似活的非可培養狀態的可培養細菌及其製備方法

2023-10-09 14:07:04 2

專利名稱：：似活的非可培養狀態的可培養細菌及其製備方法似活的非可培養狀態的可培養細菌及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌及其製備方法。
背景技術：
：細菌VBNC狀態是指細菌在不良環境中，細胞縮成球形，用常規方法(平板法、最大可能近似值法)培養時，不能生長繁殖，但仍然是活的一種特殊存在形式。細菌活的非可培養狀態(ViablebutNon-culturable,VBNC)的復甦是指將不能培養的細菌恢復為可培養狀態的過程，目前，國內外用於VBNC沙門氏菌復甦的方法主要源自於Reissbrodt等人在2002年發表在AppliedandEnvironmentalMicrobiology刊物上的一篇題為((ResuscitationofSalmonellaentericaSerovarTyphimuriumandEnterohemorrhagicEscherichiacolifromtheViablebutNonculturableStatebyHeat-StableEnterobacterialAutoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙門氏菌復甦所需主要材料為含有30%牛血清和50μπιΟ1/1去甲腎上腺素的SAPI培養基，基中SAPI培養基成份較為複雜，由6.25mmol/LNH4NO3,1.84mmol/LKH2PO4,3.35mmol/LKCl，1.Olmmol/LMgSO4,2.77mmol/L(pH=7.5)葡萄糖等組成。主要復甦步驟如下首先將SAPI培養基6000r/min，離心15min，上清液過濾除菌。然後將濾後的上清液塗於羊血瓊脂平板上，37°C厭氧培養48h，以檢測培養基中是否有雜菌汙染。最後將可能含有IO2IO3個CFU/mL濃度的VBNC沙門氏菌無菌接種於SAPI中，37°C厭氧培養至0D_=0.4時，細菌數量增多，濃度可接近IO8個CFU/mL。通過此法可以使維持VBNC長達I年的細菌恢復為可培養狀態。細菌VBNC狀態自20世紀80年代發現至今，一直是預防醫學、流行病學、微生物生態學以及公共衛生檢驗檢疫方面研究的熱點問題之一。現階段，人們已在VBNC細菌誘導、檢測、致病性等方面取得重要成果，並且在分子水平上也對該狀態有了進一步地了解和認識。但是擺在現階段的一個瓶頸問題，即VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，這使得研究者無法做更為深入地研究。也就是說，只有準確捕獲VBNC狀態，才能對該狀態細菌進行系統研究。然而遺憾的是，在VBNC領域中至今尚未獲得具有穩定遺傳性狀的研究模型。也正因如此，有關VBNC狀態發生機制的研究也只停留在某一(些)已知基因(如大腸桿菌、霍亂弧菌的毒力基因)在正常與VBNC狀態下表達情況的比較，尚未能對VBNC發生機製做客觀評述。因而，憑藉VBNC特異性基因建立針對VBNC細菌檢測方法的研究也只能停滯不前。儘管應用高通量的基因晶片技術能合理躲避瓶頸問題，可對VBNC發生機制進行深入研究，但是繁雜的工作以及大量的資金投入亦會使更多的研究者卻步。
發明內容本發明目的是解決VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，使得研究者無法做更為深入地研究的問題，而提供一種VBNC細菌的研究模型，似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌及其鑑定方法。似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌的鑑定方法，它包括用常規的進入VBNC狀態誘導方法誘導，可培養的既為似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌；同時設立對照組，所述的對照組為和待檢細菌相同種類的標準細菌；對照組用常規方法培養不可培養；所述的不可培養，連續常規培養3次，每次平板菌落數均為O。所述的常規的進入VBNC狀態誘導方法為在適合該種細菌的液體培養基中，4°C培養。似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，它是通過上述方法中的任意一種方法鑑定的可培養細菌。似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養鼠傷寒沙門氏菌，保藏號為CGMCCNo.6578。所述的似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養鼠傷寒沙門氏菌,它是由鼠傷寒沙門氏菌ATCC10708，在亞硝基胍(NTG)作用下，至死率在8595%的條件下，誘變獲得的；所述的似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養鼠傷寒沙門氏菌，在液體LB培養基中，4°C培養，進入VBNC狀態後，對照組鼠傷寒沙門氏菌ATCC10708用常規培養方法培養不可培養，可培養的即為似活的非可培養狀態(VBNC)的鼠傷寒沙門氏菌可培養。本發明人，多年從事活的非可培養狀態(VBNC)細菌的研究，細菌VBNC狀態是指細菌在不良環境中，細胞縮成球形，用常規方法(平板法、最大可能近似值法)培養時，不能生長繁殖，但仍然是活的一種特殊存在形式。發現了一種進入VBNC後，卻仍然可用常規方法培養的細菌，也就是說本發明人發現了一種細菌的另一種活的存在狀態，它具有所有的非可培養狀態(VBNC)細菌的表徵，具備了VBNC細菌相關基因，不用經過細菌活的非可培養狀態(ViablebutNon-culturable,VBNC)的復甦過程(例如用SAPI培養基復甦)，用常規方法培養既可培養。本發明人將其命名為似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，筒稱似VBNC的可培養細菌。本發明人獲得了多株似VBNC的可培養細菌，其中，似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養鼠傷寒沙門氏菌MVS株和似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養乳酸菌MVR株，已於2012年9月18日，送至中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，保藏編號分別為CGMCCNo.6578和CGMCCNo.6579。本發明提供的似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，是能準確獲取具有穩定遺傳性狀的VBNC細菌研究模型，解決了VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，使得研究者無法做更為深入地研究的瓶頸問題，從而為客觀揭示VBNC形成機制奠定基礎。似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，是在不良環境中能持續存活的「菌種」，作為益生菌製劑及疫苗等方面，提高保質期具有廣闊的應用前景。本發明還提供了似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌的製備和鑑定方法。圖1為預擴增產物瓊脂糖凝膠檢測，其中，M:分子量標記；1=VBNC細菌突變體；2正常細菌；3:陰性對照；圖2選擇性擴增產物瓊脂糖凝膠檢測，其中，M:分子量標記；1，2:陰性對照；3，4:正常細菌；5，6=VBNC細菌突變體；圖3選擇性擴增產物PAGE檢測，其中，M:分子量標記；1:陰性對照；2:正常細菌；3VBNC細菌突變體；圖4分子量標記為200bp和700bp的DHPLC圖譜；圖5陰性對照組的DHPLC圖譜；圖6未經NTG處理的正常細菌選擇性擴增產物的DHPLC圖譜；圖7VBNC細菌突變體的選擇性擴增產物的DHPLC圖譜；圖8VBNC細菌突變體DHPLC圖譜鑑定結果；圖9選擇性擴增產物PAGE檢測，其中，M:分子量標記；1:陰性對照；2:乳酸桿菌；3VBNC乳酸桿菌突變體。具體實施方式實施例1鼠傷寒沙門氏菌化學誘變。一、實驗組1.菌株培養。將鼠傷寒沙門氏菌iSalmorwllatyphimurium)標準株(ATCC10708)純培養物接種至含有100mlLB液體培養基的三角燒瓶中，37°C，180r/min，通氣振蕩培養過夜，當OD6tltl接近O.6時，停止培養。2.鼠傷寒沙門氏菌懸液製備。取濃度為5X108個/ml的細菌培養液2ml，6000rpm,離心5min，棄上清，滅菌生理鹽水洗菌體2次，2ml磷酸二氫鈉-檸檬酸緩衝液(O.93%的檸檬酸，O.1lM磷酸二氫鈉，pH5.2)懸浮菌體。3.亞硝基胍(NTG)誘變鼠傷寒沙門氏菌。取Iml細菌懸浮液，加入100μINTG(工作濃度為lmg/ml)，此劑量對細菌的致死率為92%。充分混合後，在30°C條件下作用30min，反應結束後用O.1M磷酸緩衝液[pH7.O]終止反應；將經NTG處理和處理的菌液進行10倍稀釋，塗布於SS固體培養基中，37°C培養。二、對照組將鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella標準株(ATCC10708)純培養物接種10倍稀釋，塗布於SS固體培養基中，37°C培養。實施例2似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌的製備。1.VBNC狀態誘導。將在沙門、志賀菌屬固體培養基(SS)上生長出的，實驗組和對照組的單菌落，接種到IOOml的液體LB中，37°C振蕩培養至OD6tltl接近O.6時，停止培養。取ImL菌液至無菌離心管中，6000r/min離心5min，棄上清，用滅菌生理鹽水洗菌體2次，然後將菌液再次轉移至含有IOOml液體LB中，4°C培養。3.VBNC狀態檢測。按專利200810051106.9提供方法檢測，即取待檢菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混勻，避光染色1520min。然後將經墨水染黑的微孔濾膜置於無自發螢光的載玻片上，吸取適量菌體滴在微孔濾膜上，待液體剛好被濾膜吸乾時，在其上蓋上蓋玻片，並用力壓片，使細菌充分固定在膜上。最後在蓋玻片上滴一滴無自發螢光的油，用落射螢光顯微鏡於暗室觀察。對照組及實驗組均在螢光顯微鏡可見呈現綠色螢光的菌體，證明兩組均進入VBNC狀態。3.可培養能力測定。取待檢菌液50μI，用滅菌的L型玻璃棒將菌液均勻塗布在LB固體培養基上。然後將平板正向培養30min後，再倒置於37°C中，培養2028h。經NTG處理的菌體仍能在平板上生長(實驗組)。對照組連續培養3次，無生長能力。實施例3=VBNC沙門氏菌突變體鑑定。1.基因組DNA雙酶切。分別取正常條件(37°C，LB液體培養18h)培養的沙門氏菌和疑似VBNC細菌突變體的基因組DNA，用JfeeJ和PJ兩種酶對基因組DNA進行酶切。酶切反應體系DNA模板2μI,MseI和EcoRI各3U，雙酶共用Buffer2μ1,100ΧBSA(IOmg/ml)0.2μI，補水至20μI。37°C酶切5h，65°C變性20min。2.雙酶切產物與接頭連接。酶切產物20μ1，EcoRI接頭R、EcoRI接頭F、MseI接頭R、MseI接頭F各IμI，T4DNA連接酶5U，T4DNA連接酶Buffer2μI，補水至50μI。16°C連接過夜。3.預擴增。連接產物2μ1，預擴增引物Pl和P2各10pmol，dNTP2μI,ExTaq酶5U,PCRBuffer2μ1，補水至50μI。反應程序94°C預變性5min—94°C30s,56°C30s,72°Clmin，30個循環一72延伸lOmin。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上均呈彌散狀，見圖1。4.選擇性擴增。20倍稀釋的預擴增產物2μ1，選擇性擴增引物Pl和P2各10pmol,dNTP2.5μI,ExTaq酶2.5U，PCRBuffer2.5μ1，補水至25μI。反應程序94°C預變性5min—94°C30s,65°C30s(0.7°C/循環)共12個循環，72°C60s—94°C30s,56°C30s,72°C60s共18個循環一72°C，lOmin。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上分布多條條帶，正常沙門氏菌與VBNC沙門氏菌突變體指紋圖譜不相同，但重複性較好，而陰性對照組僅出現引物二聚體，見圖2。5.8%中性聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。PAGE凝膠在電壓為100V，恆定功率為50W、溫度為50°C條件下預電泳約50min。而後吸取IXTBE緩衝液衝冼加樣孔，將2μL6Χ電泳上樣緩衝溶液點在Parafilm膜上,並與5μL選擇性擴增產物混合,加至加樣孔內。設電壓為50V，恆定功率50W，直到二甲苯青遷移至凝膠底部，停止電泳。最後用溴化乙錠染色30min。產物在PAGE凝膠上可隨機分布眾多清晰條帶，數量遠超過瓊脂糖凝膠(圖3)，並且VBNC沙門氏菌突變體與正常菌的圖譜可見明顯差異。6.DHPLC鑑定。取VBNC沙門氏菌和正常沙門氏菌的選擇性擴增產物、選擇性擴增的陰性對照組、含有IOObp和700bp片段的分子量標記各10μI置於離心管中，並放於同一檢測盤內。設定DHPLC儀器的流動相參數，即緩衝溶液A濃度為50%，緩衝溶液B濃度為50%。流速為O.9ml/min，並選用螢光檢測器。DHPLC圖譜顯示含有分子量標記的樣品出現兩個峰，分別為IOObp和700bp(圖4);陰性對照組僅出現引物二聚體，故只在近IOObp處出現色譜峰(圖5)；VBNC細菌突變體(圖6)與正常菌(圖7)的色譜峰數量及出峰時間均存在明顯差異(圖8)。實施例3植物乳酸桿菌化學誘變乳酸桿菌(L)是吉林農業大學預防獸醫學實驗室從自然發酵酸牛奶中分離，經16sRNA鑑定為植物乳酸桿菌plantarum)a由吉林農業大學預防獸醫學實驗室保存。I)似活的非可培養狀態的可培養乳桿菌MVR株的獲得。實驗組取5XIO8個/ml的乳酸桿菌(L)菌體懸浮液lml，加入100μINTG(lmg/ml)，充分混合後，在30°C條件下作用30min，反應結束後用O.1M磷酸緩衝液[pH7.O]終止反應，NTG用量以致死率達到80%95%為宜。對照組未經NTG處理的乳酸桿菌(L)懸浮液。實驗組、對照組的菌液進行10倍稀釋，塗布於MRS固體培養基中，37°C培養。將單菌落接種到100ml的液體MRS中，振蕩培養至0D_接近O.8時，取Iml菌液至pH2.O3.0，MRS液體培養基中，4°C兼性厭氧培養。在VBNC誘導過程中，取經NTG和未經NTG處理的菌液塗布於固體MRS中，37°C培養，未經NTG處理的乳酸桿菌作為對照組在35d內可培養菌數顯著下降，連續培養3d，無細菌生長，按專利200810051106.9提供方法檢測，即取待檢菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混勻，避光染色1520min。然後將經墨水染黑的微孔濾膜置於無自發螢光的載玻片上，吸取適量菌體滴在微孔濾膜上，待液體剛好被濾膜吸乾時，在其上蓋上蓋玻片，並用力壓片，使細菌充分固定在膜上。最後在蓋玻片上滴一滴無自發螢光的油，用落射螢光顯微鏡於暗室觀察。而螢光顯微鏡觀察全部為呈現綠色螢光的活菌，表明對照組已於第35d進入VBNC狀態。而經NTG處理的實驗組的可培養菌數在整個觀察期內一直具備可培養能力。採用AFLP法，對實驗組、對照組的基因組DNA，用MseI和EcoRI兩種酶對對基因組DNA進行酶切，酶切產物與接頭連接後，依次進行預擴增和選擇性擴增。選擇性擴增的模板是預擴增產物，在擴增前要對預擴增產物做20倍稀釋，最後選擇性擴增產物用8%中性聚丙烯醯胺凝膠EB染色檢測。圖9可見每條泳道上隨機分布的清晰條帶，而且條帶數目適中，譜帶質量較高，產物多集中在50bp750bp。而且實驗組與對照組間存在多條差異條帶，說明兩者基因組DNA存在多態性。由此證明乳酸桿菌在NTG誘變後，其基因組發生了突變。實驗組中獲得經NTG處理的VBNC乳酸桿菌突變體，命名為似活的非可培養狀態可培養乳桿菌MVR株，已於2012年9月18日，送至中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.6579ο權利要求1.似活的非可培養狀態的可培養細菌的鑑定方法，它包括用常規的進入VBNC狀態誘導方法誘導，可培養的為似活的非可培養狀態的可培養細菌。2.根據權利要求1所述的似活的非可培養狀態的可培養細菌的鑑定方法，其特徵在幹同時設立對照組，所述的對照組為和待檢細菌相同種類的標準細菌；對照組用常規方法培養不可培養。3.根據權利要求2所述的似活的非可培養狀態的可培養細菌的鑑定方法，其特徵在於所述的不可培養，連續常規培養3次，毎次平板菌落數均為O。4.根據權利要求1、2或3所述的似活的非可培養狀態的可培養細菌的鑑定方法，其特徵在於所述的常規的進入VBNC狀態誘導方法為在適合該種細菌的液體培養基中，4°C培養。5.似活的非可培養狀態的可培養細菌，它是通過權利要求1的鑑定方法鑑定的可培養細菌。6.似活的非可培養狀態的可培養鼠傷寒沙門氏菌，保藏號為CGMCCNo.6578。7.根據權利要求6所述的似活的非可培養狀態的可培養鼠傷寒沙門氏菌，其特徵在於，它是鼠傷寒沙門氏菌ATCC10708，在亞硝基胍作用下，至死率在8595%的條件下，誘變獲得的。8.根據權利要求7所述的所述的似活的非可培養狀態的可培養鼠傷寒沙門氏菌，其特徵在於在液體LB培養基中，4°C培養，進入VBNC狀態後，對照組鼠傷寒沙門氏菌ATCC10708用常規培養方法培養不可培養，可培養的即為似活的非可培養狀態的鼠傷寒沙門氏菌可培養。全文摘要本發明公開了的似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，是能準確獲取具有穩定遺傳性狀的VBNC細菌研究模型，解決了VBNC維持期內的細菌，其生物學性質難以穩定存在，而且極易在研究過程中突然消失，使細菌轉入真正死亡期，使得研究者無法做更為深入地研究的瓶頸問題，從而為客觀揭示VBNC形成機制奠定基礎。似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌，是在不良環境中能持續存活的「菌種」，作為益生菌製劑及疫苗等方面，提高保質期具有廣闊的應用前景。本發明還公開了似活的非可培養狀態(VBNC)的可培養細菌的製備和鑑定方法。文檔編號C12N1/20GK103031360SQ20121040360公開日2013年4月10日申請日期2012年10月22日優先權日2012年10月22日發明者李影,段銳,錢愛東,張文慧,李瑩申請人:吉林農業大學