一種胎盤幹細胞庫的構建方法及胎盤組織復甦方法

2023-09-17 12:22:35 3

一種胎盤幹細胞庫的構建方法及胎盤組織復甦方法
【專利摘要】一種胎盤幹細胞庫的構建方法及胎盤組織復甦方法，它涉及一種胎盤幹細胞庫建立方法。本發明的幹細胞庫構建方法為：將至少3個部位的胎盤組織經過無菌清洗處理後，組織剝離、進一步消毒、剪細、冷凍劑保護，程序化冷凍、深低溫暫存、液氮罐長期保存等步驟，長期保存了具有生物學活性的胎盤組織。此方法保存的胎盤組織可應用於胎盤幹細胞庫的建立，根據所需要細胞種類進行選擇組織部位復甦後復甦、酶消化、培養、擴增、質量檢驗等，以便獲得胎盤羊膜上皮細胞、胎盤羊膜間充質、胎盤絨毛膜間充質幹細胞、胎盤底蛻膜間充質幹細胞等。本發明的方法簡化操作步驟，減少人工幹預錯誤，提高效率、保存了多種幹細胞資源、為未來個性化幹細胞定製提供基礎。
【專利說明】一種胎盤幹細胞庫的構建方法及胎盤組織復甦方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種胎盤幹細胞庫的構建方法及胎盤組織復甦方法。

【背景技術】
[0002] 胎盤是寶寶賴以生存的各種營養物質輸送的紐帶，由羊膜、絨毛膜和底蛻膜構成。 羊膜和絨毛膜來源於胎兒，底蛻膜則起源於母體。胎盤除在胎兒發育、營養支持和維持耐受 中發揮重要作用外，還是一個機體的幹細胞儲備庫。
[0003] 胎盤中有多種多能幹細胞，目前已知的至少有三類胎盤幹細胞。胎盤中第一類多 能幹細胞為間充質幹細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一類能夠自我更新，具 有多向分化能力的多能幹細胞，可以分化為骨、軟骨、脂肪、神經和肝細胞等組織細胞。
[0004] 胎盤MSCs能抑制免疫和促進造血重建的特性，使其在造血幹細胞移植及移植後 GVHD防治方面具有良好的應用前景。由於胎盤來源MSCs與骨髓來源MSCs相比具有組織來 源廣和細胞增殖能力強的優勢，使其具有更好的臨床應用前景。胎盤MSCs至少可以分為3 種，絨毛膜MSCs、羊膜MSCs，還包括來自母體的底蛻膜組織的MSCs，通過對絨毛層和底蛻膜 MSCs的免疫標記檢測，發現它們均表達典型的MSCs表面抗原⑶13、⑶29、⑶44、⑶54、⑶73、 ⑶105,不表達造血幹細胞表面抗原⑶3、⑶14、⑶34、⑶45和內皮細胞表面抗原⑶31。通過 檢測發現，絨毛膜MSCs還弱表達胚胎幹細胞類表面抗原SSEA-4,而羊膜MSCs表達典型的 MSCs表面抗原外，還表達胚胎幹細胞類的表面標誌物Oct-4。而底蛻膜作為母-胎界面的 組成部分之一，為母體面，意味著來源於底蛻膜的MSCs可作為母親來源的幹細胞的一種。
[0005] 胎盤中的第二類多能幹細胞為羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs)。人hAECs作為一種幹細胞，表達多種胚胎幹細胞類標誌物，包括SSEA-4、 SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-80, hAECs表達多潛能幹細胞特定的轉錄因子0CT-4和Nanog基 因。同時具有向心肌、肝、神經細胞以及胰島細胞等多系分化的潛力，因此人hAECs是介 於胚胎幹細胞和成體幹細胞之間的一個中間等級的幹細胞。研宄中表明，hAECs不表達 HLA-A、B、C、DR等人類白細胞抗原具有免疫赦免性，移植後可以避免免疫排斥反應的發生， 具有非常廣泛的臨床應用前景，近年來收集和保存羊膜上皮細胞也成為未來進行臨床應用 創造了條件。
[0006] 胎盤中的第三類幹細胞為胎盤造血幹細胞（human placenta-derived hemopoietic stem cells, hFO-HSCs)。hFO-HSCs 是通過剪切胎盤胎兒面組織成 0.5mm3 的組織塊，經中性蛋白酶、胰蛋白酶及膠原酶等進行組織消化，或者經CXCR-4受體阻滯劑 AMD3100加入灌注液灌注法獲得中間層單個核細胞。其⑶34、⑶133等造血幹細胞表明抗 原表達均為陽性。與流動的臍帶血相比，胎盤組織間隙中的hPD-HSCs中⑶34陽性細胞是 臍帶血中的數倍，胎盤⑶34+⑶38+hro-HSCs亞群細胞分化形成的粒細胞單核細胞集落、爆 紅型集落、混合型集落數均明顯高於臍帶血造血幹細胞。hro-HSCs的臨床應用價值類似於 臍帶血造血幹細胞，可以在治療血液疾病，如急慢性白血病、再生障礙性貧血、地中海貧血 和淋巴瘤等方面有較好的效果，是一個可以補充臍帶血造血幹細胞數量不足的重要幹細胞 資源。
[0007] 目前，國內外針對胎盤幹細胞儲存方式為單一部位取樣，然後體外培養擴增，達到 一定數量後進行深低溫凍存。這種方式只進行了胎盤組織中一種幹細胞的擴增、培養，而大 部分幹細胞沒有能夠得到保存。本發明提供了一種胎盤幹細胞庫構建方法，本方法保存了 至少3個胎盤組織部位（包括但不限於羊膜、絨毛膜、胎盤底蛻膜），也保存了目前已知的多 種幹細胞，同時，對胎盤組織中目前未知的、將來可能發展應用潛力更大的幹細胞也進行了 保存，此方法簡化操作步驟、提高效率、且保存了多種幹細胞資源，為未來定製化幹細胞分 離、培養、擴增奠定了基礎。


【發明內容】

[0008] 本發明是為胎盤組織的不同部位保存提供可靠的方法，此方法用於胎盤幹細胞庫 建立，分離不同功能的幹細胞，延長胎盤組織的保存時間，保證組織內細胞不受影響，保證 組織細胞的活性，操作方法簡單，復甦後可直接用於幹細胞分離培養。
[0009] 本發明應用胎盤組織的凍存方法，將胎盤不同部位組織剝離後分別剪小至0. 5? Imm3大小，加入配置好並提前遇冷的凍存液重懸後，分裝於凍存管內，4°C溫度下平衡 30min，轉入-80°C冰箱內過夜，最終置於液氮中長期保存，根據所需要細胞種類分別進行復 蘇用於細胞培養。
[0010] 本發明的一種胎盤幹細胞庫構建方法，它是按照以下步驟進行：
[0011] -、胎盤米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤，備用；
[0012] 二、胎盤組織預處理：取步驟一至少3個部位的胎盤組織分別採用組織剪、鉗進行 仔細剝離、收集，收集後的組織分別用生理鹽水洗淨血液、剪小至〇. 5?Imm3大小，分別用 生理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗後在1300rpm轉速下離心6min，收集沉澱，繼續下一 次清洗；清洗結束後，收集沉澱備用；
[0013] 三、組織塊凍存液配製：所述凍存液每ImL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07? 0. 12mL胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-穀氨醯胺和0. 2mL二甲基亞碸組成，配製好後於4°C預 冷保存；或者組織塊凍存液採用無血清培養基進行配製；
[0014] 四、組織程序化凍存：將步驟二預冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養基 重懸配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配製的凍存液，然後分裝至 凍存管內，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然後轉入-80°C過夜暫存；
[0015] 五、對每一個凍存管設低溫防凍條碼，進行管理；
[0016] 六、對步驟二的預處理後的胎盤組織樣本和步驟五復甦的胎盤組織進行厭氧菌、 需氧菌、黴菌、B肝病毒、C肝病毒、愛滋病毒和梅毒檢測；將檢測結果全部為陰性的胎盤組 織轉入-150°C?-180°C液氮罐氣相中長期保存，即構建出胎盤幹細胞庫。
[0017] 本發明的一種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，它是按照以下步驟進行的：
[0018] -、首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進行解凍；
[0019] 二、將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複 離心操作2?3次，收集固相物；
[0020] 三、將步驟二收集的固相物接種到T75培養瓶中，加入DMEM培養液後置於0)2培 養箱內培養2天後，計算貼壁組織塊數量和懸浮組織塊數量；
[0021] 通過如下方式計算組織塊貼壁成活率：
[0022] 貼壁成活率=培養瓶中貼壁成活的組織塊數量八培養瓶中貼壁成活的組織塊數 量+培養瓶中懸浮未貼壁組織塊數量）*100% ;
[0023] 即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。
[0024] 本發明的一種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，它是按照以下步驟進行的：
[0025] 一、首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進行解凍；
[0026] 二、將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複 離心操作2?3次，收集固相物；
[0027] 三、對步驟二收集的固相物進行酶解30?50min後，在4°C溫度、轉速為1300轉/ 分鐘的條件下離心6min，去上清收集沉澱的細胞，經DMEM懸浮後取樣測定細胞活率並通過 如下方式計算復甦細胞活率：細胞活率=活細胞數量八活細胞數量+死細胞數量）*100 %; 並計算復甦後的細胞總數數量；即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。
[0028] 本發明包含以下有益效果：
[0029] 1)在建立幹細胞庫時，僅僅進行高效的組織凍存，操作簡便、省時、節省空間資源， 卻保存了大量的幹細胞資源。如果是建庫一開始就進行細胞擴增，將要建立多種擴增培養 體系、培養並保存多種細胞，這樣才能將目前已知的部分胎盤幹細胞資源進行保存。
[0030] 2)本發明是先將至少3個胎盤組織部位（胎盤羊膜、胎盤絨毛膜、胎盤底蛻膜）進 行剝離，根據胎盤的不同部位（胎兒面，母體面）分別進行凍存，根據患者需求進行復甦不 同部位的組織塊；
[0031] 3)本發明是將組織塊分別剪小至0. 5?Imm3大小，在凍存過程中，凍存保護液能 夠滲透組織細胞內，使細胞內的水分脫出，凍存過程中有效的減少凍存過程中冰晶的形成， 降低細胞的損傷；
[0032] 4)本發明冷凍保存液保護胎盤組織的不同部位，根據患者的使用需求進行復甦不 同部位的胎盤組織，有效的節約了胎盤組織塊，增加了患者的使用次數；
[0033] 5)本發明方法可應用於新生兒出生後胎盤不同組織部位的保存，延長組織的保存 時間到至少20年，於液氮中可長期保存，根據母親、胎兒疾病選擇性復甦不同部位的組織 塊，從而不同種類的幹細胞培養應用於臨床治療。
[0034] 6)本方法保存了至少3個胎盤組織部位的全部細胞，這不僅保存了目前已知的胎 盤幹細胞，可以在需要臨床使用的時候，進行有選擇性地進行擴增培養，而且，也保存了目 前未知、但是將來有可能應用前景更廣的胎盤細胞，這類細胞有可能由於目前我們的認知 水平的限制而不知道其功用，而在10-20年以後可能其應用價值才被發現，如果採用普通 的建庫方法，這類細胞在最開始就會因為我們的不了解了沒能擴增並保存。
[0035] 7)本方法也確保了胎盤組織中的一些目前我們雖然了解其未來功用、但卻沒有良 好的培養、擴增方法的幹細胞得以完整的保存。待科技發展後，擴增和培養手段不斷完善 後，再從本方法建立的胎盤幹細胞庫中將這些細胞大量增殖，從而更好地進行臨床研宄或 應用。
[0036] 8)如果採用組織塊法進行胎盤幹細胞培養，本發明方法復甦後胎盤組織塊貼壁成 活率高達98%以上。若採用酶消化法培養幹細胞，凍存組織塊復甦、酶解消化後細胞活性超 過90%，可成功製備得到胎盤間充質幹細胞、羊膜間充質幹細胞、羊膜上皮細胞等幹細胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為胎盤幹細胞庫建立流程示意圖；
[0038] 圖2為胎盤間充質幹細胞形態圖；
[0039] 圖3為羊膜間充質幹細胞形態圖；
[0040] 圖4為羊膜上皮細胞形態圖。

【具體實施方式】

【具體實施方式】 [0041] 一：本實施方式的一種胎盤幹細胞庫構建方法，它是按照以下步驟 進行：
[0042] -、胎盤米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤，備用；
[0043] 二、胎盤組織預處理：取步驟一至少3個部位的胎盤組織分別採用組織剪、鉗進行 仔細剝離、收集，收集後的組織分別用生理鹽水洗淨血液、剪小至〇. 5?Imm3大小，分別用 生理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗後在1300rpm轉速下離心6min，收集沉澱，繼續下一 次清洗；清洗結束後，收集沉澱備用；
[0044] 三、組織塊凍存液配製：所述凍存液每ImL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07? 0. 12mL胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-穀氨醯胺和0. 2mL二甲基亞碸組成，配製好後於4°C預 冷保存；或者組織塊凍存液採用無血清培養基進行配製；
[0045] 四、組織程序化凍存：將步驟二預冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養基 重懸配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配製的凍存液，然後分裝至 凍存管內，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然後轉入-80°C過夜暫存；
[0046] 五、對每一個凍存管設低溫防凍條碼，進行管理；
[0047] 六、對步驟二的預處理後的胎盤組織樣本和步驟五復甦的胎盤組織進行厭氧菌、 需氧菌、黴菌、B肝病毒、C肝病毒、愛滋病毒和梅毒檢測；將檢測結果全部為陰性的胎盤組 織轉入-150°C?-180°C液氮罐氣相中長期保存，即構建出胎盤幹細胞庫。

【具體實施方式】 [0048] 二：本實施方式與一不同的是：所述的胎盤幹細胞庫 包含但不限於胎盤絨毛膜間充質幹細胞、胎盤羊膜間充質幹細胞、胎盤底蛻膜間充質幹細 胞和胎盤羊膜上皮細胞四種幹細胞。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0049] 三：本實施方式與一不同的是：步驟一中採集後的胎 盤用無菌生理鹽水衝洗表面血液後置於無菌生物樣本採樣袋內，在4?25°C採集箱內運 輸，採集箱運輸過程要求控制溫度恆定，防止顛簸，採集的胎盤需在72小時內進行處理。其 它與一相同。

【具體實施方式】 [0050] 四：本實施方式與一不同的是：採集箱的溫度為4? 10°C。其它與一相同。
[0051]

【具體實施方式】五：本實施方式與【具體實施方式】一不同的是：採集的胎盤需在24小 時內進行處理。其它與【具體實施方式】一相同。

【具體實施方式】 [0052] 六：本實施方式與一不同的是：採集箱的採集套裝 中，可以放置但不限於生理鹽水、DMEM等保存液，體積以蓋過胎盤為準，並要求套裝密封性 能良好。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0053] 七：本實施方式與一不同的是：步驟一中採集的胎盤 的供者為無血液系統病史、免疫系統病史、神經系統病史、內分泌系統病史、HTLV、HBV、HCV、 HIV、梅毒等感染史、惡性腫瘤史、吸毒史、染色體異常史、糖尿病史、性病史和其它遺傳病史 的供者。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0054] 八：本實施方式與一不同的是：所述凍存液每ImL是 由0. 70mL DMEM、0. IOmL胎牛血清、0. 15mL L-穀氨醯胺和0. 2mL二甲基亞碸組成。其它與 一相同。

【具體實施方式】 [0055] 九：本實施方式與一不同的是：步驟四中的培養基為 DMEM、DMEM/F12、AMEM或無血清培養基。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0056] 十：本實施方式與一不同的是：所述的3個部位的胎 盤組織包括羊膜、胎盤絨毛膜和胎盤底蛻膜。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0057] ^^一 ：本實施方式一種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，它是按 照以下步驟進行的：
[0058] -、首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進行解凍；
[0059] 二、將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複 離心操作2?3次，收集固相物；
[0060] 三、將步驟二收集的固相物接種到T75培養瓶中，加入DMEM培養液後置於0)2培 養箱內培養2天後，計算貼壁組織塊數量和懸浮組織塊數量；
[0061] 通過如下方式計算組織塊貼壁成活率：
[0062] 貼壁成活率=培養瓶中貼壁成活的組織塊數量八培養瓶中貼壁成活的組織塊數 量+培養瓶中懸浮未貼壁組織塊數量）*100% ;
[0063] 即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。

【具體實施方式】 [0064] 十二：本實施方式一種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，它是按 照以下步驟進行的：
[0065] -、首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進行解凍；
[0066] 二、將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複 離心操作2?3次，收集固相物；
[0067] 三、對步驟二收集的固相物進行酶解30?50min後，在4°C溫度、轉速為1300轉/ 分鐘的條件下離心6min，去上清收集沉澱的細胞，經DMEM懸浮後取樣測定細胞活率並通過 如下方式計算復甦細胞活率：細胞活率=活細胞數量八活細胞數量+死細胞數量）*100 %; 並計算復甦後的細胞總數數量；即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。
[0068] 本
【發明內容】
不僅限於上述各實施方式的內容，其中一個或幾個【具體實施方式】的組 合同樣也可以實現發明的目的。
[0069] 通過以下實施例驗證本發明的有益效果：
[0070] 實施例一
[0071] 本實施例的胎盤幹細胞庫建立方法如下：
[0072] -、胎盤採集：採集留有3?5cm臍帶的完整胎盤，採集後的胎盤用無菌生理鹽水 衝洗表面血液後置於無菌生物樣本採樣袋內，在4?25°C採集箱（最佳控制在4-KTC)內 運輸，採集套裝中，可以放置但不限於生理鹽水、DMEM等保存液，體積以蓋過胎盤為準，並要 求套裝密封性能良好。運輸過程要求控制溫度、防止顛簸、運輸時間在72小時內，最佳不超 過24小時內進行製備；
[0073] 其中，胎盤供者要求無血液系統病史、免疫系統病史、神經系統病史、內分泌系統 病史、肌1^、耶￥、!1(^、!11￥、梅毒等感染史、惡性腫瘤史、吸毒史、染色體異常史、糖尿病史、性 病史和其它遺傳病史；供者孕期要求在38-42周，胎兒避免為早產兒；
[0074] 二、胎盤組織預處理：取步驟一至少3個部位的胎盤組織包括但不限於羊膜、絨 毛膜、胎盤底蛻膜）分別採用組織剪、鉗進行仔細剝離、收集，每一部分組織至少剝離、收集 5?20克溼重，收集後的組織分別用生理鹽水洗淨血液、剪小至0. 5?Imm3大小，分別用生 理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗後在1300rpm轉速下離心6min，收集沉澱，繼續下一次 清洗；清洗結束後，收集沉澱備用；
[0075] 三、組織塊凍存液配製：以IOml凍存液配製為例，其特徵在於所述凍存液由6. 8? 7. 2mL DMEM、0. 7?I. 2mL胎牛血清、0. 1?0. 2mL L-穀氨醯胺和2mL二甲基亞碸組成，配 制好後於4 °C預冷保存，也可採用無血清培養基進行配製。
[0076] 四、組織程序化凍存：將步驟二預冷保存的組織塊用0. 5倍體積的培養基（培養基 可以是但不限於DMEM、DMEM/F12、AMEM或者無血清培養基）重懸配成組織懸液（Iml組織： 0. 5mlDMEM培養基），然後向重懸液中加入步驟三配製的凍存液0. 5?1. 5倍（Iml組織懸 液：0. 5ml?I. 5ml凍存液），然後按每管ImL分裝到凍存管中，每部位組織凍存10-30管。 凍存管放置在程控降溫盒中4°C平衡30min後轉入-80度超低溫冰箱過夜暫存，待各項檢測 結果合格後轉入液氮中長期保存；
[0077] 五、樣本條碼管理：
[0078] 胎盤幹細胞庫建立過程會按照條碼進行管理，每個部位的胎盤組織都會有唯一的 條碼相對應，相應的凍存管上的條碼為低溫防凍條碼；
[0079] 六、對步驟二的胎盤組織樣本和步驟五的復甦的胎盤組織進行厭氧菌、需氧菌、黴 菌檢測和B肝病毒、C肝病毒、愛滋病毒和梅毒檢測；對檢測結果為全部陰性的胎盤組織轉 入-150°C?_180°C液氮罐氣相中長期保存，即構建出胎盤幹細胞庫。
[0080] 本實施例胎盤幹細胞庫的建立主要包含胎盤絨毛膜間充質幹細胞，胎盤羊膜間充 質幹細胞，胎盤底蛻膜間充質幹細胞，胎盤羊膜上皮細胞四種幹細胞，通過對每種細胞的免 疫表型進行檢測，通過流式細胞儀檢測胎盤幹細胞的表面標誌物表達和骨髓幹細胞類似， 陽性表達間充質幹細胞表面標誌物：⑶90、⑶105、⑶166、⑶29、⑶44和⑶73,羊膜來源的幹 細胞還表達胚胎幹細胞類的表面標誌物SSEA-4,通過免疫螢光檢測羊膜來源的幹細胞發現 其高表達胚胎幹細胞特有的蛋白成分0CT-4,這些因子的陽性表達說明羊膜來源的幹細胞 是介於胚胎幹細胞和成體幹細胞之間的具有多能性的類胚胎幹細胞。另外，可以從形態學 進行細胞鑑定，胎盤間充質幹細胞、羊膜間充質幹細胞均具有紡錘狀並漩渦狀生長形態，羊 膜上皮細胞具有鵝卵石狀細胞形態。
[0081] 對實施例一構建的胎盤幹細胞庫中的胎盤組織進行復甦處理：
[0082] 解凍時，先將凍存管從液氮中取出，放在37°C?40°C水浴中1?2min內迅速完成 解凍；用移液管將復甦的組織塊吸入放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM輕輕 混勻，然後離心（4°C，1300轉/分鐘、6分鐘）去掉上清液，反覆清洗2-3次，並去掉上清液； 將組織塊直接接種到T75培養瓶中，加入培養液後置於CO 2培養箱內培養，培養2天後，在 每一個培養瓶中，計算貼壁組織塊數量和懸浮組織塊數量，計算組織塊貼壁成活率（貼壁 成活率=培養瓶中貼壁成活的組織塊數量八培養瓶中貼壁成活的組織塊數量+培養瓶中 懸浮未貼壁組織塊數量）*1〇〇% );或者採用酶解法，採用但不限於膠原酶I、II、IV、胰酶、 胰酶替代物等消化酶進行消化30-50分鐘後，4°C，1300轉/分鐘、6分鐘離心，去掉上清液， 收集單細胞顆粒。臺盼藍染色後計算復甦細胞活率（細胞活率=活細胞數量八活細胞數 量+死細胞數量）*100% )和細胞總數，並進行幹細胞鑑定。鑑定結果如表1和表2所示，
[0083] 表格1 :復甦培養、擴增後流式細胞儀及免疫螢光檢測鑑定
[0084]

【權利要求】
1. 一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於它是按照以下步驟進行： 一、 胎盤米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤，備用； 二、 胎盤組織預處理：取步驟一至少3個部位的胎盤組織分別採用組織剪、鉗進行仔細 剝離、收集，收集後的組織分別用生理鹽水洗淨血液、剪小至〇. 5?1mm3大小，分別用生理 鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗後在1300rpm轉速下離心6min，收集沉澱，繼續下一次清 洗；清洗結束後，收集沉澱備用； 三、 組織塊凍存液配製：所述凍存液每lmL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07?0. 12mL 胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-穀氨醯胺和0. 2mL二甲基亞碸組成，配製好後於4°C預冷保存； 或者組織塊凍存液採用無血清培養基進行配製； 四、 組織程序化凍存：將步驟二預冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養基重懸 配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配製的凍存液，然後分裝至凍存 管內，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然後轉入-80°C過夜暫存； 五、 對每一個凍存管設低溫防凍條碼，進行管理； 六、 對步驟二的預處理後的胎盤組織樣本和步驟五復甦的胎盤組織進行厭氧菌、需氧 菌、黴菌、B肝病毒、C肝病毒、愛滋病毒和梅毒檢測；將檢測結果全部為陰性的胎盤組織轉 入-150°C?_180°C液氮罐氣相中長期保存，即構建出胎盤幹細胞庫。
2. 根據權利要求1所述的一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於所述的胎盤幹細胞 庫包含胎盤絨毛膜間充質幹細胞、胎盤羊膜間充質幹細胞、胎盤底蛻膜間充質幹細胞和胎 盤羊膜上皮細胞四種幹細胞。
3. 根據權利要求1所述的一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於步驟一中採集後的 胎盤用無菌生理鹽水衝洗表面血液後置於無菌生物樣本採樣袋內，在4?25°C採集箱內運 輸，採集箱運輸過程要求控制溫度恆定，防止顛簸，採集的胎盤需在72小時內進行處理。
4. 根據權利要求1所述的一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於所述凍存液每lmL 是由0. 70mL DMEM、0. 10mL胎牛血清、0. 15mL L-穀氨醯胺和0. 2mL二甲基亞碸組成。
5. 根據權利要求1所述的一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於步驟四中的培養基 為DMEM、DMEM/F12、AMEM或無血清培養基。
6. 根據權利要求1所述的一種胎盤幹細胞庫構建方法，其特徵在於所述的3個部位的 胎盤組織包括羊膜、胎盤絨毛膜和胎盤底蛻膜。
7. -種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，其特徵在於它是按照以下步驟進行的： 一、 首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中1? 2min進行解凍； 二、 將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM混勻， 然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複離心操 作2?3次，收集固相物； 三、 將步驟二收集的固相物接種到T75培養瓶中，加入DMEM培養液後置於C02培養箱 內培養2天後，計算貼壁組織塊數量和懸浮組織塊數量； 通過如下方式計算組織塊貼壁成活率： 貼壁成活率=培養瓶中貼壁成活的組織塊數量八培養瓶中貼壁成活的組織塊數量+ 培養瓶中懸浮未貼壁組織塊數量）*100% ; 即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。
8. -種胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦方法，其特徵在於它是按照以下步驟進行的： 一、 首先從權利要求1構建的胎盤幹細胞庫中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中1? 2min進行解凍； 二、 將步驟一解凍後的胎盤組織放入潔淨的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM混勻， 然後在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重複離心操 作2?3次，收集固相物； 三、 對步驟二收集的固相物進行酶解30?50min後，在4°C溫度、轉速為1300轉/分鐘 的條件下離心6min，去上清收集沉澱的細胞，經DMEM懸浮後取樣測定細胞活率並通過如下 方式計算復甦細胞活率：細胞活率=活細胞數量八活細胞數量+死細胞數量）*1〇〇 % ;並 計算復甦後的細胞總數數量；即完成胎盤幹細胞庫的胎盤組織復甦。
【文檔編號】C12N5/0735GK104480533SQ201410834913
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】張怡, 王靈娟, 付寅生, 劉豔青 申請人:黑龍江天晴幹細胞股份有限公司