用於抑制線粒體3-磷酸甘油醯基轉移酶1(mtgpat1)表達的rna拮抗劑化合物的製作方法

2023-10-10 02:05:39

專利名稱：用於抑制線粒體3-磷酸甘油醯基轉移酶1(mtgpat1)表達的rna拮抗劑化合物的製作方法
用於抑制線粒體3-磷酸甘油醯基轉移酶1 (MTGPAT1)表達
的RNA拮抗劑化合物
技術領域：
本發明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細胞內的mtGPATlmRNA，導致mtGPATl 的表達降低。mtGPATl表達降低有利於一系列疾病，例如超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變 性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依 賴型糖尿病(NIDDM)。
背景技術：
線粒體3-磷酸甘油醯基轉移酶1 (EC 2. 3. 1. 15，也被稱為GPATl，mtGPATl, GPAM， mtGPAM)在肝臟甘油三酯形成中起主要作用，其中高水平的mtGPATl活性導致脂肪肝(肝臟 脂肪變性)，然而mtGPATl的缺乏導致低水平的肝臟甘油三酯及刺激的脂肪酸氧化。3-磷酸甘油醯基轉移酶(GPATs)是催化甘油三酯合成中的限速步驟的酶家族。酶 催化3-磷酸甘油與活化的脂肪酸(醯基-輔酶A，醯基-CoA)之間的酯鍵形成。早已知，不 只一種酶負責細胞內GPAT酶促活性，有酶促活性存在於內質網及線粒體外膜，及一部分酶 不敏感相應敏感於NEM滅活(Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ；Coleman(2007)Cell Metab 5,87-89)。MtGPATl已鑑定為不敏感於NEM滅活的GPAT酶，及僅存在於線粒體內。mtGPATl活 性在肝外組織低，在那裡它們負責總GPAT活性的10%，然而在肝臟中活性高，其中mtGPATl 佔總 GPAT 活性的達 50% (Coleman et al. (2000)Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Co leman (2007) Cell Metab 5,87-89)。溶血 磷脂酸(LPA)，全部GPAT活性的產物，可驅動合成甘油三酯及磷脂。涉及甘油三酯合成的 多數酶存在於內質網，及mtGPATl因此早先被認為主要涉及磷脂前體合成。但是，mtGPATl 活性的激素及營養調節顯示在肝臟甘油三酯合成中的關鍵作用(Coleman et al. (2000) Annu.Rev.Nutr. 20,77-103-3 ；Colemanet al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Coleman(2007)Cell Metab5，87-89)。MtGPATl活性響應餵食及在肥胖的小鼠中顯著上調 (Xuet al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349,439-448)。mtGPATl在CHO或HEK293細胞中的過表達導致細胞內甘油三酯的水平穩固增加 (Igal et al. Q001)J. Biol. Chem. 276,42205-42212)。mtGPATl 在肝臟細胞中的過表達 導致甚至更高水平的細胞內脂質蓄積(Lewin et al. (2005)Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 288, E835-E844)，伴隨用於細胞燃料的脂肪酸利用(β -氧化)降低-看起來似乎 高水平的mtGPATl活性導致增加的肝臟脂肪酸攝取及甘油三酯合成(脂肪合成代謝)及 降低的脂肪酸氧化(脂質分解代謝)。這與丙二醯-CoA控制的「代謝轉換」的觀點一致， 其中細胞的能量需求(通過控制丙二醯-CoA濃度)驅使活化的脂肪酸向脂肪生成/儲存 (mtGPATl活性)或轉移到線粒體，然後脂肪酸氧化(用肉毒鹼棕櫚醯轉移酶-1，CPT-IJt 為限速酶)。在表達高水平的mtGPATl的全部細胞中，甘油三酯合成優於將活化的脂肪酸插 入磷脂或膽留醇酯。
mtGPATl的瞬時的肝臟腺病毒-誘導的過表達導致肝臟三醯甘油大量增加，即 肝臟脂肪變性(Linden et al. (2006)FASEB J. 20，434-443)及胰島素抗性(Nagle et al. (2007) J.Biol· Chem. 282，14807-14815)。已產生 MtGPATl 敲除小鼠。當保持標準餵 食時，動物具有更低重量及性腺脂肪墊重量，更低肝臟甘油三酯水平，更低血漿甘油三 酯，及更低 VLDL 分泌(Hammond et al. (2002)Mol. Cell Biol. 22,8204-8214 ；Yazdi et al. (2008)Biochem. Biophys. Res. Commun. 369，1065-1070)。MtGPATl 敲除動物也似乎被保 護抵抗胰島素抗性(Neschen et al. (2005) Cell Metab 2, 55-65) 在保持高脂肪，高蔗 糖攝食4個月的小鼠中，mtGPATl的缺乏導致肝臟甘油三酯含量60 %降低，伴隨刺激的脂 肪酸氧化的適應症，例如增加的血漿β-羥基丁酸水平(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25629-25636)。老的mtGPATl敲除小鼠具有增加的長鏈脂肪酸-CoA肝臟蓄積， 提示，酶促活性的平衡的下調優選相比於完全缺乏蛋白(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280,25629-25636)。但是，mtGPATl的缺乏似乎不導致任何肝臟尺寸，肝臟細胞數，或 線粒體形態的總變化(Hammond et al. (2007)Exp. Mol. Pathol. 82，210-219)。總的結論是， 高mtGPATl活性關聯於肥胖症，胰島素抗性，及肝臟脂質蓄積。mtGPATl活性抑制至今限於指向酶活性位點的小分子。但是，在GPAT家族不同成 員的活性位點有大程度的蛋白序列同源性(Gonzalez-Baro et al. (2007)Am. J. Physiol Gastrointest. LiverPhysiol 292, G1195-G1199)使設計特異於蛋白家族的一種奇異成員 的小分子抑制劑成為挑戰。因此，有對亞型特異性GPAT抑制劑的需求，例如mtGPATl特異性抑制劑。含本發 明的RNA拮抗劑的LNA是所述符合未滿足的涉及mtGPATl表達調節的治療性，診斷性及研 究應用需求的mtGPATl特異性抑制劑。發明概述本發明提供長度10 30個核苷酸之間的寡聚體，其中包括總10 30個核苷酸之 間的連續核苷酸序列，其中所述連續核苷酸序列至少80% (例如，85%，90%，95%，98%， 或99%)同源於對應於哺乳動物mtGPATl基因或mRNA，例如SEQ ID NO :263或其天然存在 的變體的反向互補體的區。因此，例如，寡聚體與具有部分SEQ IDNO :263序列的單鏈核酸 分子雜交。本發明提供綴合物，其包括本發明的寡聚體，及共價連接到所述寡聚體的至少一 個非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本發明提供藥物組合物，其包括本發明的寡聚體或綴合物，及藥學可接受的稀釋 劑，載質，鹽或佐劑。本發明提供用作藥物的本發明的寡聚體或綴合物，所述藥物例如用於治療超重， 肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)， 胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。本發明提供本發明的寡聚體或綴合物用於製備治療超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂 肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島 素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥物的用途。本發明提供治療超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括給患有，或可能患有超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性 脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病 (NIDDM)的患者施用本發明的寡聚體，綴合物或藥物組合物。本發明提供抑制表達mtGPATl的細胞內的mtGPATl的方法，所述方法包括給所述 細胞施用本發明的寡聚體，或綴合物，以實現抑制所述細胞內的mtGPATl。

圖1 顯示含針對mtGPATl的單鏈反義寡核苷酸的一系列LNA以相同納摩爾範圍 體外有效。A)用一系列含針對mtGPATl的反義分子的LNA脂質-輔助的轉染後LTK-D2細 胞內的相對mtGPATlmRNA表達。數據代表表示為模擬轉染的細胞內的相應mRNA比的百分 率的mtGPATl/GADPH mRNA表達的平均值士SD。B)用一系列含針對mtGPATl的反義分子的 LNA經脂質-輔助的轉染後HuH7細胞內的相對mtGPATlmRNA表達。數據代表表示為模擬轉 染的細胞內相應mRNA比的百分率的mtGPATl/GADPH mRNA表達的平均值士SD。圖2 雌性C57BL/6小鼠中肝臟mtGPAT mRNA表達的體內下調。測試了 5種不同 mtGPAT 反義寡聚體，SEQ ID NO :33，125，147，176，及 249 對肝臟 mtGPAT mRNA 表達的影響。序列標識號簡述1 262提供於表1。263提供於實施例部分後的序列表。264 290提供於表2。選自表1的特別優選的反義序列的列表提供於表3。發明詳述寡聚體本發明採用寡聚體化合物(在本文中稱為寡聚體)，其用於調節編碼哺乳動物 mtGPATl的核酸分子(例如顯示於SEQ ID NO :263的mtGPATl核酸，及所述編碼哺乳動物 mtGPATl的核酸分子的天然存在的變體)的功能。術語「寡聚體」在本發明中指由2個或更 多核苷酸共價連接形成的分子(即寡核苷酸)。寡聚體包括長度10 30個核苷酸之間的 連續核苷酸序列，或由其構成。在各種實施方式中，本發明的化合物不包括RNA (單元)。優選是，本發明的化合 物是線性分子或合成為線性分子。寡聚體是單鏈分子，及優選不包括例如，互補於相同寡聚 體內的等同區的至少3，4或5個連續核苷酸的短區(即雙鏈體)_在這點上，寡聚體(基本 上)不是雙鏈。在一些實施方式中，寡聚體基本上不是雙鏈，例如不是siRNA。在各種實施 方式中，本發明的寡聚體可完全由連續核苷酸區構成。因此，寡聚體基本上不自體互補。靶適宜地，本發明的寡聚體能下調mtGPATl基因的表達。在這點上，本發明的寡聚體 可一般在哺乳動物中例如人細胞中實現mtGPATl的抑制。在一些實施方式中，本發明的寡 聚體結合靶核酸，及實現相比正常表達水平至少10%或20%的表達抑制，更優選相比正常 表達水平至少30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的抑制。在一些實施方式中， 當使用0. 04與25nM之間的，例如0. 8與20nM之間的濃度的本發明的化合物時，觀察到所 述調節。在相同或不同實施方式中，表達抑制小於100%，例如小於98%的抑制，小於95%抑制，小於90 %抑制，小於80 %抑制，例如小於70 %抑制。表達水平的調節可通過測量蛋 白水平來測定，例如通過例如SDS-PAGE，然後使用針對產生的靶蛋白的適宜抗體的蛋白印 跡的方法。或者，表達水平的調節可通過測量mRNA水平來測定，例如通過RNA印跡或定量 RT-PCR。當通過mRNA水平測量時，當使用適當的劑量，例如0. 04及25nM之間的，例如0. 8 及20nM之間的濃度時，下調的水平在一些實施方式中，一般到無本發明的化合物的情況的 正常水平的10 20%之間的水平。 本發明因此提供下調或抑制表達mtGPATl蛋白和/或mRNA的細胞內的mtGPATl 蛋白和/或mRNA的表達的方法，所述方法包括給所述細胞施用本發明的寡聚體或綴合物， 以下調或抑制所述細胞內的mtGPATl蛋白和/或mRNA的表達。適宜地，細胞是哺乳動物細 胞，例如人細胞。在一些實施方式中，施用可體外實現。在一些實施方式中，施用可體內實 現。 本文所用的術語「靶核酸」指編碼哺乳動物mtGPATl多肽(例如人mtGPATl)的DNA 或RNA，例如SEQ ID NO :263。編碼mtGPATl的核酸或其天然存在的變體，及由其衍生出的 RNA核酸，優選mRNA，例如pre-mRNA，儘管優選為成熟的mRNA。在一些實施方式中，例如當 用於研究或診斷時，「靶核酸」可為cDNA或源於以上DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。 本發明的寡聚體優選能與靶核酸雜交。需知，SEQ ID NO :263是cDNA序列，及如所述，對應 於成熟的mRNA靶序列，儘管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷取代。術語「其天然存在的變體」指在指定的分類群(例如哺乳動物，例如小鼠，猴，及優 選人)中天然存在的核酸序列的mtGPATl多肽變體。一般而言，當說道多核苷酸的「天然存 在的變體」時，術語也可包括編碼通過染色體轉位或複製見於染色體10 ；位置10q25. 2Mb 的mtGPATl的基因組DNA的任何等位變體，及RNA，例如由其衍生出的mRNA。「天然存在的 變體」還可包括源於mtGPATlmRNA的可變剪接的變體。當說道特異性多肽序列時，例如，術 語也因此包括天然存在的形式的可例如通過翻譯同時或翻譯後修飾(例如信號肽切割，蛋 白水解切割，糖基化，等)加工的蛋白。序列寡聚體包括對應於SEQ ID NO :263所示的核苷酸序列的反向互補體的連續核苷酸 序列，或由其構成。因此，寡聚體可包括選自SEQID N0:l ^2的序列，或由其構成，其中 所述寡聚體(或其連續核苷酸部分)可相對所述選定的序列任選有1個、2個或3個錯配。表1 本發明的寡聚體序列的列表可根據本發明，如別處所述，通過包括增加寡核苷酸Tm的核苷酸類似物來設計此 表中的寡聚體序列。而且，可將硫代磷酸酯鍵提供為核苷酸間鍵。「S」代表硫代磷酸酯鍵，粗體字母代表LNA分子。
權利要求
1.長度10 30個核苷酸之間的寡聚體，例如SEQID NO 125，其包括總10 30個核 苷酸之間的連續核苷酸序列，其中所述連續核苷酸序列至少80%同源於對應於下列的區 哺乳動物mtGPATl基因或mRNA的反向互補體，例如SEQ ID NO J63，或者它們的天然存在 的變體。
2.權利要求1的寡聚體，其中所述連續核苷酸序列至少80%同源於對應於下列任何的 區=SEQ ID NO 264, 265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279， 280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，及 290。
3.權利要求1或2的寡聚體，其中所述連續核苷酸序列與SEQIDNO :263的相應區的 反向互補體不包括錯配，或包括不多於1個或2個錯配。
4.權利要求1 3中任一項的寡聚體，其中所述寡聚體的核苷酸序列由連續核苷酸序 列構成。
5.權利要求1 4中任一項的寡聚體，其中所述連續核苷酸序列的長度在10 18個 核苷酸之間。
6.權利要求1 5中任一項的寡聚體，其中所述連續核苷酸序列包括核苷酸類似物。
7.權利要求1 6中任一項的寡聚體，其中所述連續核苷酸包括SEQID NO 1 262 中任一個,或由SEQ ID NO :1 262中任一個構成。
8.權利要求6或7的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是糖修飾的核苷酸，例如選自下 列的糖修飾的核苷酸鎖核酸(LNA)單元；2』 -0-烷基-RNA單元，2』 -OMe-RNA單元，2』 -氨 基-DNA單元，及2，-氟-DNA單元。
9.權利要求6或7的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是LNA0
10.權利要求6 9中任一項的寡聚體，其為間隔聚體。
11.權利要求1 10中任一項的寡聚體，其中所述寡聚體是SEQIDNO :2，33，125，142， 147，169，176，182，214，249，250 及 254 中任一個。
12.權利要求1 11中任一項的寡聚體，其抑制表達mtGPATl基因或mRNA的細胞內的 mtGPATl基因或mRNA的表達。
13.綴合物，其包括權利要求1 12中任一項的寡聚體，及共價連接到所述寡聚體的至 少一個非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
14.藥物組合物，其包括權利要求1 12中任一項的寡聚體，或權利要求13的綴合物， 及藥學可接受的稀釋劑，載質，鹽或佐劑。
15.用作藥物的權利要求1 12中任一項的寡聚體，或權利要求13的綴合物，所述藥 物例如用於治療超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精 性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。
16.權利要求1 12中任一項的寡聚體，或權利要求13中定義的綴合物用於製備治 療超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥物的用途。
17.治療超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括 給患有，或可能患有超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的患者施用權利要求1 12中任一項的寡聚體，或權利要求13的綴合物，或權利要求14的藥物組合物。
18.表達mtGPATl的細胞內的mtGPATl的抑制方法，所述方法包括給所述細胞施用權利 要求1 12中任一項的寡聚體，或權利要求13的綴合物，以抑制所述細胞內的mtGPATl。
全文摘要
本發明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細胞內的mtGPAT1mRNA，導致mtGPAT1的表達減少。mtGPAT1表達降低有利於治療某些疾病，例如超重，肥胖症，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。
文檔編號C12N15/113GK102076854SQ200980124993
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月24日 優先權日2008年7月3日
發明者E·M·斯特拉爾普, M·林德霍爾姆 申請人:桑塔裡斯製藥公司