一種重組艾塞那肽的生產工藝的製作方法

2023-10-17 01:58:14 5

專利名稱：一種重組艾塞那肽的生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物多肽的合成技術領域，具體涉及一種重組艾塞那肽的生產工藝。
背景技術：
糖尿病是繼心腦血管疾病、腫瘤之後的另一個嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病，近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率呈急劇上升趨勢。目前我國糖尿病患者已逾7000萬，並且糖尿病患者增長率是歐美國家的2倍。2型糖尿病(Type 2Diabetes, T2DM)是糖尿病的主體，佔糖尿病患者的90%左右。T2DM是由遺傳和多種環境因素相互作用而引起胰島索分泌或作用缺陷。其患病率較高，尤以中老年人為多，並呈現年輕化趨勢。胰島口細胞數目減少或分泌功能障礙是導致T2DM發病的中心環節。治療一般遵循生活方式幹預(如飲食控制、運動治療等)、口服降糖藥和聯合使用胰島素等方式。傳統治療T2DM的藥物的副作用都較大，長期使用會因胰島素分泌過度導致胰島口細胞功能衰竭。近年來胰高血糖素樣肽I(GLPl)和enendin — 4成為糖尿病治療研究的熱點。因為它們具有在血糖濃度較高的情況下促進胰島素分泌的特性，而在血糖正常的情況下不發揮作用，不僅可使初治的2型糖尿病患者血糖恢復正常，而且對磺脲類藥物治療失效者也有降血糖作用。Exendin-4是一條39個胺基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的胺基酸殘基與哺乳動物GLP-I序列有53%的同源性，並且生物學效應也幾乎完全一致其與GLP-I的最大不同之處在於N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶(DPP-IV)jGLP-I的相同位置則為極易被DPP-IV切斷的丙氨酸(Ala)，故Exendin-4被吸收入血後的半衰期較長(tl/2 E =9. 7h )。Exendin-4是一種強效GLP-I受體激動劑，能模擬GLP-I這種內源性多肽的糖調控作用，降低空腹和餐後血糖。艾塞那肽(Exenatide)的活性主要通過與人體胰臟GLP-I受體結合而介導，由環腺苷酸(cAMP)依賴和β細胞分化機制引發葡萄糖依賴的胰島素合成和分泌。因為Exendin-4的胺基酸結構及生物活性與GLP-I均具有相關性，故通常也被視為腸促胰島素的一種。由於Exendin-4的降糖作用時間較長，延緩胃排空和抑制攝食衝動對肥胖病人體重的有益作用又有別於傳統的降糖藥物，因此其作為2型糖尿病治療藥物開發的潛力巨大。目前對Exendin-4進行的藥物研究主要為製備工藝，作用機制，內分泌代謝病臨床，分子藥理學和藥劑學研究。已上市的Exendin-4藥物(Exenatide)採用的是多肽合成法的製備工藝。化學合成成本高(對原料胺基酸及儀器設備要求極高)、產量少，而利用基因工程生產Exendin — 4，不僅可以實現工業化的大規模生產、有效地降低生產成本，而且對環境影響小，產品品質更安全。但用基因工程方法直接表達生產Exendin-4這樣的39肽，表達水平低，且容易降解，可採用與載體蛋白(如硫氧還蛋白等)連結融合表達的方法。但這種方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所佔比例很小，產量很低，且融合蛋白裂解後多肽種類很多，分離純化困難的問題。行之有效的增加基因的表達產物的方法是構建基因串聯體，根據目標基因的特點和表達產物的特性，運用適當的分子生物學操作技術將目的基因按一定的方式串聯在一起，置於表達載體啟動子控制之下進行表達，再將表達的串聯體產物用特定的物質(酶或化學試劑)裂解，以獲得目標肽單體。比如pET-31b ( + )是一個常用的生產多肽的質粒，但是它用來生產多肽，當初設計是為了避免多肽容易被大腸桿菌體內的蛋白水解酶水解，所以讓目的多肽和KSI融合蛋白一起表達，形成了包涵體，這對生產Exendin-4來說是個很大的缺點，如果讓Exendin-4先生成包涵體再復性會造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復，這已是重組艾塞那肽的產業化生產的瓶頸。

發明內容
本發明的目的在於解決現有技術中存在的上述技術問題，提供一種重組艾塞那肽的生產工藝。為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下
本發明的重組艾塞那肽的生產工藝，包括工程菌的構建、工程菌的發酵表達和目的蛋白的純化，所述的工程菌的構建是按下述步驟進行的
(1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因；
(2)MAG2010質粒取pET31b(+)質粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和後繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；構建的質粒順序為蛋氨酸編碼序列+6XHis_tag編碼序列+ GB-I編碼序列+腸激酶酶切位點編碼序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸編碼+雙終止子；
(3)工程菌的構建按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。要使生物合成Exendin-4能進行擴大規模的生產應用，關鍵之一是對發酵過程優化，最大可能的利用菌株Exendin-4高產能力，以最經濟的方式進行生產。一般來說，生產可溶性蛋白時不能採用高密度發酵的方法，因為這樣容易形成包涵體，目前國內外利用的培養基大多為2XYT培養基或者LB培養基來進行培養，利用的大多是實驗室內研究型的搖瓶法培養。本發明的工程菌的發酵表達包括下述步驟
(1)挑單菌落到裝有30mL目標培養基中，3rc，200rpm活化過夜；
(2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養基中，32°C，200rpm培養約2. 6 hr ；
(3)以10%的接種量，接到5L MMBL培養基中，32°C，240rpm培養約3 hr ；
(4)接到60L發酵培養基中；
(5)控制生長期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養基中葡萄糖的濃度降至O. 2g/L時開始補料；當OD55tl達到10左右時加入13 mL IM IPTG誘導，終濃度為
0.2mM,把pH緩慢調至7. 00,繼續培養10小時後結束。所述的目的蛋白的純化步驟採用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進行分離和純化；該工程菌經過發酵、純化得到的重組艾塞那肽的產量達到500毫克/升的產率。所述的三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下
(1)親和層析一採用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3個柱體積的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的緩衝液平衡柱子，然後用將用相同緩衝液透析過的蛋白質上柱，用I倍體積上述緩衝液洗然後用5mM乙酸鈉，pH5. O的緩衝液洗去未結合的雜質，接著用500mM乙酸鈉，pH5. O的緩衝液將目的蛋白洗脫下來，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小時；
(2)腸激酶處理1μ I的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的條件下8h可以完全切割融合蛋白；
(3)親和層析二將上述處理過的重組Exendin-4結合在鎳柱上,先用起始緩衝液衝洗脫磷酸鹽緩衝液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍乾燥，得到重組的艾塞那肽。由於艾塞那肽是一個分子量比較小的多肽，並不適合用大分子蛋白的體系進行表達，所以我們採用專門用來改造後的生產多肽表達體系pET-31b ( + )質粒和E. Coli(DE3) PlyS進行生產，採用這個體系有以下優點pET_31b ( + )是一個生產多肽的質粒，目的多肽和KSI融合蛋白一起表達，形成了包涵體，可以避免生產的多肽被大腸桿菌體內的蛋白水解酶水解，但是這對生產Exendin-4來說是個很大的缺點，如果讓Exendin-4首先生成包涵體的形式然後再復性會造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復，所以我們對pET-3Ib ( + )進行了改造，將pET-31b ( + )中的KSI融合蛋白序列完全刪除，同時刪除蛋氨酸裂解位點(ALWN切割位點)和C末端(多肽羧基端的)組氨酸標記(His6-tag)以及終止子，在刪除的位置，取代以蛋氨酸+ His6-tag+GBl突變序列+腸激酶裂解序列，我們將改造的pET-3Ib ( + )形成的新質粒重新命名為Mag2010,有了這個質粒,我們首先取得Exendin-4的原始序列，然後按照大腸桿菌對於遺傳密碼子的偏好進行了改造，採用適合大腸桿菌表達的遺傳序列，人工合成改造的Exendin-4的全序列,然後克隆島HJC57質粒中進行大規模擴增，將擴增後的Exendin-4序列切割並純化，然後克隆到改造好的Mag2010質粒中，並在C末端添加雙重終止子，這麼做的好處是利用了 pET-31b(+)本身的可以大規模，高產量的生產多肽的優點，保留了它的功能強大的啟動子，克服了該質粒容易形成包涵體的缺點，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進行切割，切割後的蛋白質完全是具有天然序列的Exendin-4。利用大腸桿菌E. Coli BL21 (DE3)PlyS表達體系的原因在於Exendin-4沒有需要糖基化修飾等翻譯後修飾，DNA轉錄時也不需要轉錄後修飾，所以特別適合用大腸桿菌體系進行生產，再加上我們克服了形成包涵體的問題，而E. Coli BL21(DE3)PlyS的優點在於可以大量表達外源蛋白，而且耐外源蛋白等毒素的幹擾。本發明通過連接GBl標記融合蛋白將艾塞那肽有90%的形成包涵體的可能性變成了 90%的形成可溶性蛋白。實驗證明，絕大部分重組產生的艾塞那肽都處於可溶蛋白中。在國內外進行的艾塞那肽表達的體系中，很多人採用了 His6-Thioredoxin A(TrxA)融合蛋白和Exendin-4進行融合表達，融合蛋白分子量為14. 7+4. 2=18. 9kd,exendin在融合蛋白中的比率為4. 2/18. 9=22. 2%.我們採用了自身分子量較小的GBl和Exendin-4進行融合表達,融合蛋白分子量為14. 7+4. 2=18. 9kd, exendin在融合蛋白中的比率為4. 2/11. 9=35. 3%。也就是說，Exendin-4在融合蛋白中的比重大大增加了，在類似的體系下，假如表達的融合蛋白總量相等，那麼exendin-4在我們的體系中產量是其他體系的I. 59倍。本發明採用GBl和His-tag雙標記的體系使得在純化過程中既可以採用鎳柱親和 層析，又可以採用GBl親和層析，相對於其他的純化方法，可以有更多的純化選擇方式。在現有的文獻報導中，產量很低，最多的也就是28毫克/升的產量，利用本發明的發酵體系，我們可以達到500毫克/升的產率，這個產量為目前發酵工藝的20倍左右，所以規模化生產後可以大大降低成本。對於艾塞那肽類的藥物成本價格降低和藥物的普及有著難以估量的意義，就像重組人胰島素開發成功後對於胰島素的普及那樣有著重要的社會價值和經濟價值。本發明的生產工藝相對於目前的工藝有著顯著的特點產量可以達到500mg/升以上，比目前最先進的工藝產量提高了 20倍，且均為可溶性蛋白，在生產過程中，我們採用了本公司獨特具有自主智慧財產權的的發酵工藝，產量大大提高，我們採用的雙重親和純化工藝，配合傳統的純化方法，純化效率有了極大的提高，前期粗提取的純化，減輕了後繼純化的壓力，降低了純化的成本。


圖I發酵過程中細菌生長曲線圖。圖2是發酵過程參數監測結果圖。圖3是質粒的穩定性分析結果圖。圖4是質粒的細胞內含量圖。圖5是活性細胞的檢測結果圖。圖6是聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作詳細說明。一、工程菌的構建
(I)重組Exendin — 4多肽基因序列的人工合成根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因；合成後的基因克隆進質粒HJC57中，轉化進大腸桿菌DH5 a中進行擴增,然後用EZ Bioresearch公司的質粒提取試劑盒進行純化，切割後的目的基因出純化備用。(2)MAG2010 質粒MAG2010 質粒取 pET31b(+)質粒，切割掉 SEQ ID No. 2 所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和後繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；構建的質粒順序為蛋氨酸編碼序列+6XHis_tag編碼序列+ GB-I編碼序列+腸激酶酶切位點編碼序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸編碼+雙終止子。
(3)工程菌的構建按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。亞克隆所用的質粒購自美國Novagen公司，大腸桿菌DH5 a和BL21 (DE3)PlyS分別購自北京索萊寶生物科技有限公司公司和紅葉生物科技有限公司，所用的限制性內切酶購自大連寶生物(Takara)，腸激酶購自美國西格瑪公司(Sigma),質粒提取試劑盒採用本公司銷售的美國EZ Bioresearch小量質粒提取試劑盒。二、工程菌的發酵表達
I、種子活化
(I)種子活化取凍存的工程菌劃線在含lOOul/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，37°C培養16小時。挑選生長良好的單菌落，接種於20ml LB培養液中(含AmplOOul/ml )，37°C培養過夜。(2)種子液製備取活化種子，按5%接種量接種於200ml 2XYT培養液中(含Ampl00ul/ml)，37°C培養 6 小時。(3) 5L發酵罐發酵將種子液按5%接種量接種於裝有MMBL培養基的發酵罐中，370C，控制pH在7. O左右，通過通氣及轉速控制溶氧在30%。0D600為20左右時，加入IPTG至終濃度為O. 2mM，誘導10小時後下罐。離心，收集菌體。2、培養基配方
(1)LB液體培養基(一級搖瓶)
權利要求
1.一種重組艾塞那肽的生產工藝，包括工程菌的構建、工程菌的發酵表達和目的蛋白的純化，其特徵在於所述的工程菌的構建是按下述步驟進行的 (1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因； (2)MAG2010質粒取pET31b(+)質粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和蛋氨酸和後繼序列，取代以腸激酶酶切位點和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子； (3)工程菌的構建按照啟動子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經切割好的MAG2010質粒中，得到重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培 養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組Exendin-4融合表達的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。
2.根據權利要求I所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其特徵在於所述的工程菌的發酵表達包括下述步驟 (1)挑單菌落到裝有30mL目標培養基中，3rC，200rpm活化過夜； (2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養基中，32°C，200rpm培養約2. 6 hr ； (3)以10%的接種量，接到5L MMBL培養基中，32°C，240rpm培養約3 hr ； (4)接到60L發酵培養基中； (5)控制生長期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養基中葡萄糖的濃度降至O. 2g/L時開始補料；當OD55tl達到10左右時加入13 mL IM IPTG誘導，終濃度為O. 2mM,把pH緩慢調至7. 00,繼續培養10小時後結束。
3.根據權利要求I或2所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其特徵在於所述的目的蛋白的純化步驟採用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進行分離和純化；該工程菌經過發酵、純化得到的重組艾塞那肽的產量達到500毫克/升的產率。
4.根據權利要求3所述的重組艾塞那肽的生產工藝，其特徵在於所述的三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下 (1)親和層析一採用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3個柱體積的50 mM Tris, pH 7. 5,150 mM NaCI的緩衝液平衡柱子，然後用將用相同緩衝液透析過的蛋白質上柱，用I倍體積上述緩衝液洗然後用5mM乙酸鈉，pH5. O的緩衝液洗去未結合的雜質，接著用500mM乙酸鈉，pH5. O的緩衝液將目的蛋白洗脫下來，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小時； (2)腸激酶處理1μ I的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的條件下8h可以完全切割融合蛋白； (3)親和層析二將上述處理過的重組Exendin-4結合在鎳柱上,先用起始緩衝液衝洗脫磷酸鹽緩衝液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍乾燥，得到重組的艾塞那肽。
全文摘要
一種重組艾塞那肽的生產工藝，通過對pET-31b(+)進行了改造，將pET-31b(+)中的KSI融合蛋白序列完全刪除，同時刪除蛋氨酸裂解位點(ALWN切割位點)和C末端(多肽羧基端的)組氨酸標記(His6-tag)以及終止子,在刪除的位置，取代以蛋氨酸+His6-tag+GB1突變序列+腸激酶裂解序列，然後構建工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays。利用了pET-31b(+)本身的可以大規模，高產量的生產多肽的優點，保留了它的功能強大的啟動子，克服了目前其他生產工藝中該蛋白產物容易形成包涵體的缺點，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進行切割，切割後的蛋白質完全是具有天然序列的Exendin-4。經過工程菌的發酵表達和目的蛋白的純化後得到重組艾塞那肽。產量可以達到500mg/升以上，比目前最先進的工藝產量提高了20倍，且均為可溶性蛋白。
文檔編號C07K1/16GK102618552SQ20121009455
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月1日 優先權日2012年4月1日
發明者孟建軍, 張嚴冬, 李相魯 申請人:東莞市麥亙生物科技有限公司