一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法

2023-10-27 15:40:47 7

專利名稱：一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法
技術領域：
本發明屬於農作物新品種新材料的選育方法範疇，其國際專利分類號為A01H1/02。
野生稻是重要的品種資源。野生稻的許多重要的農藝形狀，如高抗病蟲性，可以在水稻的育種上得到應用。但是，由於生殖及遺傳的隔離，野生稻與栽培稻之間的遺傳交流是很困難的，這給野生稻在育種上的應用造成了障礙。隨著現代生物技術的發展，打破野生稻與栽培稻間的隔離，從而使它們之間實現遺傳交流已成為可能。我國科學家丁穎於1929年應用雜交法就得到了普通野生稻(O.rufipogon)和栽培稻之間的雜種，並從中選育得到品種中山1號，在生產中得到大面積的推廣應用(林世成，閔紹楷主編，1971，中國水稻品種及其系譜，上海科學技術出版社，P254-256)。國際水稻研究所(IRRI)的科學家曾得到尼瓦拉野生稻(O.nivana)和栽培稻間的雜種，並培育出抗草矮病的系列品種(Kush GS，Disease and insect resistance in rice，1977，Adv Agron，29265-341)。1990年人們又將藥用野生稻(O.officinalis)中抗稻飛蝨的特性轉移到了栽培稻中(Jena KK et al，Introgression of genes from Oryza officinalis wall ex watt tocultivated rice Oryza sativa L.，Theor Appl Genet 80737-745)。之後，我國學者又將緊穗野生稻(O.eichingeri)中抗稻飛蝨的特性轉移到了栽培稻中(顏輝煌等，1997，緊穗野生稻的褐飛蝨抗性導入栽培稻的研究，遺傳學報，24(5)424-431)。1995年美國和中國科學家聯手從長花葯野生稻(O.longistaminata)和栽培稻的後代群體中克隆到抗白葉枯病的基因(Song WY et.al，A receptor kinase-likeprotein encode by the rice disease gene Xa-21，Science，1995，1804-1806)。應用細胞融合方法人們在水稻上已得到許多特異材料，它們包括水稻和稗草(Echinochlod oryzicola Vasing)(Terada R et al，Plant regeneration from somatichybrid of rice(Oryza sativa L.)and barnyard grass(Echinochlod oryzicola Vasing)，Mol Gen Genet，1987，21039-43)、水稻和大黍(Panicum maximim)(辛化偉等，水稻與大黍不對稱體細胞雜交再生植株，植物學報，1997，38(8)717-724)的後代材料。
本發明所採用的野生稻材料為我國僅存的三個野生稻種之一的疣粒野生稻(O.meyeriana)。該野生稻種的染色體組和栽培稻的染色體組不同。疣粒野生稻對白葉枯病的抗性接近免疫水平，同時對稻飛蝨和螟蟲具有抗性。至今為止，人們除將疣粒野生稻原生質體再生成植株外(何光存等，疣粒野生稻體細胞超低溫保存與原生質體培養體系的確立，中國科學C輯，1998，28(5)444-449)，尚未有將其和栽培稻細胞融合成功的報導。目前，採用常規的雜交育種法是很難將兩者的遺傳基礎結合起來的。本發明的目的在於克服已有技術的不足，提出一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法，通過不對稱細胞融合得到抗水稻白葉枯病育種材料，以提高抗水稻白葉枯病育種的效率。
本發明是這樣來實現的以2-5×104拉特的X-射線對疣粒野生稻的原生質體處理40-80分鐘，將栽培稻原生質體以2-4mol/L碘乙醯胺(IOA)處理10-20分鐘。將所述的原生質體進行細胞融合、培養並再生植株。用白葉枯病菌株對植株進行接種鑑定，結合分子生物學分析方法鑑定雜種，所獲得的雜種植株用栽培稻進行回交。所述的分子生物學鑑定方法包括以隨機擴增多態性差異(RAPD)篩選雜種植株，用螢光原位雜交(FISH)法檢測栽培稻和疣粒野生稻的染色體，並採用抗性基因擬合(RGA)進行抗白葉枯病水稻材料的指紋分析。
本發明的具體細節是分別建立栽培稻和疣粒野生稻的細胞懸浮系，取繼代培養3天的懸浮細胞以酶液(0.25％(w/v)纖維素酶RS，0.01％(w/v)果膠酶Y-23，5mM嗎林乙基磺酸，13％(w/v)甘露醇，細胞洗滌液，pH5.6.)酶解，得到原生質體。用濃度為2-5mol/l的碘乙醯胺對栽培稻的原生質體處理10-20分鐘，鈍化栽培稻的原生質體的細胞質。以照射劑量強度為2-5×104拉特的X-射線對疣粒野生稻的原生質體處理40-80分鐘，鈍化疣粒野生的原生質體的細胞核。對處理過的栽培稻和疣粒野生稻的原生質體在融合儀上進行融合處理，其參數為直流電流(VDC)300-400v；波寬5-20μs；脈衝重複2-4；脈衝間隔0.5-1s；交流電流(VAC)20-50v。經在含KM8P的低熔點瓊質糖中包埋培養一個月，將可見克隆轉移到含BA的N6培養基上作分化培養。分化出的幼苗在無激素的MS培養基上進行生根培養。幼苗長至10cm高時移栽到土壤中。對親本的葉片提取DNA，以OPERN公司的引物及推薦的RAPD分析方法對親本DNA進行擴增，得到引物在親本間存在多態性。以引物對再生植株DNA進行擴增，初步得到許多雜種植株。對雜種植株的葉片剪葉接種白葉枯病菌，鑑定它們的抗性，得到高抗白葉枯病水稻材料OME-1。同時，取根尖作染色體製片，並用原位雜交法檢測栽培稻和疣粒野生稻的染色體，證明OME-1具有栽培稻和疣粒野生稻的染色體的雜交信號。採用RGA引物PTO進行了OME-l的DNA指紋分析，使上述結果得到進一步證實。
本發明中所描述的通過不對稱融合法將栽培稻和疣粒野生稻原生質體結合在一起，並得到高抗白葉枯病水稻材料OME-1，是前人未曾實現過的。同時，對於栽培稻和疣粒野生稻的細胞融合來講，將多種分子生物學方法應用於融合雜種的鑑定具有新穎性。高抗白葉枯病水稻材料OME-1的創造必將對抗白葉枯病水稻品種的選育起重要的推動作用。
表1 高抗白葉枯病材料OME-1對不同白葉枯病菌株的反應水稻材料白葉枯病菌株病級Pxo86 1疣粒野生稻Pxo99 1Pxo79 1Pxo86 6IR24 Pxo99 6Pxo79 6Pxo86 1OME-1 Pxo99 1Pxo79 1由此可見OME-1的病級和疣粒野生稻的一樣，均為1，這說明OME-1已獲得對參試白葉枯病菌株的抗性。
在創造新的抗白葉枯病種質方面，本發明所述的原生質體不對稱融合法與常規育種方法相比具有如下優點1)能克服栽培稻與野生稻間的生殖隔離，實現它們間遺傳物質的交流。
2)能得到核質雜種，並易於實現染色體間的重組。
3)由於配套鑑定技術的應用，從而使育種效率大為提高。
權利要求
1.一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法，其特徵在於，以2-5×104拉特的X-射線對疣粒野生稻的原生質體處理40-80分鐘，將栽培稻原生質體以2-4mol/L碘乙醯胺(IOA)處理10-20分鐘，將所述的原生質體進行細胞融合，培養並再生植株，用白葉枯病菌株對植株進行接種鑑定，結合分子生物學分析方法鑑定雜種，所獲得的雜種植株用栽培稻進行回交。
2.根據權利要求書1中所述的抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法，其特徵在於，所述的分子生物學鑑定方法包括以隨機擴增多態性差異(RAPD)篩選雜種植株，用螢光原位雜交(FISH)法檢測栽培稻和疣粒野生稻的染色體，並採用抗性基因擬合(RGA)進行抗白葉枯病水稻材料的指紋分析。
全文摘要
本發明屬於新品種選育技術領域,具體涉及一種抗水稻白葉枯病育種材料的選育方法。其特點是,將栽培稻和疣粒野生稻的原生質體分別通過以碘乙醯胺(IOA)和X－射線處理,通過不對稱細胞融合得到再生植株,並與栽培稻進行回交。以PAPD、白葉枯病菌株接種鑑定、螢光原位雜交、抗性基因擬合指紋分析對植株進行鑑定,確定抗白葉枯病水稻育種材料。
文檔編號A01H1/02GK1326672SQ0011461
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月5日 優先權日2000年6月5日
發明者陳葆棠, 張端品, 餘毓君 申請人:華中農業大學