檢測類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法

2023-10-07 21:14:59 1

專利名稱：檢測類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母以及生物 測試方法，具體的說是涉及一種利用酵母雙雜交技術獲得的包含重組維曱
酸X受體基因的雙雜交酵母，以及利用該酵母來檢測類/抗維曱酸化合物，
特別是環境中的類/抗維曱酸化合物的生物測試方法。
背景技術：
環境中的內分泌幹擾物，亦被稱為環境激素，是指人類在生產、生活 過程中釋放到環境中的某些有毒化學物質，它們與人體和動物體內的激素 具有類似的化學結構，並能夠產生類似激素的作用。它們進入體內，擾亂 了激素的正常分泌，使人和動物的生理過程發生紊亂，導致生殖、免疫等
功能發生障礙。環境中的內分泌幹擾物的幹擾效應包括雌激素幹擾效應、 雄激素幹擾效應、維曱酸幹擾效應等。維曱酸(retinoicacid， RA)也稱為視 黃酸，是指天然或人工合成的維生素A的衍生物，具有重要生理活性，特 別是對生物體的胚胎發育、器官形成、生殖等具有重要作用。已經發現持 久性有毒有機汙染物(POPs)的暴露與生物體內維曱酸平衡的破壞相關，盡 管這類具有維曱酸幹擾活性的化合物在環境中濃度極小，但是其一旦進入 人體和動物體內，可以與特定的維曱酸受體結合形成複合物，啟動/抑制下
遊基因的表達，幹擾內分泌系統的正常功能。90年代對維曱酸X受體作 用機制的研究進一步發現了維曱酸X受體的共激活因子(coactor),並建 立了新的受體作用理論(參見，Hong, H., Kohlit, K., Trivedit, A., Deborah, L., Johnson, D丄.和Stallcup, M.R., 1996, Natl. Acad. Sci. USA. 93:4948-4952 )。 該理論認為，維曱酸(或者環境中類/抗維曱酸物質)與相應維曱酸X受 體的配體結合區(LBD)結合後引起構象改變，進一步結合共激活因子， 促進轉錄。
對環境中維曱酸幹擾效應的研究剛剛起步，目前報導應用較多的為化 學分析和生物測試方法。化學分析需要高分辨色譜/高分辨質譜，除了分析費用高外，對儀器設備條件和人員素質有相當嚴格的要求。另外一種廣泛
採用的是利用重組維曱酸X受體酵母菌(Yeast Estrogen Screen, YES)進行 測試，這種測試利用的是重組維曱酸X受體及受體共激活因子TIF2構建 的雙雜交酵母(參見，Nishikawa, J丄，Mamiya， S.， 2004， Environ. Sci. Technol. 38:6271-6276)。目前，通常採用報導基因的方法指示外界幹擾、
如化合物暴露等對基因轉錄的影響。在雙雜交酵母方法中，通常採用的
Z基因是一種常用的編碼p-半乳糖苷酶的報導基因，其產物p-半乳糖苷酶 具有強的酶催化活性，能夠與特定底物反應生成新的有色化合物，易於檢 測。因此，通過簡單測定(3-半乳糖苷酶的活性，就能夠表徵對基因轉錄的 影響。Nishiham等報導的雙雜交酵母方法採用的是Y190酵母菌林作為載 體，隨著技術的發展採用Y187(含有雙拷貝數的編碼|3-半乳糖苷酶的ZacZ 基因)釀酒酵母菌抹作為載體，由於其高的P-半乳糖苷酶表達量，則更能 提高整個方法的靈敏度與準確性，減少假陽性或假陰性結果的產生。

發明內容
本發明的目的在於構建一種用於檢測樣品中類/抗維曱酸化合物的雙 雜交酵母，在此基礎上建立一種檢測類/抗維曱酸化合物的生物測試方法。 該檢測方法快速簡便，成本低廉，省時省力，應用廣泛，所需樣品量少。
本發明是通過下述方案實現的
本發明的 一 個方面提供了 一種用於檢測環境樣品中的類/抗維甲酸化 合物的雙雜交酵母，其中，該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達質粒和 pGAD424-GRIPl酵母表達質粒，並且所述pGBT9-RXR酵母表達質粒包含 維曱酸X的受體基因，pGAD424-GRIPl酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維曱酸X受體共激活因子基因片段。
優選地，所述維曱酸X受體基因為鼠維曱酸X受體基因或具有如SEQ ID No.l所示序列的鼠維曱酸X受體基因片段。
所述的雙雜交酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) RXR-GRIP1,其保藏編號為CGMCC No .2305。該酵母已於2007年12 月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,北 京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101)進行了生物材 料保藏。
優選地，所述類維曱酸化合物選自天然維甲酸化合物、有機錫化合物、酚類化合物或其代謝後具有酚類結構的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、 有機氯農藥類化合物中的一種或幾種，所述抗維曱酸化合物選自酚類化合 物或其代謝後具有酚類結構的化合物、鄰苯二甲酸酯類化合物、有機氯農 藥類化合物中的一種或幾種。
本發明的另一個方面還提供了一種製備雙雜交酵母的方法，其中，該
方法包括以下步驟
(1) 純化包含維曱酸X受體基因的pGBT9-RXR酵母表達質粒；
(2) 純化包含維曱酸X受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl酵 母表達質粒；
(3) 構建雙雜交酵母，用所述的pGBT9-RXR質粒和所述的 pGAD424-GRIPl質粒轉化進入酵母細胞中，形成雙雜交酵母，此處的酵 母細胞優選Y187釀酒酵母細胞。
具體而言，pGBT9-RXR酵母表達質粒用pGBT9-RXR(日本大阪大學 Nishikawa教授惠贈。參見Nishikawa, J.I., Mamiya, S., 2004， Environ. Sci. Technol. 38: 6271-6276)轉化感受態大腸桿菌，在含有氨爺青黴素的培養 基中篩選陽性克隆，提取質粒並純化。
pGAD424-GRIPl酵母表達質粒用pGAD424-GRIPl (美國加州大學 Stallcup教授惠贈。參見Li, H.W.， Kim,丄H.， Koh， S.S., Stallcup， M.R. 2003. J.Biol. Chem. Biol. 279(6):4212-4220.)轉化感受態大腸桿菌，在含有氨爺 青黴素的培養基中篩選陽性克隆，提取質粒並純化。
優選地，所述的形成雙雜交酵母之後還篩選所述的雙雜交酵母。
所述的篩選所述的雙雜交酵母優選是採用營養缺陷型篩選和菌落轉 移濾膜分析相結合的方法篩選所述雙雜交酵母。
所述的菌落轉移濾膜分析優選是採用添加維曱酸的X-gal緩沖液的 菌落轉移濾膜分析。具體而言，在上述方法中，構建雙雜交酵母時，同時 加入pGBT9-RXR質粒和pGAD424-GRIPl質粒混合均勻，並加入感受態 Y187釀酒酵母細胞孵育，得到雙雜交酵母。
所述維曱酸優選為9-順維甲酸，所述X-gal緩衝液優選為20mg 'ml/1 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷的二曱基曱醯胺溶液。
所述營養缺陷型篩選中採用的培養基優選為不添加亮氨酸和色氨酸 的SD培養基，(即SD/-Trp/-Leu )其中包含20 mg/L腺嘌呤半硫酸鹽、20 mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L —水合鹽酸組氨酸、30 mg/L異亮氨酸、30 mg/L鹽酸賴氨酸、20mg/L曱硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200 mg/L蘇氨酸、 30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150 mg/L纈氨酸和6.7g/L無胺基酸酵 母氮源。
具體而言，在上述方法中，篩選雙雜交酵母時，採用營養缺陷型篩選 和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵母通過營養 缺陷型培養基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，進一步使用菌落轉移濾 膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#乾燥濾膜上，液氮反覆凍融，破碎 細胞；將l並濾膜置於含維曱酸的X-gal緩沖液的2弁濾膜上，3(TC孵育至 出現明顯藍色菌落，將顯色菌落繼續培養備用。
本發明的再一個方面還提供了一種利用所述的雙雜交酵母檢測環境 中類維甲酸化合物的生物測試方法，該方法包括如下步驟
(1 )首先將所述雙雜交酵母細胞分別接種於已知系列濃度維曱酸培 養液，形成菌液，暴露培養2-4小時；
(2) 暴露培養結束後，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的 反應液進行反應30-60分鐘，檢測上清液在420nm處的吸光度值，並以此 作為表示p-半乳糖苷酶活性的參數；
(3) 根據所述的系列濃度維曱酸相對於它所對應的p-半乳糖苷酶活 性的參數繪製p-半乳糖苷酶活性的誘導劑量-效應關係標準曲線；
(4) 將所述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-p-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，終止反應後檢測反應上清液在420nm處 的吸光度值，對照所述的誘導劑量-效應關係標準曲線計算出待測樣品中 類維曱酸化合物的含量。
優選地，所述的待測樣品優選為環境樣品中的有機溶劑提取液，其中 的類維曱酸化合物濃度為1(T9~ 1O一mol/L。
優選地，繪製誘導標準曲線具體步驟為將維曱酸溶解到二甲基亞碸 (DMSO)中，此處的維曱酸優選9-順維曱酸，製備一系列的9-順維曱酸 標準濃度反應液，濃度範圍2xl(T7 2xlO"mol/L,按照0.5%的比例添加 9-順維曱酸標準濃度反應液到雙雜交酵母細胞菌液中，製備暴露液；將暴 露液接種至96孔板中(200)aL/孔)；30。C培養2小時後檢測600nm處的吸 光度值；再將含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖苷的反應液加入到96孔 板中；30。C下充分反應後，添加1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應；在420nm 處用分光光度計;險測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，並以此作為表示P -半乳糖苷酶的參數，繪製9-順維曱酸對雙雜交酵母細胞的P-半乳糖香酶 活性誘導的劑量-效應關係標準曲線。
P-半乳糖苷酶活性u的計算公式如下u = (As-AB)/t .V .D .ODs, 式中，u為P -半乳糖苷酶活性；t為反應時間(min ); V為測試體積(mL); D為稀釋因子；ODs為測試樣品在595nm處的吸光度值；As為測試樣品 在420nm處的吸光度值OD42Q; AB為空白對照在420nm處的吸光度。
所述糹企測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加二曱基亞石風 (DMSO)溶解的待測樣品到含有雙雜交酵母細胞的菌液中，製備暴露液； 暴露液接種至96孔板中(200pL/孔)；30。C培養2小時後4企測600nm處的 吸光度值；再將含有過量鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷的反應液加入到96 孔板中；30。C下充分反應後，添加lmol L"的碳酸鈉溶液終止反應；在 420nm處用分光光度計4企測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，來4企測待測化 合物是否具有維曱酸X受體誘導活性，即將測得的結果與上述標準曲線比 較，進而可以計算出環境樣品中類維曱酸化合物的含量，從而評價環境中 類維曱酸化合物的毒性效應。
本發明的再一個方面還提供了一種利用所述的雙雜交酵母檢測抗維 曱酸化合物的生物測試方法，該方法具體包括如下步驟
(1 )首先將雙雜交酵母細胞分別與接種於已知系列濃度的抗維曱酸 化合物培養液，形成菌液，並向所述的菌液中添加已知濃度維曱酸，共培 養2-4小時；
(2) 培養結束後，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷反應液 進行反應，直到菌液出現黃色，；險測上清液在420nm處的吸光度值，並以 此作為表示p-半乳糖苷酶活性的參數；
(3) 根據所述的系列濃度的抗維曱酸化合物相對它所對應的P-半乳 糖苷酶活性的參數繪製|3-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲 線；
(4) 將所述的菌液與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳 糖苷反應液進行反應，終止反應後檢測反應上清液在420nm處的吸光度 值，對照步驟(3)制定的標準曲線計算出樣品中抗維甲酸化合物的含量。
優選地，在所述步驟(l)中，所述的維曱酸為9-順維曱酸，濃度為 5xlO-7~ 5xlO_6mol/L。
優選地，待測樣品為環境樣品中的有機溶劑提取液，其中抗維曱酸化合物濃度為10'8 ~ 10'5 mol/L。
優選地，在步驟(1)中，將所述的雙雜交酵母細胞接種前，調節維 曱酸培養液在600nm處的吸光度值為0.1-0.2,並且在步驟(2)培養結 束後，調節菌液在600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
具體而言，在上述檢測環境中抗維甲酸化合物的生物測試方法中，雙 雜交酵母細胞的培養方法為將上述的雙雜交酵母細胞接種到不添加亮氨 酸和色氨酸的SD培養基，(即SD/-Trp/-Leu )中，檢測菌液600nm處的吸 光度值為0.1-0.2， 3(TC培養24小時後調整酵母菌液600nm處的吸光度 值為0.7-0.8。
繪製誘導標準曲線具體步驟為將9-順維曱酸溶解到二曱基亞碸 (DMSO)中，製備9-順維曱酸標準濃度反應液(lxl(T3mol/L);將維曱 酸抑制劑五氯酚溶解到DMSO中，製備一系列的五氯酚標準濃度反應液 (濃度範圍2xl(T7 ~ 2xlO"mol/L ),按照0.5 %的比例添加9畫順維曱酸和五 氯酚標準濃度反應液到RXR-GRIP1酵母菌液中，製備暴露液；將暴露液 接種至96孔板中(200pL/孔)；30。C培養2-4小時後4全測600nm處的吸光 度值；再將含有過量鄰硝基苯-P -D-p比喃半乳糖香的反應液加入到96孔板 中；30。C下充分反應後，添加1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應；在420nm 處用分光光度計檢測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度值，並以此作為表示P-半乳糖苷酶的參數，繪製五氯酚對雙雜交酵母細胞RXR-GRIP1的P-半乳 糖苷酶活性抑制的劑量-效應關係標準曲線。
所述的檢測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加9-順維曱酸和 二曱基亞碸(DMSO)溶解的待測樣品的雙雜交酵母細胞RXR-GRIP1菌 液中，製備暴露液；暴露液接種至96孔板中(200pL/孔)；3(TC培養2小 時後檢測600nm處的吸光度值；再將含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖 香的反應液加入到96孔板中；30。C下充分反應後，添加lmol/L的碳酸鈉 溶液終止反應；在420nm處用分光光度計檢測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度 值，來檢測待測化合物是否具有維曱酸X受體抑制活性，即將測得的結果 與上述標準曲線比較，進而可以計算出環境樣品中抗維曱酸化合物的含 量，從而評價環境中抗維曱酸化合物的毒性效應。
本發明提供的用於檢測環境樣品中類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母 以及生物檢測方法的優益之處在於1)本發明的雙雜交酵母細胞 RXR-GRIP1能夠同時表達維曱酸X受體蛋白、維甲酸X受體共激活因子蛋白，支持最新的受體作用理論，最能模擬哺乳動物細胞內維曱酸x受體
的作用機制，採用Y187釀酒酵母細胞作為載體，表達基因產生的p-半乳 糖苷酶的酶活性大大增強，易於檢測，很適合作為化合物毒性篩選、環境 樣品類/抗維曱酸效應評價方面的試驗研究；2)酵母細胞試驗快速、簡便 可以對大量環境樣品或化學物質的內分泌幹擾物效應進行前期篩選，為活 體試驗提供基礎數據支持，彌補了活體試驗試驗周期長，費用高的不足； 3)添加9-順維甲酸(5xl。-6 mol'L")的X-gal緩衝液在菌落轉移濾膜分 析中的應用，大大的縮短了操作時間，相當程度上減輕了假陽性結果千擾 的可能性；4)利用SD/-Trp/-Leu營養缺陷型培養基進行酵母培養，能夠 有效防止雙雜交酵母細胞的回覆突變，減輕傳代過程中質粒丟失的情況， 使得雙雜交酵母細胞的蛋白表達穩定，試驗測試結果之間的平行性較好； 5 )利用重組維曱酸X受體基因雙雜交酵母進行類維曱酸汙染物的篩選和 毒性毒理研究時，致毒機理明確，操作簡便，省時省力，所需樣品量少， 成本低廉；6)本發明重組了幾乎全長的維曱酸X受體共激活因子GRIP1 基因(>99%)，能夠更好的與維曱酸X受體反應，增強p-半乳糖苷酶的酶 活性，提高反應靈敏度。7)本發明同時檢測了環境樣品中的類維曱酸化 合物和抗維曱酸化合物，與類維曱酸化合物的單因素檢測相比能夠更全面 的反映環境樣品對維曱酸X受體的幹擾作用；8 )與Nishikawa文獻(參見， Nishikawa， J丄，Mamiya, S., 2004, Environ. Sci. Technol. 38: 6271-6276 )報導 克隆維曱酸X受體共激活因子TIF2基因片H採用酵母細胞Y190作為 載體細胞不同的是，本發明克隆維曱酸X受體共激活因子GRIP1基因或 基因片段(>99%)採用釀酒酵母細胞Y187構建雙雜交酵母，因此在測定 環境化合物的維曱酸幹擾效應時具有更高的靈敏度和反應活性， RXR-GRIP1酵母誘導的最大酶活性值是RXRI3-TIF2酵母誘導的最大酶 活性值的3.4倍。


圖1表示9-順維曱酸對釀酒酵母CGMCCNo.2305以及RXR-TIF2酵 母酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線的比較。其中橫坐標是9-順維曱 酸濃度，縱坐標是9-順維曱酸誘導的(3-半乳糖苷酶活性；其中口表示9-順維曱酸對RXR-TIF2酵母誘導效應；固表示9-順維曱酸對釀酒酵母 CGMCC No.2305誘導效應。圖2表示五氯酚對9-順維甲酸(5xl(T6mol/L ) i秀導釀酒酵母CGMCC No.2305活性抑制的劑量-效應關係標準曲線。其中橫坐標是五氯酚濃度， 縱坐標是五氯酚抑制的(3-半乳糖苷酶活性；
圖3表示結合環境水樣前處理方法，利用釀酒酵母CGMCC No.2305 生物方法測試某汙水處理廠不同處理出水樣品類/抗維曱酸效應的結果；其 中橫坐標是某汙水處理廠不同處理工藝，縱坐標是釀酒酵母CGMCC No.2305的測試結果；其中B表示樣品的類維曱酸誘導效應；口表示樣品 的抗維甲酸抑制效應。
具體實施例方式
本發明提供的雙雜交酵母RXR-GRIP1是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的RXR-GRIP1菌抹，其保藏編號為CGMCC No .2305。該酵 母已於2007年12月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC,北京市朝陽區大屯路中國科學院」微生物研究所，郵編 100101)進行了生物材料保藏。
以下，結合附圖來詳細說明本發明。
實施例1:雙雜交酵母RXR-GRIP1細胞的製備
1. 純化包含維曱酸受體基因片段(即SEQ ID No.l所示序列)的 pGBT9-RXR酵母表達質粒。
用10|liL誘飾質粒pGBT9-RXR (日本大阪大學Nishikawa教授惠贈) 轉化100|uL感受態大腸桿菌DH5 oc,在含有氨千青黴素的培養基中篩選陽 性克隆，提取質粒並純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑑定質粒DNA大小，同 時對質粒DNA進行序列測定，測序引物為pGBT9通用引物(測序工作由 北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨千青黴素的培養基 包含100mg/L氨節青黴素、10g/L胰蛋白腖、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl 和15g/L瓊脂糖。
2. 純化包含維甲酸X受體共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所 示序列)的pGAD424-GRIPl酵母表達質粒。
用lO^L靶質粒pGAD424-GRIPl (美國加州大學Stallcup教授惠贈) 轉化100(iL感受態大腸桿菌DH5 cx ,在含有氨千青黴素的培養基中篩選陽 性克隆，提取質粒並純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑑定質粒DNA大小，同 時對質粒DNA進行序列測定，測序引物為pGAD424通用引物(測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨千青黴素的培養
基包含100mg/L氨苄青黴素、10g/L胰蛋白腖、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和15g/L瓊脂糖。
3. 構建雙雜交酵母RXR-GRIP1。
同時加入O.l(ig pGBT9-RXR質粒和O.lpg pGAD424-GRIPl質粒混合 均勻，並加入0.1mL新鮮製備的感受態Y187釀酒酵母細胞，200rpm， 30 。C孵育30min。加入70pL 二曱基亞碸(DMSO )混合均勻後，42。C水浴放 置15min;細胞迅速轉移到冰浴，靜置l-2min,構建雙雜交酵母 RXR-GRIP1。
4. 篩選雙雜交酵母RXR-GRIP1。
在上述方法中，篩選雙雜交酵母RXR-GRIP1時，採用營養缺陷型篩 選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵母通過營 養缺陷型培養基(SDATrpALeu )粗篩出陽性菌落，進一步使用菌落轉移 濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#乾燥濾膜上，液氮反覆凍融3~5 次，破碎細胞；將1 #濾膜置於含9-順維曱酸(5 x l(T6mol/L )的X-gal緩 衝液的2#濾膜上，3CTC孵育直到克隆出現明顯的藍色。顯色的菌落即為 陽性菌落，陽性菌落繼續培養24小時後備用。所述SD/-Trp/-Leu包含20 mg/L腺噤呤半硫酸鹽、20mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L—水合鹽酸組氨酸、 30mg/L異亮氨酸、30mg/L鹽酸賴氨酸、20 mg/L曱疏氨酸、50 mg/L苯 丙氨酸、200 mg/L蘇氨酸、30 mg/L酪氨酸、20 mg/L尿嘧啶、150 mg/L 纈氨酸、6.7g/L無胺基酸酵母氮源；X-gal緩衝液為20mg/L 5-溴-4-氯-3-丐l咮-13 -D-半乳糖苷的二曱基曱醯胺溶液。
實施例2:
利用雙雜交酵母RXR-GRIP1 (釀酒酵母CGMCC No .2305 )測定9-順維甲酸的誘導效應來繪製標準誘導曲線
酵母細胞培養將製備的雙雜交酵母RXR-GRIP1細胞接種到 SD/-Trp/-Leu液體培養基中，(培養基組成與實施例1中相同)檢測菌液 600nrn處的吸光度值(以培養基為空白)，調節吸光度值為0.1~0.2， 30°C 空氣浴搖床中培養24小時調整菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
繪製標準曲線取菌懸液0.995mL至對應的Eppendorf管中，加入5pL DMSO (空白)或5pL用DMSO溶解的9-順維甲酸；將以上溶液各200|iL依次轉移到96孔々反中。然後於130rpm， 30。C於96孔才反搖床振蕩培養2 小時；培養結束後，首先4會測600nm處的吸光度值；去除150pL酵母菌 液；加入120pL測試緩衝液(每100mL基礎緩沖液中加入3.33mL濃度為 0.1%的SDS溶液和270pL P-巰基乙醇)和20pL氯仿，在30。C的恆溫搖床 上預培養10min;再加入40pL鄰硝基苯-卩-D-吡喃半乳糖苷的反應液 (0.04g/L),啟動酶反應，隨著進一步的培養，可以逐漸看到培養液呈現 越來越強的黃色；30。C下充分反應後，添加100jiL碳酸鈉溶液(1 mol/L) 終止反應；取200|iL上清液在420nm處用分光光度計4金測終產物鄰硝基 酚鈉的吸光度值，並以此作為表示(3-半乳糖苷酶的參數，繪製9-順維曱酸 對雙雜交酵母細胞RXR-GRIP1的p-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關 系標準曲線(圖1)。
卩-半乳糖苷酶活性u的計算公式如下u = (As-AB)/tV'DODs,式 中，u為卩-半乳糖苷酶活性；t為反應時間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；ODs為測試樣品595nrn處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42; As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-P -D-吡喃半乳糖苷的反應液包含21.51g/L Na2HP04 12H20 、 6.22g/L NaH2P04 2H20 、 0.75g/L KC1 、 0.25g/L MgS04 . 7H20、 0.04g/L鄰硝基苯-p -D-吡喃半乳糖苷。
相同的方法4企測9-順維曱酸對雙雜交酵母RXR-TIF2細胞(日本大阪 大學Nishikawa教授惠贈)P-半乳糖苷酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲 線。
由圖1可知，9-順維曱酸對雙雜交酵母RXR-GRIP1細胞p-半乳糖苷 酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲線的EC5o值為1.0xl(T7mol/L,在 5xl(T9~5xlO-6 mol/L範圍內存在線性關係；同時，RXR-GRIP1酵母誘導 的酶活性值明顯高於RXR-TIF2酵母，RXR -GRIP1酵母誘導的最大酶活 性值約是RXR-TIF2酵母誘導的最大酶活性值的3.4倍；初步表明雙雜交 維曱酸X激素受體基因酵母RXR-GRIP1測評體系，具有更高的靈敏度， 可以作為環境中類維曱酸化合物的毒性效應的定量分析標準。
實施例3:利用雙雜交酵母RXR-GRIP1 (釀酒酵母CGMCC No .2305 ) 測定五氯酚的抑制效應來繪製抑制曲線。
酵母細胞培養將製備的雙雜交酵母RXR-GRIP1細胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養基(組成與實施例2中相同)中，；險測菌液600nm 處的吸光度值(以培養基為空白)，調節吸光度值為0.1-0.2, 30。C空氣浴 搖床中培養24小時後調整菌液600nm處的吸光度值為0.7-0.8。
繪製標準曲線取菌懸液0.995mL至對應的Eppendorf管中，加入5pL 9-順維曱酸和5pL用DMSO溶解的五氯酚；將以上溶液各200|iL依次轉 移到96孔板中。然後於130rpm, 30°C於96孔板搖床振蕩培養2小時；培 養結束後，首先4企測600nm處的吸光度值；去除150pL酵母菌液；加入 120pL測試緩衝液(每100mL基礎緩沖液中加入3.33mL濃度為0.1%的 SDS溶液和270pL p-巰基乙醇)和20(iL氯仿，在30°C的恆溫搖床上預培 養10min;再加入40pL鄰硝基苯-卩-D-他喃半乳糖苷的反應液(0.04g/L )， 啟動酶反應，隨著進一步的培養，可以逐漸看到培養液呈現越來越強的黃 色；30。C下充分反應後，添加100pL碳酸鈉溶液(1 mol/L)終止反應；取 200pL上清液在420nm處用分光光度計檢測終產物鄰硝基酚鈉的吸光度 值，並以此作為表示p-半乳糖苷酶的參數，繪製五氯酚對9-順維曱酸誘導 雜交酵母細胞RXR-GRIP1的(3-半乳糖苦酶活性抑制的劑量-效應關係曲 線(圖2)。
P-半乳糖苦酶活性u的計算公式如下u = (As-AB)/t'V.D'ODs,式 中，u為卩-半乳糖苷酶活性；t為反應時間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；ODs為測試樣品595nrn處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42Q; As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-P -D-吡喃半乳糖苷的反應液包含21.51g/L Na2HP04 . 12H20 、 6,22g/L NaH2P04 . 2H20 、 0.75g/L KC1 、 0.25g/L MgS04 . 7H20、 0.04g/L鄰硝基苯-(3 -D-吡喃半乳糖苷。
由圖2可知，五氯酚對雙雜交酵母RXR-GRIP1細胞P-半乳糖苷酶活 性抑制在lxl(T9-lxl(T5 mol/L測試濃度範圍內存在顯著的劑量-效應關 系線性關係；IC2o值(抑制20%的效應所需化合物的濃度)為1.0xl(T7mol/L， 初步表明雙雜交維甲酸X受體基因酵母測評體系可以作為環境中抗維曱 酸化合物的毒性效應的測評體系。
實施例4:利用雙雜交酵母RXR- GRIPl(釀酒酵母CGMCC No .2305 )
生物測試方法評價環境樣品的類/抗維甲酸汙染物毒性。
分別釆集某市汙水處理廠進水、不同處理工藝出水作為樣品。釆用本發明所述的樣品前處理方法提取樣品中的類/抗維曱酸汙染物，將提取到的
有機溶劑在高純氮氣中吹乾，加入DMSO溶解並製備成在標準曲線線性範 圍內任一濃度的測試用樣品溶液。
利用實施例2中所述的雙雜交酵母RXR-GRIP1生物測試方法評價環 境樣品的類維曱酸汙染物毒性，測定結果參照圖l繪製的誘導標準曲線， 表示成為9-順維曱酸的當量濃度；同時利用實施例3中所述的雙雜交酵母 RXR-GRIP1生物測試方法評價環境樣品的抗維曱酸汙染物毒性，測定結 果參照圖2繪製的抑制曲線，表示成為五氯酚的當量濃度，見圖3。
從圖3可以看出，該汙水處理廠的不同處理工藝階段出水中均不含有 類曱維甲酸物質，抗維曱酸物質則有檢測五氯酚的當量濃度範圍為0~ 2xl(T5g/L,該處理工藝對抗維曱酸物質能夠有很好的去除。圖3的結果表 示可以用本發明提出的方法，判斷環境樣品中類/抗維曱酸汙染物的毒性當
量或其潛在生態毒性的大小。序列表
中國科學院生態環境研究中心
檢測類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法 DIC07110127 2
Patentln version 3.3
1
1025
DNA
小鼠
1
ggcagagttg actgtatcgc cggattcgat tcggtacagg aggagcgtca gcggggaaag 60 gacaaggatg gggatgggga gggggctggg ggagcccccg鄉agatgcc tgtggacagg 120 atcctggagg cagagcttgc tgtggaacag aagagtgacc agggcgttga gggtcctggg 180 ggaaccgggg gtagcggcag cagcccagat gaccctgtga ctaacatctg gcaggcactg 240 acaaacagct attcacgctt gttgagtggg cgaaaaggat cccacacttt tcctccttgc 300 ctctggatga tcaggtcata ttgctgcggg caggctggaa tgaactcctc attgcctcct 360
tttcacaccg atccattgat gttcgagatg gcatcctcct tgccacaggt cttcacgtgc 420accgcaactc agcccattca gccgaggggg gagccatcgg gggatccgcc tgctgacaga 480 gctagtgtcc aaaatgcgtg acatgaggat ggacaagaca gagcttggcc gcctgagggc 540 aatcattctg tttaatccag atgccaaggg cctctccaac cctagtgagg tggaggtcct 600 gcgggagaaa atgtatgcat cactggagac ctactgcaaa acagaaagta ccctgaacca 660 gcagggacgg tttgccaagc tgctgctacg tcttcctgcc ctccggtcca ttggccttaa 720 gtgtctagag catctgtttt tcatcaagct cattggtgaa cacccccatc gacacc加c 780 tcatggaatg cttgagctcc ccatcaactg acctaatcaa gcttatcgat accggcgacc 840 tgcagccagc taattccggg cgaatttctt atgattatga tttttatatt aatacgttaa 900 aaaaaaataa atgaatacaa tttaaaggac tcttaagttt aaaagaaatt cttaatctgg 960 ataactcttc ctgaagtcag ttgcttctcg aaataaagag gagaacttat tgagaaactc 1020 tcagg
1025
2
4374
DNA
小鼠
2
ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60
18cagctcggac cc汪gccccaa aaggagcact gagaaacgga accgcgagca ggagaataag 120
tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180
ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240
gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc 300
acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat 360
gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca 420
cagtatctac ggtataacca agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat 480
gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga 540
tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg 600
aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac 660
gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat 720
ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt 780
ccctcatcag aaagctttac cacccgccag gacctccaag gcaagateac ttcactggac 840
actagcacca tgagagccgc catgaagccg ggctgggaag atctggtaag aagatgcatt 900
cagaagttcc acacacagca tgaaggggag tctctatcat atgccaagag gcatcaccat 960
gaagttctga gacaagggtt ggcgttcagt cagatctatc gtttttcttt gtctgatggc 1020actctcgttg ctgcacaaac caagagcaaa ctcatccgtt ctcagactac taatgagcct 1080 cagcttgtaa tatctttaca eatgcttcac agagagcaga atgtatgtgt aatgaatccg1140 gatctgactg gacaagcgat ggggaagcca ttgaatccaa ttagctctag cagccctgcc 1200 caccaggccc tgtgcagtgg gaacccaggt caggacatga ccctcggtag caatataaat 1260 tttcccatga atggcccaaa ggaacaaatg ggcatgccta tgggcaggtt tggtggttct 1320 gggggcatga accatgtgtc aggcatgcag gcaaccactc ctcagggtag taactatgca 1380 ctcaaaatga acagtccctc gcaaagcagc cccggcatga acccggggca agccagctcc 1440 gtgctctccc caaggcagcg catgagcccc ggcgtggctg gcagtcctcg catcccaccc 1500 agtcagtttt cccctgcagg aagcttgcat tcccctgtgg gagtttgcag cagcacagga 1560 aatagccata gttataccaa cagttccctc aatgcactgc aagccctcag cgagggccat 1620 ggggtctcac tcgggtcctc gctggcttca ccggacctaa aaatgggcaa tttgcaaaac 1680 tccccagtta atatgaatcc tcccccactc agcaagatgg gaagcttgga ctccaaagac 1740 tgttttggac tttatgggga gccctcagaa ggtacaactg gacaagcaga ggccagctgc 1800 catcctgaag aacaaaaggg gcccaatgat tccagcatgc cccaggcggc cagcggggac 1860 agggctgagg gacacagccg gctgcatgac agcaaagggc agaccaaact cctgcagctg 1920
ctgaccacca agtccgacca gatggagcct tcacccttgc ccagctcctt gtcggacaca 1980formula see original document page 21formula see original document page 22ataagtcaac aacctgatec tggctttact ggggctacga ctccccagag tcctctaatg 3960
tctccccgga tggcacatac tcagagtccc atgatgcagc agtctcaagc caacccagcc 4020
taccagccca cctcagacat gaatggatgg gcacagggga gcatgggtgg aaacagcatg 4080
ttctcacagc agtccccacc acactttggg caacaagcaa acaccagcat gtatagtaac 4140
aacatgaaca tcagtgtgtc gatggcaacc aacacgggtg gcttgagcag catgaaccag 4200
atgacatgcc agatgagcat gacctcagtg acctccgtgc ctacgtcagg actgccctcc 4260
atgggtcccg agcaggtcaa tgaccctgct ctgaggggag gcaacctttt cccaaaccaa 4320
ctgcctggaa tggacatgat caagcaggag ggagatgcat ctcggaaata ctgc 437權利要求
1. 一種用於檢測樣品中類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母，其特徵在於，該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達質粒和pGAD424-GRIP1酵母表達質粒，並且所述pGBT9-RXR酵母表達質粒包含維甲酸X的受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維甲酸X受體共激活因子基因片段。
2. 根據權利要求1所述的雙雜交酵母，其特徵在於，所述維曱酸X 受體基因為鼠維曱酸X受體基因或具有如SEQ ID No.l所示序列的鼠維曱 酸X受體基因片段。
3. 根據權利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特徵在於，該雙雜交酵 母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) RXR-GRIP1，其保藏編號為 CGMCC No .2305。
4. 根據權利要求1 、 2或3所述的雙雜交酵母，其特徵在於，所述類 維曱酸化合物選自天然維曱酸化合物、有機錫化合物、酚類化合物或其代 謝後具有酚類結構的化合物、鄰苯二甲酸酯類化合物和有機氯農藥類化合 物中的一種或幾種，並且所述的抗維甲酸化合物選自酚類化合物或其代謝 後具有酚類結構的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物和有機氯農藥類化合物中的一種或幾種。
5. —種製備權利要求1-4中任一項所述的雙雜交酵母的方法，其特徵 在於，該方法包括以下步驟(1) 純化包含維甲酸X受體基因的pGBT9-RXR酵母表達質粒；(2) 純化包含維曱酸X受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl酵 母表達質粒；(3) 構建雙雜交酵母，用所述的pGBT9-RXR質粒和所述的 pGAD424-GRIPl質粒轉化進入酵母細胞中，形成雙雜交酵母。
6. 根據權利要5所述的方法，其特徵在於所述的形成雙雜交酵母之後 還篩選所述的雙雜交酵母。
7. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的篩選雙雜交 酵母是採用營養缺陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜 交酵母。
8. 根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述的菌落轉移濾 膜分析是採用添加維曱酸的X-gal緩衝液的菌落轉移濾膜分析，並且所述 維曱酸優選為9-順維甲酸，所述X-gal緩衝液優選為20mg . mL"的5-溴 -4-氯-3-吲哚-(3 -D-半乳糖苷的二曱基甲醯胺溶液。
9. 根據權利要求7或8所述的製備方法，其特徵在於，所述營養缺陷 型篩選中採用的培養基為不添加亮氨酸和色氨酸的SD培養基，其中包含 20 mg/L腺噪呤半硫酸鹽、20 mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L —水合鹽酸組氨 酸、30mg/L異亮氨酸、30mg/L鹽酸賴氨酸、20 mg/L曱碌^氨酸、50 mg/L 苯丙氨酸、200mg/L蘇氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嗜咬、150mg/L 纈氨酸和6.7g/L無胺基酸酵母氮源。
10. 權利要求1-4中任一項所述的雙雜交酵母用於檢測類維曱酸化合 物的生物測試方法，該方法包括如下步驟(1) 首先將雙雜交酵母細胞分別接種於已知系列濃度維曱酸培養液， 形成菌液，培養2-4小時；(2) 培養結束後，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應 液進行反應30-60分鐘，檢測上清液在420nm處的吸光度值，並以此作為 表示p-半乳糖苷酶活性的參數；(3 )根據所述的系列濃度維曱酸相對於它所對應的P-半乳糖苷酶活 性的參數繪製|3-半乳糖苦酶活性的誘導劑量-效應關係標準曲線；(4)將所述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，終止反應後檢測反應上清液在420nm處 的吸光度值，對照所述的p-半乳糖苷醇活性的誘導劑量-效應關係標準曲 線計算出待測樣品中類維曱酸化合物的含量，所述的待測樣品優選為環境 樣品中的有機溶劑提取液，其中的類維甲酸濃度為1(T9~ l(T7mol/L。
11. 權利要求1-4中任一項所述的雙雜交酵母用於檢測抗維曱酸化合 物的生物測試方法，該方法具體包括如下步驟(1 )首先將雙雜交酵母細胞分別與接種於已知系列濃度的抗維曱酸 化合物的培養液，形成菌液，並向所述的菌液中添加已知濃度維曱酸，共 培養2-4小時，所述的維曱酸優選濃度為5xl(T7 ~5xl(T6mol/L的9-順維甲 酸；(2)培養結束後，向菌液中加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷反應液 進行反應，直到菌液出現黃色，4企測上清液在420nm處的吸光度值，並以此作為表示P-半乳糖苷酶活性的參數；(3) 根據所述的系列濃度的抗維曱酸化合物相對它所對應的(3-半乳 糖苷酶活性的參數繪製P-半乳糖香酶活性誘導的劑量-效應關係標準曲 線；(4) 將所述的菌液與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳 糖苷反應液進行反應，終止反應後檢測反應上清液在420nm處的吸光度 值，對照步驟(3)制定的標準曲線計算出待測樣品中抗維甲酸化合物的 含量。
12. 根據權利要求11所述的生物測試方法，其特徵在於，待測樣品為 環境樣品中的有機溶劑提取液，並且所述的抗維曱酸化合物的濃度為 10-8~ l(T5 mol/L。
13. 根據權利要求10或11所述的生物測試方法，其特徵在於，在步 驟(l)中，將所述的雙雜交酵母細胞接種前，調節維曱酸培養液在600nm 處的吸光度值為0.1-0.2，並且在步驟(2)培養結束後，調節菌液在600nm 處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
全文摘要
本發明提供一種用於檢測環境樣品中類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母及其製備方法，其中該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達質粒和pGAD424-GRIP1酵母表達質粒，其中pGBT9-RXR酵母表達質粒包含維甲酸X受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達質粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維甲酸X受體共激活因子基因片段。本發明提供還提供了一種所述的雙雜交酵母檢測環境中類/抗維甲酸化合物的生物測試方法。採用該方法，使得β-半乳糖苷酶的表達增強，檢測靈敏度大大提高，構建的酵母細胞基因性狀穩定，易於培養、篩選，整個類/抗維甲酸效應的篩選過程操作簡單，所需樣品量少，成本低廉。
文檔編號C12N1/19GK101469316SQ20071030851
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者劍 李, 王子健, 饒凱鋒, 梅 馬 申請人:中國科學院生態環境研究中心