乙型腦炎病毒ns1蛋白特異性b細胞抗原表位多肽及其應用的製作方法
2023-10-06 01:42:14
專利名稱：乙型腦炎病毒ns1蛋白特異性b細胞抗原表位多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗原表位多肽，尤其涉及乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，本發明還涉及該抗原表位多肽在診斷乙型腦炎病毒中的應用，屬於分子免疫學領域。
背景技術：
流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。該病毒首先於1953年在日本從患者腦組織中分離獲得，因此稱日本腦炎病毒，所致疾病在日本稱日本乙型腦炎。在我國最早於1940年分離此病毒，為了與甲型腦炎相區別，定名為流行性乙型腦炎，簡稱乙腦。在世界範圍內每年有 30，000-50, 000例乙腦病例，約25% -30%死亡，50%導致永久性中樞神經系統後遺症。我國近年每年的乙腦病例大於5000例，死亡200例以上。對於流行性乙型腦炎病毒多種動物易感，但除人、馬和豬外通常不呈現臨床症狀。對人主要引起中樞神經系統的急性感染，人感染臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激徵為特徵。母豬感染可引起流產、 產死胎或木乃伊胎，公豬感染導致睪丸腫大影響繁殖性能為特徵，少數豬只感染可能呈現發熱和神經症狀，而其他豬則大多數不呈顯症狀。給養豬業造成巨大的經濟損失。馬屬動物易感染，少數引起腦炎與神經症狀，馬是終末宿主。蚊是JEV的主要傳播媒介，豬是該病毒在自然界中最重要的貯存與增殖宿主。乙型腦炎病毒主要在亞洲流行，而最近發現在南半球也有報導，這說明流行性乙型腦炎可能在世界範圍內威脅著人類健康。乙型腦炎病毒JEV屬黃病毒科，黃病毒屬，為單鏈正鏈RNA病毒。基因組約111Λ， 包含一個大的開放閱讀框架0)RF)，兩端是5』端和3』端非編碼區(UTR)。基因組5』端有帽子結構，但在3』端沒有poly(A)尾。ORF編碼含3432個胺基酸的前體蛋白，在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為10個成熟蛋白，包含3個結構蛋白(C，prM, E)，7個非結構蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。病毒粒子呈球形，直徑約 30nm，有囊膜。JEV 只有一個血清型，在抗原性上與西羅病毒、墨羅河谷腦炎病毒、聖路易腦炎病毒等屬同一血清群，存在抗原交叉反應。病毒囊膜糖蛋白具有血凝特性，能凝集鵝、鴿、雛雞等動物紅細胞。病毒對熱抵抗力弱，56°C 30分鐘或100°C 2分鐘即可滅活，但對低溫和乾燥的抵抗力很強。乙醚、1 1000的去氧膽酸鈉以及常用消毒劑均可滅活病毒，在酸性條件下不穩定，適宜 ρΗ8· 5 9. 0。採用疫苗進行預防接種是控制該病流行的有效措施。對人或動物機體的JEV抗體檢測是了解JEV感染或免疫情況的重要內容，也是指導免疫預防的重要科學依據。NSl蛋白是乙腦病毒的一種重要的非結構蛋白，不存在於病毒粒子結構中，只有在自然感染或弱毒疫苗免疫情況下機體才產生抗NSl蛋白抗體，而滅活疫苗免疫或亞單位疫苗免疫則不產生NSl蛋白抗體。所以檢測NSl蛋白抗體可以診斷JEV感染，以及鑑別診斷滅活苗免疫與感染。JEV E蛋白極易與其它黃病毒如登革病毒、西尼羅病毒等產生血清學交叉反應而影響診斷結果。而JEV NSl蛋白抗體特異性強，與特性相近的其它黃病毒如登革病毒、西尼羅病毒等血清學交叉反應極低。以NSl蛋白為靶抗原檢測具有很強的特異性。更進一步地，採用NSl蛋白特異性抗原表位多肽為抗原檢測相應抗體則可以進一步提高檢測的特異性，也可以更好地進行質量標準控制。有利於提高試劑盒的質量標準化與生產控制水平，也可以提高檢測診斷結果的特異性。
發明內容
本發明的目的之一提供乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽。本發明的目的之二是將所述的乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽應用於製備成診斷或檢測乙型腦炎病毒的試劑。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的一種乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，其胺基酸序列為SEQ ID NO 1所示(34C1H-HDETTLVRSQV-0H35C1)。該抗原表位序列在不同JEV毒株中高度保守，只有少數毒株中該序列中第四位胺基酸τ突變為A。通過試驗進一步發現，將SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列中第四位胺基酸殘基T 替換為A後，所得到的胺基酸序列為SEQ ID N0:2所示(34C1H-HDEATLVRSQV-0H35C1)與SEQ ID NO 1具有同樣的與NSl蛋白單抗結合活性。其中，可以對所述的乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位的N端或C 端進行化學修飾。所述的化學修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙醯化，或C端的自然羧
基化或醯胺化。本發明中所述的乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽可以通過固相多肽合成方法合成得到，也可以通過基因工程技術製備得到，這些都為本領域人員所通曉。本發明乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位或其連接物可用於製備抗原，用於檢測抗乙型腦炎病毒JEV抗體或抗乙型腦炎病毒JEV多肽抗體的試劑。檢測乙型腦炎病毒JEV可以針對NSl蛋白抗原表位的單克隆抗體或針對抗原表位多肽的多克隆抗體，檢測方法可以包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、直接免疫螢光技術、 間接免疫螢光技術，快速檢測試紙條免疫膜層析技術等。檢測乙型腦炎病毒JEV抗體，包括野毒感染產生抗體，疫苗免疫產生抗體，母源抗體，抗JEV單克隆抗體等。檢測方法可以包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA，快速檢測試紙條免疫膜層析技術等。蛋白質抗原B細胞抗原表位鑑定的方法有多種，如基因工程定點突變表達抗原蛋白分析法、噬菌體隨機肽庫篩選技術、合成多肽檢測技術等。本項發明在鑑定抗原表位中主要採用的是基因工程技術融合表達NSl蛋白，純化後免疫小鼠，篩選製備單克隆抗體。進一步採用基因工程技術融合表達JEV NSl蛋白重疊多肽(overlapping)，體外免疫反應檢測多肽融合蛋白組與NSl蛋白單克隆抗體的結合性鑑定抗原表位序列，進一步縮短表達表位融合蛋白，鑑定抗原表位的序列結構；再應用合成多肽技術驗證表位的正確性；用合成表位多肽偶聯抗原建立JEV抗體免疫學檢測方法。本發明的有益效果如下
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1.將本發明的乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽或多肽與載體蛋白偶聯物作為抗原能夠檢測乙型腦炎病毒JEV抗體或抗乙型腦炎病毒JEV多肽抗體。2.本發明的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽具有比E蛋白更強的特異性，可減少檢測結果的假陽性率。3.本發明的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位或其連接物作為抗原， 抗原純度更高，可克服基因工程表達抗原純化中菌體雜蛋白的殘留所致的非特異性反應。4.本發明的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位或其連接物作為抗原檢測乙型腦炎病毒JEV抗體或抗乙型腦炎病毒JEV多肽抗體。所生產的抗原可以儀器自動化生產，質量易均一，檢測結果更穩定。
圖1為JEV NSl蛋白的融合表達分析。圖中從左至右依次為M 蛋白分子量標準； 1 未經誘導的菌體蛋白；2 誘導後超聲裂解上清蛋白；3-9 純化的蛋白；圖2為NSl單克隆抗體flfesterb-blot分析。單抗可結合感染JEV的BHK-21細胞中的NSl蛋白；圖3為不同毒株乙型腦炎NSl蛋白抗原表位多肽序列的同源性比較。圖示結果表明本發明中NSl抗原表位序列在不同JEV毒株中高度保守；圖4為表位多肽偶聯蛋白檢測人血清JEV抗體結果。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的範圍。實施例1 JEV NSl蛋白的融合表達與純化根據JEV SA14-14-2株NSl基因序列(基因序列號AF315119)，設計一對引物，上遊引物為5』 CGCCCATGGACACTGGATGTGCCATTGAC 3』在上遊引物的5』端引物NcoI酶切位點；下遊引物為5，TTAGGATCCTTAAGCAGCGACTAGCACCACATACC 3，下遊引物的5，端引入終止子和BamH I酶切位點。提取JEV感染BHK-21細胞中的總RNA，RT-PCR擴增NSl基因。將 NSl蛋白基因經NcoI與BamH I酶切位點克隆至原核表達載體pMAL_c5X中，構建了重組融合表達質粒pc5X-NSl。重組質粒轉化宿主菌ER2523後，經IPTG誘導得到可溶性的融合蛋白MBP-NSl (圖1)。進一步優化了誘導表達條件為^°C，0. 3mmol/L IPTG誘導4h。融合蛋白可經澱粉樹脂柱進行純化。Western blot與間接ELISA分析表明重組融合蛋白MBP-NSl 具有良好的抗原性和特異性。實施例2NS1蛋白單克隆抗體的複製與製備利用表達純化的融合蛋白MBP-NSl作為免疫原，免疫6周齡BALB/c小鼠，採用淋巴細胞雜交瘤技術進行融合，經有限稀釋法獲得1株分泌特異性針對JEVNSl抗體的雜交瘤細胞，命名為3G11。經測定3G11單抗亞類屬於IgGh，輕鏈為κ鏈。該株雜交瘤細胞所製備的小鼠腹水中抗體ELISA效價達204800，Western blot證實所得雜交瘤細胞分泌的抗體均可特異地與JEV NSl蛋白反應(圖2)，間接免疫螢光試驗表明單抗3G11能夠識別天然的JEV NSl蛋白。同時也表明該單抗的表位是位於NSl蛋白表面的線性抗原表位，可以進
5一步鑑定其抗原表位序列。實施例3重疊(over lapping)多肽融合表達系列JEV NSl蛋白抗原多肽片段並進行間接ELISA篩選單克隆抗體抗原表位根據JEV NSl蛋白胺基酸序列，設計一系列多肽，這些多肽相互重疊，且覆蓋JEV NSl蛋白全長。根據每一條多肽胺基酸序列，設計合成一對DNA鏈，將DNA鏈插入表達載體與GST進行融合表達。融合表達的系列重組蛋白與JEVNSl特異性單克隆抗體進行應用性分析，鑑定其線性抗原表位。具體流程如下設計多肽序列一合成編碼多肽序列的DNA鏈一多肽融合表達載體構建一誘導表達一表達融合蛋白親和層析純化一表達產物與單克隆抗體免疫反應性檢測一分析JEV NSl 蛋白特異性抗原表位。試驗結果見表1、表2。表1重疊多肽融合蛋白與JEV NSl特異性單克隆抗體3G1IELISA反應檢測結果
權利要求
1.一種乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，其特徵在於，其胺基酸序列為 SEQ ID NO 1 所示。
2.—種乙型腦炎病毒NS 1蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，其特徵在於，其胺基酸序列為SEQ ID NO 2所示。
3.編碼權利要求1或2所述乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽的核苷酸序列。
4.如權利要求1或2所述的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，其特徵在於，對所述的乙型腦炎病毒JEV NSl蛋白特異性B細胞抗原表位的N端或C端進行化學修飾。
5.如權利要求1或2所述的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽，其特徵在於，所述的化學修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙醯化，或C端的自然羧基化或醯胺化。
6.如權利要求1或2所述的乙型腦炎病毒NSl蛋白特異性B細胞抗原表位多肽在製備診斷或檢測乙型腦炎病毒試劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了乙型腦炎病毒NS1蛋白特異性B細胞抗原表位多肽序列，還公開了該抗原表位多肽在診斷乙型腦炎病毒中的用途及其篩選方法，屬於分子免疫學領域。本發明所述的抗原表位多肽的胺基酸序列如SEQ ID NO1或SEQID NO2所示。本發明JEV NS1蛋白特異性B細胞抗原表位合成多肽、合成表位多肽偶聯抗原以及抗原表位融合表達蛋白作為抗原可用於特異性地檢測機體免疫或感染後產生的抗JEV NS1蛋白抗體。可用於JEV感染診斷，疫苗免疫效果評價以及鑑別診斷滅活疫苗免疫與自然感染。
文檔編號C12N15/40GK102206249SQ20111010506
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者華榮虹, 步志高 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所