾燥，並噴施0.5%茚三酮的こ醇溶液。由顏色密度確定含有胺基酸濃度達峰值的管。隨後，採用小型(18*18cm)兩向色譜圖研究所述峰值，其確定餾分2000-2300包含穀氨酸-苯丙氨酸肽和餾分2630-2870包含穀氨酸-酪氨酸肽。將餾分2000-2300混合，亦將餾分2630-2870混合。在真空中除去溶劑，並使化合物從水中結晶為無色固體。經過多次再結晶後，獲得數百毫克作為無色晶體的各種多肽。實施例2:從小麥蛋白中離析焦穀氨醯肽根據 Sato etal., Journal of Agricultural and Foodchemistry46(9):3403-3405.(1998)和Higak1-Sato et al.Journal of Agricultural andFood chemistry51:8-13 (2003)中的方法進行:N 端阻斷肽的分離:在離心柱(10*5mm, 1.d, AB-1150, Atto, Tokyo, Japan)中裝入AG50WX8強陽離子交換劑(Bio-Rad, Hercules, CA)。預先採用50%甲醇和蒸餾水對離心柱進行連續清洗，再用IOmM甲酸平衡。將肽樣本(50ug/100ul)上樣到離心柱。使用IOmM甲酸(100ml*3次)洗脫N端阻斷肽。焦穀氨肽酶消化:在室溫37 ℃使用1mU的豬肝焦穀氨肽酶(Takara, Kyoto, Japan),在100uL附加的反應緩衝液中消化N端阻斷肽懼分3小時。通過添加IOuL甲酸終止反應。實施例3:衍生化胺基酸(大豆水解產物)的製備依照Leone-Bay, Journal of Medicinal chemistry38:4263-4269(1995)中的方法製備本文所述的醯化胺基酸衍生物。以N-環己醯-苯基甘氨酸的製備作為代表性示例。在攪拌下，將苯基甘氨酸(50.0g, 331mmol)溶於敞ロ燒瓶內的氫氧化鈉水溶液中(414ml,2N)。所得溶液在冰/水浴中冷卻至大約10-15°C，然後滴加環己甲醯氯(44.2ml,331mmol)，使反應溫度維持在約10-15°C。完成添加後，將反應溶液在室溫下攪拌2.5小吋。用鹽酸水溶液(37%)將反應混合物調至PH9.5，並通過過濾將未反應的苯基甘氨酸作為白色固體除去。隨後，將濾液的PH值進一歩降低至4.5，並且從溶液中沉澱出粗N-環こ醯-苯基甘氨酸。通過過濾取出此固體，並從甲醇中再結晶產生N-環己醯-苯基甘氨酸。實施例4:對包含要求保護的胺基酸衍生物的蛋白質水解物的分析及其促進生長的證明使用Waters Aceuity UPLC^PThermo-Finnigan LTQ質譜儀,通過液相色譜/質譜分析法(LC/MS, LC/MS2)分析市售的植物蛋白水解物如得自於美國FrieslandCampina Domo公司獲得的 SE50MAF-UF, WGE80M-UF, CNE80M-UF, PCE80B,其中 Thermo-Finnigan LTQ 質譜儀由電噴霧電離(ESI)源和線性離子阱(LIT)質量分析器組成。將樣本提取物分成兩個等份試樣，乾燥，然後復溶在酸性或鹼性的LC相容的溶劑中。，在使用單獨專用柱的兩支獨立注射器中，使用酸性陽離子優化條件中分析一份試樣，在鹼性陰離子優化條件下分析另ー份試樣。使用均包含0.1%甲酸的水和甲醇梯度洗脫在酸性條件下復溶的提取物，而使用包含6.5mM碳酸氫銨的水/甲醇洗脫鹼性提取物。使用動態排阻在MS和數據依賴的MS2-描之間交替進行MS分析。通過與純化標準品的代謝文庫實體或回收的(recurrent)未知實體比較來識別生物化學品。色譜性能和質譜的組合給出了與特定化合物或同重元素實體匹配的標誌。因此，歸納了存在於植物蛋白水解物中的生化成分及其相對濃度的概況。此外，對所有水解物測定細胞培養試驗階段的細胞生長和抗體產生。對細胞生長和化合物分析數據進行線性回歸分析來鑑定對細胞生長和抗體產生有重大影響的生化成分。採用Microsoft Excel2003的斜率(SLOPE)功能計算出抗體產生和所述成分相對濃度間的相關性，結果顯示在下表I中。正斜率越高，細胞培養中生化成分越重要。還採用MS Excel的相關回歸函數計算出代表數值顯著性的P值，P值越低(均在0-1之間)，所測量數值的顯著性越高。表1:胺基酸衍生物相對濃度和抗體產生的相關性
權利要求
1.關於培養真核細胞的無血清培養基的生產方法，所述方法包括以下步驟:在常規培養基成分中加入選自N-こ醯胺基酸、Y-谷醯基胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或含脯氨酸的ニ肽、氧代-胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸中的ー種或多種胺基酸衍生物以作為促進生長和/或增產的成分，從而使所述的每種胺基酸衍生物在所述培養基中的最終濃度為至少0.001mg/l、優選至少0.01mg/l、更優選至少0.lmg/1、最優選至少lmg/1, 其中，所述的ー種或幾種胺基酸衍生物作為純物質或濃縮液添加，所述濃縮液的濃度為每IOOg蛋白質的物質中至少lg，優選至少IOg衍生物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述N-こ醯胺基酸選自N-こ醯-蛋氨酸、N-乙醯-苯丙氨酸和N-こ醯-鳥氨酸。
3.關於培養真核細胞的培養基的生產方法，所述方法包括以下步驟:在常規培養基成分中加入選自Y -穀氨醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或含脯氨酸的ニ肽、氧代-胺基酸、同型胺基酸、N-こ醯蛋氨酸、N-こ醯苯丙氨酸、N-こ醯鳥氨酸和甘氨醯-甘氨酸中的ー種或多種胺基酸衍生物以作為促進生長和/或增產的成分，從而使所述的每種胺基酸衍生物在培養基中的終濃度為至少0.001mg/l、優選至少0.01mg/l、更優選至少0.lmg/1、最優選至少lmg/1, 其中，所述的ー種或幾種胺基酸衍生物作為純物質或濃縮液添加，所述濃縮液的濃度為每IOOg蛋白質的物質中至少lg、優選至少IOg衍生物。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述Y-谷醯胺基酸選自Y-谷醯基-酪氨酸和Y -谷醯基-苯丙氨酸。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述焦穀氨醯胺基酸選自焦穀氨醯穀氨醯胺和焦穀氨醯甘氨酸。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述含穀氨酸或含脯氨酸的ニ肽選自纈氨醯基-穀氨酸、甘氨醯-脯氨酸和環-甘氨醯-穀氨醯胺。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述氧代-胺基酸和同型胺基酸分別選自5-氧代脯氨酸和S-氧代-蛋氨酸，以及3 -丙氨酸、2-氨基丁酸和高絲氨酸。
8.過權利要求1-7中任一項所述的方法獲得的細胞培養基。
9.根據權利要求8所述的細胞培養基，其包含一種或多種如下濃度的所述胺基酸衍生物:至少0.001mg/l、優選至少0.01mg/l、更優選至少0.lmg/1、最優選至少lmg/1,或者至少0.02mg/kg乾物質、優選至少0.2mg/kg乾物質、更優選至少2mg/kg乾物質、更優選至少20mg/kg乾物質、最優選至少50mg/kg乾物質。
10.根據權利要求9所述的細胞培養基，其包含一種或多種如下濃度的所述胺基酸衍生物:5mg/l-30g/l,或 100mg-600g/kg 乾物質，優選 5mg/l-3g/l 或 100mg_150g/kg乾物質，更優選250mg-60g/kg乾物質。
11.關於培養真核細胞的培養基，其包含濃度為至少0.001mg/l、優選至少0.0lmg/1,更優選至少0.1mg/1、更優選至少Img/1、最優選至少5mg/1,或至少0.02mg/kg乾物質、優選至少0.2mg/kg乾物質、更優選至少2mg/kg乾物質、更優選至少20mg/kg乾物質、最優選至少250mg/kg乾物質的選自N-こ醯胺基酸、Y -穀氨醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或含脯氨酸的ニ肽、氧代-胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸的一種或多種胺基酸衍生物。
12.根據權利要求11所述的細胞培養基，其包含0.011^/1-1(^/1、優選1011^/1-1(^/1、更優選lOmg/1-lg/l的選自N-こ醯胺基酸、Y -穀氨醯胺基酸和環-甘氨醯-穀氨醯胺的ー種或多種胺基酸衍生物。
13.根據權利要求11或12所述的細胞培養基，其包含0.03mg/l-30g/l、優選30mg/l_30g/l、更優選30mg/l-3g/l的選自焦穀氨醯甘氨酸、甘氨醯脯氨酸和甘氨醯甘氨酸的一種或多種胺基酸衍生物。
14.根據權利要求11-13中任ー項所述的細胞培養基，其包含0.02mg/l-20g/l、優選20mg/l-20g/l、更優選20mg/l-2g/l的選自纈氨醯基-穀氨酸、P -丙氨酸、2-氨基丁酸、氧代-胺基酸、同型胺基酸的ー種或多種胺基酸衍生物。
15.根據權利要求8-14中任ー項所述的細胞培養基，其還包含選自維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖類、抗生素和蛋白質水解產物的培養基的其他常規成分。
16.外培養真核細胞的方法,包括將所述細胞在權利要求7-14中任一項所述的培養基中生長，其中所述真核細胞優選包括動物細胞，更優選哺乳動物和/或昆蟲細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述細胞培養基中還包含來自小麥、大豆、棉花或豌豆蛋白的至少ー種水解產物。
18.關於生產期望蛋白質產品的方法，包括根據權利要求16或17所述的方法培養產生所述蛋白質產品的真核細 胞，和從培養基中回收所述蛋白質產品。
全文摘要
本發明涉及選自N-乙醯胺基酸、γ-谷醯胺基酸、焦穀氨醯胺基酸、含穀氨酸或含脯氨酸的二肽、氧代-胺基酸、同型胺基酸和甘氨醯-甘氨酸的胺基酸衍生物作為促進生長和增產的成分在培養真核細胞的培養基中的用途。本發明還涉及包含至少0.001mg/l的這些胺基酸衍生物的培養基。
文檔編號C12N5/00GK103097516SQ201180041537
公開日2013年5月8日 申請日期2011年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者A·古普塔, M·M·加德拉, D·Y·W·馬斯 申請人:菲仕蘭品牌公司