一種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法
2023-10-17 05:37:29 1
專利名稱：一種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法
技術領域：
本發明設計綿羊18號染色體末端微衛星標記UMP基因型，分型檢測方法，可以快速高效預測陶賽特羊早期生長發育性狀，建立了該微衛星標記基因型分型的檢測方法。
背景技術：
1983年，在美國的無角陶賽特羊群體中發現了一隻後臀極度發達的個體，人們稱這種表型為雙肌臀性狀，根據表型將該基因命名為Callipyge (CLPG)基因，20世紀末，人們將CLPG基因初歩定位於陶賽特羊第18號染色體的末端區域，位於微衛星標記CSSM18和TGLA122 之間。文獻檢索披露I)Journal of Animal Science, 76(1998), 2549- 2559，作者Freking等研究發現CLPG基因可顯著提高雙肌臀羊的瘦肉率，也使皮下肌間、肌內和腎周的脂肪減少，能顯著提高屠宰率。2)GenetiCS，163(2003)，453-456，作者Maria等研究發現在CLPG基因內的DLKl和GTL2位點間存在ー處鹼基突變(A-G)可以決定CLPG表型。3)國內南京農業大學劉國慶等研究陶賽特羊和薩福克羊及其雜交後代CLPG基因多態性，發現18號染色體Meg3. 9位點與肉羊後臀肌肉發達的表型相關，詳見論文《遺傳》，28 (2006)，815-820。4)《遺傳》，28 (2006)，1525-1531，作者任航行等分析了與CLPG基因連鎖相關的 10 個微衛星基因座((ILSTS54、TGL A337、HH47、TGLA122、BP33、0B2、BM3413、MCM38、MC MA26和CSSM1)等分別對陶賽特羊和薩福克羊群體的遺傳進行了分析，結果顯示在陶賽特群體中，微衛星BM3413、MCMA26和CSS M18對臀寬有顯著影響；薩福克群體中微衛星基因座TGLA122、BM3413、MCM38和CSSM18對綿羊臀寬存在顯著或極顯著影響。隨著測序技術的發展，綿羊基因遺傳連鎖圖譜也在不斷的完善和増加。2010年10月6日第五代綿羊連鎖圖譜發布，該圖譜包含了染色體上的673個DNA標記，連鎖群的總遺傳長度已經超過3000cMo本發明研究位於綿羊18號染色體末端UMP微衛星基因座的多態性，在陶賽特羊上發現其微衛星基因座的多態性與早期生長發育具有相關性，可以將該微衛星位點作為影響陶賽特羊早期生長發育的分子標記。
發明內容
本發明的目在於提供通過綿羊18號染色體末端的微衛星標記UMP快速檢測陶賽特羔羊生長發育性能的方法，對預測陶賽特羊的生長發育速度及性能有著重要的科學價值與實踐意義。本發明的目是這樣實現的ー種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，包括I)依據第五代綿羊基因圖譜，發現位於綿羊18號染色體末端93. 9cM位置的微衛星標記UMP ；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5，- CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3』 ；上下遊引物長度分別為24bp和23bp ；3)採集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用螢光標記的PCR引物對多態位點進行擴增並確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP 的基因型分別是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ；
其中綿羊基因組DNA體外擴增
採集羊外周血液I. 5ml，使用肝素納抗凝採血管，-20°C冷凍保存，提取基因組DNA ；
其中綿羊血液基因組DNA的製備
(1)取出-20°C冷凍血液O.5-1.0 ml，在室溫下完全融化，於10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液，中含裂解的紅細胞；加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液；再加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉 澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘,棄去上層液；
(2)向管內依次加入600μ1的白細胞裂解液，70ul的10%SDS溶液，15ul濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul濃度為10mg/mL的Rnase A溶液，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻；置於55°C振蕩水浴鍋中振蕩過夜；
(3)取出混合液將其冷卻至室溫，向管內加入600ulTris-HCl飽和酚溶液，將兩相上下輕柔顛倒混勻5分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；用直徑為O. 2-0. 35cm的Iml槍頭將上層清液吸出600ul-650ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入酚氯仿比為1:1的混合溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；再用直徑大小為O. 25-0. 38cm的Iml槍頭將上層清液吸出490-520ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入氯仿溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；第三次用直徑為O. 28-0. 37cm的Iml槍頭將上層清液小心吸出300-350ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入無水こ醇1ml，輕柔的搖勻2分鐘，可看到漂浮的絮狀物即為DNA，於10000 r/min離心10分鐘；
(4)將管內的上清混合液棄去，加入70%酒精200ul，彈起管底DNA沉澱，於10000r/min離心5分鐘；將管內的上清液棄去，放置於超淨工作檯上晾乾；
向管內加入超純滅菌水50ul，將乾燥的DNA彈起混勻，室溫或4°C保存直至DNA完全溶
解；
(5)用分光光度計來檢測基因組DNA的濃度和純度，提取血樣基因組DNA，其純度，在I. 6-1. 8 ；
(6)用O.8%的瓊脂糖凝膠，檢測提取好的基因組DNA原液的質量；
(7)對每ー樣品的DNA進行相應倍數的調整，使濃度達到45-52ng /uL,作為PCR反應的模版，其餘的-20°C保存備用；
其中 PCR 擴增反應體系2. 5 yL 的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl，O. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上遊引物，I μ L 的 10 μ mol/L 下遊引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L綿羊基因組DNA L，無菌去離子水補足25 μ L ;
其中PCR反應循環程序95 V 5min I個循環；95 °C變性30s，58°C退火30 S，72 V延伸30 s共35個循環；72で延伸6 min I個循環；
其中微衛星分型標記的檢測步驟
(1)將進行PCR反應的96孔板置於冰水混合物上；
(2)將96孔板置於平板離心機中，離心2000g即停；
(3)使用美國ABI公司的3730XL測序列分析儀檢測微衛星樣本，確定陶賽特羊的微衛星標記UMP基因型；將其不同的基因型作為陶賽特羊早期生長發育速度及特性的分子標記，用於輔助選擇育種；
其中實驗液體的配製
紅細胞裂解液將NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解於800ml去離子水中，定溶至1L，高壓滅菌；
白細胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，加高壓滅菌去離子水至I L ；
10% SDS :將SDS 10g，加高壓滅菌去離子水至IOOml ；
I: I的酚氯仿取Tris飽和酚與氯仿各IOOmL混合均勻，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液將IOOmg蛋白酶K加入5mL無菌雙蒸水,終濃度20 mg/mL,分裝成小份，-20で凍存；
10mg/mL的Rnase A溶液將IOmg RNase A加入ImL無菌雙蒸水，終濃度10 mg/ml,煮沸10 min後使其自然冷卻後使用，-20で凍存。所述的方法，選用的肝素納抗凝採血管購自南昌贛達醫療器械有限公司；dNTP混合物、Taq酶、PCR buffer為Mg2+ free、Tris-HCl飽和酚，氯仿溶液購自上海生エ生物エ程技術服務有限公司；其它試劑均由北京鼎國生物技術有限公司提供。本發明構思及作用機理利用微衛星標記分析技術對陶賽特羊微衛星標記UMP基因型多態性進行了分析，分析發現了 6種基因型個體，分別為104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107;分析比較微衛星標記UMP不同基因型群體平均生長發育性狀的相關性，將其不同的基因型作為陶賽特羊早期生長發育速度及特性的分子標記，用於輔助選擇育種。該方法由於陶賽特羊微衛星標記UMP基因型多態性，可以作為判斷陶賽特羊個體是否具有優良的早期生長性狀的ー個分子標記；建立的檢測該位點的高效快速檢測方法，對提高畜牧業種群的快速生長性能及優選有著重要的實用價值，彰顯技術進歩。
具體實施例方式本發明對照實施例作進ー步說明。
實施例一、綿羊基因組DNA體外擴增
採集羊外周血液I. 5ml，使用肝素納抗凝採血管，-20°c冷凍保存，提取基因組DNA ；
其中綿羊血液基因組DNA的製備
(1)取出-20で冷凍血液1.0ml，放置於室溫直至融化完全，於10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液(含裂解的紅細胞)；
(2)向管內加入Iml紅細胞裂解液(IX)，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000r/min離心10分鐘,棄去上層液；
(3)再向管內加入Iml紅細胞裂解液(IX)，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘,棄去上層液；
(4)向管內依次加入600μI的白細胞裂解液，70ul 10% SDS，15ul蛋白分解酶K20mg/mL和3 ul Rnase溶液10mg/mL,彈起管底沉澱,輕柔的搖勻；
(5)置於55°C振蕩水浴鍋中振蕩過夜，以裂解白細胞，消化蛋白質和RNA；
(6)取出混合液將其冷卻至室溫，向管內加入600ulTris-HCl飽和酚溶液，將兩相上下輕柔顛倒混勻5分鐘,於10000 r/min離心10分鐘；
(7)用直徑為O.3cm的Iml槍頭將上層清液小心吸出650ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入1:1的酹/氯仿溶液600ul,輕柔的搖勻10分鐘,於10000 r/min離心10分鐘；
(8)用直徑為O.3cm的Iml槍頭將上層清液小心吸出500ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入氯仿溶液600ul,輕柔的搖勻10分鐘,於10000 r/min離心10分鐘；
(9)用直徑為O.3cm的Iml槍頭將上層清液小心吸出350ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入無水こ醇1ml，輕柔的搖勻2分鐘，可看到漂浮的絮狀物即為DNA，於10000 r/min離心10分鐘；
(10)將管內的上清混合液棄去，加入70%酒精200ul，彈起管底DNA沉澱，於10000r/min離心5分鐘；
(11)將管內的上清液棄去，放置於超淨工作檯上晾乾；
(12)向管內加入超純滅菌水50ul，將乾燥的DNA彈起混勻，室溫或4°C保存直至DNA完全溶解；
(13)用分光光度計來檢測基因組DNA的濃度和純度，提取血樣基因組DNA要符合後續試驗其純度應在1.8;
(14)用O.8%的瓊脂糖凝膠(溴化こ錠EB的含量為O. 5ug/mL)檢測提取好的基因組DNA原液的質量，配凝膠的溶劑及電泳液都為I XTAE緩衝液；
(15)對每ー樣品的DNA進行相應倍數的調整，使濃度達到一致(50ng /uL),作為PCR反應的模版，其餘的_20°C保存備用。依據2010年10月11日發表的第五代綿羊基因圖譜，發現位於綿羊18號染色體末端93.9cM位置的微衛星標記UMP，該標記與綿羊生長發育性狀有夫；人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5，-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3，；上下遊引物長度分別為24bp和23bp以上引物進行PCR擴增；
其中 PCR 擴增反應體系2. 5 yL 的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl, O. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上遊引物，I μ L 的 10 μ mol/L 下遊引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L綿羊基因組DNA L，無菌去離子水補足25 μ L ;
其中PCR反應循環程序95 V 5min I個循環；95 °C變性30s，58°C退火30 S，72 V延伸30 s共35個循環；72で延伸6 min I個循環；
其中實驗液體的配製
紅細胞裂解液將NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解於800ml去離子水中，定溶至1L，高壓滅菌；
白細胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，高壓滅菌加去離子水至I L ；
10% SDS :將SDS 10g，高 壓滅菌加去離子水至IOOml ；
I: I的酚氯仿取Tris飽和酚與氯仿各IOOmL混合均勻，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液將IOOmg蛋白酶K加入5mL無菌雙蒸水,終濃度20 mg/mL,分裝成小份，-20で凍存；
10mg/mL的Rnase A溶液將IOmg RNase A加入ImL無菌雙蒸水，終濃度10 mg/ml,煮沸10 min後使其自然冷卻後使用，-20で凍存。ニ、微衛星分型標記檢測
(1)將進行PCR反應的96孔板置於冰水混合物上；
(2)將96孔板置於平板離心機中，離心2000g即停；
(3)使用美國ABI公司的3730XL測序列分析儀檢測微衛星樣本，確定陶賽特羊的微衛星標記UMP基因型；
三、確定微衛星標記UMP不同基因型個體間的生長發育差別
(I)測定163隻陶賽特羔羊早期生長發育性狀(出生重，1-6月齡體重及體尺)。(2)用最小ニ乘方法分析微衛星標記不同基因型群體平均生長發育性狀的相關性，即6種不同基因型個體間體重和體尺指標的差異。(3)將其不同的基因型作為陶賽特羊早期生長發育速度及特性的分子標記，用於輔助選擇育種。四、驗證結果
所述檢測陶賽特羊生長發育性狀的方法，獲取的微衛星標記UMP的6種不同基因型，分析163隻陶賽特羊群體出生重和1-6月齡體重，用最小二乗法分析該微衛星標記不同基因型群體平均體重之間的差異，結果顯示基因型104/110的平均出生重和I月齡、4月齡體重顯著高於其他基因型個體，基因型104/104的3月齡平均體重高於其他基因型個體，結果見表I。表I微衛星標記UMP不同基因型對體重的影響
權利要求
1.ー種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，其特徵在幹包括I)依據第五代綿羊基因圖譜，發現位於綿羊18號染色體末端93. 9cM位置的微衛星標記UMP ；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5』-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT -3，；反向引物5，- GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT -3，；上下遊引物長度分別為24bp和23bp ；3)採集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用螢光標記的PCR引物對多態位點進行擴增並確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP的基因型分別是 104/110,107/110,104/107,110/110,104/104，107/107 ； 其中綿羊基因組DNA體外擴增 採集羊外周血液I. 5ml，使用肝素納抗凝採血管，-20°C冷凍保存，提取基因組DNA ；· 其中綿羊血液基因組DNA的製備 (1)取出-20°C冷凍血液O.5-1.0 ml，在室溫下完全融化，於10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液，中含裂解的紅細胞；加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘，棄去上層液；再加入Iml紅細胞裂解液，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘,棄去上層液； (2)向管內依次加入600μI的白細胞裂解液，70ul的10% SDS溶液，15ul濃度為20mg/mL的蛋白酶K溶液和3 ul濃度為10mg/mL的Rnase A溶液，彈起管底沉澱，輕柔的搖勻，置於55°C振蕩水浴鍋中振蕩過夜； (3)取出混合液將其冷卻至室溫，向管內加入600ulTris-HCl飽和酚溶液，將兩相上下輕柔顛倒混勻5分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；用直徑為O. 2-0. 35cm的Iml槍頭將上層清液吸出600ul-650ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入酚氯仿比1:1的混合溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；再用直徑為O. 25-0. 38cm的Iml槍頭將上層清液吸出490-520ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入氯仿溶液600ul，輕柔的搖勻10分鐘，於10000 r/min離心10分鐘；第三次用直徑為O. 28_0. 37cm的Iml槍頭將上層清液吸出300-350ul，移至另一新的滅菌離心管中，加入無水こ醇1ml，輕柔的搖勻2分鐘，可看到漂浮的絮狀物即為DNA，於10000 r/min離心10分鐘； (4)將管內的上清混合液棄去，加入70%酒精200ul，彈起管底DNA沉澱，於10000r/min離心5分鐘；將管內的上清液棄去，放置於超淨工作檯上晾乾； 向管內加入超純滅菌水50ul，將乾燥的DNA彈起混勻，室溫或4°C保存直至DNA完全溶解； (5)用分光光度計來檢測基因組DNA的濃度和純度，提取血樣基因組DNA，其純度為I. 6-1. 8 ； (6)用O.8%的瓊脂糖凝膠，檢測提取好的基因組DNA原液的質量； (7)對每ー樣品的DNA進行相應倍數的調整，使濃度達到45-52ng /uL,作為PCR反應的模版，其餘的-20°C保存備用； 其中 PCR 擴增反應體系2. 5 μ L的 10XPCR buffer, 2. OuL 的 25mmol/L MgCl，0. 5μ L 的 10 mmol/L dNTP 混合物，I μ L 的 10 μ mol/L 上遊引物，I μ L 的 10 ymol/L 下遊引物，1.25U的Taq酶，I μ的50ng/μ L綿羊基因組DNA L，無菌去離子水補足25 μ L ; 其中PCR反應循環程序95 V 5min I個循環；95°C變性30s，58°C退火30 s，72V延伸30 S共35個循環；72で延伸6 min I個循環； 其中微衛星分型標記的檢測步驟 (1)將進行PCR反應的96孔板置於冰水混合物上； (2)將96孔板置於平板離心機中，離心2000g即停； (3)使用美國ABI公司的3730XL測序列分析儀檢測微衛星樣本，確定陶賽特羊的微衛星標記UMP基因型，將其不同的基因型作為陶賽特羊早期生長發育速度及特性的分子標記，用於輔助選擇育種；其中實驗液體的配製 紅細胞裂解液將NH4C1 8. 29g, KHC03 I. Og和EDTA O. 37 g，溶解於800ml去離子水中，定溶至1L，高壓滅菌； 白細胞裂解液Tris I. 21g, EDTA O. 7444g, NaCl 23. 376g, SDS 10g，加去離子水至 IL，聞壓滅菌； 10% SDS :將SDS 10g，加去離子水至100ml，高壓滅菌； I: I的酚氯仿取Tris飽和酚與氯仿各IOOmL混合均勻，棕色瓶中4°C保存；20mg/mL的蛋白酶K溶液將IOOmg蛋白酶K加入5mL無菌雙蒸水,終濃度20 mg/mL,分裝成小份，-20で凍存； 10mg/mL的Rnase A溶液將IOmg RNase A加入ImL無菌雙蒸水，終濃度10 mg/ml,煮沸10 min後使其自然冷卻後使用，-20で凍存。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於選用的肝素納抗凝採血管購自南昌贛達醫療器械有限公司；dNTP混合物、Taq酶、PCR buffer為Mg2+ free、Tris-HCl飽和酚、氯仿溶液，購自上海生エ生物工程技術服務有限公司。
全文摘要
本發明提供的一種通過微衛星標記檢測陶賽特羊早期生長發育的方法，包括1)依據第五代綿羊基因圖譜，發現位於綿羊18號染色體末端93.9cM位置的微衛星標記UMP；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測微衛星標記UMP基因型的引物，其正向引物5'-CTTCCTCATTGGACTTAGCTGCTT-3'；反向引物5'-GAGCCTGGTGAGCTGCTGTCTAT-3'；上下遊引物長度分別為24bp和23bp；3)採集陶賽特羊血液，提取基因組DNA，利用引物擴增PCR，以凝膠成像確定已擴增的目的條帶；4)利用螢光標記的PCR引物對多態位點進行擴增並確定擴增片段的長度，實現對微衛星多態位點的分型，確定陶賽特羊微衛星標記UMP的基因型分別是104/110，107/110，104/107，110/110，104/104，107/107。檢測確定微衛星標記UMP不同基因型個體間的生長發育差別，用於輔助選擇育種。
文檔編號C12Q1/68GK102719532SQ20121015167
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者劉明軍, 史洪才, 楊丹, 梁慶玲, 牛志剛 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心