具有葉中改變的硝酸鹽水平的轉基因植物的製作方法

2023-05-31 22:28:56 2

具有葉中改變的硝酸鹽水平的轉基因植物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及可以用於製備轉基因植物的遺傳構建體。構建體可以具有降低植物特別是植物的葉中硝酸鹽濃度的能力，和誘導衰老樣表型的能力。本發明擴展至用這種構建體轉化的植物細胞和轉基因植物本身。本發明還涉及產生轉基因植物的方法和涉及在植物中降低硝酸鹽含量的方法。本發明還涉及已用遺傳構建體轉化的收穫的植物葉(例如菸草葉)和涉及包含這種收穫的植物葉的多種菸草製品(諸如吸菸製品)。
【專利說明】具有葉中改變的硝酸鹽水平的轉基因植物

【技術領域】
[0001] 本發明涉及可W用於製備轉基因植物的遺傳構建體。構建體可W具有降低植物特 別是植物的葉中硝酸鹽濃度的能力。本發明擴展至用此類構建體轉化的植物細胞和轉基因 植物本身。本發明還涉及產生轉基因植物的方法和在植物中降低硝酸鹽含量的方法。本發 明還提供用於改變植物胺基酸概況的方法。本發明還涉及已用遺傳構建體轉化的收穫的植 物葉（例如菸草葉）和包含此類收穫的植物葉的各種菸草製品（諸如吸菸製品）。
[0002] 背景 氮同化對於植物生長具有根本重要性。在植物所需的所有礦物質營養物中，氮是最大 豐度需要的。在田間植物攝取的氮的主要形式是硝酸鹽和氨，其是氮服的主要組分。根據 可用性，植物從±壤中攝取硝酸鹽或饋離子。硝酸鹽在充分氧化的非酸性±壤中會更豐富， 而饋會在酸性或積水±壤中佔優勢。對菸草生長參數的實驗清楚地表明，相對生長速率、葉 綠素含量、葉面積和根面積響應於漸增的硝酸鹽供應而急劇增加。
[0003] 植物已經發展了非常高效氮攝取系統W處理耕種±壤的硝酸鹽含量的巨大變化。 植物根通過特定硝酸鹽轉運蛋白（NTR)的作用攝取硝酸鹽和氨。已經顯示兩個硝酸鹽轉運 系統共存於植物中，NRT1基因家族和NRT2基因家族。據信，兩個轉運蛋白家族合作地作用 W便從±壤攝取硝酸鹽並將其分布在植物各處。通常假定NRT1基因家族介導根低親和力 轉運系統（LATS，即當外部硝酸鹽濃度〉1 ml時），而NRT2基因家族介導高親和力轉運系統 (HATS,即當外部硝酸鹽濃度<1 ml時）。在擬南芥中，已知走個基因屬於NRT2基因家族。 還已知，該些基因的表達受植物暴露的硝酸鹽的濃度調節。然而，除了 麼八麼4 和^ 7,其它NRT2基因的功能尚未闡明。
[0004] NRT2基因家族的最佳表徵成員之一是如/7打麼2。在擬南芥中，AtNRT2. 1與NAR2 (AtNRT3)蛋白相互作用，W形成HATS的重要組分。擬南芥中AtNRT2. 1硝酸鹽轉運蛋白的 突變的、非功能性形式的過表達引起高親和力硝酸鹽攝取系統活性的顯著降低和葉片硝酸 鹽含量的降低。作為結果，當擬南芥在低硝酸鹽濃度中生長時，該些麼2突變體植物的 生長受到嚴重損害。
[000引 #扣麼7是表徵不足的基因。已知其在植物種子，特別是在液泡膜中表達，並且其調 節植物種子的硝酸鹽含量。最近已經表徵了硝酸鹽轉運蛋白化，f麼4。NRT2. 4蛋白參與在 非常低的外部濃度下植物的根對硝酸鹽的攝取和將硝酸鹽裝載到植物枝條的初皮部。
[0006] 硝酸鹽轉運蛋白、和硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶的活性調節在整個植物中控制主要 氮同化中是關鍵的，且對於植物的生長和發育具有顯著影響。然而，在某些條件下，硝酸鹽 可能積累，主要是在綠色光合活躍組織中積累，在那裡它被儲存在葉肉細胞的液泡中。當具 有較低同化儲存的硝酸鹽的光合能力時，或作為±壤中高硝酸鹽水平的結果，高水平的硝 酸鹽積累可W在低溫和/或太陽福射（例如，在冬季期間的溫室作物中）期間發生。硝酸 鹽水平的增加可W具有許多有害後果，不僅在植物生長的方面，而且在消耗植物的人或動 物健康W及環境後果的方面。硝酸鹽積累的許多不利後果通過產生亞硝酸鹽所介導。
[0007] 因此，為了防止硝酸鹽聚集，一個策略將是增加植物中的氮再動員（nitrogen remobilisation)，例如當它們變得衰老時，該可能在作物生產中具有重要應用。首先，從葉 再動員的氮可W被轉運至較嫩葉W及正在發育的種子。增強氮從衰老葉離開的效率因此可 W潛在增加對植物的種子和較嫩部分的氮供給，從而增加作物產量和氮使用效率。當世界 人口不斷增加，但作物產量沒有增加到足W滿足需求時，該顯然是有價值的目標。一種潛在 的目標作物是歐洲油菜油菜），其由於從營養組織的差的氮再動員而 具有差的氮效率。另一個目標作物是小麥，因為增強巧粒蛋白含量的潛在益處是巨大的。巧 粒蛋白含量不僅影響小麥的營養價值，而且決定巧粒使用，並因此決定市場價值。例如，增 加的巧粒蛋白含量導致增加的麵包體積。
[000引此外，增加氮再動員的能力在菸草行業中可W是非常有用的，因為已知菸草葉中 的殘餘氮有助於亞硝胺類的形成，如圖1所示。具體而言，硝酸鹽和亞硝酸鹽在烤葉（cured leaf)中充當菸草特異性亞硝胺（TSNA)形成的前體。菸草工業對菸草葉的處理涉及去除被 認為充當硝酸鹽儲存器官的烤葉的葉柄和中脈，其缺乏味道且TSNA高。
[0009] 此外，亞硝胺在胃中的形成是由於內源性亞硝化作用。口腔細菌將食物和飲料中 消耗的硝酸鹽化學還原為亞硝酸鹽，所述亞硝酸鹽在胃的酸性環境中可W形成亞硝基化 齊U。該些與胺反應產生亞硝胺，且引起DNA鏈斷裂或DNA的交聯。與過量的硝酸鹽有關的 另一個問題是高鐵血紅蛋白的形成，其產生藍嬰症候群化lue b油y syn化ome)，其中血紅 蛋白的攜氧能力被亞硝酸鹽所阻斷，在嬰兒中引起化學窒息。
[0010] 作為該些健康問題的後果，根據收穫的時間，許多監管機構已對於綠葉蔬菜諸如 玻菜和窩宦中允許的硝酸鹽的量設置了限制（例如歐洲委員會法規653/2003)。該些限制 已經導致任何具有高硝酸鹽含量的產品不能出售。因此，已經存在通過管理含氮化服的或 改進的種植業系統的應用而進行降低植物的硝酸鹽含量的努力。一些機構也已經對於飲用 水中硝酸鹽的量設置了限制。
[0011] 因此，存在對於用於減輕植物中與硝酸鹽積累有關的不利影響的方法的需要。考 慮到該一點，本發明人已經開發了遺傳構建體，其可用於轉基因植物的製備中，所述轉基因 植物表現出令人驚訝的降低的硝酸鹽濃度。
[001引發明概述 因此，根據本發明的第一個方面，提供了遺傳構建體，其包含與編碼具有硝酸鹽轉運蛋 白活性的多膚的編碼序列可操作連接的啟動子，其中所述多膚包含如SEQ ID No. 3所述的 胺基酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物，條件是該啟動子不是SP6啟動子。
[0013] 如實施例中所述，本發明人已經研究了植物中氮的再動員（remobilization)，目 的在於開發表現出（特別在葉中）硝酸鹽濃度降低的植物。本發明人已經製備了遺傳構建 體（參見圖2)，其中將編碼硝酸鹽轉運蛋白的基因置於啟動子的控制下，所述啟動子不是 SP6啟動子，諸如組成型啟動子或組織特異性啟動子。
[0014] 構建體中的編碼序列可W編碼擬南芥硝酸鹽轉運蛋白AtNRT 2. 5。編碼擬南芥硝 酸鹽轉運蛋白化t2. 5的一個實施方案的基因組DNA序列（包括內含子和外顯子）在本文 中作為SEQ ID No. 1提供，如下：

【權利要求】
1. 遺傳構建體，其包含與編碼具有硝酸鹽轉運蛋白活性的多肽的編碼序列可操作連接 的啟動子，其中所述多肽包含如SEQ ID No. 3所述的胺基酸序列，或其功能變體或片段或直 向同源物，條件是所述啟動子不是SP6啟動子。
2. 根據權利要求1所述的遺傳構建體，其中所述啟動子是組成型的、非組成型的、組織 特異性的、發育調節型或誘導型/阻遏型的啟動子。
3. 根據權利要求1或權利要求2所述的遺傳構建體，其中所述啟動子是香石竹蝕環病 毒（CERV)啟動子、豌豆質體藍素啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子、胭脂氨酸 合成酶啟動子、葉綠素 a/b結合啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、a，0 -麥醇溶蛋白啟動 子、大麥醇溶蛋白啟動子、馬鈴薯塊莖儲藏蛋白啟動子、或衰老特異性啟動子。
4. 遺傳構建體，其包含與編碼具有硝酸鹽轉運蛋白活性的多肽的編碼序列可操作連接 的香石竹蝕環病毒（CERV)啟動子，其中所述多肽包含如SEQ ID No. 3所述的胺基酸序列， 或其功能變體或片段或直向同源物。
5. 根據任何前述權利要求所述的遺傳構建體，其中所述編碼序列包含基本上如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所述的核酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
6. 根據任何前述權利要求所述的遺傳構建體，所述啟動子包含基本上如SEQ ID No. 4 所述的核苷酸序列，或其功能變體或功能片段。
7. 根據任何前述權利要求所述的遺傳構建體，其中所述編碼序列源自擬南芥屬物種 5/7/7.)、稻屬物種 5/7/7.)、楊屬物種5/7/7.)或菸草屬物種 iMcotiana spp.~)。
8. 根據任何前述權利要求所述的遺傳構建體，其中所述編碼序列源自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、犧{Oryza sativa)、敗撕 \ \\\ 場{Populus tremuld)或懷尊 (/Vico tiana tabacurri)。
9. 重組載體，其包含根據前述權利要求中任一項所述的遺傳構建體。
10. 使試驗植物的葉中硝酸鹽濃度降低至低於在相同條件下培養的野生型植物葉中對 應的硝酸鹽濃度的方法，所述方法包括：_ a)用根據權利要求1-8中任一項所述的構建體的遺傳構建體或根據權利要求9所述 的載體轉化植物細胞；和 ai)從轉化的細胞再生植物。
11. 產生轉基因植物的方法，所述轉基因植物以比在相同條件下培養的對應野生型植 物更高的速率將硝酸鹽轉運出葉，所述方法包括：- a)用根據權利要求1-8中任一項所述的構建體的遺傳構建體或根據權利要求9所述 的載體轉化植物細胞；和 ai)從轉化的細胞再生植物。
12. 用於產生轉基因植物的方法，所述方法包括將編碼硝酸鹽轉運蛋白多肽的外源基 因引入未修飾的植物，其中所述多肽包含如SEQ ID No. 3所述的胺基酸序列，或其功能變體 或片段或直向同源物，並且其中相對於所述未修飾的植物的葉中的硝酸鹽濃度，由所述外 源基因編碼的硝酸鹽轉運蛋白的表達降低了所述轉基因植物的葉中的硝酸鹽濃度。
13. 轉基因植物，其包含根據權利要求1-8中任一項所述的遺傳構建體或根據權利要 求9所述的載體。
14. 轉基因植物，其包含編碼硝酸鹽轉運蛋白多肽的外源基因，其中所述多肽包含如 SEQ ID No. 3所述的胺基酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物，並且其中與未修飾的 植物葉中的硝酸鹽濃度相比，所述轉基因植物葉中的硝酸鹽濃度降低。
15. 編碼硝酸鹽轉運蛋白多肽的外源核酸序列用於通過用所述外源核酸序列轉化植物 而降低植物葉中的硝酸鹽濃度的用途，所述多肽包含如SEQ ID No. 3所述的胺基酸序列，或 其功能變體或片段或直向同源物。
16. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述外源基因包含基本上如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所述的核 苷酸序列，或其功能變體或片段或直向同源物。
17. 宿主細胞，其包含根據權利要求1-8中任一項所述的遺傳構建體或根據權利要求9 所述的載體。
18. 根據權利要求17所述的宿主細胞，其中所述細胞是植物細胞。
19. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述植物來自十字花科，諸如芸苔屬物種spp.)，且優選 為歐洲油菜dassica (油菜）。
20. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述植物來自禾本科，諸如小麥族物種spp.)，且優選 為小麥屬物種spp.)(小麥）。
21. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述植物來自茄科，例如曼陀羅、茄子、風茄、顛茄（顛茄）、辣椒（辣 椒、辣椒）、馬鈴薯或菸草。
22. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述植物來自菸草屬，優選菸草。
23. 根據權利要求12所述的方法，根據權利要求14所述的轉基因植物，或根據權利要 求15所述的用途，其中所述植物來自菊科的植物，其例如萵苣（萵苣（Lactuca sativa))， 或來自藜科的植物，其包括菠菜（Spinacia oleracea)和甜菜（Beta vulgaris)。
24. 植物繁殖產物，其可從根據權利要求13或權利要求14所述的轉基因植物獲得。
25. 收穫的葉，其含有比從在相同條件下培養的野生型植物採集的收穫的葉中對應的 硝酸鹽水平更低的硝酸鹽水平，其中所述葉是從根據權利要求13或權利要求14所述的或 通過根據權利要求11或權利要求12所述的方法產生的轉基因植物收穫的。
26. 菸草產品，其包含從突變體菸草植物獲得的硝酸鹽降低的菸草，所述突變體菸草植 物包含根據權利要求1-8中任一項所述的構建體或根據權利要求9所述的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
27. 根據權利要求26所述的菸草產品，其中所述菸草產品是無煙菸草產品，諸如鼻煙， 或可通過嘴遞送的口服菸草產品，諸如溼鼻煙，或吸菸製品。
28. 吸菸製品，其包含從突變體菸草植物獲得的硝酸鹽降低的菸草，所述突變體菸草植 物包含根據權利要求1-8中任一項所述的構建體或根據權利要求9所述的載體，所述突變 體能夠降低其葉中的硝酸鹽濃度。
29. 相比於在相同條件下培養的野生型植物的對應葉的胺基酸概況，調節參與試驗植 物的葉的氮同化的胺基酸概況的方法，所述方法包括：- (i) 用根據權利要求1-8中任一項所述的遺傳構建體或根據權利要求9所述的載體轉 化植物細胞；和 (ii) 從轉化的細胞再生植物。
30. 相比於從在相同條件下培養的野生型植物採集的對應的收穫的葉的胺基酸概況， 調節參與從轉基因植物採集的收穫的葉的氮同化途徑的胺基酸概況的方法，其中所述葉是 從由根據權利要求11或12所述的方法產生的轉基因植物收穫的。
31. 根據權利要求29或30所述的方法，其中參與植物和它們的葉的氮同化途徑的氨基 酸包含穀氨醯胺（Gin)、天冬醯胺（Asn)、天冬氨酸（Asp)、穀氨酸（Glu)或脯氨酸（Pro)。
32. 根據權利要求29-31中任一項所述的方法，其中與在相同條件下生長的野生型植 物中至少一種胺基酸的濃度相比，所述構建體能夠使用所述構建體轉化的植物中參與氮 同化途徑的至少一種胺基酸的濃度降低或增加至少1 〇%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、 65%、70% 或 75%。
33. 根據權利要求29-32中任一項所述的方法，其中與在相同條件下生長的野生型植 物中發現的對應葉相比，所述構建體能夠降低轉基因植物的下部葉中胺基酸Pro和Gin的 濃度。
34. 根據權利要求29-33中任一項所述的方法，其中與在相同條件下生長的野生型植 物中發現的對應葉相比，所述構建體能夠降低在轉基因植物的上部位置中發現的葉中氨基 酸61]1、六811、六8。、6111和/或？1'0的濃度。
【文檔編號】C12N15/82GK104395473SQ201380015390
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年3月19日 優先權日:2012年3月20日
【發明者】S.達文波特, P.勒萊, J.P.桑切斯坦布裡諾 申請人:英美菸草(投資)有限公司