確定人april基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法及用途的製作方法

2023-10-17 06:46:29 2

專利名稱：確定人april基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種確定人APRIL基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法及用途。
背景技術：
在世界範圍內，結直腸癌在癌症引起死亡病例中排第三位。近幾年，結直腸癌在亞洲和東歐國家的發病率呈上升趨勢。APRIL在1998年克隆並鑑定。APRIL除了在結直腸癌和淋巴瘤和黑色素瘤細胞細胞高表達之外，在別的組織中表達水平很低，說明APRIL具有組織特異性。前面的研究發現，與其周圍的正常組織相比，APRIL在結直腸癌細胞株SW480 中高表達。我們實驗室的研究也發現APRIL在結直腸癌SW480細胞中高表達。此外將APRIL 幹擾質粒轉染到SW480結直腸癌裸鼠模型中，裸鼠體內的的腫瘤明顯減少。以上說明APRIL 在結直腸癌的的發生發展中具有重要的作用。因此，了解APRIL的轉錄調節機制對結直腸癌的治療具有重要的作用。人APRIL基因定位於染色體17pl3. 1，與小鼠11號染色體上的位置相似。APRIL 是一個典型的跨膜蛋白，N端在內，C端在外。它是腫瘤壞死因子家族的一名成員。它通過腫瘤壞死因子的同源區域與含有半胱氨酸富集區的受體相結合。它有三個受體B細胞成熟抗原、穿膜蛋白活化物、硫酸乙醯肝素蛋白聚糖。APRIL與B細胞成熟抗原和穿膜蛋白活化物結合能激活經典的NF-kB途徑，NF-kB途徑在腫瘤的發生發展中具有重要的作用。APRIL 和硫酸乙醯肝素蛋白聚糖結合能促進有APRIL誘導產生的腫瘤的生長。然而到，到底是哪一個受體對APRIL信號通路有直接的作用，到現在還不清楚。

發明內容
本發明的目的在於提供一種方法簡單、準確的確定人APRIL基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法。本發明的目的還在於提供一種光輝黴素和Bayl 1-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用。本發明的技術解決方案是—種確定人APRIL基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法，其特徵是包括下列步驟(1)結構分析APRIL啟動子區域用生物信息學軟體分析APRIL基因5，側翼區的3500bp的基因序列，發現-1899 到+103的區域是APRIL的潛在啟動子區域，PromoterScan軟體分析發現-1889到-1639 和-968到-718是潛在的啟動子區域，CpG Island分析發現CpG島位於-222到-15區域， APRIL的5，側翼區含有大量的GC和CpG島；(2)擴增APRIL啟動子區域和構建螢光素酶報告質粒採用單向缺失方法來分析APRIL 5』側翼區的2003個鹼基，平截片段的5末端從-1889到-222，3，末端是+103，APRIL的4個平截片段由PCR從人基因組DNA上擴增得到， 每個PCR產物的長度分別是200;3bp，1643bp, 1105bp and 407bp，然後PCR產物用限制性內切酶MluI和HindIII進行雙酶切，並連接到無啟動子活性的螢光素酶報告質粒pGL3-BasiC 上；把質粒與PCR產物組成的重組產物分別命名為APRIL-1889，APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL-304,重組產物通過酶切和DNA測序進行驗證；(3)功能性鑑定APRIL啟動子區域為了鑑定哪一個片段對APRIL基因的轉錄調節有作用，將這4個重組產物瞬時轉染到人結直腸癌SW480細胞和Η ^9細胞中。質粒pG14. 74作為內參，轉染48小時後，將細胞提取物用於螢光素酶活性分析，在SW480細胞APRIL-1539在所有的重組產物中表現出最強的螢光素酶活性，APRIL-1001和APRIL-304啟動子的活性低於APRIL-1539，APRIL-1889 的活性最低，在HT-四細胞中具有相似的結果；再用TFSEARCH軟體來尋找該區域潛在的轉錄因子結合位點，分析發現兩個重要的順式作用元件，NF-kB位於-1023to-1032，和Spl位於-1029to-1038 ；(4) Spl和NF-kB結合APRIL啟動子區域用EMSA電泳遷移位移試驗來觀察Spl和NF_kB是否結合APRIL基因的核心啟動子區的潛在轉錄因子結合位點，生物素標記探針與SW480細胞核提取物在室溫下孵育20分鐘後，觀察到NF-Kb和Spl生物素標記探針與SW480DNA核蛋白相互反應產生的DNA蛋白複合體，核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競爭掉，說明轉錄因子與其結合位點的結合是特異性的；(5)轉錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動子之間的相互作用為了檢測轉錄因子NF-kB和Sp 1對APRIL調節的影響，分別將不同量的pcDNA3. 1/ p65或pCMV-HA/Spl與螢光素酶報告質粒APRIL-538轉染SW480細胞，538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長度，轉染48小時後，檢測螢光素酶活性，過表達NF_kB或Spl 後，APRIL啟動子的活性明顯升高，結果說明轉錄因子NF-kB和Spl能通過APRIL-538上的轉錄因子結合位點激活APRIL的轉錄。一種光輝黴素和Bayll-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用。本發明克隆並鑑定了 APRIL的啟動子區域。發現-1539到-1001的區域對APRIL 的轉錄調控具有重要的作用；這一區域內存在轉錄因子Spl或NF-kB，並且能激活APRIL基因的轉錄。本發明提供了光輝黴素和Bayll-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用， 效果確切。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。圖1是生物信息學軟體分析人APRIL基因的5』側翼區。圖上顯示了 APRIL潛在啟動子區域和CpG島的位置。翻譯起始位點ATG中的「A」定為+1，其它鹼基的數字都按照它來計數。圖2是驗證重組質粒示意圖。是用瓊脂糖凝膠電泳來分析酶切產物，M代表的是DNAmarker，泳道1_4分別代表的的重組質粒(APRIL-1889，APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL-304)用限制性內切酶進行消化。圖3是APRIL-1889的測序結果。圖4是功能性分析人APRIL基因的5』側翼區示意圖。瞬時轉染分析APRIL啟動子區的各個片段，圖代表了 4個重組產物的相關螢光素酶活性與無啟動子活性PGL3-BasiC質粒螢光素酶活性的比值。用於檢測的APRIL區域分別是 APRIL-1889 (_1889to+103)，APRIL-1539 (_1539to+103)，APRIL-1001 (-1001to+103)。 所有的數據都是三次實驗的平均值。誤差線表示標準誤。圖5是APRIL啟動子區域從-1539到-1001的核苷酸序列。下劃線表示潛在轉錄因子的結合位點。圖6是NF-kB和Spl與APRIL啟動子區上它們結合位點的相互作用示意圖。EMSA顯示NF-kB和Spl結合APRIL啟動子區域的轉錄因子結合位點。泳道1和 6，只加了標記探針；，泳道2和7，核提取物+標記的標準探針(野生型探針)；泳道3和8， 核提取物+標記的突變探針；泳道4和9，核提取物+標記的標準探針+未標記的冷凝探針 (競爭探針)；泳道5和10，核提取物+標記的突變探針+未標記的冷凝探針(競爭探針)。 NE 核提取物；WT 野生型探針；MT 突變探針；NS 非特異性結合；COM 競爭探針。圖7是NF-kB和Spl對APRIL-538的影響示意圖。將0. 2ug的APRIL-538和不同量的pcDNA3. 1/p65, ρCMV-HA/SP及其相應的空載體分別轉染SW480細胞。結果是與空載體轉染組的比值。質粒PG14.74做為內參。所有的數據都是三次實驗的平均值。誤差線表示標準誤。圖8是抑制劑對APRIL-538的影響示意圖。將APRIL-538轉染細胞後，各自與不同濃度的藥物作用M小時。結果是與沒加藥物組的比值。所有的數據都是三次實驗的平均值。誤差線表示標準誤。
具體實施例方式細胞培養含10%胎牛血清的完全培養基單層培養結腸癌SW480細胞株，於37°C，5% C02飽和溼度恆溫孵育箱內，0. 25%胰酶消化傳代。以細胞數2X IO6個/ml傳代6孔培養板，當細胞融合度達90%以上時，按脂質體2000說明書轉染質粒，倒置螢光顯微鏡下觀察轉染效^ ο啟動子區及轉錄因子分析以APRIL基因5，側翼區3. 5kb作為研究對象，用潛在啟動子預測用軟體i^romoter 2.OPrediction Server (http//www. cbs. dtu. dk/services/Promoter/)和Promoter Scan program(http: //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/proscan/)進行分析。CpG 島用 CpG Islmd karcher(http://cpgislmds.usc. edu/)進行查找。啟動子區潛在的轉錄因子用 TF search program (http://molsunl. cbrc. aist. go. jp/research/db/TFSEARCH. html)進行分析。複製人APRIL基因的5，側翼區基因組DNA用人基因組DNA抽提試劑盒(凱傑，美國)從人全血中抽提。以人基因組DNA為模板，用基因特異性引物，PCR擴增得到不同長度的APRIL啟動子片段。利用引物設計軟體I^rimer 5. 0按疊瓦方式在5』側翼序列設計4個片段的引物，由上海生工合成，引物序列(表 1)。PCR用 25「1^反應體系，941預熱51^11後，941 30sec、55°C 30sec、72°C 2min 30個循環，72°C延伸lOmin。PCR產物APRIL-1899 (核苷酸計數以翻譯起始點ATG的A作為 +1)、APRIL-1539、APRIL-1001、APRIL-304 用膠回收試劑盒進行回收，與 PMD18-T 載體 16°C 連接過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 α，塗布於經2% X-gal和20% IPTG處理的含75μ g/ml氨苄青黴素的LB平皿上，37°C培養12 16h。經藍白斑篩選，白色菌落經 PCR初步鑑定，陽性克隆進一步測序分析(由上海生工生物工程公司完成)。將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質粒。得到的質粒和空載pGL3kiSiC分別用HindIII和Mlu I雙酶切，電泳後回收。回收的酶切片段和載體PGL3kiSiC用T4DNA連接酶於16°C過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 α，塗布LB平板過夜培養菌體，從平板上挑選菌落，擴增，用質粒抽提試劑盒(凱傑，美國)提取質粒，酶切和測序(上海生工生物工程公司)鑑定。
表1.擴增APRIL基因5』側翼轉錄調控區的引物序列
擴增產物引物序列
F: 5'ACGACGCGTCTTGCTGGTGGATGGTGTGCT3『 R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 『 F: 5'GCGACGCGTCCATCCCACATAAATACAG3『 R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 『 F 5 'TCGACGCGTGAGCAGAGGTAGGAAGGCACACT3 『 R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 『
F: 5』ACTACGCGTTGTTCCTCCTGGGTGTCACT3』 R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 『 F: 5' GCGACGCGTCC ATCCC AC ATAAATAC AG3 』 R: 5 'CATAAGCTTCCACCTGGGGGCTGGAGGCA3 』上遊引物加MluI限制性酶切位點，下遊引物加HindIII限制性酶切位點(下劃線部分。F:上遊引物，R 下遊引物。瞬時轉染和螢光素酶活性分析用質粒中抽試劑盒(凱傑，美國)抽提質粒。將人結直腸癌細胞株SW480細胞以 2 X IO5濃度接種M孔板中，待細胞生長融合至80 % -90 %時，分別用脂質體2000轉染上述質粒，同時轉染的有陽性對照pGL3Control、陰性對照pGL3-BasiC、內參pG14. 74質粒。轉染4 後收集並裂解細胞，進行螢光素酶活性檢測。實驗重複3次。核蛋白抽提和凝膠遷移分析利用核蛋白抽提試劑(Pierce Biotechnology，美國)從SW480細胞中提取核蛋白。BCA蛋白定量分析試劑盒檢測核蛋白的濃度。EMSA反應混合物中包括1.5μ1的結合緩衝液(IOx)、1 μ 1的Poly (dl dC)和2 μ g的核蛋白。混合物在室溫下孵育20分鐘後，加
APRIL-1899 (-1899/+103)
APRIL-1539 (-1539/+103) APRIL-1001 (-1001/+103)
APRIL-304 (-304/+103)
APRIL-538 (-1539/-1001)入0. 5 μ 1的生物素標記探針再孵育20分鐘。在競爭實驗中，非標記的探針在生物素標記探針20分鐘之前加入。將DNA-蛋白質複合物加於6. 5%的聚丙烯醯胺凝膠樣品孔中，低溫下180V，電泳1.證，轉膜後紫外交聯lOmin，封閉液室溫封閉15min，然後將結合膜與辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素反應液孵育30min，洗膜後用增強化學發光進行顯影。EMSA中用到的生物素標記探針野生型Spl 探針5，TATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC 3，突變型Spl 探針5，GTTCAGGCTTGGGGGCGGGGACCTCCAT 3，野生型NF-kB 探針』 GTAAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCCGT 3'突變型NF-kB 探針5，CTTGGGGGCGGGGACCTCCATGCCTCCA 3，.過表達NF-kB 和 Spl Spl表達質粒pCMV-HA/Spl、NF-kB p65表達質粒pcDNA3. 1/ρ65 (由南通大學免疫學實驗室提供)與pGL3-basic或APRIL-538質粒共轉染SW480細胞中。空載體pcDNA3. 1 和pCMV-HA作為陰性對照。轉染4 後，裂解細胞用於螢光素酶活性分析。抑制NF-kB 和 Spl:轉染前M小時，將SW480細胞以2X IO5/孔接種到6孔培養板裡面。在將APRIL-538/pGL3-basiC轉染到SW480細胞前lh，在培養基中分別加入不同濃度的 Bayl 1-7082和光輝黴素。24h後，測螢光素酶的活性。結果結構分析APRIL啟動子區域我們用了幾個生物信息學軟體分析了 APRIL基因5』側翼區的3500bp的基因序列， 發現-1899到+103的區域是APRIL的潛在啟動子區域。PromoterScan軟體分析發現-1889 到-1639和-968到-718是潛在的啟動子區域(圖1)。CpG Island分析發現CpG島位於-222到-15區域(圖1)。APRIL的5』側翼區含有大量的GC和CpG島。擴增APRIL啟動子區域和構建螢光素酶報告質粒我們採用了一系列的單向缺失方法來分析APRIL 5』側翼區的2003個鹼基。平截片段的5末端從-1889到-222，3，末端是+103。APRIL的4個平截片段由PCR從人基因組 DNA上擴增得到。每個PCR產物的長度分別是2003bp，164;3bp，1105bp and 407bp。然後 PCR產物用限制性內切酶MluI和HindIII進行雙酶切，然後連接到無啟動子活性的螢光素酶報告質粒pGL3-BasiC上。把質粒與PCR產物組成的重組產物分別命名為APRIL-1889， APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL_304(圖2)。重組產物通過酶切和DNA測序進行驗證(圖 3)。功能性鑑定APRIL啟動子區域為了鑑定哪一個片段對APRIL基因的轉錄調節有作用，我們將這4個重組產物瞬時轉染到人結直腸癌SW480細胞和Η ^9細胞中。質粒pG14. 74作為內參。轉染48小時後，將細胞提取物用於螢光素酶活性分析。如圖4所示，在SW480細胞APRIL-1539在所有的重組產物中表現出最強的螢光素酶活性。APRIL-1001和APRIL-304啟動子的活性低於 APRIL-1539。APRIL-1889的活性最低。在HT-四細胞中具有相似的結果。根據以上的結果，我們推測-1539到-1001區域中存在重要的調節因子，這些因子能影響啟動子的活性。 因此我們用TFSEARCH軟體來尋找該區域潛在的轉錄因子結合位點。分析發現兩個重要的順式作用元件，NF-kB 位於-1023to-1032，和 Spl 位於-1029to-1038 (圖 5)Spl和NF-kB結合APRIL啟動子區域我們用EMSA電泳遷移位移試驗來觀察Spl和NF_kB是否結合APRIL基因的核心啟動子區的潛在轉錄因子結合位點。生物素標記探針與SW480細胞核提取物在室溫下孵育 20分鐘後，能觀察到NF-Kb和Spl生物素標記探針與SW480DNA核蛋白相互反應產生的DNA 蛋白複合體(圖6泳道2，，3，7,8)。核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競爭掉(圖6泳道4，5，9，7)，說明轉錄因子與其結合位點的結合是特異性的。轉錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動子之間的相互作用為了檢測轉錄因子NF-kB和Sp 1對APRIL調節的影響，我們分別將不同量的 pcDNA3. l/p65 (NF-kB過表達質粒)或pCMV_HA/Spl (Spl過表達質粒)與螢光素酶報告質粒(APRIL-538)轉染SW480細胞。538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長度。重組質粒APRIL-538，按照前面描述的方法獲得，其中用到的引物正義鏈5』 GCGACGCGT CCATCCCACATAAATACAG 3，，反義鏈是 5，CATAAGCTTCCACCT GGGGGCTGGAGGCA 3，。限制性酶切位點MluI和HindIII用下劃線標出來了。轉染48小時後，檢測螢光素酶活性。過表達 NF-kB或Spl後，APRIL啟動子的活性明顯升高。結果說明轉錄因子NF_kB和Spl能通過 APRIL-538上的轉錄因子結合位點激活APRIL的轉錄。Bayl 1-7082 和 Mithramycin A 對 APRIL 最小啟動子的影響我們用NF-kB抑制劑(Bayl 1-7082)和Spl抑制劑(MithramycinA，光輝黴素)來進一步分析，轉錄因子和APRIL啟動子之間的相互關係。分別加入Bayll-7082和Mithramycin A之後APRIL-538螢光素酶的活性明顯下降。結果說明Bayll-7082和Mithramycin A能分別幹擾掉NF-kB和Spl介導的APRIL啟動子的活性。光輝黴素和Bayll-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用。討論在本研究中我們克隆鑑定了人APRIL基因的5』側翼區。我們用PCR擴增的方法獲得5』側翼區的2003bp的基因序列。這個區域缺乏標準的TATA盒，但是含有大量的GC和 CPG島(圖1)。5』平截進一步來分析-1899到+103的序列。缺失產物亞克隆到pGL3-BasiC 載體上。重組質粒被鑑定並轉染到SW480細胞中。螢光素酶活性分析發現每一個重組質粒與pGL3-C0ntr0l(陽性對照質粒)都具有相似或者更高的螢光素酶活性。值得注意的是APRIL-1539具有最高的螢光素酶活性，而APRIL-1899的螢光素酶活性最低。結果說明在-1889到-1539之間存在抑制因子，在-1539到-1001之間存在重要的能促進APRIL基因轉錄的順式作用元件。因此我們用TFSEARCH軟體分析-1539到-1001啟動子區域發現這個區域含有兩個轉錄因子結合位點NF-kB和Spl。EMSA鑑定了他們的特異性結合。過表達和抑制實驗進一步說明了 NF-kB和Spl對APRIL基因的轉錄具有重要的作用。
權利要求
1.一種確定人APRIL基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法，其特徵是包括下列步驟(1)結構分析APRIL啟動子區域用生物信息學軟體分析APRIL基因5，側翼區的3500bp的基因序列，發現-1899到+103 的區域是APRIL的潛在啟動子區域，PromoterScan軟體分析發現-1889到-1639和-968 到-718是潛在的啟動子區域，CpG Island分析發現CpG島位於-222到-15區域，APRIL 的5』側翼區含有大量的GC和CpG島；(2)擴增APRIL啟動子區域和構建螢光素酶報告質粒採用單向缺失方法來分析APRIL 5』側翼區的2003個鹼基，平截片段的5末端從-1889 到-222，3，末端是+103，APRIL的4個平截片段由PCR從人基因組DNA上擴增得到，每個 PCR產物的長度分別是2003bp，1643bp, 1105bp and 407bp，然後PCR產物用限制性內切酶MluI和HindIII進行雙酶切，並連接到無啟動子活性的螢光素酶報告質粒pGL3-BasiC 上；把質粒與PCR產物組成的重組產物分別命名為APRIL-1889，APRIL-1539, APRIL-1001, APRIL-304,重組產物通過酶切和DNA測序進行驗證；(3)功能性鑑定APRIL啟動子區域為了鑑定哪一個片段對APRIL基因的轉錄調節有作用，將這4個重組產物瞬時轉染到人結直腸癌SW480細胞和HD9細胞中；質粒pG14. 74作為內參，轉染48小時後，將細胞提取物用於螢光素酶活性分析，在SW480細胞APRIL-1539在所有的重組產物中表現出最強的螢光素酶活性，APRIL-1001和APRIL-304啟動子的活性低於APRIL-1539，APRIL-1889的活性最低，在HT-四細胞中具有相似的結果；再用TFSEARCH軟體來尋找該區域潛在的轉錄因子結合位點，分析發現兩個重要的順式作用元件，NF-kB位於-1023 to -1032，和Spl位於-1029 to -1038 ；(4)Spl和NF-kB結合APRIL啟動子區域用EMSA電泳遷移位移試驗來觀察Spl和NF-kB是否結合APRIL基因的核心啟動子區的潛在轉錄因子結合位點，生物素標記探針與SW480細胞核提取物在室溫下孵育20分鐘後，觀察到NF-Kb和Spl生物素標記探針與SW480 DNA核蛋白相互反應產生的DNA蛋白複合體，核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競爭掉，說明轉錄因子與其結合位點的結合是特異性的；(5)轉錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動子之間的相互作用為了檢測轉錄因子NF-kB和Spl對APRIL調節的影響，分別將不同量的pcDNA3. 1/ p65或pCMV-HA/Spl與螢光素酶報告質粒APRIL-538轉染SW480細胞，538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長度，轉染48小時後，檢測螢光素酶活性，過表達NF-kB或Spl 後，APRIL啟動子的活性明顯升高，結果說明轉錄因子NF-kB和Spl能通過APRIL-538上的轉錄因子結合位點激活APRIL的轉錄。
2.一種光輝黴素和Bayll-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種確定人APRIL基因啟動子、轉錄因子結合位點的方法及用途，本發明克隆並鑑定了APRIL的啟動子區域。發現-1539到-1001的區域對APRIL的轉錄調控具有重要的作用；這一區域內存在轉錄因子Sp1或NF-kB，並且能激活APRIL基因的轉錄。本發明提供了光輝黴素和Bay11-7082在製備治療人結直腸癌的藥物中的應用，效果確切。
文檔編號A61K31/704GK102533996SQ20121000052
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者季夥燕, 徐錦, 景蓉蓉, 王惠民 申請人:南通大學附屬醫院