細菌類非點源汙染源追蹤方法
2023-10-09 18:44:29
專利名稱：細菌類非點源汙染源追蹤方法
技術領域：
本發明涉及流域水環境保護技術領域，具體的說是一種細菌類非點源汙染源追蹤方法。
背景技術：
非點源(Non-point Source, NPS)汙染的嚴重性及防治的重要性已經為國內外所認識。國內外開展的多項研究表明，非點源已經成為水環境的重要汙染源；許多發達國家已經證實，農業非點源汙染是導致水環境惡化的主要原因之一。據報導，美國的非點源汙染量佔汙染總量的2/3，其中農業非點源貢獻率佔非點源汙染量的75%左右。我國的多項研究也表明，非點源汙染已經上升為威脅人類飲用水安全的主要原因，許多水域的非點源汙染甚至超過點源汙染。非點源汙染有以下主要特點發生具有隨機性；汙染物的來源和排放點不固定； 排放具有間歇性；汙染負荷的時間變化(次降雨徑流過程、年內不同季節及年際間)和空間變化幅度大；監測、控制和處理困難而複雜。簡單地說，就是不確定時間、不確定途徑、不確定量。因此，確定非點源汙染的來源和汙染負荷，是非點源汙染控制的重要前提。非點源汙染的主要控制指標之一是病原體，病原體產生來源廣泛，有人的排洩物， 家畜、家禽以及鳥類、野生動物的排洩物等，其排放具有無固定位置、難以預見等特點，要準確地確定其來源，其難度很大，要對其進行模擬及控制難度就更大。水體是眾多疾病的傳播媒介，一般而言，由不同方式產生的病原體通過暴雨徑流衝刷進入水體，給人體帶來多種潛在危害，如霍亂、傷寒、痢疾等，特別是近幾年發現的野生動物病毒向人體的傳播，如2004 年年初全球發生的高致病禽流感。據專家介紹，大量攜帶病毒的候鳥的糞便及分泌物會汙染遷徙沿途的水源、土壤等環境，當地禽類一旦接觸帶有病毒的環境，便會感染禽流感，並波及與之接觸的人類；目前，人類認識到以水作為媒介傳播的疾病是有限的，仍有許多疾病未被人所知。因此，對水體特別是飲用水水源地的病原體的控制顯得十分重要。抗生素廣泛應用於治療人類的疾病感染，目前在動物飼料中也加入了抗生素。細菌對於抗生素抵抗力的表現不僅存在於人類糞便，同樣存在於家禽、家畜糞便中。對人類或動物腸道中棲息的大腸桿菌應用抗生素時，不同的大腸桿菌會表現出不同的抗藥性，而不同的抗藥類型恰好反應了不同微生物群落的存在，這些不同的類型就被認為是表型的「生物指紋」。抗生素抵抗力分析方法是通過鑑別人類或動物的糞大腸菌群在抗生素抑制生長環境下不同程度抵抗力的細菌源追蹤方法。目前尚沒有文獻能夠充分反映流域汙染特點需要的抗生素種類及濃度。為了準確，有效，快速地追蹤糞大腸菌群非點源汙染來源，及時保障飲用水安全，許多學者致力於用最少抗生素及其濃度梯度反映流域汙染特點，如美國的Harwood在2000年的研究中應用氨苄青黴素、阿莫西林、頭孢菌素、金黴素、土黴素、鏈黴素、四環素、紅黴素、萬古黴素等9 種抗生素在4種不同濃度下評價糞鏈球菌和糞大腸菌群的抵抗力類型，在此次研究中，分別計算了人類與動物的糞鏈球菌株的平均準確率(ARCC)分別是75. 5%和72.4%。應用不同濃度的抗生素抑制生長實驗並結合確認性分析可為地表水汙染細菌來源追蹤提供至關重要的信息。
發明內容
本發明的目的是研究一種將細菌類非點源汙染監測轉化為點源汙染監測，適用於非點源汙染治理中的汙染源鑑定、追蹤、治理和控制的細菌類非點源汙染源追蹤方法。該技術主要思路是採集流域內已知非點源汙染源環境樣本，根據不同來源的細菌對抗生素耐藥性的差異性，利用抗生素抵抗力分析方法對已知的細菌(大腸桿菌、糞大腸菌、腸球菌等)來源進行耐藥性分析，並獲得其「指紋」(Fingerprint)，進而建立「指紋」資料庫；在此基礎上，對流域水質進行監測，通過細菌源追蹤技術對研究區域內非點源汙染物來源進行追蹤鑑別，並鑑別、量化研究區域內不同非點源汙染物的來源和貢獻率，識別非點源汙染關鍵源區，為制訂針對性的非點源控制措施提供依據。本發明細菌類非點源汙染源追蹤方法，其步驟如下 一、建立已知源資料庫
1、培養基的選擇及配製
(1)胰蛋白腖大豆瓊脂培養基(TSA=Trypticase Soy Aga)
TSA是一種多用途的培養基，按照說明書將其準備至瓶子中；並倒入IOOml至250ml的燒瓶中用高壓鍋滅菌，在水浴鍋中溫度降至50°C時加入抗生素；
(2)mFC培養基
mFC培養基是一種選擇性的培養基，用於分離培養糞大腸菌群；
(3)腸球菌肉湯(EB:Enterococcosel broth)
EB是一種選擇性的培養基，配方可從微生物培養基手冊得到；
(4)mENT培養基
mENT是一種選擇培養腸道球菌的培養基；
(5)Colilert 肉湯
Colilert是一種選擇性培養總大腸菌群和大腸桿菌的培養基，所有的成分都包含在獨立包裝的管子裡；按照說明，每一管試劑加IOml無菌水；
2、抗生素原液的配製(AntibioticStock Solutions)
(1)抗生素選擇
抗生素應在較大範圍(抗生素的種類、濃度)進行測試，然後儘可能減少抗生素的種類和濃度組成，使所建立的資料庫能夠達到足夠的解析度；經過實驗室反覆實驗，最終確定適合於國內的抗生素種類有利福平(RIF)、土黴素(0TC)、鏈黴素(STR)、頭孢菌素(CEP)^l 黴素(ERY)、四環素(ΤΕΤ)、新黴素(NEO)；
(2)配製方法
按如下介紹的方法配製抗生素原液；配製10mg/ml濃度的抗生素原液40ml ；分裝適當體積的原液至消毒過的小瓶中，並置於4°C儲存(有效期6個月)；包含有抗生素的培養皿也需儲存於4°C環境中(有效期為1個月)；
3、樣品採集
已知源樣品的採集按照項目區的面積來確定樣品數量，並對已知汙染來源進行分類；為了提高已知源資料庫分析識別的準確率，樣品採集必須滿足以下兩個條件①建立已知源資料庫需要有足夠的數據量，每一類已知源不少於15個樣品；②採集源樣本的範圍要求全面涵蓋整個研究區域或流域；
水質樣品的採集按照流域的特點進行監測點的布設，並進行定期採集； 表1源樣品數分配表
權利要求
1.一種細菌類非點源汙染源追蹤方法，其特徵在於對已知的細菌來源進行耐藥性分析，並獲得其「指紋」，進而建立「指紋」資料庫；鑑別、量化研究區域內不同非點源汙染物的來源和貢獻率，識別非點源汙染關鍵源區。
2.根據權利要求1所述的細菌類非點源汙染源追蹤方法，其特徵在於所述建立「指紋」資料庫，即採集流域內已知非點源汙染源環境樣本，根據不同來源的細菌對抗生素耐藥性的差異性，利用抗生素抵抗力分析方法對已知的細菌來源進行耐藥性分析，並獲得其「指紋」。
3.根據權利要求1所述的細菌類非點源汙染源追蹤方法，其特徵在於在建立「指紋」 資料庫的基礎上，對流域水質進行監測，通過細菌源追蹤技術對研究區域內非點源汙染物來源進行追蹤鑑別，並鑑別、量化研究區域內不同非點源汙染物的來源和貢獻率，識別非點源汙染關鍵源區，為制訂針對性的非點源控制措施提供依據。
全文摘要
本發明為一種新型的非點源汙染源追蹤方法-「細菌類非點源汙染源追蹤方法」，針對非點源汙染的不確定性問題和汙染無固定位置、不可預見性等特點，根據不同細菌的宿主群體或種群差異性對抗生素耐藥性的不同，建立已知細菌非點源汙染來源的資料庫，通過數學統計的方法構建細菌源和水體中細菌的相關關係，進而分析水體中細菌類非點源汙染的來源，以及各種來源的貢獻率。本方法提供一種將非點源汙染監測轉化為點源汙染監測的技術，適用於非點源汙染治理中的汙染源鑑定、追蹤、治理和控制。本發明其先進性在於將由暴雨徑流產生的、隨機性和不確定性強的非點源汙染進行有效識別和準確測定，能夠解決目前非點源汙染難以識別、控制的問題。
文檔編號G06F19/28GK102212606SQ201110097768
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者餘秋梅, 葉閩, 李超, 李迎喜, 楊芳, 王孟, 蔣固政, 賈海燕, 雷阿林 申請人:長江水資源保護科學研究所