一種彎曲假單胞菌及其應用的製作方法

2023-10-29 22:09:42

本發明涉及生物工程
技術領域：
，具體涉及一種彎曲假單胞菌及其應用。
背景技術：
：原油是未經加工的石油，是天然有機物質經過地質變遷而形成的一種粘稠的黑色或深棕色的液體或固體，一般情況下大多存在於地下或海底，且帶有刺激性氣味，主要成分是碳氫原子結合形成的鏈狀化合物，其對水體環境具有極大的危害。水環境中維持生命所需的最小溶解氧量約為2mg/L，石油或含油廢水排入水體後一方面會漂浮在水面上，阻隔氧氣的進入，影響氣體交換，另一方面部分靠石油提供碳源繁殖的微生物也會消耗氧氣，導致水中溶解氧的缺乏。同時又會使厭氧生物迅速繁殖使水體水質惡化。同時芳香烴類化合物產生的毒性也影響藻類的生長，進而對食物鏈造成影響。此外，石油中的有毒成分也會影響水生生物的生長繁殖，它會沾附在魚鰓上使其窒息死亡或影響其卵化，多環芳烴會破壞水生生物的內分泌系統，當存在極低的濃度的多環芳烴時，魚類都會產生魚臭味，直接影響了魚類的正常生存，嚴重破壞了水環境中水生生物的多樣性。目前，對石油汙染的水體的修復技術主要有物理修復技術、化學修復技術、光催化修復技術和生物修復技術；生物修復技術是一個具有政策、經濟和技術吸引力的處理方法，被認為是最具發展潛力的技術方法，並且逐步發展成為一種經濟效益和環境效益俱佳的、解決複雜環境汙染問題的最有效的手段。技術實現要素：針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種彎曲假單胞菌，該菌種可用於降解修復原油汙染水體。為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案予以實現。提供一種可用於降解原油汙染水體的彎曲假單胞菌，將該菌種直接投加入汙染水體中，達到較好的降解效果，實現原油汙染的治理。為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案予以實現。(一)一種彎曲假單胞菌，已於2016年09月12日保藏於北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.13004；命名為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。將所述彎曲假單胞菌在牛肉膏蛋白腖培養基上培養，菌株3在牛肉膏蛋白腖的平板上起初呈淡黃色，隨著菌齡的增加，顏色越來越深，最後呈黃色。該菌落特徵為針尖大小的淡黃色菌落，呈規則圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，革蘭氏染色後，不易著色。菌體細胞呈短杆、棒狀，大小為(1-1.5)μm×0.5μm，為革蘭氏陰性菌。所述彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的16SrDNA測序結果如SEQIDNo.1所示。(二)一種彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在降解原油汙染水體中的應用。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明提供的彎曲假單胞菌不但易於規模化生產，而且降解效率高，環境適應性強。所提供的彎曲假單胞菌能在大量有機物存在的條件下順利生長，以原油為碳源，達到較好的降解效果。該菌能在原油濃度達1mL/100mL的原油汙染水體中體現出較優的降解效果，實現原油汙染水體的修復處理，在原油汙染廢水的生物修復中展現了良好的應用前景。附圖說明下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為本發明的彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在牛肉膏蛋白腖培養基平板上的菌落形態圖；圖2為本發明的彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3在顯微鏡下的的菌體形態圖，圖中，放大倍數為1000倍；圖3為本發明實施例3中I號原油的波長-吸光度曲線圖；圖中，橫坐標為波長，單位為nm，縱坐標為吸光度，單位為1；圖4為本發明實施例3中I號原油的標準曲線圖；圖中，橫坐標為濃度，單位為mg/L，縱坐標為吸光度，單位為1。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例1菌株的分離純化(1)菌株來源本發明提供一種彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3，分離自延長石油集團的七裡洞採油場集油站落地原油汙染土壤中，土壤的理化性質為：銨態氮15.09ppm，硝態氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，鉀含量17.45ppm，有機質含量1.43％，pH為7.65。(2)菌株的分離純化將10g石油汙染土壤樣品加入100mL富集液體培養基中，28℃、130r/min搖床培養7d。待培養液混濁後，吸取5mL培養液重新轉接入新鮮富集培養基中，與上述培養條件相同連續轉接富集培養3次。取1mL上述菌懸液，用無菌水系列稀釋後，分別接種於牛肉膏蛋白腖培養基中，29℃左右恆溫培養3d。其中，富集液體培養基的成分為：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油I號1％(體積比)，pH7.0。牛肉膏蛋白腖培養基的成分為：牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g，NaCl5.0g，營養瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分離後，根據菌落顏色、形態特徵及表面溼度的不同，分別用接種針挑選菌落進行平板劃線純化分離。將菌株接種於斜面，4℃冰箱冷藏備用。(3)溶油圈法篩選石油降解菌將上述菌種接種於含油無機鹽固體培養基上，置於37℃培養箱中培養10-15d，觀察有無嗜油圈，並根據嗜油圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值初步確定菌株的石油降解能力；其中，含油無機鹽固體培養基的成分為NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油I號1％(體積比)。將初步篩選的石油降解菌接種於斜面培養基，4℃冰箱冷藏備用。實施例2菌株的鑑定(1)菌株的形態特徵如圖1所示，將所述彎曲假單胞菌在牛肉膏蛋白腖培養基上30℃恆溫培養24h後觀察菌落形態，菌株3起初呈淡黃色，隨著菌齡的增加，顏色越來越深，最後呈黃色。該菌落特徵為針尖大小的淡黃色菌落，呈規則圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，革蘭氏染色後，不易著色。如圖2所示，菌體細胞呈短杆、棒狀，大小為(1-1.5)μm×0.5μm，為革蘭氏陰性菌。(2)生化特性根據《伯傑氏細菌鑑定手冊》和《常見細菌系統鑑定手冊》對彎曲假單胞菌進行生理生化鑑定，鑑定結果如表1所示。表1彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3的菌株生理生化鑑定結果指標特性革蘭氏染色—葡糖糖+麥芽糖+澱粉水解—M.P(甲基紅)試驗—硫化氫—硝酸鹽還原—氧化酶+吲哚+V.P(乙醯甲基甲醇)試驗—接觸酶+過氧化氫酶+明膠液化+註：「—」表示反應為陰性；「+」表示反應為陽性(3)菌株的16SrDNA鑑定用DNA提取試劑盒提取彎曲假單胞菌3的基因組DNA，然後進行16SrDNA基因克隆、測序，其16SrDNA測序結果如SEQIDNo.1所示，具體如下：之後在GenBank中進行Blast比對，結果顯示，與其序列相似度達到98.56％均為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)，將其歸屬為單胞菌類並命名為彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3。實施例3彎曲假單胞菌(Pseudomonasgeniculata)3對原油汙染水體的降解試驗方法：(1)彎曲假單胞菌3菌懸液的製備在無菌條件下，挑取分離純化獲得的石油降解菌，接種於100mL的牛肉膏蛋白腖液體培養基中，搖床擴大培養培養48h；其中，牛肉膏蛋白腖液體培養基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白腖10.0g，NaCl5.0g，營養瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氫氧化鈉或1mol/L氯化氫調至要求值。培養基滅菌條件是：溫度為121～126℃，時間為25min。(2)I號原油最大吸收波長的測定石油及其產品在紫外光區有一定的吸收特徵，石油組分中帶有苯環的芳香族化合物波長一般為250～260nm，而帶有共軛雙鍵的化合物波長一般在215～230nm之間，有研究表明，在使用紫外分光光法測定時，255nm左右為原油和重質油的選擇範圍，225nm左右與為輕質油及煉油廠的油品的選擇範圍。在100mg/L濃度下，依據獲得的波長與吸光度數據，繪製供試I號原油的波長-吸光度曲線如圖3所示，其中，I號原油採自延長石油集團七裡洞採油場集油站，密度為0.65g/mL。(3)I號原油標準曲線的繪製分別取0、2、2.5、5、6、7mgI號原油於50mL比色管中，用石油醚定容，此時的濃度分別為0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波長下，以石油醚為參比溶液，測定標準濃度的吸光度，橫坐標為濃度(mg/L)，縱坐標為吸光度，繪製I號原油的濃度(mg/L)-吸光度(A)的標準曲線如圖4所示。(4)原油降解率的測定取擴大培養的彎曲假單胞菌3菌懸液3mL，接種於100mL含油無機鹽液體培養基中，含油無機鹽培養基的成分是：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油1.5mL，pH7.0；在30℃，120rpm恆溫水浴振蕩器中培養7d。培養液用5:1(V/V)的硫酸溶液調節pH值為2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液經無水硫酸鈉乾燥後轉入50mL容量瓶並定容。將石油醚萃取液經系列稀釋後，以石油醚為參比，通過紫外分光光度法測定其相應的吸光度，根據I號原油的濃度(mg/L)-吸光度的標準曲線，確定石油醚提取液相應樣品的濃度，依據濃度計算降解效率。原油降解率的計算方法參考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油濃度；Co-對照原油濃度。按照上述計算公式計算得彎曲假單胞菌3-1對原油汙染水體的降解率為71.24％。雖然，本說明書中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。SEQUENCELISTING長安大學一種彎曲假單胞菌及其應用20161PatentInversion3.511319DNA彎曲假單胞菌（Pseudomonasgeniculata）31AGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAA60TCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACG120GGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTA180GTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAG240CCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG300ACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTA360AAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCC420AAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCG480TTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAG540CCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTA6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