一種蛋白晶片的製備方法

2023-10-09 08:44:34

專利名稱：一種蛋白晶片的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物晶片，尤指一種蛋白質晶片的製備方法。
背景技術：
在現階段，臨床檢驗人員及科研人員都習慣用「+」、「-」的形式來判定免疫學凝集試驗和螢光試驗的結果。例如在玻片上進行的凝集實驗，就以「-」代表試驗陰性；「+」代表陽性(一個加號)；「++」代表中陽性(兩個加號)；「+++」代表中強陽性(三個加號)；「++++」代表強陽性(四個加號)；從「+」到「++++」的變化代表被檢測物質含量的變化，以此來進行標本的半定量分析。同樣，在免疫螢光技術中，更常用「+」的形式來判定顯微鏡下視野中螢光分子的數量。如若滿視野均見螢光染色，可判為「++++」，而每個視野只看到一、兩個的螢光染色，則判一個「+」；否則為「-」陰性結果。
如同一份標本，經兩次檢測後顯色由「+++」變成「+」，表示待檢標本中某種抗原或抗體的量由多變少，以利於臨床醫生判斷治療的效果等。
上述方法顯示結果的共同點是均由肉眼來主觀判定，人為的誤差因素較多，不同的觀察者，觀察的結果差異很大，造成觀察結果不客觀。
生物晶片技術的發展，使原來分多次檢測的步驟只需一次即可完成，實現了高通量並行檢測的目的，不但效率高，且節約試劑和人力。但就目前來說，生物晶片檢測結果的判斷均以螢光點的出現與否及螢光分子的數量獲取為主要方法，必須依靠需要精密儀器和配套軟體方可作出最後的分析，這對大多數沒有精密儀器和分析軟體的用戶來說，無疑是不現實的，且只適用於科研，不適用於臨床應用，處理結果屬靜態分析，而無動態分析的任何因素。

發明內容
本發明的目的在於提供一種蛋白質晶片的製備方法，其可實現生物晶片技術的普及化和結果判斷方法的簡單實用化。
本發明的目的是這樣實現的一種蛋白晶片的製備方法，其包括如下步驟
A準備好含有足夠量的活化基團活化處理的玻璃晶片片基；B準備待點樣的蛋白質(抗原)將待點樣的蛋白質用點樣緩衝液進行梯度稀釋；C準備質控蛋白一般要經過多次實驗，使其與標記物能夠足量而穩定地結合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現質控線，當某一濃度點樣後在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點樣緩衝液進行梯度稀釋；D點樣設計按如下表格質控蛋白線 (抗原濃度)E點樣將豎向點樣蛋白和橫向質控蛋白分別按上述圖案點樣於設計好的方格內(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時；G乾燥在真空乾燥箱內乾燥後裝於有乾燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個月。
其中，所述的玻璃晶片片基為帶有能與蛋白質結合的活性基團的片基。
更優的，所述的玻璃晶片片基為醛基片或賴氨酸片。
該蛋白晶片的檢測結果會以「++++」、「+++」、「++」、「+」、「-」的圖案顯示出來，利於顯微鏡或掃描儀觀察分析。
所述步驟E的點樣方式為用人工點樣或用生物晶片點樣機點樣。採用上述製備方法後，將傳統的臨床醫生普遍使用的 「+」的判斷方法設計在蛋白質晶片上，並且通過普通顯微鏡、螢光顯微鏡、灰度攝相儀及生物晶片掃描分析儀均可分析結果，這種結果是客觀的，徹底消除了人為因素造成的判斷誤差，直接在視野裡或顯示器上顯示「++++」、 「-」的變化符號，臨床人員只需登記或列印結果而已，這些變化符號本身就含有量的成分，讓實驗員只測一次就有一個含量的指標；另外，這種判斷方法非常適合於臨床疾病治療過程中的療效觀察和治療前後的對比分析，結果一目了然，沒有模糊之處，具有動態分析的優點；比精密儀器和軟體所獲取的螢光分子數量等靜態的、死板的方法更貼近臨床實用，從而達到生物晶片技術的普及化和結果判斷方法的簡單實用化的目的。


圖1為使用本發明後晶片的顯示結果與傳統判斷結果及其所代表的臨床意義對比示意圖。
具體實施例方式
實施案例最典型的為HP感染和IAA的測定用蛋白晶片。
實施例1HP蛋白晶片的製備臨床上大多數檢測工作需要觀察動態的變化過程HP蛋白晶片的製備方法包括以下步驟A準備好含有足夠量的活化基團的醛基化玻璃晶片片基；B將HP抗原(如CagA)用點樣緩衝液(一般為PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀釋，共四個濃度梯度，如1∶20、1∶40、1∶80、1∶160C準備質控蛋白一般要經過多次實驗，使其與標記物能夠足量而穩定地結合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現質控線，當某一濃度點樣後在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點樣緩衝液進行梯度稀釋；D點樣設計按如下表格質控蛋白線 (抗原濃度)(注此圖案是點在1×1cm的方格內放大後的示意圖)E點樣將豎向點樣蛋白和橫向質控蛋白分別按上述圖案點樣於設計好的方格內(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時；G乾燥在真空乾燥箱內乾燥後裝於有乾燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個月。
VacA和Ure-B的晶片製備同上法。
消化性潰瘍及部分胃癌的發病與幽門螺桿菌(HP)的感染有很大關係，HP感染後患者體內有HP-IgG的存在。臨床上一般以根除HP作為治癒的標準。因此在治療過程中需要監測血中HP-IgG的動態變化，直至HP-IgG消失為準。可以將HP的抗原成分CagA、VacA、Ure-B等以本發明的設計方法點樣，製成蛋白晶片試劑，來監測相應的抗體變化。如圖1所示，A代表晶片的顯示結果，B代表傳統的判斷結果，C代表臨床意義，X1表示待測物質含量為四個「+」號(強陽性)，X2表示待測物質含量為三個「+」號(中強陽性)，X3表示待測物質含量為兩個「+」號(中陽性)，X4表示待測物質含量為一個「+」號(陽性)，X5表示待測物質含量為陰性；此顯示為質控線，質控線在每次情況下均應出現，若不出現，則說明晶片失效。若治療前HP-IgG測定結果為「++++」，而治療一段時間後變成「+」說明治療有效，可繼續治療直至檢測為「-」。這樣每檢測一次即可同時觀測HP三種抗原CAgA、VacA、Ure-B的消減情況，以使臨床醫生能夠更好地採取治療方案。
實例2IAA+ICA+GAD三聯蛋白晶片的製備IAA+ICA+GAD三聯蛋白晶片的製備方法包括以下步驟A準備好含有足夠量的活化基團的醛基化玻璃晶片片基；B將點樣抗原(如IAA等)用點樣緩衝液(一般為PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀釋，共四個濃度梯度，如1∶20、1∶40、1∶80、1∶160C準備質控蛋白一般要經過多次實驗，使其與標記物能夠足量而穩定地結合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現質控線，當某一濃度點樣後在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點樣緩衝液進行梯度稀釋；D點樣設計按如下表格質控蛋白線 (抗原濃度)(注此圖案是點在1×1cm的方格內放大後的示意圖)E點樣將豎向點樣蛋白和橫向質控蛋白分別按上述圖案點樣於設計好的方格內(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時；G乾燥在真空乾燥箱內乾燥後裝於有乾燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個月。
ICA和GAD可以用同樣方法點樣，三者可以放在一個方格內。
抗胰島素抗體(IAA)存在於胰島素治療的糖尿病患者血清中，接受胰島素治療後，IAA一般在3-6個月出現，9-12個月時達到高峰；如停止用藥，則3-9個月內抗體可消減直至消失。停藥後一段時間，若再次使用胰島素治療，則IAA濃度迅速上升；因此，IAA這種動態變化的過程最適合於動態顯示測定方法。測定IAA為改進糖尿病治療方案提供了重要的依據，也是評價藥用胰島素的質量(免疫原性和純度)的一種可靠指標。本發明已用於糖尿病患者血清IAA的測定，共測定了500例，已顯示良好的一致性。++++到+、-的變化非常適用於上述疾病的檢測。
本發明方法完全可以應用於IAA的檢測，並以動態方法顯示結果。用本發明方法更可以將IAA、ICA(抗胰島細胞抗體)和GAD(抗穀氨酸脫羧酶抗體)同時測定，以更全面地觀察糖尿病患者IAA、ICA、GAD的變化。對糖尿病的分型和治療有非常實用的價值。若用胰島素治療前用蛋白晶片檢測到IAA為「+」，而治療過程中檢測IAA時已升至為「++」或「+++」，則證明該患者對胰島素已不敏感，或胰島素質量不符合標準，應停藥另設計治療方案或換藥。這在糖尿病治療中非常重要。
當應用於患者樣品檢測時，待檢測樣品在本晶片上反應完畢後加如已標記的示蹤物，通過檢測螢光或酶與底物的反應顏色即可觀察到++++到+、-的變化。
上述點樣抗原的四個濃度是經過與傳統方法多次對比後選擇出來的，不是隨便一個濃度就適合點樣，要充分考慮到檢測的靈敏度和特異性。生產不同品種的晶片所用的點樣濃度範圍是不同的，也與蛋白質的含量有直接關係。
本發明非常切合臨床檢驗人員對實驗結果判斷的傳統習慣，易於推廣和接受，結果直觀、客觀，並有動態分析的優點和臨床實用價值。在將來成套試劑盒中可以直接使用這種方法來生產蛋白質晶片檢測試劑。也為生物晶片試劑真正走上臨床應用開闢了新途徑。
權利要求
1.一種蛋白晶片的製備方法，其特徵在於包括有如下步驟A準備好含有足夠量的活化基團活化處理的玻璃晶片片基；B準備待點樣的蛋白質(抗原)將待點樣的蛋白質用點樣緩衝液進行梯度稀釋；C準備質控蛋白一般要經過多次實驗，使其與標記物能夠足量而穩定地結合，無論待檢樣品是陽性還是陰性，均能夠出現質控線，當某一濃度點樣後在掃描儀或顯微鏡下能夠清楚地觀察到即可，此蛋白同樣用點樣緩衝液進行梯度稀釋；D點樣設計按如下表格質控蛋白線 E點樣將豎向點樣蛋白和橫向質控蛋白分別按上述圖案點樣於設計好的方格內(1×1cm大小)，室溫下(25℃)放置3小時；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時；G乾燥在真空乾燥箱內乾燥後裝於有乾燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個月。
2.如權利要求1所述的一種蛋白晶片的製備方法，其特徵在於所述的玻璃晶片片基為帶有能與蛋白質結合的活性基團的片基。
3.如權利要求2所述的一種蛋白晶片的製備方法，其特徵在於所述的玻璃晶片片基為醛基片或賴氨酸片。
4.如權利要求1或2所述的一種蛋白晶片的製備方法，其特徵在於該蛋白晶片的檢測結果會以「++++」、「+++」、「++」、「+」、「-」的圖案顯示出來，利於顯微鏡或掃描儀觀察分析。
全文摘要
一種蛋白質晶片的製備方法，包括如下步驟A準備好含有足夠量的活化基團活化處理的玻璃晶片片基；B將待點樣的蛋白質抗原和質控蛋白用點樣緩衝液進行梯度稀釋；C點樣設計按如下表格E點樣按本發明的圖案設計點樣，室溫下(25℃)放置3小時；F封閉用含1％BSA的PBS封閉1小時；G乾燥在真空乾燥箱內乾燥後裝於有乾燥劑的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6個月。該蛋白晶片的檢測結果會以「++++」、「+++」、「++」、「+」、「－」的圖案顯示出來，利於顯微鏡或掃描儀觀察分析。與習用相比，本發明可實現生物晶片技術的普及化和結果判斷方法的簡單實用化的目的。
文檔編號C12Q1/68GK1566952SQ03126940
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月23日 優先權日2003年6月23日
發明者林連成 申請人:林連成