一種重組豬α幹擾素標準品的製備方法

2023-10-05 14:56:59 1

專利名稱：：一種重組豬α幹擾素標準品的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種標準品的製備方法，具體是一種重組豬a幹擾素標準品的製備方法。
背景技術：
：畜牧業是我國國民經濟重要支柱產業之一，養殖方式從傳統的粗放經營向高密度、集約化養殖高速發展。但是伴隨高密度、集約化的養殖高速發展，病毒性疾病已經成為限制畜禽產業快速發展的第一大障礙。據不完全統計，我國每年因各種病毒性疾病引起畜禽死亡率高達15%_20%，經濟損失達數十億元。與此同時，我國加入WTO後，市場對畜禽產品的需求逐漸從數量型轉向質量型，對畜禽產品的質量要求達到前所未有的程度，因畜禽病害、藥物殘留、以及不符合衛生標準的畜禽類食品不僅影響我國畜牧業發展、產品出口創匯，甚至威脅到人的身體健康。豬病毒性疾病是當前嚴重製約豬養殖業健康發展的主要傳染病。全年均有發生，如豬病毒性腹瀉、流行性感冒等。這些動物一旦感染髮病，則有起病急，臨床症狀嚴重，極易傳播擴散，以及病死率和死亡率均較高的特點，給養殖業造成巨大經濟損失；更為重要的是，豬與人類密切接觸，某些人畜共患病還給人類健康帶來潛在威脅。幹擾素(interferon,IFN)是病毒感染誘導機體產生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調節作用的蛋白質，於1957年Issacs和Lindeman首先發現，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合後，可誘導機體產生特異的蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發揮抗腫瘤的活性。按照幹擾素的產生細胞、生化特徵及在機體免疫方面所發揮的作用不同，分為a、13、Y三類，其中a型幹擾素在機體內能發揮廣譜、高效抗病毒作用機制是抑制病毒蛋白質的合成，並能選擇性地作用於受感染細胞，而對正常宿主細胞無作用或作用微弱，在臨床上得到廣泛的應用。由於幹擾素具有良好的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節功能，而對正常宿主細胞無影響，因此被認為是當今應用前景最為廣闊的生物製劑之一。為了有效預防和控制人畜共患病，減少病毒性疾病對養豬業帶來的損失，本實驗室已經構建了可高效表達具有生物學活性的重組豬a幹擾素(rpoIFN-a)的重組菌。對於生物製品來說，其質量評價的有效性指標多採用生物學方法，如動物法和細胞法等進行檢測。這些方法本身變異性較大，因此標準品是生產中必不可少的組成部分，在生物製品標準化、質量控制和效力評價中標準品是藥品質量評價的標尺，起著非常重要的作用。然而目前國際國內均沒有rpoIFN-a的標準品，這給實際研究工作帶來很多不便。
發明內容本發明提供了一種重組豬a幹擾素標準品的製備方法，所製備的重組豬a幹擾素標準品純度高，對胰蛋白酶極為敏感，對酸穩定，可用於重組豬a型幹擾素特性鑑別和效價測定。本發明的技術方案為—種重組豬a幹擾素標準品的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)、重組豬a型幹擾素工程菌的發酵及蛋白提取將重組豬a型幹擾素工程菌接種於含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，保持溫度為35-38t:，培養過夜；重組豬a型幹擾素工程菌表達質粒為pET-32(a)，裝入豬a幹擾素基因；基因工程宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3);序列是CCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然後將培養得到的陽性克隆菌接種至含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，搖床振蕩培養，培養溫度為35-38t:，時間為17-20小時；將搖床振蕩培養得到的菌液接種至LB培養基中再次進行搖床振蕩培養，菌種與LB培養基的體積比為1:80-100，培養溫度為35-38°C，時間為17-20小時；將再次進行搖床振蕩後得到菌種接種至含有LB培養基的發酵罐內進行發酵，發酵罐內的溶氧量為25-35%，溫度為35-38t:，ra值為7-8;對發酵後的菌種進行檢領"當0D6。。達到0.6-0.8時，在菌種中加入異丙基-13-D-硫代半乳糖苷進行誘導，溫度為30-35°C，時間為5小時；將誘導後的菌種進行離心、緩衝液重懸、細胞破碎，再次離心取上清液，即重組豬a型幹擾素；(2)、重組豬a型幹擾素的純化親和層析純化將重組豬a型幹擾素經過層析柱上樣、洗雜，梯度洗脫，收集洗脫後的蛋白吸收峰；分子篩層析純化將洗脫後的蛋白吸收峰經分子篩層析柱上樣，洗脫，收集洗脫後的蛋白吸收峰，即重組豬a幹擾素標準品；所述的重組豬a幹擾素標準品的製備方法，其特徵在於具體步驟為(1)、重組豬a型幹擾素工程菌的發酵及蛋白提取將重組豬a型幹擾素工程菌種於含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，37t:培養過夜；然後將培養得到的陽性克隆接種至3ml含有氨苄青黴素的LB培養基中，37。C搖床震蕩培養18h，轉速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長；將搖床振蕩培養得到的菌液接種至200mlLB培養基中置37。C搖床，轉速為220r/min，震蕩培養18h，作為發酵種子，菌液與LB培養基的體積比為1:100。將再次進行搖床振蕩後得到菌種接種至含有LB培養基的發酵罐內進行發酵，設置溫度為37t:、溶氧為30%、轉速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養基的體積比為i:ioo;當0D6。。達到0.6-0.8時，在菌種中加入異丙基_P_D_硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進行誘導，調溫度至32°C，誘導表達5h;誘導結束後收集發酵液，清洗罐體；將發酵液fC條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩衝液重懸；然後將重懸後菌液在lOOObar壓力下高壓細胞破碎、4t:條件下12000r/min離心lOmin，收集上清。(2)、重組豬a型幹擾素的純化親和層析純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和層析柱；平衡用3-5個柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱；上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱；洗雜用2個柱體積以上的BindingBuffer1溶液過層析柱，該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl，調節pH至7.4，洗去未與層析柱結合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰；洗脫用ElutionBuffer,該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脫，之後繼續100%梯度洗脫20ml;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱；保存用20%乙醇過層析柱；分子篩層析進一步純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和分子篩層析柱；平衡用2-3個柱體積的BindingBuffer2，該溶液組成為50mMNa2HP04，0.15MNaCl，調節pH至7.0，平衡分子篩層析柱；上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱；洗脫用BindingBuffer2洗脫；收集洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗柱子；保存用20%乙醇過柱。重組豬a型幹擾素標準品鑑定方案如下1)SDS-PAGE和HPLC鑑定在95%以上；2)N端胺基酸測序使用Edman降解法，在測序之前先用腸激酶將重組幹擾素酶切，再電泳並轉到PVDF膜上，立春紅染色後將幹擾素部分的蛋白條帶剪下進行測序，N-末端胺基酸序列從第十個胺基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR;3)在H印-2/VSV系統上以北京生物製品所製備的重組人a型幹擾素(rhIFN-a)國家標準品對其效價經行標定，其效價為^1.OX1041.OX105IU/ml;4)Lowry法檢測蛋白濃度，其蛋白含量為0.4mg/ml。重組豬a型幹擾素標準品其理化特徵是豬a幹擾素單克隆抗體可中和重組豬a幹擾素標準品的生物學活性，證明該重組蛋白確實為豬a幹擾素；對胰蛋白酶極為敏感，但對酸和熱較為穩定，在56t:保溫lh，活性仍保留在50%。本發明製備的製備的重組豬a型幹擾素生物學活性標準品效價為>1.0X104-1.0X105IU/ml;SDS-PAGE純度》95%;HPLC純度為》95%;相對分子量為35KD±5%;N-末端胺基酸序列從第十個胺基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR;豬a幹擾素單克隆抗體可中和重組豬a幹擾素標準品生物學活性，證明該重組蛋白確實為豬a幹擾素；對胰蛋白酶極為敏感，但對酸(pH2.0)和56°C30min非常穩定，在56。C保溫lh，活性仍保存在50%左右，主要理化性質與北京生物製品所研製的重組人幹擾素a2b標準品類似。可用作重組豬a型幹擾素效價測定的參考標準。具體實施例方式重組豬a幹擾素標準品的製備方法1、重組豬a型幹擾素工程菌的發酵及蛋白提取將重組豬a型幹擾素工程菌種於含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，37t:培養CCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然後將培養得到的陽性克隆接種至3ml含有氨苄青黴素的LB培養基中，37。C搖床震蕩培養18h，轉速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長。LB培養基是一種用於培養基因工程受體菌(大腸桿菌)的常用培養基。LB解釋為Luria-Bertani培養基，應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。它含有酵母提取物、蛋白腖和NaCl。將搖床振蕩培養得到的菌液接種至200mlLB培養基中置37。C搖床，轉速為220r/min，震蕩培養18h，作為發酵種子，菌液與LB培養基的體積比為1:100。將再次進行搖床振蕩後得到菌種接種至含有LB培養基的發酵罐內進行發酵，設置溫度為37t:、溶氧為30%、轉速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養基的體積比為i:ioo;當0D6。。達到0.6-0.8時，在菌種中加入異丙基_P_D_硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進行誘導，調溫度至32°C，誘導表達5h;誘導結束後收集發酵液，清洗罐體；將發酵液4t:條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩衝液重懸；然後將重懸後菌液在lOOObar壓力下高壓細胞破碎、4t:條件下12000r/min離心lOmin，收集上清。2、重組豬a型幹擾素的純化(1)、親和層析純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和層析柱，流速為5ml/min;平衡用3-5個柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱，流速為2ml/min;上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱，流速為lml/min;洗雜用2個柱體積以上的BindingBuffer1(20mMNa2HP04(3.5814)，0.5MNaCl(14.61)，pH7.4)過層析柱，洗去未與層析柱結合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰，流速lml/min;洗脫用ElutionBuffer(20mMNa2HP04(3.5814)，0.5MNaCl(14.61)0.5M咪唑(17.02)，pH7.4)梯度洗脫，0%-100%40ml，之後繼續100%梯度洗脫20ml，流速lml/min;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱，流速為5ml/min;保存用20%乙醇過層析柱，流速為5ml/min;(2)、分子篩層析進一步純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;平衡用2-3個柱體積的BindingBuffer2(50mMNa2HP04(8.908)，0.15MNaCl(4.383)，pH7.0)平衡分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱，流速為0.5ml/min;洗脫用BindingBuffer2以0.5ml/min的流速洗脫；收集洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗柱子，流速0.5ml/min;保存用20%乙醇過柱，流速為0.5ml/min。3、蛋白質含量測定對上述純化前後的豬a幹擾素樣品用Lowry法檢測蛋白濃度，其蛋白含量為0.4mg/ml。4、SDS-PAGE進行純度鑑定對蛋白表達條件優化及工程菌發酵得到的蛋白樣品進行SDS-PAGE鑑定純度及分按照分子克隆試驗指南進行製備5%的濃縮膠和的12%分離膠；灌膠按照儀器使用說明安裝好垂直板SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳裝置，迅速在兩層玻璃板間灌入分離膠，並在膠面上用少量蒸餾水覆蓋；待分離膠完全聚合後，倒出表面的蒸餾水，以少量IXSDS-PAGE緩衝液(25mmolTris-ClpH8.0，250mmol甘氨酸，O.1%SDS)衝洗表面。以濾紙吸去凝膠表面液體，迅速加入適量濃縮膠並插入梳齒，室溫靜置，待濃縮膠聚合完全後拔出梳齒；上樣以10iU低分子量蛋白標準作為電泳分子量指示，取樣品10iU與等體積上樣緩衝液混合(4%SDS，20X甘油，10%P-琉基乙醇，125,1/LTris-HClp朋.8，0.1溴酚藍)，IO(TC煮沸5分鐘，短暫離心後以微量加樣器依次上樣；電泳將適量1XSDS-PAGE緩衝液(25mmolTris-ClpH8.0，250mmol甘氨酸，0.1%SDS)倒入電泳槽，連接好電源。電泳條件為恆壓方式，電壓調為8V/cm，待樣品進入分離膠後，升至15V/cm，當指示劑抵達分離膠底部時關閉電源；固定、染色及脫色取下凝膠，以5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液(0.25g考馬斯亮藍溶解於ioomi甲醇/冰醋酸溶液中，甲醇水冰醋酸=45:45:io)浸泡凝膠，室溫下緩慢搖動4小時。回收染色液，以脫色液(45%甲醇，10%冰醋酸)浸泡凝膠，緩慢搖動脫色，其間更換脫色液3次，待凝膠背景清晰後，觀察結果；SDS-PAGE鑑定其純度>95%。5、HPLC純度鑑定純化後的rpoIFN-a做HPLC純度鑑定清洗用雙蒸水洗去純化系統管道中的保存液，再用2-3個柱體積的雙蒸水清洗分子篩層析柱，流速為0.5ml/min;平衡用2-3個柱體積的0.1%TFA水溶液平衡分子篩層析柱，流速為lml/min;上樣將樣品脫鹽處理後上樣50iU;洗脫線性梯度洗脫0-70min070%0.1%TFA乙腈溶液；洗柱用雙蒸水清洗柱子，流速lml/min;保存用20%乙醇過柱，流速為lml/min;結果經HPLC鑑定純化後的rpoIFN-a其純度^95%。6、N-端胺基酸序列測定N-端胺基酸序列測定的作用是確證純化的目的蛋白就是重組豬a型幹擾素；酶切取純化後的rpoIFN-a200iig，加4單位重組腸激酶，與酶切緩衝液中4t:條件下酶切16小時；SDS-PAGE電泳取酶切產物進行SDS-PAGE電泳，上樣前先將配置好的聚丙烯醯胺凝膠裝到垂直電泳儀上，用50V恆壓空跑30min;轉膜將蛋白電轉到PVDF膜上，電轉緩衝液用CAPS緩衝液；立春紅染色將PVDF(聚偏氟乙烯)膜放到立春紅染液中染色，待看到蛋白條帶後拿出，用水洗去背景顏色；將目的條帶剪下放於E卯endorf管中，-2(TC保存，用Edman降解法進行N端胺基酸測序；N-末端胺基酸序列從第十個胺基酸開始為CDLPQTHSLAHTRALR，確證純化的目的蛋白就是重組豬a型幹擾素。7、效價滴定rhIFN-a標準參考品購自北京中國藥品生物製品研究所，幹擾素a國家標準品，批號97/04，下稱標化幹擾素；細胞人喉癌傳代細胞(H印-2)株；病毒攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV);方法採用微量細胞病變抑制法；測定幹擾素抗病毒活性，以實際測得的效價即幹擾素的工作單位表示。工作單位經修正後以國際單位表示，必須有標化國際單位的IFN同時滴定，測定的標化幹擾素國際單位除以標化單位即可得到一係數，將此係數乘以工作單位；標化IFN7500IU-=3.75xIFN工作單位本次實際測定2000U二倍遞增系列稀釋待檢重組豬a幹擾素根據需要橫排做IO個稀釋度(1:2.......1:1024);第11孔為病毒對照；第12孔為細胞對照，若豎排做為6個稀釋度(1:2......1:64);第7孔病毒對照，第8孔細胞對照，亦可用四倍遞增系列稀釋IFN;每個批號IFN需作復孔；標化幹擾素以同上方法稀釋10孔或6孔。10%牛血清RPMI1640液作為IFN稀釋液，每個稀釋度每孔100ill可在96孔板上用100y1加樣器直接稀釋，最終每孔100iU。病毒對照和細胞對照不加幹擾素；製備H印-2細胞懸液H印-2為處於對數生長期，即傳代後1824h已形成單層，鏡下觀察時，細胞透亮，立體感強；用pH7.4PBS洗滌細胞二次，倒去PBS加入35mlVTP消化液室溫作用3min後一倒去VTP—靜透5min—待細胞從玻璃瓶表面滑下，加入10%小牛血清RPMI1640培養液，調整細胞數為l-3X107ml，每孔100iU與不同稀釋度rIFN混合。病毒對照，細胞對照孔均加100ii1細胞懸液。混勻後將該96孔板置5%(A37。C孵箱培養16-18h，(IFN在細胞上誘導抗病毒蛋白的時間控制在16-18h若要快速亦不能少於6h);VSV攻擊IFN與細胞共孵育16-18h後，倒去96孔板的液體加入配製合適濃度的VSV100y1/孔(預先滴定VSVTCID5。，以24h可使H印-2細胞完全破碎的TCID5。為合適濃度)；結果觀察與分析通常VSV攻擊後24h，鏡檢病毒對照孔細胞破碎達100%而細胞對照正常時，即可用結晶紫染色，水洗後肉眼觀察記錄，細胞完整良好呈紫色如細胞對照孔，幹擾素保護孔均呈紫色(一)100%病變細胞為細胞全脫落故無色，如病毒對照孔和無幹擾素保護的孔均無色(100%CPE++++)舉例如下表1.某批重組豬a幹擾素標準品結果以"+""-"記號記錄形式tableseeoriginaldocumentpage11表2.50%保護細胞的幹擾素稀釋度計算(ReedMuench計算)tableseeoriginaldocumentpage1150%保護為27，即1:128，即本rIFN的工作單位(U)為128U;工作單位修正以國際單位(IU)表示每次設立有標化國際單位的IFN同時測定，若標化的IFN為7500IU,而本次實驗滴定標化幹擾素的工作單位為2000U，以下面公式算出係數，乘以實際滴定的每個樣本工作單位，即為該rIFN國際單位。formulaseeoriginaldocumentpage11所以每次滴定幹擾素必需加上標化幹擾素，使所測幹擾素的工作單位加以修正，並以國際單位(IU)表示；經過測試，製備的重組豬a幹擾素標準品效價達到^1.OX1041.OX105IU/ml。8、重組豬a幹擾素蛋白理化性狀檢測材料與方法對照參比品為rhIFN-a標準參考品購自北京中國藥品生物製品研究所，幹擾素a國家標準品，批號97/04，下稱標化幹擾素；豬a幹擾素單克隆抗體購自ABcam公司；細胞用於抗病毒活性測定的細胞人喉癌傳代細胞(H印-2)株；幹擾素效價測定採用微量板染色法進行。攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV);結果抗胰蛋白酶水解實驗用胰蛋白酶溶液重新溶解重組豬a幹擾素標準品(豬a幹擾素效價稀釋為10000IU/ml，胰蛋白酶的終濃度2.5iig/ml)。37。C作用lh，加入含10%小牛血清的匿EM營養液，稀釋並中止胰蛋白酶的作用，而後依照微量板測定方法測定其幹擾素活性，對照為未經胰蛋白酶處理的同批標準品。結果經胰蛋白酶作用lh的幹擾素樣品的活性損失在95%以上，表明重組豬a幹擾標準品素對胰蛋白酶不耐受(表3)，符合蛋白質的生物學特性；表3重組豬a幹擾素標準品對胰蛋白酶耐受性測定結果*幹擾素(IU/ml)樣品編號-殘存活性(％)作用前作用後110000<543<5.43210000<526<5.26310000<544<5.44410000<435<4.35510000<411<4,11平均10000<492<4.92*0.25%胰蛋白酶，37"作用lh熱穩定性實驗取三批重組豬a幹擾素標準品2ml(濃度為0.4mg/ml)，分別於0.5h、lh和2h取樣，4t:保存，統一測其生物學活性。以同批未經加熱處理的樣品為對照測定其幹擾素活性。結果，經上述3種時間在561:加熱處理後的幹擾素仍分別保留58.68%、51.55%和24.15%的活性，說明重組豬a幹擾素標準品具有較好的熱穩定性(詳見表2);表4重組豬a幹擾素標準品的熱穩定性測定結果*熱處理後幹擾素效價殘存幹擾素活性(％)樣品編號(x104IU/ml)2h0.5h2h0.5h2h0,5h12.62.41.753.949.630.622.82.51.256.550.125.232.72.21.354.547.326.1平均2.72.41.454.974927.3*測定樣品原效價5X104單位/ml，水浴溫度56°C。酸穩定性實驗用2.5mol/LHCL分別將重組豬a幹擾素標準品以及標準參比品(北京生物製品所產品)調至pH2.0，而後置4t:。分別於24h、48h和96h取樣，以同批未經酸滅活的幹擾素樣品為對照，測定其IFN活性；結果見表3。三種樣品在pH2.0作用24h時，用NaOH將pH值調回後，測定效價，幹擾素活性幾乎未受破壞；表5pH2.0處理重組豬a幹擾素標準品的測定結果*樣品編號原效價(x104IU/ml)pH2.0處理後效價(x104IU/ml)損失活性(％)24h48h96h24h48h96h110.09.69.58.42.76.514.925.04.84.33.62.86.115.3標準參比品(對照)10.09.89.68.52.76.313.6*用2.5mol/LHC1調IFN樣品pH至2.0，4。C處理不同時間後測定3份平行標本測定的平均結果與抗豬幹擾素抗體的中和實驗將從ABcam公司購買的抗豬a幹擾素單克隆抗體，與重組豬a幹擾素混合後，37t:水浴作用lh後測定效價，結果被檢的活性損失在95X以上，表明抗豬a幹擾素單克隆抗體可中和重組豬a幹擾素標準品的生物學活性(表4);表6重組豬a幹擾素標準品對抗豬幹擾素抗體的中和實驗測定結果*樣品編號IFN(IU/ml)殘存活性(％)tableseeoriginaldocumentpage14*抗豬a幹擾素單克隆抗體，37。C作用lh結果判斷我們用ABcam公司購買的豬a幹擾素單克隆抗體對重組豬a幹擾素標準品進行了中和試驗，結果證明，該重組蛋白確實為豬a幹擾素；並證實該IFN對胰蛋白酶極為敏感，但對酸和熱較為穩定。在56t:保溫lh，活性仍保留在50%，主要理化性質與北京生物製品所研製的重組人幹擾素a2b標準品類似。權利要求一種重組豬α幹擾素標準品的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)、重組豬α型幹擾素工程菌的發酵及蛋白提取將重組豬α型幹擾素工程菌接種於含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，保持溫度為35-38℃，培養過夜；重組豬α型幹擾素工程菌表達質粒為pET-32(a)，裝入豬α幹擾素基因；基因工程宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)；序列是TGAAAGTGAAAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTGGAATTCATGTGTGACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGGGACTTTGGATCCCCTCATGAGGCTTTTGGGGGCAACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGTGCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCAGCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACGCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCATGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAGCCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGAAAGCTTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAATCGGCCCAACGCGCGGGGGAGAGGGCGGTTTTGCGTATTTGAGCGCTCTTTCCCGCTTCCCTTCGCTTCACTGACTTCGGCTGCCGGCTT然後將培養得到的陽性克隆菌接種至含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，搖床振蕩培養，培養溫度為35-38℃，時間為17-20小時；將搖床振蕩培養得到的菌液接種至LB培養基中再次進行搖床振蕩培養，菌種與LB培養基的體積比為1∶80-100，培養溫度為35-38℃，時間為17-20小時；將再次進行搖床振蕩後得到菌種接種至含有LB培養基的發酵罐內進行發酵，發酵罐內的溶氧量為25-35％，溫度為35-38℃，PH值為7-8；對發酵後的菌種進行檢測，當OD600達到0.6-0.8時，在菌種中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，溫度為30-35℃，時間為5小時；將誘導後的菌種進行離心、緩衝液重懸、細胞破碎，再次離心取上清液，即重組豬α型幹擾素；(2)、重組豬α型幹擾素的純化親和層析純化將重組豬α型幹擾素經過層析柱上樣、洗雜，梯度洗脫，收集洗脫後的蛋白吸收峰；分子篩層析純化將洗脫後的蛋白吸收峰經分子篩層析柱上樣，洗脫，收集洗脫後的蛋白吸收峰，即重組豬α幹擾素標準品；2.根據權利要求1所述的重組豬a幹擾素標準品的製備方法，其特徵在於具體步驟為(1)、重組豬a型幹擾素工程菌的發酵及蛋白提取將重組豬a型幹擾素工程菌種於含有氨苄青黴素的固體LB培養基上，37t:培養過夜；然後將培養得到的陽性克隆接種至3ml含有氨苄青黴素的LB培養基中，37t:搖床震蕩培養18h，轉速為220r/min;非陽性克隆菌不能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長，只有陽性克隆菌能在含有氨苄青黴素的LB培養基上生長；將搖床振蕩培養得到的菌液接種至200mlLB培養基中置37t:搖床，轉速為220r/min，震蕩培養18h，作為發酵種子，菌液與LB培養基的體積比為1:100。將再次進行搖床振蕩後得到菌種接種至含有LB培養基的發酵罐內進行發酵，設置溫度為37t:、溶氧為30X、轉速為270r/min、pH為7.4，菌種與LB培養基的體積比為l:100;當OD,達到O.6-0.8時，在菌種中加入異丙基-!3-D-硫代半乳糖苷至終濃度為lmmol/L進行誘導，調溫度至32°C，誘導表達5h;誘導結束後收集發酵液，清洗罐體；將發酵液fC條件下4000r/min離心10min，收集菌體，用200ml磷酸緩衝液重懸；然後將重懸後菌液在1000bar壓力下高壓細胞破碎、4t:條件下12000r/min離心10min，收集上清。(2)、重組豬a型幹擾素的純化親和層析純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和層析柱；平衡用3-5個柱體積的BindingBuffer1平衡層析柱；上樣將用0.22m孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱；洗雜用2個柱體積以上的BindingBuffer1溶液過層析柱，該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl，調節pH至7.4，洗去未與層析柱結合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰；洗脫用ElutionBuffer,該溶液組成為20mMNa2HP04，0.5MNaCl0.5M咪唑，pH7.4，梯度洗脫，之後繼續100%梯度洗脫20ml;收集洗脫過程中用自動收集器收集洗脫下來蛋白吸收峰；洗柱用雙蒸水清洗層析柱；保存用20%乙醇過層析柱；分子篩層析進一步純化重組豬a型幹擾素清洗用雙蒸水清洗系統管道和分子篩層析柱；平衡用2-3個柱體積的BindingBuffer2，該溶液組成為50mMNa2HP04，0.15MNaCl，調節pH至7.0，平衡分子篩層析柱；上樣4t:條件下將上述親和層析收集的樣品12000r/min離心10min，按柱體積的1%上樣通過層析柱；用BindingBuffer2洗脫;洗脫過程中收集洗脫下來蛋白吸收峰；用雙蒸水清洗柱子；用20%乙醇過柱。脫集柱存洗收洗保全文摘要本發明公開了一種重組豬α幹擾素標準品的製備方法，將重組豬α型幹擾素的重組菌進行發酵、誘導表達並提取總蛋白，用兩步法純化後得到標準品。本發明製備的重組豬α型幹擾素生物學活性參考標準品可用於重組豬α型幹擾素特性鑑別和效價測定，以此為標準可使不同批次及同一批次不同次測定的重組豬α型幹擾素效價結果更為可信。文檔編號C07K1/16GK101736062SQ20091018565公開日2010年6月16日申請日期2009年11月27日優先權日2009年11月27日發明者王明麗,趙俊申請人:王明麗;趙俊