載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系及製備方法

2023-10-22 11:54:47 1

專利名稱：載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系及製備方法
技術領域：
本發明屬於生物材料和藥劑學交叉的技術領域，特別涉及可儲存和控制胰島素聚集體釋放的體系及製備方法。
背景技術：
研究顯示，對糖尿模型動物單次皮下注射牛胰島素聚集體(簡稱B-SIA) 200 μ g，可以控制其體內血糖濃度正常120天，對糖尿病模型動物單次皮下注射重組人胰島素聚集體(簡稱rH-SIA)200yg，可以控制體其內血糖濃度正常140天，但對糖尿病模型動物單次皮下注射胰島素聚集體400 μ g,則會導致過度低血糖(見Gupta, S., Chattopadhyay, T.,Singh，M.P.，et al.，Supramolecular insulin assembly II for a sustained treatmentof type I diabetes mellitus.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2010，107:13246-13251.);對糖尿病模型動物單次皮下注射豬胰島素聚集體(簡稱P_SIA)200yg，可以控制其體內血糖濃度正常129天。研究還顯示，由於各種原因(例如缺乏智能響應性的控制釋放)導致的胰島素劑量控制不當會極大增加各種癌症的發病率和致死率(見Smith，U.，Gale，E.A.M.，Does diabetes therapy influence the risk of cancer Diabetologia 2009，52:1699-1708.)。病例報導顯示，長期直接使用胰島素的部位有可能產生胰島素的沉積而導致澱粉樣變形病(見 Dische, F.E.，ffernstedt, C.，ffestermark, G.T.，et al.，Insulin asan amyloid-fibril protein at sites of repeated insulin injection in a diabeticpatient.Diabetologia 1988,31:158-161.)。因而，非常有必要構建能負載並控制胰島素聚集體釋放的智能響應性系統。

發明內容

本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系及製備方法，所述藥物控釋體系不僅可延長糖尿病模型動物體內血糖濃度正常的時間，而且可智能響應性控制所載胰島素的釋放。本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，有下述兩種類型。1、第一種類型:基底為非胰島素聚集體此種類型的藥物控釋體系由基底及重疊或包覆在基底上的具有pH敏感性的聚合物層和胰島素聚集體層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體；或由基底及重疊或包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層組成，基底、具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體；所述基底為平板、微球或醫療器械，所述平板或微球由有機玻璃、石英、雲母中的一種製作。上述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，具有pH敏感性的聚合物層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有pH敏感性的聚合物層、胰島素聚集體層的所有組合方式，或具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層的所有組合方式。2、第二種類型:基底為胰島素聚集體此種載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，由基底及包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層和蛋白質層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、蛋白質層相互之間通過靜電作用結合成一體；或由基底及包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層組成，基底、具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體；所述基底為胰島素聚集體顆粒。上述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，具有pH敏感性的聚合物層和蛋白質層在基底上的包覆順序可以是具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層的所有組合方式，或具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層的所有組合方式。上述兩種載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，所述胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種。所述具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯 、殼聚糖中的一種，分子量為I lOOOkda。所述蛋白質為葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶。本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系的製備方法，有以下兩種:1、第一種方法第一種方法用於製備上述第一種類型的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，工藝步驟如下:(I)配製原料溶液或懸濁液原料溶液或懸濁液為具有pH敏感性的聚合物溶液和胰島素聚集體懸濁液，或具有pH敏感性的聚合物溶液、胰島素聚集體懸濁液和蛋白質溶液；所述具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N- 二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯、殼聚糖中的一種，分子量為I IOOOkda ;用pH值為I 7的鹽酸水溶液、乙酸溶液或去離子水將具有pH敏感性的聚合物配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液，若具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯或聚甲基丙烯酸酯，則再加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.01 5mol/L為限；所述胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將胰島素聚集體配製成濃度為0.015 100mg/mL的懸池液；所述蛋白質為葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶；用pH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將蛋白質配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液；(2)處理基底表面使其帶電荷；
(3)組裝重疊層或包覆層將具有pH敏感性的聚合物溶液、胰島素聚集體懸濁液和/或蛋白質溶液用旋塗、浸塗或噴塗的方法按照所述藥物控釋體系的結構重疊或包覆在基底上和在前的重疊或包覆物上，在製備每一層重疊或包覆物時，靜置O-lOOmin，並將形成所述重疊或包覆物的多餘溶液或懸濁液用去離子水衝洗、離心或透析的方法去掉並乾燥，即得到載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系；所述基底為平板、微球或醫療器械，所述平板或微球由有機玻璃、石英、雲母中的一種製作。2、第二種方法第二種方法用於製備上述第二種類型的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，工藝步驟如下:(I)配製原料溶液或懸濁液原料溶液或懸濁液為具有pH敏感性的聚合物溶液和蛋白質溶液，或具有pH敏感性的聚合物溶液、蛋白質溶液和胰島素聚集體懸濁液；所述具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N- 二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯、殼聚糖中的一種，分子量為I IOOOkda ;用pH值為I 7的鹽酸水溶液、乙酸溶液或去離子水將具有pH敏感性的聚合物配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液，若具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯或聚甲基丙烯酸酯，則再加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.01 5mol/L為限；所述胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將胰島素聚集體配製成濃度為0.015 100mg/mL的懸池液；所述蛋白質為葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶；用pH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將蛋白質配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液；(2)製備胰島素聚集體基底將胰島素聚集體用pH 2 5的乙酸或鹽酸溶液配製成濃度為I 100mg/mL懸濁液，然後用NaOH溶液調節聚集體懸濁液的pH值至6 10，然後加入NaCl，NaCl的加入量以混合液中NaCl的濃度達到0.5 5mol/L,在室溫、常壓下攪拌混合I 20h,繼後離心分離，獲帶負電荷的顆粒狀胰島素聚集體基底；(3)組裝包覆層將具有pH敏感性的聚合物溶液和蛋白質溶液採用與基底混合和與在前的包覆物混合的方法按照所述藥物控釋體系的結構包覆在基底上和在前的包覆物上，或將具有PH敏感性的聚合物溶液、蛋白 質溶液和胰島素聚集體懸濁液採用與基底混合和與在前的包覆物混合的方法按照所述藥物控釋體系的結構包覆在基底上和在前的包覆物上，在製備每一層包覆物時，攪拌至少lOmin，並將形成所述包覆物的多餘溶液或懸濁液用去離子水衝洗、離心或透析的方法去掉，即得到載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系。本發明所述方法中，牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體的製備方法見下述文獻:
IΛGupta, S.，Chattopadhyay, T.，Singh, M.P.，et al.，Supramolecular insulinassembly II for a sustained treatment of type I diabetes mellitus.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2010，107:13246-13251.
本發明所述方法中，豬胰島素聚集體的製備方法如下:將豬胰島素用溶液配製成濃度在0.01mg/mL-400mg/mL之間的溶液，將該溶液置於反應容器中在攪拌下於常壓、5 60°C反應I 300h，反應時間屆滿後，得豬胰島素聚集體懸濁液，然後將豬胰島素聚集體懸濁液冷凍乾燥即得到豬胰島素聚集體；所述溶液為鹽酸水溶液，或醋酸水溶液，或鹽酸和醋酸的混合水溶液，或為磷酸鹽緩衝液，或為檸檬酸緩衝液，或為氫氧化鈉水溶液，它們的pH值在I 14之間。本發明具有以下有益效果:1、試驗表明，將本發明所述藥物控釋體系埋植於糖尿病模型動物皮下，可以控制其體內正常血糖濃度達295天(見實施例7)，與現有技術相比，大大延長了單次用藥控制體內正常血糖濃度的時間。2、本發明所述藥物控釋體系具有葡萄糖濃度響應性能，是一種智能響應性的胰島素控制釋放體系。3、本發明所述藥物控釋體系中的聚合物和蛋白質均為無毒性、生物相容性好的物質，因而其生物相容性好，對機體無毒副作用。4、本發明所述方法操作簡單，便於工業化生產。


圖1是本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系的一種結構示意圖，圖中，1:基底；2:具有pH敏感性的聚合物層；3:胰島素聚集體層；4:葡萄糖氧化酶層；5:過氧化氫酶層。圖2是實施例1所製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系在葡萄糖溶液中智能響應性的雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)圖片，其中，圖2(a)為在濃度Og/L葡萄糖溶液中智能關閉的雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)圖片，圖2(b)為在濃度5g/L葡萄糖溶液中智能打開的雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)圖片。圖3是將本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系埋植在糖尿病模型動物體內，其體內血糖濃度的變化曲線。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系及其製備方法和應用作進一步說明。實施例1本實施例的工藝步驟如下:(I)製備豬胰島素聚集體將豬胰島 素用pH值為6.5的磷酸鹽緩衝溶液配製成濃度為10mg/mL的溶液，將該溶液置於反應容器中在攪拌下於常壓、35°C反應26h，反應時間屆滿後，得豬胰島素聚集體懸濁液，然後將豬胰島素聚集體懸濁液在_80°C冷凍乾燥15h即得到豬胰島素聚集體(在下述描述中簡稱P-SIA)；(2)配製原料溶液或懸濁液將分子量為120kda的星型聚合物:聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯(在下述描述中簡稱Star-PDMAEMA)用pH值為5的鹽酸水溶液配製成濃度為0.5mg/mL的溶液，然後加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.2mol/L為限；將步驟(I)製備的P-SIA用去離子水配製成濃度為2mg/mL的P-SIA懸濁液；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱G0D)粉末用pH值為6的鹽酸水溶液配製成濃度為3mg/mL的GOD溶液；將過氧化氫酶(在下述描述中簡稱CAT)粉末用去離子水配製成濃度為2mg/mL的CAT溶液；(3)處理基底基底為有機玻璃片，其長度為2cm、寬度為2cm、厚度為2mm。首先用去離子水清洗3次，然後在體積比為1:1的去離子水與異丙醇的混合液中浸泡15分鐘，再放入體積比5:1:1的去離子水/質量濃度30% H2O2/質量濃度29%氨水的混合溶液中，在70°C水浴條件下浸泡10分鐘，繼後用去離子水衝洗後乾燥，即獲得表面帶負電荷的有機玻璃片。(4)組裝覆蓋層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，Star-PDMAEMA層、P-SIA層、GOD層、CAT層在基底上的重疊順序為:{(Star-PDMAEMA/P-SIA) 2+ (Star-PDMAEMA/CAT)!+ (Star-PDMAEMA/GOD) J 2+Star-PDMAEMA,其結構見圖1。按照上述結構，首先在室溫、常壓下將步驟⑵配製的Star-PDMAEMA溶液150 μ L塗覆於經過表面處理的有機 玻璃片表面，吸附30min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾；再將步驟⑵配製的P-SIA懸濁液200yL塗覆於Star-PDMAEMA層表面，吸附40min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾；重複上述操作，得到2個Star-PDMAEMA/P-SI雙分子層。在室溫、常壓下將步驟⑵配製的Star-PDMAEMA 150yL溶液塗覆於P-SIA層表面，吸附30min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾，再將步驟(2)配製的CAT溶液150 μ L塗覆於Star-PDMAEMA層表面，吸附40min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾，得到I個Star-PDMAEMA/CAT雙分子層。在室溫、常壓下將步驟⑵配製的Star-PDMAEMA溶液150 μ L塗覆於CAT層表面，吸附30min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾，再將步驟(2)配製的GOD溶液200 μ L塗覆於Star-PDMAEMA層表面，吸附40min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾；重複上述操作，得到2個Star-PDMAEMA/GOD雙分子層。至此，在基底上形成了下述覆蓋順序的「(Star-PDMAEMA/P-SIA)2+(Star-PDMAEMA/CAT) J(Star-PDMAEMAAiOD)2」的10層覆蓋層。重複上述操作，得到基底上形成了下述覆蓋順序的「 {(Star-PDMAEMA/P-SIA) 2+ (Star-PDMAEMA/CAT)汴(Star-PDMAEMA/GOD) 2} 2 」的 20 層覆蓋層。最後，在室溫、常壓下將150 μ L Star-PDMAEMA溶液塗覆於GOD層上，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾，即得到圖1所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系。在室溫、常壓下，將本實施例所製備的載有胰島素聚集體的藥物控釋體系分別放入濃度Og/L葡萄糖溶液中和5g/L的葡萄糖溶液中，其雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)圖片見圖2，從圖2可以看出，在Og/L葡萄糖溶液中本體系處於關閉狀態，而在5g/L的葡萄糖溶液中本體系處於開放狀態。
實施例2本實施例的工藝步驟如下:(I)製備牛胰島素聚集體將牛胰島素用pH值為5.9的鹽酸水溶液配製成濃度為0.01mg/mL的溶液，將該溶液置於反應容器中在攪拌下於常壓、25°C反應43h，反應時間屆滿後，得牛胰島素聚集體懸濁液，然後將牛胰島素聚集體懸濁液在_60°C冷凍乾燥18h即得到牛胰島素聚集體(在下述描述中簡稱B-SIA)；(2)配製原料溶液將分子量為170kda的星型聚合物:聚甲基丙烯酸_N，N-二甲氨基乙酯(在下述描述中簡稱Star-PDMAEMA)用pH值為6.2的鹽酸水溶液配製成濃度為10mg/mL的溶液，然後加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.lmol/L為限；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱GOD)粉末用pH值為6的鹽酸水溶液配製成濃度為10mg/mL的GOD溶液；將過氧化氫酶(在下述描述中簡稱CAT)粉末用pH值為6的鹽酸水溶液配製成濃度為10mg/mL的CAT溶液；(3)製備胰島素聚集體基底將步驟(I)製備的B-SIA用pH值為3的鹽酸溶液配製成濃度為100mg/mL的B-SIA懸濁液，然後用濃度lmol/L的NaOH溶液調節B-SIA懸濁液的pH值至6 (牛胰島素等電點以上)，再加入NaCl，NaCl的加入量以混合液中NaCl的濃度達到0.5mol/L為限，在室溫、常壓下攪拌混合lh，繼後以1000轉 /分的轉速離心5min，獲帶負電荷的顆粒狀B-SIA基底。(4)組裝包覆層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，Star-PDMAEMA層、GOD層、CAT層在顆粒狀B-SIA基底上的包覆順序為:(Star-PDMAEMA/GOD) 2+ (Star-PDMAEMA/CAT) J (Star-PDMAEMA/GOD) 2+Star_PDMAEMA。按照上述結構，在室溫、常壓下將步驟(3)製備的顆粒狀B-SIA基底20mg與步驟(2)配製的Star-PDMAEMA溶液5mL通過攪拌的方式混合,攪拌時間20min,攪拌時間屆滿後，以1000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度ImM的HCl與濃度0.5M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲包覆有Star-PDMAEMA層的微粒；在室溫、常壓下將包覆有Star-PDMAEMA層的微粒與步驟(2)配製的GOD溶液3mL通過攪拌的方式混合，攪拌時間20min，攪拌時間屆滿後，以1000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度ImM的HCl與濃度0.5M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲依次包覆有Star_PDMAEMA、GOD層的微粒，即I個Star-PDMAEMA/GOD雙分子層。重複上述操作,得到2個Star-PDMAEMA/GOD雙分子層。在室溫、常壓下將依次包覆有Star-PDMAEMA、GOD層、Star-PDMAEMA、GOD層的微粒與步驟(2)配製的Star-PDMAEMA溶液5mL通過攪拌的方式混合，攪拌時間20min，攪拌時間屆滿後，以1000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度ImM的HCl與濃度
0.5M的NaCl混合液洗滌、離心2次；在室溫、常壓下將前述微粒與步驟(2)配製的CAT溶液ImL通過攪拌的方式混合,攪拌時間20min,攪拌時間屆滿後，以1000轉/分的轉速離心5min,然後將所獲沉澱用濃度ImM的HCl與濃度0.5M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲I個Star-PDMAEMA/CAT雙分子層。至此，在基底上形成了下述包覆順序的「(Star-PDMAEMA/GOD) 2+ (Star-PDMAEMA/CAT)! 」的6層包覆層。重複上述操作，在基底上形成了下述包覆順序的「(Star-PDMAEMA/GOD) J(Star-PDMAEMAZCAT)1+(Star-PDMAEMA/GOD)2」 的 IO 層包覆層。最後，在室溫、常壓下上述10層包覆層的微粒與步驟(2)配製的Star-PDMAEMA溶液2mL通過攪拌的方式混合，攪拌時間20min,攪拌時間屆滿後，以1000轉/分的轉速離心5min,然後將所獲沉澱用濃度ImM的HCl與濃度0.5M的NaCl混合液洗滌、離心2次，即得到本實施例所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，將所製得的微球狀藥物控釋體系在-60°C凍乾乾燥17h。實施例3本實施例的工藝步驟如下:(I)製備重組人胰島素聚集體將重組人胰島素用pH值為4.9的醋酸水溶液配製成濃度為400mg/mL的溶液，將該溶液置於反應容器中在攪拌下於常壓、5°C反應48h，反應時間屆滿後，得重組人胰島素聚集體懸濁液，然後將重組人胰島素聚集體懸濁液在_80°C冷凍乾燥9h即得到重組人胰島素聚集體(在下述描述中簡稱rH-SIA)；(2)配製原料溶液將分子量為IOkda的殼聚糖用pH值為6.2的乙酸水溶液配製成濃度為lmg/mL的殼聚糖溶液；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱G0D)粉末用pH值為5的鹽酸水溶液配製成濃度為3mg/mL的GOD溶液。(3)製備胰島素聚集體基底將步驟(I)製備的rH-SIA用pH值為5的鹽酸溶液配製成濃度為lmg/mL的rH_SIA懸濁液，然後用濃度0.1N的NaOH溶液調節rH-SIA懸濁液的pH值至10，然後加入NaCl，NaCl的加入 量以混合液中NaCl的濃度達到5mol/L為限，在室溫、常壓下攪拌混合20h，繼後以3000轉/分的轉速離心15min，獲帶負電荷的顆粒狀rH-SIA基底。(4)組裝包覆層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，殼聚糖層、GOD層在顆粒狀rH-SIA基底上的包覆順序為:(殼聚糖/G0D) 1(|。按照上述結構，在室溫、常壓下將步驟(3)製備的顆粒狀rH-SIA基底IOmg與步驟(2)配製的殼聚糖溶液5mL通過攪拌的方式混合,攪拌時間60min,攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲包覆有殼聚糖層的微粒；在室溫、常壓下將包覆有殼聚糖層的微粒與步驟(2)配製的GOD溶液ImL通過攪拌的方式混合,攪拌時間IOmin,攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲依次包覆有殼聚糖層、GOD層的微粒，即I個殼聚糖/GOD雙分子層。重複上述操作，在基底上形成了下述包覆順序的「(殼聚糖/G0D)1(l」的20層包覆層，即本實施例所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，將所製得的微球狀藥物控釋體系在_80°C凍乾乾燥9h。實施例4本實施例的工藝步驟如下:(I)製備重組人胰島素聚集體將重組人胰島素用pH值為6的檸檬酸水溶液配製成濃度為200mg/mL的溶液，將該溶液置於反應容器中在攪拌下於常壓、30°C反應30h，反應時間屆滿後，得重組人胰島素聚集體懸濁液，然後將重組人胰島素聚集體懸濁液在-70°C冷凍乾燥12h即得到重組人胰島素聚集體(在下述描述中簡稱rH-SIA)；(2)配製原料溶液將分子量為Ikda的線型聚合物:聚丙烯酸二甲氨基乙酯(在下述描述中簡稱PDMAEA)用pH值為5的鹽酸水溶液配製成濃度為0.5mg/mL的溶液，然後加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.6mol/L為限；將將步驟(I)製備的rH-SIA用去離子水配製成濃度為lmg/mL的rH_SIA懸濁液；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱G0D)粉末用pH值為6的鹽酸水溶液配製成濃度為2mg/mL的GOD溶液；(3)處理基底基底為雲母片，其長度為2cm、寬度為2cm、厚度為2mm，處理方法與實施例1相同。(4)組裝覆蓋層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，PDMAEA 層、rH-SIA 層、GOD 層在基底上的重疊順序為:(PDMAEA/rH_SIA/PDMAEA/GOD) 2。按照上述結構，在室溫、常壓下將步驟(2)配製的PDMAEA溶液100 μ L旋塗於經過表面處理的雲母片表面，吸附60min，然後透析處理多餘的PDMAEA溶液；將步驟(2)配製的rH-SIA懸濁液100 μ L塗覆於PDMAEA層表面，吸附5min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾；將步驟⑵配製的PDMAEA溶液100 μ L旋塗於rH-SIA層表面，吸附20min，然後透析處理多餘的PDMAEA溶液；將步驟(2)配製的GOD溶液200 μ L旋塗於PDMAEA層表面，吸附lOmin，然後離心處理多餘GOD溶液，得到I個PDMAEA/rH_SIA/PDMAEA/GOD四分子層。重複上述操作，得到基底上形成了下述覆蓋順序的「(PDMAEA/rH-SIA/PDMAEA/GOD)2」的8層覆蓋層，即本實施例所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系。實施例5本實施例的工藝步驟如下:(I)製備豬胰島素聚集體豬胰島素聚集體(在下述描述中簡稱P-SIA)的製備方法與實施例1相同。(2)配製原料溶液將分子量為IOOOkda的線型聚合物:聚丙烯酸二甲氨基乙酯(在下述描述中簡稱PDMAEA)用pH值為5.2的鹽酸水溶液配製成濃度1.5mg/mL的溶液，然後加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.3mol/L為限；將將步驟(I)製備的P-SIA用去離子水配製成濃度為2mg/mL的P-SIA懸濁液；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱GOD)粉末用pH值為6的鹽酸水溶液配製成濃度為2mg/mL的GOD溶液；(3)處理基底基底為聚氨酯材質的導管表面，處理方法同實施例1。(4)組裝覆蓋層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，PDMAEA 層、P-SIA 層、GOD 層在基底上的重疊 順序為:PDMAEA/P_SIA/PDMAEA/GOD。
按照上述結構，在室溫、常壓下將步驟(2)配製的PDMAEA溶液150 μ L旋塗於經過表面處理的導管表面，吸附20min，然後透析處理多餘的PDMAEA溶液；將步驟(2)配製的P-SIA懸濁液100 μ L旋塗於PDMAEA層表面，吸附15min，然後用去離子水清洗表面，並用氮氣吹乾；將步驟⑵配製的PDMAEA溶液200 μ L旋塗於P-SIA層表面，吸附lOmin，然後透析處理多餘的PDMAEA溶液；將步驟(2)配製的GOD溶液200 μ L旋塗於PDMAEA層表面，吸附lOmin，然後離心處理多餘GOD溶液。得到基底上形成了下述覆蓋順序的「PDMAEA/P-SIA/PDMAEA/GOD」的4層覆蓋層，即本實施例所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系。實施例6本實施例的工藝步驟如下:(I)製備豬胰島素聚集體豬胰島素聚集體(在下述描述中簡稱P-SIA)的製備方法與實施例1相同。(2)配製原料溶液將分子量為25kda的殼聚糖用用pH值為5.2乙酸水溶液配製成濃度為2mg/mL的殼聚糖溶液；將步驟(I )製備的P-SIA用pH值為5的鹽酸溶液配製成濃度lmg/mL的P-SIA懸濁液；將葡萄糖氧化酶(在下述描述中簡稱GOD)粉末溶解於pH為5的鹽酸溶液中，配成濃度為lmg/mL的溶液。(3)製備胰島素聚集體基底將步驟(I)製備的P-SIA用pH值為5的鹽酸溶液配製成濃度為25mg/mL的P-SIA懸濁液，然後用濃度2N的NaOH溶液調節B-SIA懸濁液的pH值至8，然後加入NaCl，NaCl的加入量以混合液中NaCl的濃度達到4N為限，在室溫、常壓下攪拌混合8h，繼後以3000轉/分的轉速離心5min，獲帶負電荷的顆粒狀P-SIA基底。(4)組裝包覆層本實施例製備的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系中，殼聚糖層、P-SIA層、GOD層在顆粒狀P-SIA基底上的包覆順序為:(殼聚糖/GOD/殼聚糖/P-SIA)4。按照上述結構，在室溫、常壓下將步驟(3)製備的顆粒狀P-SIA基底IOmg與步驟(2)配製的殼聚糖溶液5mL通過攪拌的方式混合,攪拌時間60min,攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲包覆有殼聚糖層的微粒；在室溫、常壓下將包覆有殼聚糖層的微粒與步驟
(2)配製的GOD溶液3mL通過攪拌的方式混合,攪拌時間IOmin,攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲依次包覆有殼聚糖層、GOD層的微粒；在室溫、常壓下將包覆有殼聚糖層、GOD層的微粒與步驟(2)配製的殼聚糖溶液5mL通過攪拌的方式混合，攪拌時間20min，攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min，然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，獲依次包覆有殼聚糖層、GOD層、殼聚糖層的微粒；在室溫、常壓下將包覆有殼聚糖層、GOD層、殼聚糖層的微粒與步驟(2)配製的P-SIA懸濁液2mL通過攪拌的方式混合，攪拌時間15min,攪拌時間屆滿後，以3000轉/分的轉速離心5min,然後將所獲沉澱用濃度2mM的HCl與濃度0.7M的NaCl混合液洗滌、離心2次，得到I個殼聚糖/GOD/殼聚糖/P-SIA四分子層。重複上述操作，在基底上形成了下述包覆順序的「(殼聚糖/GOD/殼聚糖/P-SIA)/』的16層包覆層，即本實施例所述結構的載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，將所製得的微球狀藥物控釋體系在_80°C凍乾乾燥10h。實施例7動物實驗採用健康8周SD大鼠，體重210 240g。SD大鼠共20隻，隨機分為兩組，每組10隻，其中一組為試驗組，一組為健康對照組。將試驗組大鼠禁食12h後腹腔注射用檸檬酸緩衝液以4mg/mL的濃度冰浴溶解的鏈脲佐菌素，按空腹體重50mg/kg注射構建糖尿病大鼠模型，注射一周後空腹血糖值大於16.7mmol/L( = 300mg/dl)的大鼠為患糖尿病的大鼠。在患糖尿病大鼠皮下埋植實施例1製備的載有豬胰島素聚集體的藥物控釋體系，所有大鼠全天自由取水和飼料。監測大鼠血糖的方法是將大鼠尾靜脈取出的血用一觸式血糖監測系統(OneTouch UltraEasy , LifeScan, Inc.Milpitas, CA.)測出。試驗結果見圖3，從圖3可以看出，使用本發明所述藥物控釋體系，單次用藥可以控制患糖尿病大鼠體內的正常 血糖濃度達295天。
權利要求
1.一種載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於由基底及重疊或包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層和胰島素聚集體層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體； 或由基底及重疊或包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層組成，基底、具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體； 所述基底為平板、微球或醫療器械，所述平板或微球由有機玻璃、石英、雲母中的一種製作。
2.根據權利要求1所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於具有PH敏感性的聚合物層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有pH敏感性的聚合物層、胰島素聚集體層的所有組合方式，或具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層的所有組合方式。
3.一種載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於由基底及包覆在基底上的具有PH敏感性的聚合物層和蛋白質層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、蛋白質層相互之間通過靜電作用結合成一體； 或由基底及包覆在 基底上的具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層組成，基底、具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體； 所述基底為胰島素聚集體顆粒。
4.根據權利要求3所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於具有PH敏感性的聚合物層和蛋白質層在基底上的包覆順序可以是具有pH敏感性的聚合物層、蛋白質層的所有組合方式，或具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層在基底上的包覆順序可以是具有PH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層的所有組合方式。
5.根據權利要求1至4中任一權利要求所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種。
6.根據權利要求1至4中任一權利要求所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯、殼聚糖中的一種，分子量為I lOOOkda。
7.根據權利要求1至4中任一權利要求所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，其特徵在於蛋白質為葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶。
8.—種權利要求1或2所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系的製備方法，其特徵在於工藝步驟如下: (I)配製原料溶液或懸濁液 原料溶液或懸濁液為具有PH敏感性的聚合物溶液和胰島素聚集體懸濁液，或具有pH敏感性的聚合物溶液、胰島素聚集體懸濁液和蛋白質溶液；所述具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯、殼聚糖中的一種，分子量為I IOOOkda ;用pH值為I 7的鹽酸水溶液、乙酸溶液或去離子水將具有pH敏感性的聚合物配製成濃度為0.015 lOOmg/mL的溶液，若具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯或聚甲基丙烯酸酯，則再加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.01 5mol/L為限； 所述胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將胰島素聚集體配製成濃度為0.015 100mg/mL的懸池液； 所述蛋白質為葡萄 糖氧化酶或過氧化氫酶；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將蛋白質配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液； (2)處理基底表面使其帶電荷； (3)組裝重疊層或包覆層 將具有PH敏感性的聚合物溶液、胰島素聚集體懸濁液和/或蛋白質溶液用旋塗、浸塗或噴塗的方法按照所述藥物控釋體系的結構重疊或包覆在基底上和在前的重疊或包覆物上，在製備每一層重疊或包覆物時，靜置O-lOOmin，並將形成所述重疊或包覆物的多餘溶液或懸濁液用去離子水衝洗、離心或透析的方法去掉並乾燥，即得到載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系； 所述基底為平板、微球或醫療器械，所述平板或微球由有機玻璃、石英、雲母中的一種製作。
9.一種權利要求3或4所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系的製備方法，其特徵在於工藝步驟如下: (1)配製原料溶液或懸濁液 原料溶液或懸濁液為具有PH敏感性的聚合物溶液和蛋白質溶液，或具有pH敏感性的聚合物溶液、蛋白質溶液和胰島素聚集體懸濁液； 所述具有PH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯酸酯、殼聚糖中的一種，分子量為I IOOOkda ;用pH值為I 7的鹽酸水溶液、乙酸溶液或去離子水將具有pH敏感性的聚合物配製成濃度為0.015 lOOmg/mL的溶液，若具有pH敏感性的聚合物為聚甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、聚甲基丙烯醯胺丙基二甲基胺、聚丙烯酸二甲氨基乙酯或聚甲基丙烯酸酯，則再加入NaCl，NaCl的加入量以其在混合液中的濃度達到0.01 5mol/L為限； 所述胰島素聚集體為牛胰島素聚集體、重組人胰島素聚集體、豬胰島素聚集體中的一種；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將胰島素聚集體配製成濃度為0.015 100mg/mL的懸池液； 所述蛋白質為葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶；用PH值為3 8的鹽酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液或去離子水將蛋白質配製成濃度為0.015 100mg/mL的溶液； (2)製備胰島素聚集體基底 將胰島素聚集體用pH 2 5的乙酸或鹽酸溶液配製成濃度為I 100mg/mL懸池液，然後用NaOH溶液調節聚集體懸濁液的pH值至6 10，然後加入NaCl，NaCl的加入量以混合液中NaCl的濃度達到0.5 5mol/L，在室溫、常壓下攪拌混合I 20h，繼後離心分離，獲帶負電荷的顆粒狀胰島素聚集體基底； (3)組裝包覆層 將具有PH敏感性的聚合物溶液和蛋白質溶液採用與基底混合和與在前的包覆物混合的方法按照所述藥物控釋體系的結構包覆在基底上和在前的包覆物上，或將具有PH敏感性的聚合物溶液、蛋白質溶液和胰島素聚集體懸濁液採用與基底混合和與在前的包覆物混合的方法按照所述藥物控釋體系的結構包覆在基底上和在前的包覆物上，在製備每一層包覆物時，攪拌至少lOmin，並將形成所述包覆物的多餘溶液或懸濁液用去離子水衝洗、離心或透析的 方法去掉，即得到載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系。
全文摘要
本發明所述載有胰島素聚集體的長效控制血糖濃度的藥物控釋體系，由基底及重疊或包覆在基底上的具有pH敏感性的聚合物層和胰島素聚集體層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體；或由基底及重疊或包覆在基底上的具有pH敏感性的聚合物層、蛋白質層和胰島素聚集體層組成，基底、具有pH敏感性的聚合物層、蛋白質層、胰島素聚集體層相互之間通過靜電作用結合成一體。其製備方法1、配製原料溶液或懸濁液；2、處理基底表面或製備基底；3、在基底上組裝覆蓋層或包裹層。
文檔編號A61K9/00GK103191417SQ201210002190
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者李建樹, 羅珺 申請人:四川大學