調節細菌的粘附和應激耐受力的方法和組合物的製作方法

2023-10-18 00:43:34

專利名稱：調節細菌的粘附和應激耐受力的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及細菌，特別是益生菌和乳酸菌，以及用於控制其中的細胞信號傳導的方法和構建體。
背景技術：
在小腸中，乳酸桿菌代表共生微生物區系的主要和重要組分。各種乳酸桿菌 (Lactobacillus)種類已用作益生菌培養物，基於需要來自那種生物的特定利益和製造商所需的生物工藝特徵，選擇用於在食物或飲食輔助物中使用。所有益生菌培養物並不顯示相同的特徵，使得選擇這些菌株和澄清其利益是極為重要的。乳酸菌且特別是乳酸桿菌是為了一系列預期的健康促進因素包括在食品中的常見種類。乳酸菌(LAB)在各種環境小生境中天然發現，在所述小生境中它們作為複雜的微生物群落的成員存在。在每種小生境中的存活取決於該生物對各種條件的感覺和應答能力，所述條件例如溫度、PH、營養物可用性、和細胞群體密度。LAB經常佔據的一種主要小生境是哺乳動物的胃腸道(GIT)。多重信號轉導途徑可能控制粘著因子、應激應答基因和其他遺傳決定子的表達，它們促進LAB在GIT的各種區室內的存活和競爭。某些腸乳酸桿菌連同革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌一起具有與腸上皮和其中的黏膜層結合的能力。這種結合被認為對於實現某些益生特性是重要的，所述益生特性包括競爭排斥、免疫調節、和遞送生物治療藥物。儘管這種結合中涉及的分子機制仍未明了，但顯然該過程是複雜的，涉及宿主-特異性、細菌-特異性、和環境因素。某些腸乳酸桿菌連同革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌一起具有與腸上皮和其中的黏膜層結合的能力。定居這些表面的能力可以使益生菌獲得超過其他固有和病原性微生物區系的顯著優點。特別感興趣的是這些細菌藉以存活且潛在定居腸道的動態環境的機制。影響粘附的某些環境因素已得到研究，所述環境因素包括PH、生長期、和其他微生物的存在。乳酸桿菌必須維持滿足其自身生長需求以及經受得住不利條件之間的平衡， 所述不利條件包括胃酸衝擊、被宿主防禦呈遞和競爭微生物區系(Tarmock000 Appl. Environ. Microbiol. 71 :8419-8425)。然而，關於這些應激物如何影響乳酸桿菌與腸環境中的各種基質結合的能力知之甚少。發明簡述提供了改善細菌與靶基質的粘附和/或改善細菌的應激耐受力(stress tolerance)的方法和組合物。方法包括使細菌暴露於粘附適應性條件(adhesion adaptive condition)且從而增加細菌的粘附活性和/或應激耐受力。進一步提供的是具有被調節水平的自誘導物-2(ΑΙ1)的細菌。組合物包括表達參與自誘導物-2生產途徑的核酸分子的重組細菌。進一步提供的是自誘導物-2相關的融合蛋白、抗原肽、抗體和載體。進一步提供了篩選將刺激自誘導物-2生產和/或產生粘附適應性應答的化合物或環境條件的方法， 以及使用具有增加的粘附和/或應激耐受力的細菌的各種方法。本發明在本文的附圖和下文所述說明書中進一步詳細說明。附圖簡述

圖1表示如顯微鏡觀察到的，嗜酸乳桿菌(L. acidophilus)NCFM在體外與Caco_2 細胞的粘附。細菌細胞(a)在未濃縮的條件(lxl08CFU/ml)下於37°C孵育1小時，或(b) 形成團塊且在IOX濃縮的條件(lxl09CFU/ml) (AAR條件)下於37°C孵育1小時。圖2描述了粘附方案。圖3表示在標準孵育條件(實心棒)和粘附適應性條件(條紋棒)下，突變株和 NCFM =IacL對照菌株對Caco-2細胞的粘附特性。計數表示為平均細菌粘附/顯微鏡視野，且誤差棒表示相對於平均值的1個標準差。圖4顯示在嗜酸乳桿菌NCFM中由甲硫氨酸生產AI_2的途徑。對於AI_2生產必需的中間產物以粗體表示，且編碼每種酶的ORF在酶名稱下列出。SAM-依賴性甲基轉移酶縮寫為SAM-MT。最後步驟涉及4，5-二羥基-2，3-戊二酮非酶促環化成AI-2。圖5顯示與NCFM =IacL對照菌株比較，嗜酸乳桿菌NCFM的LuxS—突變株與Caco_2 細胞的粘附能力。圖6顯示如從無菌中和上清液(條紋棒)中檢測的，在嗜酸乳桿菌NCFM的生長期間產生的AI-2，且表示為親本株的平均螢光/LuxS_突變株的平均螢光。由OD6tltl表示的嗜酸乳桿菌NCFM生長(帶圓圈的實線)以及PH的下降(帶三角的虛線)，與對數生長期間 AI-2的快速生產一致。每個值表示一式三份實驗的平均值，且誤差棒是相對於平均值的1 個標準差。圖7表示暴露和不暴露於粘附適應性條件的對照菌株和所選嗜酸乳桿菌NCFM突變株的粘附特性。圖8的圖表是在野生型(圖A)或LuxS-突變株(圖B)中過表達的總ORF的COG 分類。餅形圖中列出了 COG群(圖C)以及那個群中過表達的ORF的編號(C0G，0RF的#)。圖9顯示從(A)對數早期到中期或(B)從對數中期到晚期表達增加(無斜槓)或減少(斜槓)的ORF的編號。野生型由白色棒表示且LuxS-突變株由灰色棒表示。圖10表示在對數生長早期(0D_0. 2)、對數生長中期(0D_0. 7)和對數生長晚期 (OD600L 2)收穫的嗜酸乳桿菌NCFM(無斜槓)和LuxS-突變株(斜槓)的膽汁耐受力。將細菌群體進行稀釋並在補充0.75% (白色棒)、1.0% (灰色棒)或2.0% (黑色棒)牛膽汁(Oxgall)的MRS上鋪板。存活百分比通過與在無補充的MRS上生長的CFU/ml比較來計算。通過斯氏t檢驗(Student，s t test) (P < 0. 05)檢測的顯著差異由星號(*)表示。 誤差棒是相對於平均值的1個標準差。圖11表示在對數生長早期OD6J). 2 (圖A)、對數生長中期OD6J). 7 (圖B)和對數生長晚期0D_1.2(圖C)收穫時，於55°C熱應激後野生型(開環)和LuxS-(閉環)群體的存活。星號(*)指示對於那個時間點已檢測到統計學顯著差異(P <0.05)。誤差棒表示相對於平均值的1個標準差。發明詳述本發明現在將在下文中參考附圖更充分地描述，其中顯示了本發明的某些但並非
5全部實施方案。事實上，本發明可以以許多不同形式體現且不應被解釋為限制於本文所述實施方案；更正確地，提供這些實施方案從而使得本公開內容將滿足可應用的合法要求。自始至終相同的編號指相同的元件。有前文說明書和附圖中呈現的教導的幫助，本文所述的本發明的許多修改和其他實施方案對於本發明所屬領域的技術人員將是顯而易見的。因此，應當理解本發明並不限於公開的具體實施方案，並且修改和其他實施方案預期包括在所附權利要求的範圍內。儘管本文使用了特定術語，但它們僅以一般和描述性意義而不是為了限制性的目的使用。如本文使用的，如說明書和權利要求自始至終所使用的，「a」、「an」和「the」可以是單數或複數的。例如細胞可以指單個細胞或多個細胞。同樣如本文使用的，「和/或」指包含一種或多種所列項目的任何和所有可能組合， 以及當以選擇性解釋(「或」)時缺乏組合。I.概況提供了改善細菌與靶基質的粘附和/或改善細菌的應激耐受力的方法和組合物。 共生生物例如益生菌對胃腸道或泌尿生殖道的細胞的粘附增加可以減少腸、泌尿生殖道和創傷部位的感染危險。類似地，改善益生生物的應激耐受力從而使得益生菌的存活率在腸道的苛刻環境中增加，將進一步幫助減少腸、泌尿生殖道和創傷部位的感染危險。在一個實施方案中，本發明已鑑定「粘附適應性條件」。如本文使用的，「粘附適應性條件」包括改善細菌與基質的粘附的任何物理、化學、生物學或類似條件。本發明已證實用這些粘附適應性條件預處理細菌細胞導致粘附增加和/或應激耐受力增加。如本文使用的，改善的細菌粘附特性稱為「粘附適應性應答(adhesion adaptiveresponse) 」或「AAR」。 其水平和/或活性在粘附適應性條件下被調節的多肽和多核苷酸在本文中稱為「粘附適應性應答相關」或「AAR相關」多肽或多核苷酸。本文公開了各種AAR相關多核苷酸和多肽。 參見下表8和9。另外的AAR相關多核苷酸及其編碼的多肽在SEQ IDNO :1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、33、34、35、36、37 和 38 中列出。進一步提供的是調節細菌的自誘導物-2途徑、且從而調節細菌的粘附和/或應激耐受力的方法和組合物。更具體而言，提供了細菌中的自誘導物-2(ΑΙ1)生產途徑的多核苷酸和多肽。細菌細胞通常經由細胞密度感受機制(quorum sensing mechanisms)溝通，所述細胞密度感受機制涉及基因表達變化前的自誘導物的密度依賴性識別。可以用於在種類中和種類間溝通的一種重要的細胞密度感受系統基於稱為自誘導物-2(AI-2)的呋喃硼酸二酯(furanosyl borate diester)，它通過4個酶促步驟由甲硫氨酸產生。AI-2調節眾多種類中的各種表型表達，所述表型包括毒力因子、DNA加工、細胞形態、運動性、生物膜形成、 毒素生產、光生產、和細胞分裂(Xavier 等人(2003) Curr. Opin. Microbiol. 6 :191-197)。因此，提供了允許調節AI-2途徑中的多肽水平和/或活性的方法和組合物，且從而提供了調節各種細菌表型的能力。AI-2途徑的多核苷酸和多肽序列在SEQ ID N0:l、2、3、4、13、14、 15、16、21或22中列出。此類序列在本文中稱為「AI-2相關序列」。II. AI-2相關和AAR相關多肽和多核苷酸提供了使用本發明的各種AAR相關和AI-2相關多核苷酸和多肽的組合物。本發明進一步提供了這些AI-2相關或AAR相關序列的片段和變體，它們也可用於實踐本發明的方法。如本文使用的，術語「基因」和「重組基因」指包含可讀框的核酸分子，特別是編碼涉及AI-2生產或ARR中的蛋白質的那些。本發明的分離核酸分子包含編碼SEQ ID NO :2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36或38中列出的AI-2相關或AAR相關蛋白質的核酸序列，SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、33、；35 或 37 中列出的核酸序列，及其變體和片段。如下所述本發明還包含反義核酸分子。還包括了 AI-2生產或ARR中涉及的分離的多肽和蛋白質，及其變體和片段，以及用於生產那些多肽的方法。為了本發明的目的，術語「蛋白質」和「多肽」可互換使用。示例性的AI-2相關多肽包括SEQID NO :2、4、14、16、22。示例性的AAR相關多肽包括SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、34、36 和 38。"AI-2生產」或「粘附適應性應答(AAR) 」指根據標準測定法技術在體內或體外測定的生物或功能活性。例如，AI-2生產可以使用報導菌株哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和自誘導物生物測定法進行測量(DeKeersmaecker等人000；3) Microbiology 149 :1953-6)。 另外的測定法涉及例如在本文其他地方描述的粘附適應性條件下測量細菌存活或生長。本發明的細菌和方法對於細菌發酵有用，例如當希望刺激AI-2生產、或促進細菌在基質上的粘附或生物膜形成以進行發酵過程時。本發明的細菌可用作益生菌，例如當希望促進AI-2生產、或促進細菌在腸或腸壁上的粘附或生物膜形成，以競爭性排斥其他較不需要的細菌。誘導細菌中的細胞信號傳導或粘附適應性應答的方法可用於刺激AI-2生產，或促進細菌粘附或生物膜形成(所述細菌包括重組和非重組的野生型細菌)，刺激AI-2生產、 或促進益生菌的粘附或生物膜形成。本發明包含的核酸和多肽組合物是分離的或基本上純化的。「分離的」或「基本上純化的」意指核酸或多肽分子，或生物學活性片段或變體，基本上或大體上不含在其天然狀態下通常發現與所述核酸分子或蛋白質結合的組分。此類組分包括其他細胞材料，來自重組生產的培養基、和在蛋白質或核酸的化學合成中使用的各種化學藥品。優選地，本發明的 「分離的」核酸不含在核酸所來源的生物的基因組DNA中位於目的核酸側翼的核酸序列(例如5』或3』末端處存在的編碼序列)。然而，分子可以包括不會有害地影響組合物的基本特性的某些額外鹼基或部分。例如，在各種實施方案中，分離的核酸分子包含在所述核酸分子所來源的細胞中通常與基因組0嫩結合的少於5吐、41^、31^、21^、11^、0. 51Λ或0. Ikb的核酸序列。類似地，基本上純化的蛋白質具有少於約30%、20(%、10(%、5(%或1(%的(乾重) 汙染蛋白質，或非AI-2相關或非AAR相關蛋白質。當蛋白質重組生產時，優選地培養基佔少於30^^20^^10%或5%的蛋白質製劑體積，且當蛋白質化學生產時，優選地製劑具有少於約30^^20^^10%或5%的(乾重)與AI-2生產或粘附適應性條件無關的化學前體或化學藥品。i.片段和變體本發明提供了包含編碼AI-2相關或AAR相關蛋白質的核苷酸序列的分離的核酸分子，以及由其編碼的AI-2相關或AAR相關蛋白質。還提供了這些核苷酸序列以及編碼的蛋白質的片段和變體。核苷酸序列或蛋白質的「片段」意指核苷酸或胺基酸序列的部分。本文公開的核酸分子的片段可以用作雜交探針以鑑定編碼AI-2相關或AAR相關蛋白質的核酸，或可以用作AI-2相關或AAR相關核酸分子的PCR擴增或突變中的引物。核酸片段還可以與物理基質結合以構建巨陣列或微陣列(例如，美國專利號5，837，832 ；美國
7專利號5，861，242)。此類核酸陣列可以用於研究基因表達或鑑定與靶序列具有充分同一性的核酸分子。本發明進一步提供了核酸陣列或晶片，即作為分子探針精確組織或排列在固體支持體上的大量核酸(例如DNA)，這允許基因測序、研究其中包含的突變和/或分析基因表達，因為考慮到它們非常小的尺寸和就分析數目而言的高容量，此類陣列和晶片是目前感興趣的。這些核酸陣列/晶片的功能基於附著至載體的分子探針，主要是寡核苷酸，所述載體一般具有數平方釐米或需要時更大的尺寸。對於分析，例如DNA陣列/晶片中的載體用DNA探針(例如寡核苷酸)包被，所述DNA探針排列在載體上的預定場所或位置處。包含已預先標記的待分析靶核酸和/或其片段，例如DNA或RNA或cDNA的樣品，與DNA陣列 /晶片接觸，導致通過雜交形成雙鏈體。洗滌步驟後，晶片表面的分析允許通過標記的靶發出的信號定位任何雜交。通過計算機處理的雜交指紋結果允許取回下列信息例如基因表達、樣品中特定片段的存在、序列測定和/或突變鑑定。在本發明的一個實施方案中，靶核酸和本發明核酸之間的雜交可以通過本領域眾所周知的螢光、放射性、電子檢測等進行檢測，所述核酸以探針的形式使用且在DNA晶片/ 陣列上放置或原位合成。在另一實施方案中，本發明的核苷酸序列可以以DNA陣列/晶片的形式使用，以進行AI-2生產或AAR中涉及的基因表達分析。這種分析基於在其上存在探針的DNA陣列/ 晶片，所述探針由於其特異性而選擇以表徵給定基因或核苷酸序列。待分析的靶序列在晶片上雜交前進行標記。洗滌後，檢測和定量標記的複合物，雜交至少一式兩份地進行。相對於相同探針用於不同樣品和/或對於相同樣品使用不同探針獲得的信號強度的比較分析， 允許例如來源於樣品的RNA的差示轉錄。在再一實施方案中，包含本發明核苷酸序列的陣列/晶片可以包含對其他微生物特異的核苷酸序列，這允許連續測試和快速鑑定樣品中存在的微生物。在一個進一步的實施方案中，DNA陣列/晶片的原理還可以用於生產蛋白質陣列/ 晶片，在其上支持體已用本發明的多肽和/或抗體或其陣列代替核酸而包被。這些蛋白質陣列/晶片使得能夠例如通過表面等離子共振(SPR)分析由上的靶的親和力捕獲誘導的生物分子相互作用，所述載體用蛋白質包被。本發明的多肽或抗體能夠特異性結合來源於待分析樣品的抗體或多肽，可以在蛋白質陣列/晶片中用於檢測和/或鑑定樣品中的蛋白質和/或肽。因此，本發明提供了包含以任何組合(包括重複)的本發明各種核酸的微陣列或微晶片，以及包含以任何組合(包括重複)的本發明各種多肽的微陣列。還提供的是包含以任何組合(包括重複)的一種或多種抗體的微陣列，所述抗體與本發明的各種多肽特異性反應。「核酸分子」意指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選的是雙鏈DNA。編碼AI-2相關或AAR相關蛋白質的核酸分子片段可以編碼蛋白質片段，所述蛋白質片段是生物學活性的，或它可以如下所述用作雜交探針或PCR引物。本文公開的多肽的生物學活性片段可以通過下列方法製備分離本發明的核苷酸序列之一的一部分，表達AI-2相關或AAR相關蛋白質的編碼的一部分(例如通過體外重組表達)，並評估AI-2相關或AAR相關蛋白質的編碼的一部分的活性。編碼AI-2相關或AAR相關蛋白質的核酸分子片段包含如本文公開的全長AI-2相關或AAR相關核苷酸序列中存在的至少約15、20、50、 75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、 1100、1200、1300、1400、1500、1600個核苷酸，或高達全長序列的核苷酸的總數目(例如對於SEQ ID NO :1為693個核苷酸，對於SEQ ID NO :3為942個核苷酸，對於SEQ ID NO 13 為1116個核苷酸，對於SEQ IDNO 15為471個核苷酸等)。胺基酸序列片段包括適合於用作免疫原的多肽片段，以產生針對AI-2生產或AAR 中涉及的多肽的抗體。片段包括包含胺基酸序列的肽，所述胺基酸序列充分同一於或來源於本發明的AI-2相關或AAR相關蛋白質或部分長度蛋白質，且顯示AI-2相關或AAR相關蛋白質的至少一種活性，但包括比本文公開的全長AI-2相關或AAR相關蛋白質更少的胺基酸。在一個實施方案中，片段可以包括生物學活性的多肽。多肽的生物學活性部分是顯示本發明全長蛋白質的至少一種活性(例如，與AI-2生產或AAR相關的活性)的部分。AI-2 相關或AAR相關蛋白質的生物學活性部分可以是本發明的全長AI-2相關或AAR相關蛋白質中的長度為10、25、50、100、150、200、250、300、400、500個連續胺基酸，或高達其中存在的胺基酸總數目(例如，對於SEQ ID NO :2為231個胺基酸，對於SEQ ID NO :4為314個胺基酸，對於SEQ IDNO 14為372個胺基酸，對於SEQ ID NO 16為157個胺基酸等)的多肽。此類生物學活性部分可以通過重組技術製備並評估天然AI-2相關或AAR相關蛋白質的一種或多種功能活性。如本文使用的，包括偶數SEQ ID NOS :2-22、34、36或38的至少 5個連續胺基酸。然而，本發明包含其他片段，例如蛋白質中超過6、7、8、9、10、20、50、100、 200,300,400或超過500個胺基酸的任何片段。本發明的AAR相關序列包含編碼纖連蛋白結合蛋白的SEQ ID N0:19和20;編碼胞外多糖生產中涉及的蛋白質的SEQ ID NO :33、34、35和36 ；和編碼脂磷壁酸和壁磷壁酸的D-丙氨酸酯化中涉及的蛋白質的SEQ ID N0:37和38。在具體實施方案中，SEQ ID NO 19或20的生物學活性變體或片段將仍具有與腸黏膜的結合活性，包括與纖連蛋白、粘蛋白或細胞外基質分子結合。測定這種活性的方法是已知的。例如，變體的纖連蛋白結合活性可以使用由FN-120包被的螢光微球體測定，所述FN-120是血漿纖連蛋白的糜蛋白酶的細胞結合片段。參見，例如，Schultz 和 Armant (1995) J. Biol. Chem. 270(19) 11522-31。 SEQ ID NO :33、34、35或36的生物學活性變體或片段將仍涉及胞外多糖的生產。胞外多糖生產可以通過Mozi，等人(2001) J. Appl. Microbiol. 91(1) 160-167中描述的苯酚/硫酸定量方法來估計。SEQ ID NO :37或38的生物學活性變體或片段將仍涉及細菌中的脂磷壁酸的D-丙氨酸化(alanation)。D-丙氨酸攝取可以根據0，Brien，等人(1995) Microbios 83(335) :119-137描述的方法進行測量。本發明的其他AAR相關序列包含涉及AI-2生產的酶，包括編碼核苷磷酸化酶 (pfs)的SEQ ID NOS :1和2 ；編碼SAM依賴性甲基轉移酶(SAM-MT)的SEQ ID NOS :3和4 ； 編碼甲硫氨酸腺苷基轉移酶(metE)的SEQ ID NOS 13和14 ；編碼S-核糖基同型半胱氨酸酶(IuxS)的SEQ ID NOS 15和16 ；和編碼甲硫氨酸腺苷基轉移酶(metK)的SEQID NOS 21和22。在具體實施方案中，SEQ ID NOS :1、2、3、4、13、14、15、16、21或22的生物學活性變體或片段將仍分別具有上述酶活性。測定這些酶中每一種的活性的方法是已知的。例如
9me (活性可以通過根據 Posnick 和 Samson (1999) J. Bacteriol. 181(21) :6756-6762 中描述的方法使用高效液相色譜定量S-腺苷基轉移酶生產來測量。SAM-MT的甲基供體活性可以根據 Borchardt 等人(1974) J. Med. Chem. 19(9) :1104-1110 的方法來測定。MTA/SAH 核苷活性可以通過如 Della-Ragione 等人(1995)Biochem. J. 232 :335-341 和 Cornell 等人 (1996)Biochem. J. 317 =285-290描述的，將14C-甲硫腺苷轉變成14C-甲硫核糖後來測量。 MetE活性可以根據Hondorp和Matthews (2004) PLoS Biol. 2(11) :e336描述的測定法來測量。LuxS活性可以使用如本文其他地方描述的哈氏弧菌報導測定法來測量。核苷酸和胺基酸序列的變體包含在本發明內。「變體」意指充分等同的序列。因此，本發明包含分離的核酸分子，所述核酸分子充分等同於編碼偶數SEQ ID NOS :2-22,34, 36或38中AI-2相關或AAR相關蛋白質的核苷酸序列，或在嚴格條件下與奇數SEQ ID NOS
1-21,33,35或37的核酸分子或其互補物雜交的核酸分子。變體還包括由本發明的核苷酸序列編碼的變體多肽。另外，本發明的多肽具有的胺基酸序列充分等同於偶數SEQ ID NOS
2-22、34、36或38中所示的胺基酸序列。「充分等同的」意指一種胺基酸序列或核苷酸序列與第二種胺基酸序列或核苷酸序列比較，包含足夠或最小數目的等價或相同胺基酸殘基或核苷酸，從而提供共同的結構域和/或顯示共同的功能活性。保守性變體包括由於遺傳密碼簡併而不同的那些核苷酸序列。一般而言，與偶數SEQ ID NOS :2_22、34、36或38中的任何胺基酸序列，或與奇數 SEQ ID NOS :1-21、33、35或37中的任何核苷酸序列分別具有至少約45%、55%或65%的同一性，至少約70%或75%的同一性，至少約80%、85%或95%，至少約91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或99. 5%的序列同一性的胺基酸序列或核苷酸序列在本文中定義為充分等同的。本發明包含的變體蛋白質是生物學活性的，即它們保留天然蛋白質的所需生物學活性。本發明的蛋白質的生物學活性變體與那種蛋白質的差別可以少至 1-15個胺基酸殘基、少至1-10，例如6-10，少至5、少至4、3、2、或甚至1個胺基酸殘基。天然存在的變體可以存在於群體內(例如，乳酸菌群體)。此類變體可以通過使用眾所周知的分子生物學技術來鑑定，例如如下文描述的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交。合成來源的核苷酸序列，例如由定點誘變或PCR介導的誘變產生、仍編碼AI-2相關或AAP相關蛋白質的序列也作為變體。可以將一種或多種核苷酸或胺基酸置換、添加或缺失引入本文公開的核苷酸或胺基酸序列內，從而使得將置換、添加或缺失引入編碼的蛋白質內。添加 (插入)或缺失(截短)可以在天然蛋白質的N末端或C末端處進行，或在天然蛋白質內的一個或多個位點上進行。類似地，一個或多個核苷酸或胺基酸置換可以在天然蛋白質內的一個或多個位點上進行。例如，保守胺基酸置換可以在一個或多個預測的、優選非必需胺基酸殘基處進行。 「非必需」胺基酸殘基是可以從蛋白質的野生型序列中改變而不改變生物活性的殘基，而 「必需」胺基酸是生物活性所需的。「保守胺基酸置換」是其中胺基酸殘基用具有類似側鏈的胺基酸殘基替換的置換。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族是本領域已知的。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、 非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。此類置換將不對保守胺基酸殘基進行，或不對位於保守性基序內的胺基酸殘基進行，在所述胺基酸殘基對於蛋白質活性是必需的。可替代地，突變可以沿著AI-2相關或AAR相關的編碼序列長度的全部或部分隨機進行，例如通過飽和誘變。突變型可以重組表達，且通過使用標準測定技術測定 AI-2相關或AAR相關保護活性來篩選保留生物活性的那些。參見，例如，Kunkel (1985) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 :488-492 ；Kunkel 等人(1987)Methods in Enzymol. MolecularBiology(MacMiIlan Publishing Company, New York)以及其中引用的參考文獻。在編碼變體的DNA中進行的突變不應破壞可讀框，且優選不會造成可以產生二級mRNA 結構的互補區域。參見，EP專利申請
發明者阿斯卡拉特-佩裡爾 A·, B·L·巴克, E·阿爾特曼, T·R·克萊哈默 申請人:北卡羅來納州大學