利用發光體k-37的脂蛋白測定的製作方法

2023-10-23 00:37:52 3

專利名稱：：利用發光體k-37的脂蛋白測定的製作方法利用發光體K-37的脂蛋白測定本發明涉及用於鑑別樣品混合物中不同類別脂質分子的測定系統。特別地，本發明涉及確定血漿或血清中特別是脂蛋白濃度的方法。本發明還涉及用於實施所述方法的裝置。脂質是有生命生物中存在的多種組的有機化合物。它們在水中是不溶的，但是可溶於有機溶劑。將脂質廣泛分類成兩個類別(i)複雜脂質；和(ii)簡單脂質。複雜脂質是長鏈脂肪酸的酯並且包括甘油酯類、糖脂類、磷脂類、膽固醇和蠟。不含有脂肪酸的簡單脂質，包括類固醇(例如，膽固醇)和萜類。脂質可以與蛋白質結合形成脂蛋白，其形式為其中諸如膽固醇和甘油三酯的脂質在血液和淋巴中被輸送。血漿中發現的脂蛋白屬於三個主要分類(i)高密度脂蛋白(HDL)，(ii)低密度脂蛋白(LDL)，禾P(iii)極低密度的脂蛋白(VLDL)，以及中間密度脂蛋白(IDL)。為了簡潔，在這裡使用術語"血清"，但是涉及"血清"應當解釋為涉及血清或血漿。充分記載的是，在血漿中多種脂蛋白的濃度和動脈粥樣硬化風險之間存在有力的關係，即有害斑塊在血管壁上的發展可以導致心臟病發作。同樣已知，不同類別的脂蛋白(HDL、LDL和VLDL)在動脈粥樣硬化中各自起不同的作用。例如，將HDL認為是抗致動脈粥樣化的(anti-atherogenic)，而已知LDL是高度致動脈粥樣化的(它攜帶的膽固醇與動脈粥樣硬化的發展密切相關)。因此，關於多種脂質成分的每一種(S卩脂蛋白)在血液中的相對濃度的知識，將是有利的，因為這將幫助臨床醫生治療具有這些不適當的脂質血液濃度的患者。應當理解，具有患者脂蛋白分布的知識對於臨床醫生將是最有利的。已經開發了用於確定血液中一些脂質成分濃度的測定。這樣的測定通常涉及首先從患者取血樣，然後將其送到檢驗實驗室用於分析。這樣的測定利用昂貴的裝置進行，並且出於計算原因需要相當長的時間以產生結果。這耽誤治療。而且，所述測試是複雜的，並且因此是昂貴的。另外，在實驗室中使用的裝置不容易便攜，並且因此不能由GPS或護士在出診時使用，或者甚至不能作為家用測試試劑盒使用。最近已經開發了試圖在"治療點(pointofcare)"複製實驗室測定的裝置，但是這些己經證明是昂貴的並且需要熟練的使用者操作。因此，存在提供用於分析血清中脂蛋白分布的改進方法的需要。血清是多種蛋白質的複雜混合物，並且雖然分離並直接測量不同類別脂蛋白濃度的方法是已知的，但是這樣的方法是複雜而昂貴的。用於確定血清的脂蛋白濃度的測定實施例公開在WO01/53829A1中。該文件涉及特別的有機發光體，4-二甲基氨基-4'-二氟甲基-磺醯-苯亞甲基-苯乙酮(DMSBA)，作為螢光探針的使用。所述探針的公式，確定為K-37,給定formulaseeoriginaldocumentpage5探針K-37在水中不發光，但是在脂蛋白水溶液諸如血清中是高度發光的。特別是，螢光強度高度依賴於血清的脂蛋白含量並因而可以將K-37用作螢光探針以測量可能存在的脂蛋白濃度，即當結合到脂蛋白的脂質並在適當輻射波長激發時K-37發螢光。因此，脂蛋白混合物的時間分辨(time-resolved)螢光衰減的測量可用於直接產生關於存在於那個混合物中的不同脂蛋白(LDL、和VLDL)的相對濃度的信息。然而，利用K-37時間分辨螢光衰減的問題是它的測量是複雜的並且需要昂貴的裝備。而且，它涉及所產生數據的髙度專業的計算機分析，其對於正確解釋可能是耗時的。因此，當希望快速決定治療過程而不是花費時間使用時間分辨螢光衰減以提供脂蛋白分析時，使用K-37時間分辨的螢光衰減以確定血液中脂質成分濃度對於臨床醫生具有嚴重的限制。因此，即使存在通過利用具有探針K-37的時間分辨螢光分析而有效確定樣品中特定脂蛋白濃度的方法，應當理解該方法具有許多限制。因此本發明實施方案的目的是用現有技術排除或減輕所述問題，並且提供用於確定樣品中脂蛋白濃度的改進方法。進一步的目的是提供用於實施所述方法的裝置。本發明人開發了基於使用K-37測量生物分子中脂蛋白的簡化測定。為了利用K-37螢光測量確定血樣中總脂蛋白(即HDL、LDL、和VLDL)的濃度，本發明人認識到將優選，來自結合到多種脂蛋白類別的探針物質的螢光應答必須基本上對於給定的總脂蛋白濃度，即總脂蛋白濃度是相同的，不考慮它的組成(即樣品中HDL丄DL:IDL:VLDL的比例)。因此，本發明人相信，將優選來自探針物質的螢光強度響應在脂蛋白分子的濃度範圍內也應當基本上是線性的，所述脂蛋白分子的濃度範圍是從臨床測試中將遇到的樣品所預期的。雖然本發明人不希望受限於任何假設，但是它們相信來自探針物質的螢光強度將取決於它對於樣品中特定脂蛋白分子(HDL、LDL、IDL或VLDL)的親合性，取決於脂蛋白分子絡合物內環境的螢光量子收率，以及還有由壓緊在一起的探針分子之間的能量傳遞所引起的螢光猝滅。因此，本發明人推斷，可以選擇適合的探針物質濃度，通過簡單的螢光測量，可以將所述探針物質用於進行總脂蛋白的精確測量。本發明人還認識到，與對於HDL具有更高親合性的VLDL和LDL相比，這樣一種濃度的探針將需要平衡HDL中K-37的更高量子收率，和因此在HDL內更高的猝滅程度，以在全部脂蛋白顆粒上產生恆定的螢光信號響應。本發明人因此進行一系列實驗(在實施例1中論述)以研究是否可以獲得探針物質K-37和各自脂蛋白顆粒類型(HDL、LDL和VLDL)的脂蛋白濃度之間跨越真實血清樣中遇到的脂蛋白濃度範圍的線性和相等的關係。令他們驚奇地是，他們發現存在K-37的限定濃度，在所述濃度在K-37螢光和脂蛋白濃度之間存在線性關係。根據本發明的第一個方面，提供確定在樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法，所述方法包含下列步驟-(i)將O.lmM-1.0mM探針物質K-37(如這裡所限定)加入到樣品的等分部分，所述探針物質結合至樣品中的脂蛋白，並且當其如此結合時在適當激發下發螢光；和(ii)利用螢光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。由術語"總脂蛋白"，我們指的是樣品中VLDL、HDL、LDL、IDL和乳糜微粒的共同濃度。有利地，在0.1-1.0mM濃度的K-37，可以更精確測定總脂蛋白濃度，因為意外地從所述方法步驟(ii)的螢光測量分析獲得相當小的信號失真。適合地，加入到樣品的K-37濃度可以在大約0.2-l.OmM之間，更適合地，在大約0.3-0.9mM之間，並且甚至更適合地在大約0.5-0.8mM之間。優選地，加入到樣品的K-37濃度在大約0.65-0.75mM之間。0.65mM的K-37是優選濃度並且特別優選的濃度是約0.7mM的K-37。因此，在優選實施方案中，將大約0.7mM的探針物質K-37加入到所述方法步驟(i)的樣品中以便進行根據本發明方法的步驟(ii)。本發明人已經發現0.65mM的K-37在許多試驗條件中是有用的，儘管當測定含有蛋白質的生物試樣時，0.7mM表示該探針的優選濃度。優選地，根據第一方面的方法包含在約400nm-500nm之間，並且更優選約420nm-480nm之間，並且甚至更優選約440nm-470nm之間的激發波長激發樣品。可以使用約450nm的特別優選的激發波長，儘管在約450-470nm之間任何波長的激發也是特別優選的。優選地，所述方法包含在約500-650nm之間，並且更優選約520nm-600nm之間的發射波長觀察螢光。可以使用約540nm(或更高)的特別優選的發射波長，在那裡，可以觀察到用於確定總脂蛋白濃度(即HDL、IDL、LDL和VLDL的濃度，如果存在，還有乳糜微粒)的最精確讀數。由術語"螢光分析"，我們指的是脂蛋白測定產物的螢光測量，通過首先激發樣品以致它發螢光，然後觀察所述螢光。樣品可以是需要知道其中總脂蛋白濃度的食品。優選地，所述樣品是可以從要測試的受試者獲得的生物樣品。所述樣品可以包含任何生物流體，例如，血漿或血清，或淋巴。特別優選的是所述樣品包含血清或血漿。本發明人認識到，如果他們能夠鑑別測試樣品中的各種脂蛋白，則可以進一步改善並且更詳細利用根據本發明產生的脂質分布。因此，本發明人研究了除K-37以外的探針物質的使用以觀察是否可以鑑別多種脂蛋白分子。他們驚奇地發現可獲得許多結合脂蛋白的染料，並且取決於結合的特定的脂蛋白它們顯示不同的螢光響應。用這些染料的螢光測量可以鑑別存在於樣品中的脂蛋白類型。這通過下列比較而進行，將由脂蛋白混合物中一種類型的脂蛋白所引起的增強的或減少的螢光與從校準曲線確定的另一個脂蛋白(不存在特定性質的脂蛋白)預期的螢光和由K-37測定給出的總脂蛋白含量的已知值進行比較。例如相比於其它脂蛋白諸如LDL和VLDL，螢光染料尼羅紅(NileRed)在HDL中顯示顯著更高的螢光。因此，本發明人認識到，可以將第二探針物質(例如尼羅紅，或對於特定脂蛋白顯示專一性、或螢光增強或減少的任何其它親脂性探針)用於鑑別樣品中的脂蛋白類別或亞類。在已經確定總脂質濃度以後，這是可能的。因此本發明的方法還可以包含利用第二探針通過特異於那個脂蛋白的染料螢光響應的移位，以確定脂蛋白的特定類別或亞類的濃度。可以將第二探針物質加入到樣品的第二等分樣品，其探針結合至脂蛋白的特定類別或亞類，並且當其結合時，其在適當激發下改變螢光收率，其指示脂蛋白特定類別或亞類的濃度。優選這個另外步驟包含在所述方法步驟(i)以後將探針尼羅紅加入到樣品的單獨等分樣品，以便測定樣品中的HDL。這詳細地描述在實施例3中。優選地，為了利用尼羅紅確定樣品中HDL濃度，必須對由於HDL存在而產生的來自尼羅紅的過量螢光進行計算。首先，通過K-37螢光與(如步驟(ii)確定的)脂蛋白濃度的直線相關而測量總脂蛋白濃度(測量"A")。第二，然後用多種濃度的LDL(和/或VLDL，因為螢光對於濃度的響應必須基本相同)校準尼羅紅螢光以獲得具有斜率"X"和截距"Y"的校正曲線。技術人員將知道如何製備LDL(和域VLDL)的濃度範圍，並且對於各自濃度確定各自的螢光。第三，然後對於一系列濃度的HDL和恆定濃度的LDL構建另外的校正曲線以產生斜率"Z"。第四，已知來自K-37測量的總脂蛋白濃度"A"和未知樣品的過量尼羅紅螢光"B"，未知樣品中HDL濃度"C"可以通過下列方程確定-C=(B-(AX-Y))/Z應當理解，在本發明的實施中，可以使用預先製備或標準的校正曲線。而且，為了產生脂質分布而開發的裝置(見下文)可以具有內標和/或具有將無需用戶幹涉而允許自動計算HDL水平的處理裝置裝置。因此，根據本發明的方法還可以包含利用螢光分析確定樣品中HDL濃度。所述方法包含另外步驟，其中將探針物質尼羅紅加入到樣品的第二等分部分，其探針結合至HDL及其它脂蛋白。在適當激發之下，與樣品中HDL濃度成比例，尼羅紅越來越強烈地發螢光。當在本發明方法中進行該另外的步驟時，可以產生更詳細的由總脂蛋白濃度、和HDL濃度組成的樣品脂蛋白分布，所述脂蛋白分布將對臨床醫生是非常有用的。本發明人進行一系列實驗以確定應該加入到樣品的尼羅紅最適濃度，以改善測定樣品HDL的準確度，並且這需要相當大的創造力。因此，加入到樣品的探針物質尼羅紅濃度可以在接近0.1-1mM之間。有利地，在該濃度的尼羅紅下，HDL濃度的更精確濃度測定是可能的。適合地，加入到樣品的尼羅紅濃度可以在大約0.1-0.9mM之間，更適合地在大約0.2-0.7mM之間，並且甚至更適合地，在大約0.3-0.6mM之間。特別優選的是將尼羅紅加入到樣品至終濃度約為0.4mM。優選通過在約400nm-650nm之間的激發波長激發樣品來誘導尼羅紅優選激發波長是400nm-650nm;優選在約420nm-620nm之間，更優選在約500nm-610nm之間，並且甚至更優選在約590nm-610nm之間。關於尼羅紅，可以使用約600nm的激發波長，當與另一個脂蛋白相比較時，來自HDL中尼羅紅的螢光響應之間提供最大的鑑別(5X)。當採用這些激發波長時，優選使用如下更詳細論述的封閉人血清清蛋白(HSA)上的"脂肪酸和藥物結合域"試劑。然後可以在約540-700nm之間並且更優選在約570-650nm之間的發射波長觀察並測量從尼羅紅得到的螢光。可以使用約620nm的優選發射波長，在所述發射波長可以觀察到用於確定HDL濃度的最準確讀數。本發明人研究了是否可以進一步改善根據本發明方法中使用的單獨測定的準確度，因此將他們的關注轉到人血清清蛋白(HSA)，其作為血清的主要組分，具有大約30-50mg/ml的濃度。已知HSA具有至少兩個類型的能結合多種配體的結合位點。第一類型在這裡指的是"疏水性域"，而第二類型的域在這裡指的是"藥物結合域"。這些域是本領域技術人員已知的並且在NatureStructuralBiology(V5p827(1998))的論文中相互不同。該論文將疏水性域確定為脂肪酸可以結合的域，而所述藥物結合域能夠結合許多可以與HSA締合的藥物。從他們的實驗，本發明人意外地確定，探針物質K-37和尼羅紅可以獨立地都結合至HSA的疏水性結合位點/域。因此，K-37和尼羅紅都是HSA的配體。另外，意外地是，本發明人發現當結合到HSA時，K-37和尼羅紅髮螢光。因此，雖然本發明人不希望受限於任何假設，但是本發明人相信當結合至HSA時該另外的K-37螢光可以引起實質的背景信號，其可以失真並在根據本發明的方法的步驟(ii)中的總脂蛋白濃度測定中產生顯著誤差。類似地，本發明人相信當結合至HSA時，該另外的尼羅紅螢光可以引起實質的背景信號，其可以失真並且當該另外步驟用於根據本發明的方法時在HDL濃度測定中產生顯著誤差。結果，本發明人研究了抑制配體K-37和配體尼羅紅與HSA結合的影響。特別是，他們嘗試封閉HSA的疏水性結合位點，在所述位點探針K-37和尼羅紅結合併發螢光。該工作描述在實施例3和4中。雖然本發明人不希望受限於任何假設，但是出乎他們的預料，他們發現，當結合至所述脂蛋白分子(HDL、LDL、VLDL)時，抑制所述配體K-37與疏水性結合位點的結合導致探針物質的螢光，相比於如果不添加配體結合抑制劑，這是樣品中總脂蛋白濃度的更精確測量。本發明人也發現抑制配體尼羅紅與HSA的結合改善HDL測定的準確度。因此，優選根據本發明的方法包含將配體結合抑制劑加入到樣品，所述配體結合抑制劑適合於基本上抑制所述探針物質(K-37和/或尼羅紅)對於HSA並且優選其疏水性結合位點的結合。特別優選的是，在如步驟(i)之前或同時，也將配體結合抑制劑加入到樣品。也優選的是，將所述抑制劑加入到尼羅紅所加入的單獨等分部分，用於進行HDL測定。所述配體結合抑制劑可以是疏水性的。所述抑制劑可以是兩親性的(amphipathic)。配體結合抑制劑可以包含脂肪酸或其功能衍生物，以及其它疏水性分子。可以封閉HSA疏水性結合位點的適合的脂肪酸衍生物實例可以包含脂肪酸、它的酯、醯基滷化物、羧酸酐、或醯胺等。優選的脂肪酸衍生物是脂肪酸酯。脂肪酸或其衍生物可以包含C,-C2。脂肪酸或其衍生物。優選所述脂肪酸或其衍生物可以包含C3-C,8脂肪酸或其衍生物，更優選，C5-C,4脂肪酸或其衍生物，並且甚至更優選，CVC9脂肪酸或其衍生物。特別優選的是，所述配體結合抑制劑包含辛酸(C8)或其衍生物，例如，辛酸鹽(酯)。優選地，將所述配體結合抑制劑作為鹼金屬辛酸鹽加入，優選I族的鹼金屬辛酸鹽，例如，辛酸鈉或辛酸鉀。優選地，在進行所述方法的步驟(i)之前，將約10-400mM之間，更優選約20-200mM之間，並且甚至更優選約50-150mM之間的配體結合抑制劑加入到樣品。特別優選的是，加入約100mM的抑制劑。因此，在所述方法的優選實施方案中，可以在進行步驟(i)以前或同時將約100mM的辛酸鈉加入到樣品。當本發明的方法也延伸至尼羅紅的用途時，優選將約10-400mM之間，更優選約20-200mM之間，並且甚至更優選約50-150mM之間的配體結合抑制劑加入到樣品。最優選的是使用約lOOmM的抑制劑。因此，在所述方法的優選實施方案中，優選在加入尼羅紅之前或同時，將約100mM的辛酸鈉加入到樣品，並進行根據所述方法的HDL測定。在本發明的優選實施方案中，將配體結合抑制劑，例如，約100mM辛酸鈉和大約0.7mM的K-37探針首先加入到取自所述樣品的第一等分部分，之後進行所述方法步驟(i)中總脂蛋白濃度的螢光測量。在另一個實施方案中，將配體結合抑制劑，例如，約100mM辛酸鈉與大約0.4mM的尼羅紅探針首先加入到另一份等分部分，之後進行所述方法中的HDL濃度螢光測量。有利地，與確定濃度的K-37探針組合的配體結合抑制劑導致獲得高度精確的總脂蛋白測量(以及當加入尼羅紅探針時的HDL濃度)。實施例1和3說明染料K37的螢光測量如何可以用於確定樣品中總脂蛋白濃度，以及尼羅紅螢光測量如何可以用於確定樣品中HDL濃度。所述實施例也描述了用配體結合抑制劑封閉HSA以便優化由K-37或尼羅紅螢光產生的結果的準確度。因此，本發明人認識到，可以發生單一平行方法用於分析脂蛋白組成。因此，優選方法由兩個測定(總脂蛋白和HDL)組成，其幾乎立刻產生結果。臨床醫生可以使用該信息以決定某一治療過程。本發明人另外發現了尼羅紅也與以上涉及的HSA上的藥物結合域相互作用。該藥物結合域的配體包括藥物分子諸如甲狀腺素、布洛芬、安定、甾類激素和它們的衍生物(藥物)、血紅素、膽紅素、親脂性前藥、丙酮節羥香豆素(warfarin)、基於香豆素的藥物、麻醉藥、安定、布洛芬和抗抑鬱藥(例如硫代黃嘌呤(thioxanthine》。本發明人發現了試劑可以用於封閉該藥物結合域而且這導致用尼羅紅的測定結果的進一步改善。上述藥物，或對於該域具有親合性的任何其它分子可以用作封閉HSA的藥物結合域用的試劑。然而最優選的是，將苯甲酸或其衍生物(例如三氯苯甲酸或三碘苯甲酸)用於封閉所述藥物結合域。因此，本發明的最優選實施方案可以包含從患者取血樣，然後從所述血細胞分離血清。這可以通過已知技術實現，諸如過濾或離心。然後可以將血漿分成兩個等分部分，將每個進行生化分析以確定脂質成分的濃度。第一等分部分可以用於確定樣品中總脂蛋白濃度；第二等分部分可以在知道樣品中總脂蛋白時用於確定樣品中HDL濃度。可以將HSA配體結合抑制劑如辛酸鈉加入到第一等分部分。優選也將探針K37加入到步驟(i)中的第一等分部分，優選至終濃度約為0.7mM。然後可以在接近450nm激發第一等分部分以便引起所述探針發螢光。然後可以在540nm或以上的發射波長測量所述螢光。由此值，然後可以確定樣品中的總脂蛋白(HDL、LDL、IDL禾QVLDL，並且如果存在還有乳糜微滴)的濃度。可以將HSA配體結合抑制劑例如辛酸鈉加入到第二等分部分至終濃度約為100mM。也可以加入將結合到HSA藥物結合域的試劑諸如苯甲酸至l-10mM或更多，具體而言是約5mM的濃度。然後可以加入探針尼羅紅至約0.4mM的終濃度。然後可以在大約600nm激發該樣品以便引起所述探針發螢光。可以在大約620nm的發射波長測量所述螢光，並且由此值然後可以如實施例3中所述確定樣品中HDL濃度。在本發明的最優選實施方案中，所述方法可以包含(A)將100mM辛酸鈉(配體結合抑制劑)與大約0.7mM的K-37探針加入到取自生物樣品的第一等分部分；在大約450nm激發；並且在大約540nm的發射波長進行所述方法步驟(i)中總脂蛋白濃度的螢光測量；和(B)將100mM辛酸鈉(配體結合抑制劑)和5mM苯甲酸鈉(封閉HSA藥物結合域的試劑)與大約0.4mM的尼羅紅探針加入到取自所述樣品的第二等分部分；在大約600nm激發；並且在大約620nm的發射波長進行螢光測量以確定HDL濃度；和(C)根據本發明方法的步驟(ii)計算總脂蛋白濃度以及HDL濃度。另外，為了開發根據第一方面的方法，本發明人也開發了用於進行所述方法的裝置。因此，根據本發明的第二方面，提供用於確定樣品中總脂蛋白濃度的裝置，所述裝置包含用於進行脂蛋白測定的反應儲器；適合於含有根據第一方面方法所需試劑的容納裝置；可操作用於激發樣品以便它發螢光的激發裝置，和可操作用於檢測由樣品所發射螢光的檢測裝置。優選所述裝置包含用於混合反應儲器中樣品和試劑的裝置。優選地，所述裝置包含許多類型的儲器。第一類型的儲器可以是用於含有樣品並且在這裡稱為樣品儲器。所述反應儲器可以是第二類型的儲器，其中可以進行確定樣品中脂蛋白濃度的測定(在引入樣品和試劑之後)。所述裝置可以包含單一反應儲器並且可以在不同樣品等分部分的反應之間清洗。備選地，可以將多個(例如單一應用)的反應儲器與激發裝置接觸。所述容納裝置可以包含第三儲器(第一試劑儲器)，其含有K-37染料及其它用於總脂蛋白測定的試劑(例如配體結合抑制劑)。當要確定HDL(例如利用尼羅紅)時，所述容納裝置可以包含第四儲器(第二試劑儲器)，所述第四儲器含有尼羅紅染料及其它用於確定HDL的試劑(例如配體結合抑制劑和用於封閉HSA藥物結合域的試劑)。備選地，可以將K-37試劑和尼羅紅試劑包括在單獨的容納裝置中。因此用於K-37測定的試劑可以在第一容納裝置中的第一試劑儲器之內，並且用於尼羅紅測定的試劑可以在第二容納裝置中的第二試劑儲器之內。優選安排所述反應儲器以便可以將其與激發裝置進行光學接觸。優選安排所述反應儲器，以致從所述測定產生的螢光可以由檢測裝置檢測。應當理解，在一些實施方案中，可以設計所述裝置以致可以將樣品直接引入到所述反應儲器。這將排除對第一或樣品儲器的需要。在優選實施方案中，第一試劑儲器在適合的稀釋劑中含有探針物質K-37，並且還可以含有HSA配體結合抑制劑例如辛酸鈉。第二試劑儲器可以包含探針物質尼羅紅並且任選包含HSA配體結合抑制劑，例如，辛酸鈉，並且也任選包含用於封閉HSA藥物結合域的試劑諸如苯甲酸。所述裝置可以包含閱讀器，並優選地，包含適於放在與之功能通信的盒。優選地，可以將所述盒插入到，或結合到所述閱讀器。所述閱讀器可以包含其中可以插入所述盒的對接裝置。所述對接裝置可以是槽。因此，優選地，可以從所述閱讀器除去所述盒。所述盒可以包含或各自包含容納裝置和反應以及樣品儲器(如果存在)。因此，一旦已經排空所述試劑，可以從閱讀器除去攜帶測定試劑的盒，並且用含有新的測定試劑的新盒替換。應當理解，可以將自身包含的盒(包含全部儲器)容易地用作單一用途的反應盒。可以簡單地從所述閱讀器除去盒並用包含試劑的新盒替換，並且可以將樣品配置到所述盒之內的反應儲器中。閱讀器可以包含激發裝置並且優選包含檢測裝置。優選地，所述裝置包含適合於基於檢測的螢光而確定樣品中總脂蛋白濃度的處理裝置。在優選實施方案中，所述處理裝置也適合於基於螢光分析而確定樣品中HDL的濃度。所述處理裝置可以適合於以總脂蛋白和HDL的濃度為基礎計算樣品中的LDL、VLDL和IDL濃度。所述裝置可以包含用於顯示樣品中總脂蛋白濃度並且優選HDL濃度的顯示裝置，優選作為讀數(read-out)。例如，所述顯示裝置可以包含LCD屏幕，或者可以依賴於計算機以驅動和/或計算和/或顯示。優選地，所述裝置是便攜的，並且可以用於通過在那裡取樣而產生患者的脂蛋白分布。所述樣品可以是任何生物流體，例如，血液、血清、淋巴等。優選地，所述激發裝置包含照明源，可操作用於在大約400nm-500nm照亮所述樣品(用於K-37測定)，並且對於尼羅紅測定的優選實施方案，在大約600nm。因此優選所述光源能夠在約400nm-600nm之間照亮所述樣品。照明源可以包含燈泡或者一個或多個LEDs並且可以利用450nm幹涉濾波器和600nm的幹涉濾波器改變激發波長。所述激發裝置可以包含極化裝置，可操作用於極化由照明源產生的光。所述激發裝置可以包含適合於將光聚焦在樣品上的聚焦裝置。所述聚焦裝置可以包含透鏡。優選地，所述檢測裝置包含光電二極體或光電倍增管，其優選是黃色-紅色敏感的。由樣品發射的螢光優選在大約500nm-650nm檢測，並且更優選在540nm和更長的波長用於K-37測定。檢測裝置能檢測在620nm發射的螢光用於包括尼羅紅的測定。所述螢光可以用第二透鏡收集，並且可以經過起偏振器。可以用截止濾波器除去散射的激發光。為了測量螢光強度，來自光電二極體的電流或來自光電倍增管的計數速率可以從安培計、伏特計或速率表模塊讀出。在一個實施方案中，所述裝置可以包含適合於接收兩個(或更多)盒的閱讀器。這樣一種閱讀器可以包含兩個(或更多)激發裝置，所述激發裝置可以與每個反應儲器對齊。另外，所述裝置可以包含用於每個反應儲器的檢測裝置。所述裝置也可以包含激發校正系統以便可以解釋光源的波動。所述裝置可以包含至少一個螢光標準，以在確定脂蛋白濃度之前用於校準。所述標準可以是內標。因此，將所述裝置配置成當所述盒進入閱讀器時或其後一段時間，同時或依次檢測並測量每個測定的螢光強度，從而產生由總脂蛋白濃度和HDL濃度組成的脂蛋白分布。有利地，根據第二方面的裝置可以用於進行快速和容易的測定，其可以同時進行以產生來自生物流體的脂蛋白分布。然後，具有脂蛋白和HDL濃度知識的臨床醫生可以決定有效的治療過程。另外，所述裝置是便攜的並且可以由出診的GPs或護士使用，或者甚至作為家用測試試劑盒。描述於此的全部特徵(包括任何伴隨的權利要求、摘要和附圖)，和/或如此公開的任何方法或過程的全部步驟，可以以任何組合與任何以上方面相結合，其中至少一些這樣特徵和/或步驟是相互排他的組合除外。為了更好理解本發明，並且為了顯示本發明實施方案如何可以起作用，經由實例，現在將對附圖進行參考，其中-圖1是顯示如實施例1中涉及的在HDL中三個濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度的曲線圖；圖2是顯示如實施例1中涉及的在LDL中三個濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度的曲線圖；圖3是顯示如實施例1中涉及的在VLDL中三個濃度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度的曲線圖；圖4是顯示如實施例1中涉及的HDL、LDL和VLDL中的0.4mM的K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度的曲線圖；圖5是顯示如實施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.65mM的K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度曲線圖；圖6是顯示如實施例1中涉及的HDL、LDL、和VLDL中0.9mM的K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度曲線圖；圖7是顯示如實施例1中涉及的一系列HDL、LDL、禾卩VLDL混合物中0.65mM的K-37的相對於總脂質濃度的螢光強度曲線圖；圖8顯示如說明書和實施例3中所涉及的染料尼羅紅的結構；圖9是如實施例3中所涉及的相對於螢光強度的LDL濃度校正曲線；圖10是如實施例3中所涉及的相對於HDL濃度的過量螢光的校正曲線；圖11是顯示如實施例3中所涉及的相對於HDL濃度的誤差曲線圖；圖12顯示如實施例5中涉及的根據本發明的盒的實施方案的示意性視圖；圖13顯示如實施例5中涉及的根據本發明的閱讀器的實施方案的透視圖；圖14顯示如實施例5中所涉及的插入到所述閱讀器中的盒的主視圖；圖15是說明如實施例6中涉及的相對於HDL濃度的尼羅紅螢光(ex460nm和em620nm)的曲線圖；圖16是說明如實施例6中涉及的相對於HDL濃度的尼羅紅螢光(ex600nm和em620nm)的曲線圖;禾口圖17是說明在HDL(+辛酸鹽)或HSA(+辛酸鹽)存在下在460nm和600nm的激發波長的尼羅紅螢光光譜分析的曲線圖。本發明人進行一系列實驗以便研究螢光探針對於確定樣品中總脂蛋白以及HDL濃度的用途，以便產生患者的脂蛋白分布。患者脂蛋白分布的知識，在幫助臨床醫生決定特定的治療過程中是有利的。然後將描述在下列實施例中的這些實驗的結果用於開發根據本發明的方法和裝置。實施例1-總脂蛋白濃度的測量本發明人研究了螢光染料K-37對於檢測一系列樣品中的總脂蛋白濃度(其等於總甘油三酯加上膽固醇加上膽固醇酯，因為假設全部脂質結合到脂蛋白)的應用。染料K-37對於技術人員是已知的，並且是容易利用的。首先將所述染料在確定波長激發，然後在如下所述的另一個確定波長測量螢光。將螢光強度用於計算樣品中總脂蛋白濃度(即根據本發明的方法的步驟(ii))。方法將溶解在二甲基甲醯胺(DMF)中的染料K-37以不同濃度範圍加入到一個濃度系列的溶解在磷酸鹽緩衝液中的HDL、LDL、和VLDL。實驗的目的是對於每個顆粒類型(HDL、LDL、和VLDL)在將要在真實血漿或血清樣品中遇到的脂蛋白濃度範圍內獲得螢光和脂蛋白濃度之間的線性和相等關係。在Perkin-ElmerLS50螢光計中在450nm的激發波長和540nm的發射波長測量螢光強度。結果圖1至3說明磷酸鹽緩衝液中HDL、LDL、和VLDL中的K-37在三個濃度即0.4mM、0.65mM、和0.9mM的螢光強度對總脂蛋白濃度。對於線性擬合至每個系列(在頂部的0.4mM、在中央的0.65mM和在下面的0.9mM)顯示W值。相同數據也繪製在圖4至6中，並且由K-37濃度分組。來自實驗的結論是1)對於全部三個脂蛋白顆粒類型(HDL、LDL、禾PVLDL)，R2顯示在K-37濃度為0.65mM的總脂蛋白濃度和螢光強度之間存在良好的線性關係。對於LDL和VLDL中的0.9mM的K-37也觀察到良好的線性關係，但是在HDL中0.9mM的K-37的線性度不太好。對於具有0.4mM的K-37的全部脂蛋白，線性度是不良的。值得注意的是，雖然它在線性度不良的濃度仍起作用，但是它是不準確的。然而，可以利用多項式擬合處理非線性度。2)認為影響線性度的兩個因素。在低染料濃度，在高總脂蛋白濃度下存在響應的平化。雖然本發明人不希望受限於任何假設，但是他們相信這因為存在可用於充分佔據所述脂蛋白顆粒的染料不足而發生。在高染料濃度，隨著低的總脂蛋白濃度存在一個平面響應。這是當所述染料非常接近地充滿在所述顆粒中時由螢光的自猝滅所引起的。3)當在磷酸鹽緩衝液中測量時，0.65mM的K-37濃度對於跨越適當範圍的全部脂蛋白顆粒類型給出了線性的和非常類似的螢光響應。因此，然後將0.65mM的K-37加入到一系列HDL/LDL/VLDL混合物，如上所述測量螢光強度。所述數據圖解在圖7中。如圖可以看出，總脂蛋白濃度與螢光強度是高度相關的(R、0.9983)，證實該濃度的K-37(0.65mM)適於總脂蛋白濃度的高度精確的測量。當將這個應用到來自患者的生物樣品時，本發明人在高脂質濃度觀察到一些彎曲。因而，選擇0.7mM濃度的K-37作為血清或血漿中使用的最理想的K-37濃度。因此，選擇該濃度作為根據本發明方法所用的最適濃度。實施例2-HSA的封閉然後本發明人進行了優化根據本發明的方法的進一步研究。到最後，他們認識到HSA具有K-37結合併發螢光的疏水性結合位點。當結合至HSA時K-37的這個另外的螢光引起實質的背景信號，其失真並從而引起脂蛋白分子即HDL、LDL和VLDL測量中的顯著誤差。他們因此決定用配體結合抑制劑諸如辛酸鈉封閉HSA上的疏水性結合位點，以觀察是否可以將另外的螢光最小化。設想，以這種方法抑制K-37與HSA的結合將改善利用K-37螢光測量獲得的結果的準確度。在50mg/mlHSA存在或不存在下，將染料K37以0.5mM的濃度加入到總脂質濃度為5mM的LDL。在有和沒有加入0.1M辛酸鈉的情況下進行測量，所述辛酸鈉作為配體結合抑制劑。腿對於全部樣品測量螢光強度並概況在下面的表中:tableseeoriginaldocumentpage19所述結果顯示單獨LDL中的K-37的螢光強度是213500單位。當辛酸鹽加入到LDL時K-37的螢光強度是209700單位(即與無辛酸鹽的情況大致相同)，認為辛酸鹽的存在未有助於獨自結合到LDL的K-37的螢光強度。結合到HSA的K-37的螢光強度是79300單位，然而在HSA和辛酸鹽存在下K-37的螢光強度是3600。這說明HSA有助於K-37螢光並且因此有助於幹涉信號。辛酸鹽的加入顯著減少所述幹涉並從而消除HSA的破裂作用。所述結果因此顯示在辛酸鹽存在下HSA大量抑制K-37的螢光強度，但是對於LDL中的K37螢光的影響小。這顯示辛酸鹽在封閉HSA上的K-37結合位點方面是顯著成功的，使K-37螢光成為總脂蛋白濃度的因此，本發明人相信可以將結合HSA疏水性結合位點的配體結合抑制劑諸如辛酸鹽在測量K-37螢光之前加入到血樣以改善總脂蛋白濃度的準確性。另外，本發明人認為該技術還可以用於封閉其它配體對於HSA疏水性結合位點的結合，並且用於代替可能己經結合於此的配體，並且所述配體比辛酸鹽具有更低的對HSA的親合性。在該工作之後，本發明人發現0.65mM的K-37和100mM的辛酸鹽是最佳的。實施例3-HDL的測量然後本發明人研究了是否可以鑑別血樣中存在的不同類型脂蛋白。因此，他們測試了利用除K-37以外的螢光探針例如尼羅紅的功效，以考察是否可以鑑別脂蛋白類型。令他們意外的是，他們發現通過利用尼羅紅代替K-37，可以確定血樣中HDL的濃度。力7去測量的原則是探針尼羅紅在HDL中比在LDL和VLDL中更有螢光性，後者具有非常類似但是不同的隨濃度的螢光響應。尼羅紅的結構圖解在圖8中。對於總脂蛋白，所述測量比K-37測量更複雜，因為必須對來自HDL中尼羅紅的過量螢光進行計算，而不僅僅是全部脂蛋白的總螢光。程序如下-1)校準將溶解在二甲基甲醯胺中的0.5mM尼羅紅以通常在4和10mM之間的多種總脂蛋白濃度與LDL混合(一般地，將50微升染料與50微升脂蛋白和lml磷酸鹽緩衝液混合)。將樣品放在螢光計中並測量螢光強度(激發波長450nm，發射波長600nm)。將螢光強度相對於LDL總脂質濃度繪圖，給出了具有斜率"X"和截距"Y"的校準直線，如圖9中所示。然後對於LDL和HDL的混合物重複所述程序。將HDL以0和3.0mM之間的濃度加入，加入LDL而對於全部樣品將總脂蛋白濃度保持在6mM(但是3-12mM將是界限)。然後測量這些樣品的螢光強度。然後對由於HDL存在而產生的過量螢光進行繪圖，給出了具有斜率"Z"的校準直線，如圖IO中圖解。2)未知物的測量在研究下，將溶解在二甲基甲醯胺中的0.5mM尼羅紅與樣品混合。在對於上述校準的相同條件下，將樣品放入螢光計中並測量螢光強度。3)HDL濃度的計算HDL的計算需要知道總脂蛋白濃度"A"，其可以例如但非排他地從K-37的螢光強度測量。對於特定的樣品，將要預期是否樣品不包含HDL的螢光強度是從顯示在圖10中的校準線獲得的。測量的螢光強度減去該計算的螢光強度而得到由於樣品中存在的HDL而產生的過量螢光。然後可以利用圖10中所示的校正線和下列等式獲得未知樣品中的HDL濃度"C":-C=(B-(AX-Y))/Z製備HDL/LDL/VLDL混合物的濃度範圍，意欲包括在實際臨床樣品中將預期的濃度範圍。將上面論述的校準數據用於計算來自所述混合物的HDL濃度。圖11圖解了真實HDL濃度和從尼羅紅螢光確定的HDL濃度之間的誤差，顯示最大誤差僅為大約0.15mM。本發明人還推敲了供血清樣品之用的尼羅紅濃度是0.4mM。作為這些數據結果，本發明人已經顯示可以鑑別存在於樣品中的脂蛋白類型，並且可以利用染料尼羅紅確定HDL濃度。在實施例2中描述的發現之後，關注於加入辛酸鹽以封閉HSA的疏水性結合位點，本發明人然後觀察到，尼羅紅也結合到HSA並且發螢光。當結合到HSA時，尼羅紅的這個另外螢光也引起實質的背景信號，其失真並從而引起HDL測量中的顯著誤差。他們因此決定用如用於K-37封閉的相同配體結合抑制劑即辛酸鈉封閉HSA中的疏水性結合位點。用尼羅紅和HSA進行的實驗是基於實施例2中所論述的那些，並且全部利用0.5mM尼羅紅。表2樣品螢光強度尼羅紅加5mMLDL187.532尼羅紅加50mg/mlHSA58.905尼羅紅加5mMLDL+50mM辛酸鹽183.786尼羅紅加50mg/mlHSA+50mM辛酸鹽9.118PBS+50mM辛酸鹽7.382表2中表示的結果顯示，單獨在LDL中的尼羅紅的螢光強度是187.532單位。當辛酸鹽加入到LDL時尼羅紅的螢光強度是183.786單位(即與無辛酸鹽的情況大致相同)，認為辛酸鹽的存在未有助於獨自結合到LDL的K-37的螢光強度。結合到HSA的尼羅紅的螢光強度是58.905單位，而在HSA和辛酸鹽存在下的尼羅紅螢光強度是9.118。這說明HSA有助於尼羅紅螢光並且因此有助於幹涉信號。辛酸鹽的加入顯著減少所述幹涉並從而消除HSA的破裂作用。所述結果因此顯示尼羅紅與HSA在辛酸鹽存在下大量抑制螢光強度，但是對於LDL中的尼羅紅螢光的影響小。這顯示，辛酸鹽在封閉HSA上的尼羅紅結合位點是顯著成功的，使尼羅紅螢光成為脂蛋白濃度的真實測量。因此，本發明人相信可以將擬合HSA疏水性結合位點的配體結合抑制劑諸如辛酸鹽在測量尼羅紅螢光之前加入到血樣以改善脂蛋白(HDL)濃度的準確性。在該工作之後，本發明人發現0.4mM尼羅紅和50mM或更優選約100mM的辛酸鹽對於血清樣品的分析是最佳的。實施例6描述了其中可以通過添加結合至HSA藥物結合域的試劑(例如苯甲酸)而進一步改善尼羅紅的螢光測量的進一步開發工作。實施例4-產生脂蛋白分布的同時測定實施例1和3說明染料K37的螢光測量如何可以用於確定樣品中總脂蛋白濃度，和尼羅紅的螢光測量如何可以用於確定樣品中HDL濃度。實施例2描述了封閉HSA以改善由K-37螢光產生的結果的準確度。因此，本發明人認識到，可以產生單一平行方法用於分析患者血樣的脂質組成以便產生該患者的脂蛋白分布。優選方法由兩個測定組成，都可以在非常類似的條件下進行，並且由此，可以非常迅速地產生結果。臨床醫生可以使用該信息以決定治療過程。方法最初從患者取血樣，然後利用充分建立的常規方法離心以便分離血清。然後將血清分成兩個1ml的等分部分(a&b)，將每個進行生物化學分析以確定脂質成分的濃度。將等分部分(a)用於確定總脂蛋白濃度；並且將等分部分(b)用於確定HDL濃度，如下所述。等分部分(a)-將HSA配體結合抑制劑辛酸鈉加入到1ml血清至100mM的濃度，如上面實施例2中所描述。然後將溶解在二甲基甲醯胺(DMF)中的探針K-37在攪拌下緩慢加入到樣品至0.7mM的終濃度。然後在約450nm激發樣品以便引起所述探針發螢光。在上述520nm或540nm的發射波長測量所述螢光，並且然後由此值可以確定樣品中總脂蛋白(HDL、LDL、和VLDL)的濃度，如上面實施例l中所描述。等分部分(b)-將HSA配體結合抑制劑辛酸鈉加入到1ml血清至50mM或100mM的濃度，如上面實施例3中所描述。此外，可以將苯甲酸加入到所述血清至5mM的濃度。然後在攪拌之下緩慢將探針尼羅紅加入到樣品至0.4mM的終濃度。然後在600nm激發樣品以便引起所述探針發螢光。在620nm的發射波長測量所述螢光，並且然後由此值可以確定樣品中HDL濃度，如上面實施例3中所描述。實施例5-用於產生脂蛋白分布的裝置關於圖12-14，顯示了由本發明人開發的便攜裝置，其可用於產生患者的脂蛋白分布。所述裝置由詳細顯示在圖12中的盒1和顯示在圖13和14中的閱讀器50組成。盒1具有一系列互連的儲器，沿著所述儲器流體可以流動，以便進行根據本發明的測定。盒1經由縫52插入到閱讀器50用於對盒1中進行的這些測定的每一個檢測和測量螢光強度。關於圖12，盒1具有樣品儲器2，其中包含取自患者的生物流體諸如血液。提供過濾器18，用於從血液除去血細胞，留下淋巴或血清或其它體液，用其進行所述測定。將所述流體分成兩個等分部分(a和b，如實施例4屮所述)，並沿著通道分別推進到反應儲器4、8中。將分別含有K-37和辛酸鈉的兩個試劑儲器10、12連接到反應儲器4(等分部分(a))。將染料和辛酸鹽推進到反應儲器4中並啟動總脂蛋白測定。將分別含有尼羅紅；和辛酸鈉+任選苯甲酸的兩個試劑儲器16、17連接到反應儲器8(等分部分(b))。將尼羅紅和辛酸鹽推進到儲器8中，與所述流體混合，並啟動HDL測定。應當理解，可以使一個含有辛酸鈉的一個試劑儲器代替兩個儲器12、17，並且可以將辛酸鹽從這一個儲器根據需要進料到反應儲器4、8。所述盒也包括螢光標準20、24，可以將其分別用於校準閱讀器50。在所述裝置(即盒1和閱讀器50)的一個實施方案中，所述兩個測定在反應儲器4,8中進行。將盒1插入到閱讀器50前面的縫52，如圖13所示。將盒1開槽到閱讀器50中，引起兩個反應儲器4、8與存在於閱讀器50中的相應的激發裝置(光源30、34)以及相應的檢測裝置(光電二極體36、40)各自對齊。在另一個實施方案中，閱讀器50可以僅具有一個光源或LED，代替用於每個儲器4、8的單獨LEDs。LEDs(或來自LED的波導管P0、34每個為相應的測定提供需要的螢光激發照明用於使各自的測定發螢光。來自LEDs30、34的每一個光波長大約在450-470nm，並且對於一些測定實施方案也可以是大約600nm。所述光可以經過450nm或600nm的幹涉濾波器(未顯示)，之後將其定向到反應儲器4、8。閱讀器50可以具有激發校正系統46。因此，將兩個測定(a和b)的螢光用透鏡或類似的收集光學器件收集，並且對於測定a(總脂蛋白)可以在540nm的波長和對於測定b(HDL)在約600nm或620nm的波長經過起偏振器。備選地，可以將普通的起偏振器用於這兩個測定。為了測量螢光強度，光電二極體36、40的電流輸出放大並讀出為電流或電壓。因此，將閱讀器50配置成保持盒1以檢測並測量兩個測定的每一個的螢光強度，從而確定總脂蛋白和HDL濃度。在一個實施方案中，所述裝置具有LCD讀數顯示42，在其上顯示每一血液組分的濃度。在另一個實施方案，所述閱讀器50可以由PC的USB埠、可攜式電腦、PDA26提供動力並且具有通過其提供的它的讀數，使臨床醫生讀出關於脂蛋白濃度信息。備選地，所述裝置可以包含所述盒和測量儀器的兩個方面並且包含可以計算每一脂質組分本身濃度的微處理器44。所述盒1和閱讀器裝置50的優勢在於快速並容易的測定系統，其可以同時進行以產生來自生物流體的脂蛋白分布。然後臨床醫生可以決定有效的治療過程。所述盒l是可任意使用的並且可以便宜地製造，準備有用於兩個測定的試劑。實施例6:根據本發明測定的進一步優化在人血清樣品上進行進一步測試以研究用於誘導根據本發明方法的指示HDL水平的螢光的最佳激發波長。本發明人測試了許多波長並且確定，當利用尼羅紅時，600nm的激發波長和620nm的發射波長提供最佳結果(參見圖15)。令本發明人意外的是，該激發波長是最佳的，因為它達到所述光譜的非常長波長的邊緣。對於某些樣品，本發明人觀察到具有460nm激發波長和620nm發射波長的更有噪聲(noisier)的圖(參見圖16)。本發明人相信，當在600nm激發時，尼羅紅在HDL中比VLDL和LDL多發約5倍的螢光，與之相反，在460nm激發時，在那裡它僅多發約2倍的螢光。當從LDL加VLDL的標準曲線減去時，這為噪聲提供了更好的信號。雖然本發明人不希望受限於任何假設，但是他們相信在460nm激發時在血清樣品中觀察到的"噪聲"是信噪比的效應。本發明人注意到尼羅紅結合至HSA並且特別是在低脂質濃度。他們因此在HDL(+辛酸鹽)或HSA(+辛酸鹽)存在下都在460nm和600nm的激發波長進行尼羅紅螢光的光譜分析(參見圖17)。這些實驗產生出乎意料的光譜行為，本發明人相信這可以由下列事實解釋，即尼羅紅是在剛性的但是(but)極性的環境(HAS上結合位點)中，並且尼羅紅顯示扭曲的分子內電荷傳遞(TICT)(Joumalof激發和發射頻變至更長的波長。在這激發狀態中的分子具有不同的偶極矩並且因此表現類似一個不同的種。在600nm激發時，由於與其它脂蛋白相比較的HDL中尼羅紅之間超過TICT狀態激發補償的較大信號差異，產生更好的信噪比，因為TICT螢光是通過620nm發射波長設置排除的。換言之，雖然本發明人在600nm更理想地激發HSA/尼羅紅，但是它的螢光受到儀器拒絕。這引導本發明人認識到，通過利用另外封閉劑可以進一步改進HDL/尼羅紅測定。他們嘗試封閉HSA藥物結合域的試劑。令他們意外的是，他們發現大約5mM的試劑諸如苯甲酸以及它的三氯和三碘衍生物全部對於從HSA置換尼羅紅起作用，而不影響脂蛋白發螢光。苯甲酸具有猝滅溶液中尼羅紅殘留螢光約20%的附加優點。權利要求1.確定樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法，所述方法包含下列步驟-(i)將0.2mM-1.0mM探針物質K-37(此處定義)加入到樣品的第一等分部分，所述探針物質結合樣品中的脂蛋白，並且當其如此結合時在適當激發下發螢光；和(ii)利用螢光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。2.根據權利要求1的方法，其中加入到第一等分部分的K-37濃度在大約0.5-0.85mM之間。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述方法包含將配體結合抑制劑加入到第一等分部分，所述配體結合抑制劑適合於基本上抑制所述探針物質與人血清白蛋白上的疏水性結合域的結合，之後確定脂蛋白或HDL濃度。4.根據權利要求3的方法，其中所述配體結合抑制劑包含脂肪酸或其功能衍生物。5.根據權利要求3或權利要求4的方法，其中所述配體結合抑制劑包含辛酸(Cs)或其衍生物，例如，辛酸鹽(酯)。6.根據前述權利要求任一項的方法，其中，對於每個步驟，通過在400nm-650nm的激發波長激發第一等分部分來誘導螢光，並且在約540nm-700nm之間的發射波長測量得到的螢光。7.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述方法還包含確定脂蛋白特定類別或亞類濃度的步驟。8.根據權利要求7的方法，其中將第二探針物質加入到樣品的第二等分部分；其中第二探針結合脂蛋白的特定類別或亞類，以致當與它們結合時所述第二探針在適當激發之下改變螢光產率；並且該螢光指示脂蛋白特定類別或亞類的濃度。9.根據權利要求8的方法，其中脂蛋白的類別或亞類是HDL。10.根據權利要求9的方法，其中第二探針物質是尼羅紅。11.根據權利要求10的方法，其中加入到樣品的探針物質尼羅紅的濃度在大約0.1-0.9mM之間。12.根據權利要求8-11任何一項的方法，其中將根據權利要求5-7任何一項的配體結合抑制劑加入到第二等分部分。13.根據權利要求8-12任何一項的方法，其中將封閉HSA藥物結合域的試劑也加入到第二等分部分，之後確定HDL濃度。14.根據權利要求13的方法，其中所述試劑是苯甲酸或其鹽或衍生物。15.根據權利要求10-14任何一項的方法，其中通過在400nm-650nm之間的激發波長激發第二等分部分並且在約540nm-700rnn之間的發射波長測量得到的螢光來誘導螢光。16.根據權利要求10-15任何一項的方法，其中通過在400nm-500nm之間的激發波長激發第一等分部分；在約600nm的激發波長激發第二等分部分；並且在約620nm的發射波長測量從每個等分部分得到的螢光來誘導螢光。17.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述樣品是生物流體。18.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述樣品包含血漿或血清，或淋巴。19.一種裝置，用於進行根據權利要求l-18任何一項的脂蛋白測定，所述裝置包含反應儲器；適合於含有根據權利要求1-18任何一項方法所需試劑的容納裝置；可操作用於激發所述樣品以便它發螢光的激發裝置，和可操作用於檢測由所述樣品發射的螢光的檢測裝置。20.根據權利要求19的裝置，其中所述裝置包含閱讀器和盒，所述盒包含所述反應儲器和所述容納裝置。21.根據權利要求19或20的裝置，其中所述激發裝置包含照明源，可操作用於在大約460nm並且也任選在600nm照亮所述樣品。22.根據權利要求19-21任何一項的裝置，其中所述檢測裝置在大約500nm-700nm檢測由樣品發射的螢光。全文摘要本發明涉及確定樣品溶液中總脂蛋白濃度的方法。所述方法包含下列步驟將結合樣品中脂蛋白的探針物質K-37加入到樣品的等分部分，並且當其如此結合時在適當激發下發螢光。然後利用螢光分析確定樣品中總脂蛋白濃度。所述方法可以採用對於脂蛋白的類別或亞類是特異性的第二探針物質，以便使用者可以鑑別脂蛋白。本發明還涉及可以用於實施本發明方法的裝置。文檔編號G01N35/00GK101133329SQ200580047864公開日2008年2月27日申請日期2005年12月12日優先權日2004年12月11日發明者加雷斯·羅伊斯頓·瓊斯,戴維·託馬斯·克拉克申請人:科學技術設備委員會