多肽在製備用於促進心內膜細胞向間質細胞轉化的藥物中的應用的製作方法

2023-10-29 19:59:22 2

專利名稱：多肽在製備用於促進心內膜細胞向間質細胞轉化的藥物中的應用的製作方法
多肽在製備用於促進心內膜細胞向間質細胞轉化的藥物中的應用
本申請是中國專利申請02816688.4的分案申請。
背景技術：
相關申請的交叉引用
本發明要求2001年8月29日提交的申請號為No. 60/315， 347的美國臨時 申請的權益。
1、 發明領域
本發明涉及在心肌事件(例如心肌梗塞)發生前、發生過程中或剛發生 後治療或預防發生在心臟、心瓣膜和中隔壁中的炎症、損傷和其他改變的領域。
2、 背景技術描述
心肌血管和冠狀血管和組織損傷的原因有很多，包括但不限於心肌缺血、 凝塊、血管堵塞、感染、發育缺陷或畸形以及其他這類心肌事件。心肌梗塞是 由於心內的血管病變。發生在當供給心臟部分的血液減少或停止時(由冠狀動 脈的阻塞引起)。減少的血液供給引起心肌細胞損傷並且甚至殺死心肌細胞。 對心臟血液供給的減少經常是由動脈粥樣斑導致的心外膜的血管狹窄引起的。 這些動脈粥樣斑可能破裂導致出血、血栓形成、血纖維蛋白和血小板積聚以及 血管的收縮。
在本技術領域中一直需要改進在心肌事件發生前、其過程中或在其剛發生 後用於治療或預防炎症、損傷和其他改變的方法和組合物。
發明概述
按照本發明，用於促進與心肌事件相關的損傷的醫治或預防的治療方法涉 及給藥於需要這種治療的患者或病人有效量的一組合物，該組合物包括一血管 生成誘導的和抗炎的多肽，該多肽含有LKKTET的胺基酸序列或具有心肌事件 抑制活性的其保守變異體。發明詳述
本發明是基於這樣一個發現含有LKKTET胺基酸序列或其保守變異體的 諸如胸腺素P4 (T|34)的肌動蛋白螯合(actin-sequestering)肽和其他肌動 蛋白螯合肽或肽片段促進與心肌事件相關的損傷和其他改變的治療或預防。包 括諸如KLKKTET和LKKTETQ的N-或C-末端變異體。在齧齒動物模型中已提示 T卩4在血管生成中作為一個因子發揮作用。然而，迄今尚沒有已知的跡象表明 這類性質在治療諸如心肌梗塞、血管閉塞和心瓣膜缺陷和損傷的心肌血管和冠 狀血管事件中有用。沒有與任何特定的理論相結合，這些多肽可能具有促進修 復的能力，通過具有誘導末端脫氧核酸轉移酶(一種無模板指導的DNA聚合 酶)，來降低和調控一種或多種炎性細胞素(cytokines)或化學素(chemokines) 的水平，並且為內皮細胞充當趨化因子和/或血管生成因子的能力而醫治和預 防，並因而在發生心肌事件的病人中治療和預防變性改變。
本發明提供能增強或下調間質的上皮細胞分化並恢復因局部缺血、感染、 老化和其他損傷或傷害導致的損傷的心肌組織和血管的功能。
在體外，胸腺素p4最初是作為在內皮細胞遷移和分化的過程中上調的蛋 白被鑑定。最初是從胸腺中分離的胸腺素(34，其是有43個胺基酸、4.9kDa的 多肽，該多肽在各種組織中均鑑定出普遍存在。幾種角色都歸於這種蛋白，包 括在內皮細胞分化和遷移、T細胞分化、肌動蛋白隔離(sequestration)和 血管形成中的角色。
根據本發明的一個實施方案，一種用於促進與心肌事件相關的損傷和炎症 的醫治和預防的治療方法，包括給藥於需要這種治療的患者有效量的一組合 物，該組合物含有一血管生成誘導、抗炎的^C，該肽含有LKKTET胺基酸序列 或具有血管生成誘導、抗炎活性的其保守變異體，所述肽優選為胸腺素p4、胸 腺素P4同型物、氧化的胸腺素(34、胸腺素P4的硫氧化物、或胸腺素f34的拮抗 體。
按照本發明，可以使用的組合物包括胸腺素P'i (TP4)、 TP4同型物、氧化 的Tp4、胸腺素(34的硫氧化物、具有肌動蛋白結合區的螯合(sequestering) 的或集束(bundling)的多肽或任何其他肌動蛋白、或具有血管生成誘導、抗 炎活性的包含或基本由LKKTET胺基酸序列或其保守變異體組成的肽片段。No.PCT/US99/17282的國際申請，這裡通過引用結合進來，公開了按照本發明中 可以有用的TP4的同型物以及LKKTET胺基酸序列和具有血管生成誘導、抗炎 活性的其保守變異體，其可以用於本發明。No. PCT/GB99/00833 (W0 99/49883) 的國際申請，這裡通過引用結合進來，公開了按照本發明可以利用的氧化的胸 腺素(34。雖然本發明後面主要是描述有關T(34和Tp4同型物，應當理解的是 下面的描述可以同樣地應用於胺基酸序列LKKTET、 LKKTETQ、含有或基本上由 LKKTET或LKKTETQ組成的肽和片段、具有血管生成誘導、抗炎活性的其保守 變異體、以及氧化的胸腺素|34。
在一個實施方案中，本發明提供通過用有效量的血管生成誘導、抗炎組合 物接觸損傷位點而醫治和預防患者的炎症和損傷的方法，該組合物含有TP4 或TP4同型物。所述接觸可以是直接的或系統的(systemically)接觸。接觸 損傷位點包括用僅含有TP4的組合物接觸該位點、或以與至少一個增加TP4 滲透、或延遲或緩釋TP4肽進入要治療區域的藥劑聯合的形式。給藥形式可以 包括，例如，靜脈內、腹膜內、肌內或皮下注射、或吸入、透皮或口服給予含 有Tp4或Tp4同型物等的組合物。患者可以是哺乳動物，最好是人。
T|34，或其類似物、同型物或衍生物，可以以任何適於心肌事件損傷抑制 或減輕的量使用。例如，TP4可以以大約0.1 50微克的劑量來給予，更優選 的是以大約1 25微克的量給藥。
按照本發明的組合物可以每天、每隔一天等用單次給予或每天多次給予的 形式給藥，例如每天2次、3次、4次或更多次給藥。
已鑑定了 TJ34的同型物，並具有與已知的TP4胺基酸序列大約70X、或 大約75%、或大約80%或更高的同源性。這類同型物包括，例如，Tp4ala、 TP9、 T|310、 T|311、 T(312、 T卩13、 Tpi4和T卩15。與T卩4類似，TplO和Tpl5同型物 已顯示出螯合肌動蛋白。Tp4、 TpiO和Tpi5以及這類其他的同型物共同有一 個胺基酸序列，LKKTET，該序列似乎與介導肌動蛋白螯合或結合有關。雖然不 希望與任何特定的理論結合，TP4同型物的活性可能部分由於調節肌動蛋白的 聚合的能力。P—胸腺素似乎通過螯合自由的G-肌動蛋白使F-肌動蛋白解聚。 Tp4的調控肌動蛋白聚合的能力因此可能全部或部分由於其具有通過LKKTET 序列與肌動蛋白結合或螯合的能力。因此，就像用T(34，如這裡闡明的，其他 結合或螯合肌動蛋白的蛋白，或調控肌動蛋白聚合的蛋白，包括具有LKKTET胺基酸序列的TP4同型物，單獨或與Tf34聯合使用似乎都有效。
因此，特別預期已知的Tp4同型物，例如Tp4ala、 Tp9、 T|310、 Tpil、 T卩12、 T(313、 Tpi4和Tpi5，以及尚未鑑定的Tp4同型物，將都在本發明的方法中有 用。這類Tp4同型物在本發明的方法中有用，該方法包括在患者中使用的方法。 因此本發明進一步提供含有Tp4，以及TP4同型物TP4, Tp9、 T卩IO、 Tpil、 T(312、 Tpi3、 Tpi4和Tf315，以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。
另外，具有肌動蛋白螯合或結合能力的其他蛋白，或那些能動員或調控肌 動蛋白聚合的蛋白，就像以適當地螯合、結合、動員或聚合分析所證實的，或 通過諸如LKKTET的介導肌動蛋白結合的胺基酸序列的存在而鑑定的，都可同 樣地用於本發明方法中。這類蛋白包括例如(肌動蛋白)凝溶膠蛋白、維生素 D結合蛋白(DBP)、(肌動蛋白)抑制蛋白、cofilin、 adsevertin、前肌球蛋 白(propomyosin)、 fincilin、 depactin、脫氧核糖核酸酶I、 vilin、(肌動 蛋白)片段化蛋白、severin、(肌動蛋白)加帽蛋白、p —輔肌動蛋白、和 acumentin。由於這類方法包括那些在患者中實施的方法，本發明進一步提供 含有上述(肌動蛋白)凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白(DBP)、(肌動蛋白) 抑制蛋白、cofilin、 d印actin、脫氧核糖核酸酶I、 vilin、(肌動蛋白)片 段化蛋白、severin、(肌動蛋白)加帽蛋白、P—輔肌動蛋白、禾B acumentin 的藥物組合物。因此本發明包括含有LKKTET胺基酸序列(可以是在其最初的 胺基酸序列內)的血管生成誘導、抗炎多肽和其保守變異體的用途。
在此使用的術語"保守變異體"或其語法變化指用一個胺基酸殘基代替另 一個生物學上相類似的殘基。保守變異的例子包括例如用異亮氨酸、纈氨酸、 亮氨酸或甲硫氨酸的疏水殘基代替另一個，用極性殘基代替另一個，例如用精 氨酸代替賴氨酸，用穀氨酸代替天冬氨酸，或用穀氨醯胺代替天冬醯胺等等。
已將TP4定位於幾個組織和細胞類型，並且因此可以加入刺激TP4產生的 藥劑，或該藥劑可以包含一組合物，以影響來自組織和/或細胞中的Tp4產生。 這類藥劑包括生長因子家族的成員，例如胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板 衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子P (TGF-(3)、鹼性 成纖維細胞生長因子(bFGF)、胸腺素od (Tal)和血管內皮生長因子(VEGF)。 更優選的是，該藥劑是轉化生長因子p (TGF-p)或TGF-(3總科的其他成員。本 發明的TP4組合物可以通過細胞外基質沉積、細胞的遷移和皮膚的血管形成實
6現相連接組織的生長而降低心肌事件的影響。
按照本發明的一個實施方案，給患者用刺激在該患者中產生如上述的血管 生成誘導、抗炎的肽的藥劑治療。
另外，可將幫助或刺激醫治由心肌事件引起的損傷的藥劑與Tf34或Tp4 同型物一起加入到組合物中。這類藥劑包括血管生成劑、生長因子、指導細胞 分化的藥劑。例如，並以非限制的方式，Tp4或Tp4同型物可以單獨或聯合與 有效量的下述藥劑的任何一種或多種結合VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGF(3、 IGF-1、 IGF-2、 IL-1、前胸腺素a (prothymosina)和胸腺素al。
本發明也包括在藥學上可接受的載體中含有治療有效量的T(34或TP4同型 物的藥物組合物。這類載體包括那些列舉在腸胃外投藥的參考資料中的載體。
醫治或預防與心肌事件相關的炎症、損傷和退化的實際劑量、配方或組成 成分可以取決於許多因素，包括患者的體型和健康狀況。然而，本領域技術人 員可以運用在PCT/US99/17282 (見前)中公開的，和其中引用的參考文獻中 描述的用於確定臨床劑量的方法和技術的教導來確定使用的適當劑量。
合適的配方包括T|34或T|34同型物重量濃度範圍在大約0. 001-10%，更優 選在大約0. 01-0. 1%重量濃度範圍內，最優選為大約0. 05%重量濃度。
在這裡描述的治療途徑涉及含有TP4和本發明其他化合物的試劑或組合 物的各種途徑的給藥或輸送，包括任何常規的對患者的給藥技術。可以按照使 用的方法，通過與藥學上可接受的無毒性賦形劑或載體混合，將含有T(34和本 發明其他化合物的組合物配製成藥物組合物。
本發明包括與TP4肽或其功能片段相互作用的抗體的用途。提供基本由具 有不同表位特異性的混合的單克隆抗體以及性質不同的(distinct)單克隆抗 體製劑組成的抗體。通過本領域技術人員已知的，如在PCT/US99/17282 (見 前)中公開的方法，由含有蛋白片段的抗原製備單克隆抗體。在本發明中使用 的術語抗體意在包括單克隆抗體和多克隆抗體。
在另一個實施方案中，本發明提供給予患者有效量的調控T(34基因表達的 藥劑的治療方法。術語"調控"指當TP4過量表達時，Tp4表達的阻礙或抑制， 而在TP4表達不足時，其表達的誘導。術語"有效量"意為在有效治療中，調 控TP4基因表達中的T(34藥劑的量。調控TP4或Tp4同型物基因表達的藥劑 可以是例如一多核苷酸。該多核苷酸可以是反義(核酸)、三螺旋(triplex)劑、或核糖酶。例如，可以使用直接針對結構基因區域或針對TP4啟動子區域 的反義(核酸)。
在另一個實施方案中，本發明提供使用調控T(34活性的化合物的方法。影 響TP4活性(例如拮抗劑和促效劑)的化合物包括肽、肽模擬物 (p印tidomimetics)、多肽、化學化合物、例如鋅的礦物、以及生物藥劑。
不與任何特定的理論結合，本發明可以通過誘導末端脫氧核酸轉移酶(一 種無模板指導的DNA聚合酶)促進與心肌事件相關的炎症或損傷的醫治或預 防，通過誘導末端脫氧核酸轉移酶以降低一種或多種炎性細胞素或化學素的水 平，並且在內皮細胞中作為趨化性因子，因而促進在由心肌事件或其他變性或 環境因子導致的、發生在心血管和組織中的變性改變的醫治或預防。
下面的實施例進一步說明本發明，但不應作為其限制。
實施例
合成的Tp4和抗TI34抗體由RegeneRx生物製藥公司(3 Bethesda Metro Center, Suite 700， Bethesda， MD 20814)提供，並在膠原蛋白凝膠分析測 試以測定它們由心內膜細胞向間質細胞轉化的效果。已充分證實通過上皮一間 質轉化形成心瓣膜和其他心臟組織的發育，並證實在此過程中的缺陷可在發育 過程中和終生導致嚴重的心血管畸形和損傷。在膠原蛋白凝膠分析中，生理濃 度的Tp4明顯增強心內膜細胞向間質細胞的轉化。而且抗TP4抗體抑制並阻 斷這種轉化。在正常心臟組織形成和維護過程中和心瓣膜形成過程中，房室的 心內膜向侵入的間葉細胞的轉化是關鍵的。
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權利要求
1、多肽在製備用於促進心內膜細胞向間質細胞轉化的藥物中的應用，其中所述多肽含有LKKTET胺基酸序列或其保守變異體。
2、 如權利要求l所述的應用，其中所述多肽包括KLKKTET、 LKKTETQ、胸 腺素|34、胸腺素P4的C-末端變異體、胸腺素P4的同型物、氧化的胸腺素P4 或胸腺素P4硫氧化物。
3、 如權利要求l所述的應用，其中將所述藥物系統地給藥。
4、 如權利要求l所述的應用，其中將所述藥物直接給藥於冠狀組織。
5、 如權利要求l所述的應用，其中將所述藥物通過靜脈內、腹膜內、肌 內、皮下、吸入、透皮或口服給藥。
6、 如權利要求l所述的應用，其中所述多肽是重組的或合成的。
7、 如權利要求l所述的應用，其中所述多肽具有肌動蛋白螯合或結合能力。
8、 如權利要求l所述的應用，其中所述多肽是一抗體。
9、 如權利要求8所述的應用，其中所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
10、 組合物在製備用於促進心內膜細胞向間質細胞轉化的藥物中的應用， 其中所述組合物含有一藥劑，所述藥劑刺激血管生成誘導的抗炎多肽產生，所 述多肽含有LKKTET胺基酸序列，或含有具有血管生成誘導的抗炎活性的其保 守變異體。
11、 如權利要求10所述的應用，其中所述多肽為胸腺素(34。
12、 如權利要求10所述的應用，其中所述藥劑為胸腺素P4的拮抗劑。
13、 一種用於促進促進心內膜細胞向間質細胞轉化的組合物，包括一有效 量的組合物，所述組合物包括一血管生成誘導的抗炎多肽，所述多肽含有 LKKTET胺基酸序列或具有血管生成誘導的抗炎活性的其保守變異體。
14、 如權利要求13所述的組合物，其中所述組合物含有LKKTET胺基酸序 列的N-末端或C-末端變異體。
15、 如權利要求13所述的組合物，其中所述組合物含有LKKTET或 LKKTETQ。
16、 如權利要求13所述的組合物，其中所述組合物含有胸腺素(34、胸腺 素(34的同型物、氧化的胸腺素P4或胸腺素P4硫氧化物。
全文摘要
本發明通過給予諸如胸腺素β4、胸腺素β4的同型物或氧化的胸腺素β4的血管生成誘導、抗炎肽，公開了多肽在促進心內膜細胞向間質細胞轉化中的應用，並提供了一種含有多肽的組合物。所述多肽和組合物可促進冠狀組織癒合或預防其損傷，用於治療或預防與心肌事件相關的炎症和損傷。
文檔編號C07K7/06GK101549148SQ20091011832
公開日2009年10月7日 申請日期2002年8月29日 優先權日2001年8月29日
發明者小傑克·芬科爾斯坦, 艾倫·L·戈爾德斯坦 申請人:雷根內克斯生物製藥有限公司