一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體及其合成方法
2023-10-07 23:31:04 1
一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體及其合成方法
【專利摘要】一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體及其合成方法，先對端甲氧基聚乙二醇進行胱胺化改性，得到胱胺化mPEG；接著利用碳二亞胺法將RAFT聚合鏈轉移劑鍵接於胱胺化聚乙二醇鏈端，獲得大分子RAFT鏈轉移劑；隨後實施RAFT聚合，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺)-聚(N-叔丁氧羰基丙烯醯肼)三嵌段共聚物；最後去除保護基(叔丁氧羰基)，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺)-聚丙烯醯肼三嵌段共聚物。該合成方法原料易得，且反應條件溫和，得到的載體中各段聚合物分子量和鏈長度易控制，載阿黴素後能夠自組裝成納米粒、藥效高，實現了化療藥物和基因藥物的共同裝載。
【專利說明】一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體及其合成方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫用材料領域，具體涉及一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體及其合成方法。
【背景技術】
[0002]化療是臨床腫瘤治療的主要策略之一，它主要是利用循環系統將細胞毒性的化學藥物遞送至病變部位，同時不可避免地給身體中正常細胞帶來毒副作用。化療藥物的療效和毒副作用均與施用劑量密切相關。因此，如何提高化療藥物療效並避免其毒副作用是始終是腫瘤化療最關心的問題。目前，開發分子靶向藥物和藥物遞送體系就成為研究熱點。其中，分子靶向藥物因開發困難和臨床療效遠遜於預期等問題，進展相對緩慢；而基於生物材料的藥物遞送體系因載藥量大、適用藥物種類多、生物相容性好、可生物降解等優點，成為研究重點，已開發出納米粒、納米凝膠、聚合物-藥物偶聯物、納米膠束等載體形式。在藥物遞送體系開發中，普遍通過聚乙二醇修飾載體，以避免載體在血液中循環時被免疫系統快速清除掉，利於載體在腫瘤區的富集。然而，聚乙二醇修飾也降低了載體與細胞相互作用，使載體經胞吞作用進入腫瘤細胞內或從內涵體內逃逸進入細胞質變得困難。可見，適時將載體上修飾的聚乙二醇去掉，將利於提高藥物療效。 [0003]阿黴素是臨床上廣泛應用的抗腫瘤藥物，對肺癌、乳腺癌、膀胱癌等均有很好的療效。與大多數藥物一樣，阿黴素水溶性和選擇性均差，臨床上多以其鹽酸鹽形式，存在生物利用度低、半衰期短、毒副作用明顯等缺點，嚴重製約其臨床療效。因此，將其裝載於各種形式的藥物載體中，將可有效緩解/克服這些缺點。然而，這仍無法解決阿黴素的耐藥性問題。耐藥性的產生通常是因為腫瘤細胞表達某種蛋白如P-gp蛋白時將藥物泵出細胞外以避免其毒性作用。近年來，基因治療被視為提高化療療效和從根本上消除耐藥性的有前景的方法，如siRNA法。它可以通過沉默腫瘤細胞產生的耐藥性蛋白，實現化療藥物在腫瘤細胞內的聚集，發揮治療作用。然而，基因藥物的遞送更是一個挑戰性難題，因為它通常荷負電，極易被免疫系統清除而無法發揮治療作用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和SiRNA載體及其合成方法，該合成方法原料易得，且反應條件溫和，得到的載體中各段聚合物分子量和鏈長度易控制，載阿黴素後能夠自組裝成納米粒、藥效高，實現了化療藥物和基因藥物的共同裝載。
[0005]為達到上述目的，本發明可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，包括如下步驟:
[0006]I) mPEG大分子RAFT鏈轉移劑的合成:
[0007]將胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶於無水有機溶劑中，然後在氮氣氛保護下向其中加入帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑、4- 二甲氨基吡啶以及二環己基碳二亞胺，再在室溫反應24小時~72小時，得到反應液；向反應液中加入冷乙醚使反應液中析出固體，將反應液中的固體分離後收集，即得mPEG大分子RAFT鏈轉移劑；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑、4-二甲氨基吡啶和二環己基碳二亞胺的摩爾比為1:(2~20):1:(4 ~40)；
[0008]2) mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成:
[0009]將mPEG大分子RAFT鏈轉移劑、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺和引發劑溶於無水無氧有機溶劑中，然後於60°C~65°C反應24小時~48小時，得到反應液；反應液經濃縮後用冷乙醚沉澱，再將沉澱分離並真空乾燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT鏈轉移劑和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺的摩爾比為10: (100~600)；
[0010]3) N-叔丁氧羰基丙烯醯肼的合成:
[0011]將叔丁氧羰基肼溶於O~4°C的水中，然後在攪拌下滴加丙烯醯氯有機溶液，同時調節PH值至8~9，並在室溫反應4~10小時，最後將得到的產物用二氯甲烷萃取、重結晶並真空乾燥，得到N-叔 丁氧羰基丙烯醯肼；其中，叔丁氧羰基肼與丙烯醯氯有機溶液中的丙烯醯氯的摩爾比為1:1.1;
[0012]4) mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成:
[0013]將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯醯肼和引發劑溶於無水無氧有機溶劑中，然後於60°C~65°C反應24小時~48小時，得到反應液；反應液經濃縮後用冷乙醚沉澱，再將沉澱分離並真空乾燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA與N-叔丁氧羰基丙烯醯肼的摩爾比為5: (100~500)；
[0014]5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護基脫除，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體。
[0015]所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇採用如下步驟合成:
[0016]a)將分子量為800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2，2』-二硫代二乙基異氰酸酯溶於無水甲苯中，在氮氣氛下於85°C反應48小時，然後用無水正己烷沉澱出固體，收集固體真空乾燥，得到2，2』 - 二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫以及2，2』-二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為1:(0.02 ~0.08): (3 ~8)；
[0017]b)將2，2』 - 二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶於蒸餾水中，然後在60°C反應6小時，最後將得到的反應液經透析和凍幹，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
[0018]所述的步驟I)中帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑為S-1-十二烷基-S』_(α，α』-二甲基-α "-乙酸)三硫代碳酸酯、4-氰基_4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
[0019]所述的步驟I)中每升無水有機溶劑中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步驟2)中每升無水無氧有機溶劑中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT鏈轉移劑，步驟
4)中每升無水無氧有機溶劑溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
[0020]所述的步驟2)中N-(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺與引發劑的摩爾比為(100~600):1，步驟4)中N-叔丁氧羰基丙烯醯肼與引發劑的摩爾比為(100~500):1。
[0021]所述的步驟2)和步驟4)中無水無氧有機溶劑為無水無氧二氧六環、無水無氧四氫呋喃或無水無氧二甲基甲醯胺。
[0022]所述的步驟2)和步驟4)中引發劑為偶氮二異丁腈或4，4』-偶氮雙(氰基戊酸)。
[0023]所述的步驟5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護基脫除的方法為:
[0024]將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA溶於無水有機溶劑中，於(TC滴加到體積比為1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶劑中，然後升至室溫反應5小時；減壓蒸餾去除溶劑，再向得到的固體中加入碳酸氫鈉水溶液進行中和處理，接著裝入截留分子量為3500Da的透析袋中對質量濃度為0.25%的氨水透析48小時，最後凍幹，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA和三氟乙酸的摩爾比為1: (15~40)。
[0025]所述的步驟I)以及步驟5)中的無水有機溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、無水二氧六環或無水四氫呋喃。
[0026]一種所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體，化學名稱為端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺)_聚丙烯醯肼三嵌段共聚物，結構式為:
[0027]
【權利要求】
1.一種可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和SiRNA載體的合成方法，其特徵在於，包括如下步驟: DmPEG大分子RAFT鏈轉移劑的合成: 將胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶於無水有機溶劑中，然後在氮氣氛保護下向其中加入帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑、4- 二甲氨基吡啶以及二環己基碳二亞胺，再在室溫反應24小時~72小時，得到反應液；向反應液中加入冷乙醚使反應液中析出固體，將反應液中的固體分離後收集，即得mPEG大分子RAFT鏈轉移劑；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑、4- 二甲氨基吡啶和二環己基碳二亞胺的摩爾比為1: (2~20):1:(4 ~40)； 2)mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成: 將mPEG大分子RAFT鏈轉移劑、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺和引發劑溶於無水無氧有機溶劑中，然後於60°C~65°C反應24小時~48小時，得到反應液；反應液經濃縮後用冷乙醚沉澱，再將沉澱分離並真空乾燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT鏈轉移劑和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺的摩爾比為10: (100~600)； 3)N-叔丁氧羰基丙烯醯肼的合成: 將叔丁氧羰基肼溶於0°C~4°C的水中，然後在攪拌下滴加丙烯醯氯有機溶液，同時調節pH值至8~9，並在室溫反應4小時~10小時，最後將得到的產物用二氯甲烷萃取、重結晶並真空乾燥，得到N-叔丁氧羰基丙烯醯肼；其中，叔丁氧羰基肼與丙烯醯氯有機溶液中的丙烯醯氯的摩爾比為1:1.1 ;
4)mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成: 將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯醯肼和引發劑溶於無水無氧有機溶劑中，然後於60°C~65°C反應24小時~48小時，得到反應液；反應液經濃縮後用冷乙醚沉澱，再將沉澱分離並真空乾燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA與N-叔丁氧羰基丙烯醯肼的摩爾比為5: (100~500)； 5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護基脫除，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體。
2.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於，所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇採用如下步驟合成: a)將分子量為800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2，2』- 二硫代二乙基異氰酸酯溶於無水甲苯中，在氮氣氛下於85°C反應48小時，然後用無水正己烷沉澱出固體，收集固體真空乾燥，得到2，2』 - 二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫以及2，2』-二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為1:(0.02~0.08): (3 ~8)； b)將2，2』- 二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶於蒸餾水中，然後在60°C反應6小時，最後將得到的反應液經透析和凍幹，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
3.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟I)中帶一個羧基的RAFT鏈轉移劑為S-1-十二烷基-S』_(a, a』-二甲基-a"-乙酸)二硫代碳酸酯、4_氰基_4_[(十二烷基硫烷基硫擬基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲醯)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
4.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟I)中每升無水有機溶劑中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步驟2)中每升無水無氧有機溶劑中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT鏈轉移劑，步驟4)中每升無水無氧有機溶劑溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
5.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟2)中N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺與引發劑的摩爾比為(100~600):1，步驟4)中N-叔丁氧羰基丙烯醯肼與引發劑的摩爾比為(100~500):1。
6.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟2)和步驟4)中無水無氧有機溶劑為無水無氧二氧六環、無水無氧四氫呋喃或無水無氧二甲基甲醯胺。
7.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟2)和步驟4)中引發劑為偶氮二異丁腈或4，4』 -偶氮雙(氰基戊酸)。
8.根據權利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於，所述的步驟5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護基脫除的方法為: 將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA溶於無水有機溶劑中，於(TC滴加到體積比為1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶劑中，然後升至室溫反應5小時；減壓蒸餾去除溶劑，再向得到的固體中加入碳酸氫鈉水溶液進行中和處理，接著裝入截留分子量為3500Da的透析袋中對質量濃度為0.25%的氨水透析48小時，最後凍幹，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA和三氟乙酸的摩爾比為1:(15 ~40)。
9.根據權利要求8所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體的合成方法，其特徵在於:所述的步驟I)以及步驟5)中的無水有機溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、無水二氧六環或無水四氫呋喃。
10.一種如權利要求1~9中任意一項權利要求所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共裝載阿黴素和siRNA載體，其特徵在於，化學名稱為端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯醯胺)_聚丙烯醯肼三嵌段共聚物，結構式為:
【文檔編號】A61K48/00GK104027816SQ201410268060
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】姚煜, 錢軍民, 徐明輝, 胥偉軍 申請人:西安交通大學