一種新的抗異種移植抗原位點合成酶反義基因克隆的製作方法
2023-10-28 16:43:27
專利名稱：一種新的抗異種移植抗原位點合成酶反義基因克隆的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的異種移植抗原位點合成酶反義基因技術領域，具體地說，是一種梅山豬異種抗原位點合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶)的外顯子大片段的反義基因克隆及其在哺乳動物細胞中的表達的方法。
人體器官或細胞終末期衰竭性疾病通過器官或細胞移植可以得到治癒。用於移植的器官或細胞必須儘量減少其免疫原性和免疫反應性。
八十年代，天然的未經生物工程改造的異種器官雖然開創了一代器官移植先河，在世界上首先成功應用與臨床心臟移植。但是，由於難於接受的異常劇烈的排斥反應的發生，在臨床長期存活的移植醫學中，目前異種器官移植終被同種異體移植代替。然而，人類器官難以獲得，近緣異種動物器官更加難以獲得。用基因工程改造易繁易養的遠緣異種動物獲取抗超急性排斥反應的器官或細胞在臨床上有廣闊應用前景。
1994年以來，已有學者獲得可用於醫用移植的重組人補體調節蛋白DAF基因轉基因動物，據稱可獲得抗排效果(G.A.Langford，et alProduction of pigs transgenic for human decay accelerating factor.Transplantation Proceedings 1994，26，3，1400-1401)。但是，目前尚未見臨床應用獲滿意效果的研究成果的報告發表。從生物學原理看，這種生物工程轉基因動物的器官中異種抗原並未消除。這種方式僅僅對抗補體免疫效應，補體殺傷以外的許多其它免疫排斥效應無法消除。異種器官移植後人的免疫球蛋白與供體器官細胞表面不斷表達的異種移植抗原進行識別和反應後啟動了機體許多方面超急性反應體系，例如凝血系統、激肽系統、炎症介質系統和免疫吞噬系統等，導致兇猛的超急性排斥反應發生，使移植失敗。異種抗原不消除，難免對免疫識別和免疫反應防範不全。
為消除移植後受體對異種器官的免疫識別和免疫反應，可以用生物工程方法有效幹預異種抗原表達。本發明提供一種DNA產品和方法可以有效達到這個目的。
在發現中國人-梅山豬之間異種血型表位上半乳糖是人抗豬IgM所針對的主要抗原決定族分子(張良平等用流式細胞儀觀察半乳糖對異種排斥免疫反應的抑制作用。雷射醫學1996年第6卷2期55-58。)的基礎上，發明人發明了一種方法和產品用於消除供體器官的主要移植抗原的表達，從而獲得更有效的抗超急性排斥反應醫用移植動物和細胞。
目前基因工程動物的異種抗原位點合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶)基因克隆及其在哺乳動物細胞或體內表達主要遵循以下方法1、編碼異種抗原位點合成酶DNA片段的獲取主要有兩種方法一種是提取血細胞RNA，經逆轉錄合成cDNA文庫或提取DNA建基因組文庫，用特異引出物篩選克隆；另一種是用特異引物經PCR從RNA或DNA擴增得到該基因後再連接載體。2、構造反義基因常用各種在哺乳動物細胞內能有組成性表達做用的啟動子和增強子反向置於目的基因編碼區某片段的3』端，選用有效保護轉錄核酸的多聚腺苷信號置於目的基因的5』端。3、轉基因細胞株的構建重組質粒用磷酸鈣、脂質體、逆轉錄病毒、電穿孔或顯微注射等方法導入哺乳動物細胞(包括受精卵或體內或離體器官內)。
本發明質粒可用於豬、羊、牛、猴、鼠等多種哺乳動物的細胞用於消除供體細胞和器官的主要移種抗原的表達。細胞或受精卵或器官轉基因後異種抗原表達缺陷。
本發明還提供一對正逆向引物，其DNA序列為與(agTL)上遊和下遊匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL845』cgg gat ccg atacat tga gca tta ctt gga gga gtt ct；aL825′GCGTCGACGGCACAAT-TTAAAGTCAGATGTTATTTCTAACC3。
本發明還提供一種異種抗原位點合成酶基因片段DNA分子，707bp，第259位鹼基為G，已發表的文獻(Sandrin-GS，McKenzie-IFGal alpha(1，3)Gal，the major xenoantigen(s)recognized in pig by human natural antibodies.Immuno Rcv1994，141169-90.)為T；本發明還提供一種新的肽片段及其應用，包括用作免疫原生成單抗或抗原作檢測試劑或用作免疫耐受原用於移植受體獲得異種移植免疫耐受。
本發明還提供一種新的反義基因，其全序列為2550對鹼基組成；本發明提供一種新的反義基因重組質粒，其全序列為6375對鹼基組成。該質粒用於轉化受精卵轉化哺乳動物細胞得到穩定轉化的異種抗原缺陷細胞株或轉基因動物。或作為供核用於進行克隆動物的核移植，進而生產供體細胞或器官中減免主要異種抗原表達的有效抗超急性排斥反應醫用移植動物和細胞。本發明的質粒有傳代穩定，抑制效率高。
本發明還提供一種方法和產品用於消除供體器官的主要移植抗原的表達，從而生產更有效的抗超急性排斥反應醫用移植動物和細胞。這些可幫助解決臨床異種移植的相容性。用於治療器官毀損或終末衰竭疾病。
使用本發明中的可在哺乳動物細胞中表達和篩選的含有反義異種抗原位點合成酶的質粒，轉化哺乳動物細胞或受精卵或作為供核用於進行克隆動物的核移植，可產生供體細胞或器官中減免主要異種抗原表達的有效抗超急性排斥反應醫用移植動物和細胞。
實施本發明的技術要點是1、設計和合成引物，從新鮮血中提取中過梅山豬的外周血單個核細胞DNA，用上述引物、DNA、rTth DNA合成酶經聚合酶鏈法案應(PCR)合成和擴增梅山豬的異種抗原位點合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶)的外顯子大片段(αgal T)。酶切PCR產物，克隆到同酶切過的質粒載體pGEM7Z，粘端連接後轉化大腸桿菌JM109感受態菌；經篩選和限制性內切酶鑑定，得到重組分子為pZagTL84。用Sp6引物引導測序分析；2、構建反義agTL基因pCN84在agTL基因片段上遊側翼反向構築SV40 polyA信號序列和新黴素選擇基因(表達G418抗性的新黴素磷酸轉移酶基因)，在下遊側翼反向構築CMV啟動子序列和增強子序列及人造內含子序列，用內切酶鑑定插入方向正確，名為pCN84。其中反義agTL基因用T7引物引導測序分析正確。
3、豬成纖維細胞轉基因及選擇克隆用磷酸鈣沉澱法轉導線性反義agTL基因。用G418選擇陽性克隆細胞。提取陽性克隆的RNA，用T7引物與aL82進行RT-PCR反應檢測反義基因的轉錄效率；測定豬細胞轉基因後異種抗原表達缺陷。未轉基因細胞作對照組。FCM測定轉基因的豬成纖維細胞表面結合的人血清IgM試驗、測定補體介導細胞毒反應、測定人血凝集反應均證明該質粒和方法可用於消除供體器官的主要移植抗原的表達。
4、羊、牛、鼠成纖維細胞轉基因及選擇克隆同第3，磷酸鈣沉澱法轉導線性反義agTL基因。用G418選擇陽性克隆細胞。測定羊、牛、鼠細胞轉基因後異種抗原表達缺陷。異種的該同源反義基因可以抑制其它哺乳動物同源該基因表達；反義αgal-T大片段轉基因後可以抑制異種移植超急性排斥反應抗原表達。反義異種移植抗原基因的抗超急性排斥作用。這為異種細胞或器官移植提供了一個好模型。
下面通過實施例對本發明作進一步說明實施例一梅山豬α(1，3)半乳糖基轉移酶(αgal T)部分編碼序列的擴增和測序DNA片段克隆(1)用Beckman Oligo1000M DNA Syntheesizer合成與αgal T外顯子大片段(agTL)上遊和下遊匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL8484#5』cg-g gat ccg ata cat tga gca tta ctt ggagga gtt ct 38er；aL8282#5′-GC GTCGAC GGC ACA ATT TAA AGT CAGATG TTA TTT CTAACC3′41er；(2)用RT-PCR方法擴增agTL用上述引物進行PCR反應5ml梅山豬抗凝血淋巴細胞經典方法[7]提取DNA後，用0.5mlTE溶解。取2μl加100pM引物，並加入2u rTth熱合成酶，在PE公司2400型PCR儀上進行反應。反應參數94℃，3分鐘變性；熱循環94℃，20秒，56℃20秒，72℃50秒共28次循環。(3)PCR產物克隆到JM109PCR產物和質粒載體pGEM7Z用BamHI和SalI切成粘端後按文獻進行回收、連接、轉化限制性內切酶鑑定[8]。得到克隆名為pZagTL84。(4)對插入片段agTL測序分析用Sp6引物引導，按螢光標記雙脫氧末端終止法Kit(Perkin Elmer Co)說明書操作，上AppliedBiosystems 373 DNA Sequencer Sttretch自動測序儀測序。序列見表1。
表1.質粒pZagTL84中的agTL插入片段DNA序列gatacattga gcattacttg gaggagttct taatatctgc aaatacatacttcatggttg gccacaaagt catctttaac atcatggtgg atgatatctccaggatgcct ttgatagagc tgggtcctct gcgttccttt aaagtgtttgagatcaagtc cgagaagagg tggcaagaca tcagcagtat gcgcatgaagaccatcgggg agcacatcct ggcccacatc cagcacgagg tggacttcctcttctgcatg gacgtggatc aggtcttcca aaacaacttt ggggtggagaccctgggcca gtcggtggct cagctacagg cctggtggta caaggcacatcctgacgagt tcacctacga gaggcggaag gagtccgcag cctacattccgtttggccag ggggattttt attaccacgc agccattttt gggggaacacccactcaggt tctaaacatc actcaggagt gcttcaaggg aatcctccaggacaaggaaa atgacataga agccgagtgg catgatgaaa gccatctaaacaagtatttc cttctcaaca aacccactaa aatcttatcc ccagaatactgctgggatta tcatataggc atgtctgtgg atattaggat tgtcaagatagcttggcaga aaaaagagta taatttggtt agaaataaca tctgactttaaattgtgcc
709對鹼基來自模板。第683-685對為終止碼。
根據測定的DNA序列，推導出梅山豬異種抗原位點合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶(α[1，3]galactosyl-transferase))羧基端的230個胺基酸序列，見表2.。
表2.梅山豬異種抗原位點合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶(α[1，3]galactosyltransferase))羧基端的230個胺基酸序列YIEHYLEEFL ISANTYFMVG HKVIFNIMVD DISRMPLIEL GPLRSFKVFEIKSEKRWQDI SSMRMKTIGE HILAHIQHEV DFLFCMDVDQ VFQNNFGVETLGQSVAQLQA WWYKAHPDEF TYERRKESAA YIPFGQGDFY YMAAIGGTTPTQVLNITQEC FYGILQDYEN DIEAEWHDES HLNKYFLLNK PTKILSPEYCWDYHIGMSVD IRIVKIAWGK KEYNLVRNNI4、反義agTL基因的構建(1)用BamHI切開pZagTL84質粒，Klenow片段酶補平3』端。然後用Xbal切開。低溶點瓊脂糖回收721b插入片段。再連接進入pTargetT載體的Nhel和EcoRV位點間。轉化JM109菌並篩選克隆，用內切酶鑑定插入方向。得到質粒名為pCN84；菌種名為JM109+pCN84；(2)克隆質粒pCN84中反義agTL基因測序分析用T7引物引導。按上述方法用自動測序儀測序。其序列見表3.。質粒pCN84DNA全序列見表4。
表3.質粒pCN84中的反義編碼agTL基因插入片段DNA序列gctagactcg acggcacaat ttaaagtcag atgttatttc taaccaaattatactctttt ttctgccaag ctatcttgac aatcctaata tccacagacatgcctatatg ataatcccag cagtattctg gggataagat tttagtgggtttgttgagaa ggaaatactt gtttagatgg ctttcatcat gccactcggcttctatgtca ttttccttgt cctggaggat tcccttgaag cactcctgagtgatgtttag aacctgagtg ggtgttcccc caaaaatggc tgcgtggtaataaaaatccc cctggccaaa cggaatgtag gctgcggact ccttccgcctctcgtaggtg aactcgtcag gatgtgcctt gtaccaccag gcctgtagctgagccaccga ctggcccagg gtctccaccc caaagttgtt ttggaagacctgatccacgt ccatgcagaa gaggaagtcc acctcgtgct ggatgtgggccaggatgtgc tccccgatgg tcttcatgcg catcatgctg atgtcttgccacctcttctc ggacttgatc tcaaacactt taaaggaacg cagaggacccagctctatca aaggcatcct ggagatatca tccaccatga tgtaaaagatgactttgtgg ccaaccatga agtatgtatt tgcagatatt aagaactcctccaagtaatg ctcaatgtat cggatcatct ttcccggggg taccgtcgactgcggccgcg aattccaagc ttga774對鹼基。表4.含有反義異種抗原位點合成酶的質粒pCN84全DNA序列共6375個鹼基對。tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca100*atattggcta ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtacatttatattg gctcatgtcc aatatgaccg ccatgttggc attgattatt200gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccatatatggaggt ccgcgttaca taacttcgg taaatggccc gcctggctga300ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccatagtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac400ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccgccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca500gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattagtcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt600ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgtcaatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc700gtaacaactg cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtgtacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc800actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagtcagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta900aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaaggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac1000agagaagact cttgcgtttc 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5、梅山豬成纖維細胞轉基因及選擇克隆用磷酸鈣沉澱法轉導線狀反義agTL基因質粒純化的pCN84按1μg/μl加Scal內切酶1°，在37℃的1倍緩衝液中切開，純化待用。
豬成纖維細胞培養將梅山豬麻醉後無菌切取皮下組織1×0.5×0.3cm。剪碎洗滌後培養於RPMI1640完全培養基中，其中含20％小牛血清，培養於5％CO2、37℃環境。傳代3-5代後用於基因轉導。用即時配製的磷酸鈣液0.5ml加入去培養液的豬成纖維細胞皿中，靜止20-30分鐘，再加5ml培養液培養48-60小時後測轉錄效率。以後用選擇培養液(500μg/ml G418)培養三天換一次液。10天後挑選單個陽性克隆轉入24孔板擴增後轉入培養瓶。6，測定細胞轉基因後反義基因的穩定轉錄和異種抗原表達缺陷提取陽性克隆的RNA，用T7引物與aL82進行RT-PCR反應檢測反義基因的轉錄效率取20μlRNA加100pM引物，並加入200MMLV逆轉錄合成酶，在PE公司2400型PCR儀上進行逆轉錄反應。反應參數42℃，15分，56℃15分。取逆轉錄反應液2μl作模板，同上加樣到100μl進行PCR反應熱循環94℃3分充分變性後每循環94℃變性20秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒共28次循環。陽性克隆RT-PCR反應陽性。FCM測定轉基因的豬成纖維細胞表面結合的人血清lgM試驗胰蛋白酶消化散開的轉基因細胞用PBS洗滌三次，調節到106/ml濃度，加等量的人AB滅活血清，37℃反應1小時，然後加FITC標記的抗人IgM單抗(DAKO公司，滴度1∶100)4℃溫育30分後再用PBS洗滌三次，定容到600μl，用流式細胞儀(FACStar Plus)檢測(488nm，150mW)，與未轉基因細胞對照，結果顯示轉基因細胞螢光標記率與空白相似，而未轉基因細胞螢光標記率高。測定證明該質粒和方法可用於消除供體器官的主要移植抗原的表達。
圖表說明
圖1.質粒pCN84的結構示意圖pCN84質粒結構CMVe/p CMV增強子 1-659CMV啟動子 669-750內含子 890-1022T7啟動子 1227-1251反向agIT 梅山豬agTL基因反義編碼區 1276-2034SV40pA 多聚腺苷酸加尾信號片段2140-2460NEO-r新酶素抗性基因2965-4286AMP-r氨苄青黴素抗性基因4683-5543ScaI4989
權利要求
1.一對正逆向引物，其特徵為(1)DNA序列與(agTL)上遊和下遊匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL8484#5』cgg gat ccg ata cat tga gca tta ctt gga gga gtt ctaL8282#5′GCGTCGACGGCACAATTTAAAGTCAGATGTTATTTCTAACC
2.一種異種抗原位點合成酶基因片段DNA分子(agTL)，其特徵為(1)其全序列為gatacattga gcattacttg gaggagttct taatatctgc aaatacatacttcatggttg gccacaaagt catctttaac atcatggtgg atgatatctccaggatgcct ttgatagagc tgggtcctct gcgttccttt aaagtgtttgagatcaagtc cgagaagagg tggcaagaca tcagcagtat gcgcatgaagaccatcgggg agcacatcct ggcccacatc cagcacgagg tggacttcctcttctgcatg gacgtggatc aggtcttcca aaacaacttt ggggtggagaccctgggcca gtcggtggct cagctacagg cctggtggta caaggcacatcctgacgagt tcacctacga gaggcggaag gagtccgcag cctacattccgtttggccag ggggattttt attaccacgc agccattttt gggggaacacccactcaggt tctaaacatc actcaggagt gcttcaaggg aatcctccaggacaaggaaa atgacataga agccgagtgg catgatgaaa gccatctaaacaagtatttc cttctcaaca aacccactaa aatcttatcc ccagaatactgctgggatta tcatataggc atgtctgtgg atattaggat tgtcaagatagcttggcaga aaaaagagta taatttggtt agaaataaca tctgactttaaattgtgcc由709對鹼基組成。第260位鹼基為G，已發表的文獻為T；相應的胺基酸殘基為Met即甲硫氨酸，已發表的文獻為Ile即異亮氨酸。
3.一種新的反義基因，其特徵為(1)全序列為tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca100atattggcta ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtacatttatattg gctcatgtcc aatatgaccg ccatgttggc attgattatt200gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccatatatggaggt ccgcgttaca taacttcgg taaatggccc gcctggctga300ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccatagtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac400ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccgccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca500gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattagtcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt600ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgtcaatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc700gtaacaactg cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtgtacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc800actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagtcagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta900aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaaggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac1000agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatccactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca attacagctc1100ttaaaaattg gatctccatt cgccattcag gctgcgcaac tgctgggaaggacgatcaga gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaagggacg1200tggcaagcaa ggcgattaag ttgagttacg ccaggatttt cccagtcacgacgttgtaaa acgacggcca gagaattata atacgactca ctatagggcg1300aattcggatc cttgctagac tcgacggcac aatttaaagt cagatgttatttctaaccaa attatactct tttttctgcc aawctatctt gacaatccta1400atatccacag acatgcctat atgataatcc cagcagtatt ctggggataagattttagtg ggtttgttga gaaggaaata cttgtttaga tggctttcat1500catgccactc ggcttctatg tcattttcct tgtcctggag gattcccttgaagcactcct gagtgatgtt tagaacctga gtgggtgttc ccccaaaaat1600ggctgcgtgg taataaaaat ccccctggcc aaacggaatg taggctgcggactccttccg cctctcgtag gtgaactcgt caggatgtgc cttgtaccac1700caggcctgta gctgagccac cgactggccc agggtctcca ccccaaagttgttttggaag acctgatcca cgtccatgca gaagaggaag tccacctcgt1800gctggatgtg ggccaggatg tgctccccga tggtcttcat gcgcatcatgctgatgtctt gccacctctt ctcggacttg atctcaaaca ctttaaagga1900acgcagagga cccagctcta tcaaaggcat cctggagata tcatccaccatgatgtaaaa gatgactttg tggccaacca tgaagtatgt atttgcagat2000attaagaact cctccaagta atgctcaatg tatcggatca tctttcccgggggtaccgtc gactgcggcc gcgaattcca agcttgagta ttctatcgtg2100tcacctaaat aacttggcgt aatcatggtc atatctgttt cctgtgtgaaattgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag2200tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgttgcgcgatgct tccattttgt gagggttaat gcttcgagaa gacatgataa2300gatacattga tgagtttgga caaaccacaa caagaatgca gtgaaaaaaatgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat2400aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttcaggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac2500aaatgtggta aaatccgata aggatcgatt ccggagcctg aatggcgaat由2550對鹼基組成。
4.一種新的反義基因重組質粒，其特徵為(1) 該質粒由表1.的6370個鹼基組成；(2) 該質粒中的第1～2550個鹼基為權利3中的DNA分子(3) 該質粒用於轉化哺乳動物受精卵或細胞，得到穩定的異種抗原缺陷的細胞株或轉基因動物，或轉化細胞作為供核用於進行克隆動物的核移植，進而生產供體細胞或器官。該細胞或器官或動物體內缺乏主要異種抗原表達。用於臨床能有效防止超急性排斥反應。本發明的質粒有傳代穩定，在哺乳動物細胞內轉錄水平高、對哺乳動物細胞的異種抗原位點合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉位酶(α[1，3]galactosyltransferase))抑制效率高的特點。
5.使用本發明的方法製備反義異種抗原位點合成酶基因；
6.使用本發明的方法製備反義異種抗原位點合成酶基因生產的細胞、器官(包栝所有哺乳動物的)和相應產品。
7.第2條權力所述基因相對應的肽片段及其應用，包括用作免疫耐受原等。
全文摘要
一種有抗異種排斥反應作用的反義基因克隆及其在哺乳動物細胞中轉化和篩選的方法。其特點是提取梅山豬DNA,經聚合酶鏈反應擴增克隆編碼異種抗原位點合成酶基因片段反向連入載體,得到有可轉錄反義基因質粒pCN84,用於動物細胞、受精卵或器官得到穩定轉化細胞株或轉基因器官、動物,或轉化細胞作核卵移植用於克隆動物,所得細胞或器官缺乏主要異種移植抗原,避免異種免疫識別和結合及免疫攻擊,有效對抗移植後超急性排斥反應。
文檔編號C12N15/56GK1255550SQ9812205
公開日2000年6月7日 申請日期1998年11月30日 優先權日1998年11月30日
發明者張良平 申請人:張良平