鞘翅目毒性多肽組合物和抗蟲轉基因植物的製作方法

2023-05-30 02:31:16 2

專利名稱：：鞘翅目毒性多肽組合物和抗蟲轉基因植物的製作方法本申請是在1999年5月4日籤訂的美國臨時申請60/172240的基礎上提出的，其完整內容在此引入作為參考。1.0發明背景1.1發明領域本發明主要涉及分子生物學領域。某些實施方案更特別涉及包括來自細菌的DNA區段和蛋白質的方法和組合物。本發明更特別涉及來自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的編碼鞘翅目毒性晶體蛋白的新基因。本文公開了這些DNA區段、編碼合成修飾的δ-內毒素多肽的DNA區段以及編碼天然蛋白質和合成蛋白質的DNA區段的多種製取方法和使用方法。例如，DNA區段用作診斷探針以及蛋白質生產的模板，蛋白質、融合蛋白質載體和多肽在多種免疫和診斷方面的應用。本文還公開了在發展包含本文公開多核苷酸的轉基因植物細胞過程中核酸區段的製取方法和使用方法。1.2相關領域有商業效益的作物通常是昆蟲的攻擊目標，所以在許多情況下需要的是防治和根除昆蟲侵襲的環境敏感方法。對於農民、苗圃工、栽培者以及商業區和住宅區來說尤其如此，因為他們使用有利於生態的組合物防治昆蟲群體。近年來發展的使用最廣泛的環境敏感殺蟲劑由來自於細菌蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的微生物殺蟲劑組成。蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種革蘭氏陽性細菌，產生的晶體蛋白或包含體對某些目和種的昆蟲有特異的毒殺作用。許多蘇雲金芽孢桿菌菌株產生殺蟲晶體蛋白。包括能產生殺蟲蛋白質的蘇雲金芽孢桿菌菌株的組合物可商購。因為它們對特異的靶昆蟲有特別強的毒殺作用而對植物以及其它非靶生物無害，因此可以用作環境可接受的殺蟲劑。1.2.1δ-內毒素δ-內毒素可以用來防治多種食葉毛蟲、甲蟲以及蚊子。這些蛋白質類的伴孢晶體，亦即殺蟲晶體蛋白、晶體蛋白、Bt內含物、晶狀包含體、包含體(inclusionbody)以及Bt毒素(Bttoxin)，是由蘇雲金芽孢桿菌產生的晶體蛋白的大量集合體，對易感昆蟲寄主的攝食有毒殺作用。過去的十年以來，有關蘇雲金芽孢桿菌毒素結構和功能的研究覆蓋了所有主要毒素類別；雖然這些毒素在特異的結構和功能上有所不同，但是還是認為它們在結構和功能上有著普遍的相似性。在積累的蘇雲金芽孢桿菌毒素知識的基礎上，提出來一種有關蘇雲金芽孢桿菌毒素普遍的作用模式，該模式包括昆蟲攝食，昆蟲中腸(由胃和小腸組成)中的溶解，對消化酶產生抗性(有時毒素的部分消化實際上卻「激活」了毒素)，結合到中腸細胞上，昆蟲細胞上形成穿孔並且破壞細胞內環境(English和Slatin，1992)。蘇雲金芽孢桿菌的獨特特徵之一是它在芽孢形成過程中產生晶體蛋白，晶體蛋白對某些目和種的昆蟲有特異的毒殺作用。許多種蘇雲金芽孢桿菌菌株產生殺蟲晶體蛋白。包括能產生對鱗翅目(lepidopteran)昆蟲和雙翅目(dipteran)昆蟲有殺蟲活性蛋白質的蘇雲金芽孢桿菌菌株的組合物可商購。因為它們對特異的靶昆蟲有特別強的毒殺作用而對植物以及其它非靶生物無害，因此可以用作環境可接受的殺蟲劑。過去十年中對蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白的殺蟲作用機制進行了大量的研究。研究表明，只有在晶體蛋白被昆蟲攝食後蛋白質才對昆蟲有毒殺作用。昆蟲中腸中的鹼性pH值和水解蛋白質的酶類將蛋白質溶解，因此使得對昆蟲有毒殺作用的成分釋放出來。這些毒性成分使中腸細胞破裂，使昆蟲停止進食並最終導致昆蟲死亡。正是因為這個原因，才證實蘇雲金芽孢桿菌在對付各種害蟲時是一種有效且環境安全的殺蟲劑。正如Hfte等(1989)所注意到的一樣，大多數殺蟲蘇雲金芽孢桿菌菌株對鱗翅目昆蟲如毛蟲(caterpillarinsect)有活性。其它蘇雲金芽孢桿菌菌株對雙翅目昆蟲如蠅(fly)和蚊子(mosquito)有殺蟲活性，或既對鱗翅目昆蟲有殺蟲活性又對雙翅目昆蟲有殺蟲活性。近年來，有人報導幾種蘇雲金芽孢桿菌菌株產生的晶體蛋白對鞘翅目(Coleoptera)昆蟲如甲蟲(beetle)有毒殺作用(Krieg等，1983；Sick等，1990；Donovan等，1992；Lambert等，1992a；1992b)。1.2.2編碼晶體蛋白的基因許多δ-內毒素由於其胺基酸序列相似性而有不同程度的相關性。從研究過程來看，蛋白質以及編碼這些蛋白質的基因主要在其殺蟲譜的基礎上進行分類。Hfte和Whiteley(1989)在綜述中討論了1990年以前蘇雲金芽孢桿菌中鑑定的基因和蛋白質，並且列出了蘇雲金芽孢桿菌基因和蛋白質常規使用的命名法和分類法。cryI基因編碼毒殺鱗翅目的CryI蛋白質，而cryII基因編碼的CryII蛋白質既對鱗翅目有毒殺作用又對雙翅目有毒殺作用。cryIII編碼毒殺鞘翅目的CryIII蛋白質，而cryIV基因編碼毒殺雙翅目的CryIV蛋白質。在序列相似性不同程度的基礎上，蛋白質又分類到了亞族(subfamily)；每個家族(family)中更高程度相關的蛋白質用分類字母表示，如CryIA、CryIB、CryIC，等等。每個分類中更為相關的蛋白質稱為CryIC1、CryIC2等。近年來發展起來一種新的命名法，以胺基酸序列同源性為基礎進行系統分類而並不是在靶昆蟲特性的基礎上進行分類(Crikmore等，1998)。4.3部分中概括了許多已知毒素的分類方法，其中並不包括各蛋白質中的等位變異(allelicvariation)。1.2.3對鞘翅目昆蟲有毒殺作用的晶體蛋白已有人對cry3Bb基因的克隆和表達作了描述(Donovan等，1992)。該基因編碼的74-kDa蛋白質對鞘翅目昆蟲如馬鈴薯甲蟲(Coloradopotatobeetle，CPB)和南方玉米根蟲(southerncornrootworm，SCRW)有殺蟲活性。據報導，蘇雲金芽孢桿菌菌株PS201T6對西方玉米根蟲(WCRW，Diabroticavirgiferavirgifera)有效，美國專利5436002(其完整內容在此特別引入作為參考)對該菌株作了描述。該菌株對Muscadomestica、Aedesaegypti以及Liriomyzatrifoli也顯示了活性。也有人對cryET29基因的克隆和表達作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17507，1997)。該基因編碼的25-kDa蛋白質對鞘翅目昆蟲尤其是CPB、SCRW、WCRW以及跳蚤(catflea)和Ctenocephalidesfelis有效。有人對cryET33基因和cryET34基因的克隆和表達作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17600，1997)。這兩個基因分別編碼～30kDa和～15kDa的蛋白質，對鞘翅目昆蟲尤其是CPB幼蟲和日本甲蟲(Popilliajaponica)有效。vip1A基因產生的是營養期(vegetative)可溶性蛋白質，該基因已經克隆並測序(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO96/10083，1996)。該基因編碼的蛋白質大約為80kDa，既對WCRW有效又對北方玉米根蟲(northerncornrootworm，NCRW)有效。另一個對包括WCRW的鞘翅目昆蟲有效的內毒素是Cry1Ia(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO90/13651，1990)。編碼此81kDa多肽的基因已經克隆並測序。其它對WCRW有毒殺作用的晶體蛋白業已進行描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/40162，1997)。這些蛋白質似乎作為雙元毒素(binarytoxin)行使功能，與分離自B.sphaericus的殺蚊蛋白質有序列相似性。某些B.sphaericus菌株對蚊子幼蟲有很強的作用。這些菌株在芽孢形成過程中產生一種由兩種蛋白質毒素組成的晶狀包含體。編碼這些蛋白質的基因分析情況已經由Baumann等(1988)描述過。推測毒素的分子量分別是51.4kDa和41.9kDa，因此將這兩種毒素分別命名為P51和P42。單獨的P42蛋白質對蚊子幼蟲的效果是微弱的。P51蛋白質本身沒有殺蚊活性。完全的殺蟲活性既需要P51又需要P42。除了對蚊子有效外，還沒有B.sphaericus晶體蛋白對其它昆蟲有效的報導(參照近來Charles等的綜述，1996a；1996b)。某些B.sphaericus菌株產生第二種殺蚊蛋白質毒素。這些蛋白質即Mtx毒素是在營養生長過程中產生的，並不形成晶狀包含體。兩種已經鑑定的Mtx毒素分別稱作Mtx和Mtx2，分子量分別為100kDa和30.8kDa。這兩種毒素的基因分別記作mtx和mtx2，有人對其基因的克隆和測序進行了描述(Thanabalu等，1991；Thanabalu和Porter，1995)。Mtx和Mtx2蛋白質與包括B.sphaericus晶體蛋白和蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白在內的其它已知殺蟲蛋白質都沒有序列相似性(sequencesimilarity)。2.0發明概述本發明提供了新的殺蟲多肽以及編碼這些多肽的DNA序列。對於這些多肽中的其中5種多肽，因為它們與目前已知殺蟲多肽的胺基酸序列同一性(sequenceidentity)都低於65％。它們與已知晶體蛋白的相似性很低，說明存在新的一類或新的一亞類(sub-class)蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白。本發明也提供一些新的多肽，這些多肽組合時就能產生出有殺蟲活性的晶體蛋白。本發明還提供轉化寄主細胞、轉基因植物、載體以及新的多肽和新的多核苷酸的製取方法和使用方法。在第一個實施方案中，本發明提供了一種分離出來的CryET69多肽，該多肽包括SEQIDNO14中至少7個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO14中至少9個或至少11個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO14中至少13個或至少15個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO14中至少17個或至少19個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO14中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括由SEQIDNO13中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括由SEQIDNO13中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO13中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO13中至少150個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO13中的核苷酸序列。同時公開和申請專利的是分離出來的CryET84多肽，該多肽包括SEQIDNO19中至少15個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO19中至少30個至45個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO19中至少45個至90個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO19中至少90個至150個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO19中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO18中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO18中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO18中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO18中至少300個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO18中的核苷酸序列。同時公開和申請專利的是分離出來的CryET75多肽，該多肽包括SEQIDNO16中至少15個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO16中至少30個至45個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO16中至少45個至90個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO16中至少90個至150個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO16中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO15中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO15中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO15中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO15中至少300個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO15中的核苷酸序列。另一個實施方案中，本發明公開並申請專利的是分離出來的CryET80多肽，該多肽包括SEQIDNO4中至少17個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO4中至少20個或至少23個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO4中至少26個或至少29個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO4中至少32個或至少35個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO4中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO3中至少51個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO3中至少60個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO3中至少78個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO3中至少96個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO3中的核苷酸序列。另一個實施方案中，本發明提供分離的CryET76多肽，該多肽包括SEQIDNO2中至少55個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO2中至少60個或至少70個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO2中至少75個或至少80個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO2中至少85個或至少90個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO2中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO1中至少165個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO1中至少180個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO1中至少225個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO1中至少270個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO1中的核苷酸序列。另外一個實施方案中，本發明公開並申請專利的是分離出來的CryET71多肽，該多肽包括SEQIDNO12中至少146個連續胺基酸。更優選的是，該多肽包括SEQIDNO12中至少150個或至少154個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO12中至少158個或至少162個連續胺基酸。更為優選的是，該多肽包括SEQIDNO12中至少166個或至少170個連續胺基酸。在一個典型的實施方案中，該多肽包括SEQIDNO12中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO11中至少438個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO11中至少450個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO11中至少462個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO11中至少510個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO11中的核苷酸序列。本發明也提供了分離的CryET74多肽，該多肽包括SEQIDNO6中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO5中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO5中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO5中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO5中至少300個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO5中的核苷酸序列。此外，本發明提供了分離的CryET39多肽，該多肽包括SEQIDNO8中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO7中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO7中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO7中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO7中至少300個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO7中的核苷酸序列。另外，本發明提供分離的CryET79多肽，該多肽包括SEQIDNO10中的序列。優選編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO9中至少45個連續鹼基對組成的核苷酸序列。更優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO9中至少90個連續鹼基對組成的序列。更為優選的是，編碼該多肽的核酸區段包括SEQIDNO9中至少150個連續鹼基對組成的序列。典型的編碼該殺蟲多肽的多核苷酸包括SEQIDNO9中至少300個連續鹼基對組成的核苷酸序列，其中的一個實施方案中包括SEQIDNO9中的核苷酸序列。本發明同時公開包括一種或多種本文公開多肽的組合物和製劑。這樣的組合物可以是細菌細胞的細胞抽提物、細胞懸浮液、細胞勻漿、細胞裂解物、細胞上清液、細胞濾液或者細胞沉澱，在細菌細胞中包括編碼這些多肽的多核苷酸。典型的產生這些多肽的細菌細胞包括蘇雲金芽孢桿菌EG4550(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21784)、EG5899(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21783)、EG11529(1998年2月12日於NRRL保藏的NRRLB-21917)、EG4100(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21786)、EG11647(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21787)、EG9444(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21785)、EG11648(1997年5月30日於NRRL保藏的NRRLB-21788)、EG4851(1998年2月12日於NRRL保藏的NRRLB-21915)以及EG11658(1998年2月12日於NRRL保藏的NRRLB-21916)。本文公開內容中詳細描述的組合物可以製作成粉末、粉劑、藥片、顆粒、乳劑、膠體、溶液等等，可優選通過常規方法如乾燥、冷凍乾燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降和濃縮製備包括多肽的細胞培養物。這些組合物優選從一種或多種本文所述蘇雲金芽孢桿菌細胞中獲得。在所有包含至少其中一種殺蟲多肽的組合物中，多肽的濃度可以是大約1％到大約99％(按重量計)。典型的殺蟲多肽製劑的製備過程中包括的步驟有在能有效產生殺蟲多肽的條件下培養適當的蘇雲金芽孢桿菌細胞；收穫產生出的殺蟲多肽。例如，本發明公開並申請專利的是對鞘翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲有殺蟲活性的δ-內毒素多肽的製備方法。該方法主要包括從在合適條件下生長的蘇雲金芽孢桿菌細胞培養物中分離一種或多種細胞所產生得δ-內毒素多肽。這些多肽可以從細胞培養物或細胞上清液中分離或者從來自於細胞培養物的芽孢懸浮液從分離並以天然形式使用。這些多肽也可以純化和濃縮，以供特定使用。本發明也提供了一種防治昆蟲群體的方法。本方法主要包括給蟲群施以有效殺蟲量的多肽，多肽中包括SEQIDNO2、4、6、8、10、12、14、16或19中的胺基酸序列。這些方法可以用於殺死或減少指定區域靶昆蟲的數量，也可以預防性地用於某一環境地區以防止易感昆蟲的侵襲。昆蟲優選攝取有效殺蟲量的多肽或優選接觸有效殺蟲量的多肽。此外，本發明提供一種能與本文所公開殺蟲多肽特異結合的純化抗體。本文也提供了製備抗體的方法，也提供了使用抗體分離、鑑定和/或純化與抗體特異結合的多肽的方法。本文詳細提供在鑑定多肽和多肽片段和/或其表位中有用的免疫試劑盒和免疫檢測方法，這也是本發明的重要內容。這些抗體可以用於檢測樣品中以上多肽的存在，或如下文所述可用於多種免疫方法中。在生物樣品種檢測δ-內毒素多肽的典型的方法主要包括獲得懷疑含有δ-內毒素多肽的生物樣品；在能有效形成抗原-抗體複合物的條件下，樣品與能與多肽特異結合的抗體接觸；檢測所形成的複合物。針對這些方法，本發明也提供了免疫檢測試劑盒(immunodetectionkit)。在合適的容器中，這樣的試劑盒中一般包括能與δ-內毒素多肽結合的抗體，以及至少一種第一免疫檢測試劑。另外，試劑盒還可以提供其它試劑或用抗體檢測樣品中δ-內毒素多肽的說明書。正如下文所述，使用所公開的多肽作為抗原可以在動物中完成這些抗體的製備過程。抗原表位、短肽、融合肽、與載體連接的肽片段等等也都可以從本文公開的多肽序列的全部或部分中產生得到。本發明的另一方面涉及表9中所示蘇雲金芽孢桿菌細菌的生物純培養物，培養物於AgriculturalResearchCultureCollection，NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)保藏。本發明的另一個實施方案涉及的載體中包括的序列編碼包括本文公開的一個或多個胺基酸序列的多肽，涉及用此重組載體轉化的重組寄主細胞，涉及用編碼本文公開多肽的多核苷酸序列轉化的重組細菌的生物純培養。所有的菌株是遞交PatentCultureCollection於NRRL保藏的，依照InternationalReceiptFormBP/4獲得了存活性聲明。下文中對可用載體、重組寄主細胞、轉基因細胞系、多能植物細胞(pluripotentplantcell)以及轉基因植物進行了詳細描述，它們包括至少第一個序列編碼包括一種或多種本文公開序列在內的多肽。本發明的另一個實施方案提供了殺蟲多肽組合物的製備方法。在典型的實施方案中，這樣的多肽可以用作殺蟲劑，可以用來防治包括農業環境等環境中的昆蟲群體。通過體表接觸(topicalapplication)或者通過昆蟲攝食多肽組合物，製劑可以用來殺死昆蟲。有時，可以將本發明的多肽應用到土壤中，應用到植物、樹、灌木等上或其周圍，應用到活體植物、家畜、住所、農場設備、建築等的周圍。本發明也提供轉化寄主細胞、多能植物細胞群(pluripotentplantcellpopulation)、植物胚性組織(embryonicplanttissue)、植物愈傷組織(plantcallus)、小植株以及轉基因植物，它們包括編碼殺蟲多肽的選擇序列。這些細胞優選原核細胞或真核細胞，如細菌細胞、真菌細胞或植物細胞，其中可以使用的細菌細胞包括蘇雲金芽孢桿菌細胞、枯草芽孢桿菌細胞(B.subtilis)、B.megaterium細胞、B.cereus細胞、埃希氏桿菌屬(Escherichia)細胞、沙門氏菌屬(Salmonella)細胞、農桿菌屬(Agrobacterium)細胞和假單胞菌屬(Pseudomonas)細胞。植物和植物寄主細胞優選單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞，如玉米、小麥、大豆、燕麥、棉花、水稻、黑麥、高粱、甘蔗、番茄、菸草、木棉、亞麻、馬鈴薯、大麥、草坪草、牧草、漿果、水果、莢豆、蔬菜、修飾性植物(ornamentalplant)、灌木、仙人掌、肉質植物(succulent)及樹的細胞。本發明中說明的轉基因植物優選將所選多核苷酸(或「轉基因」)整合到其基因組中，所選核苷酸(或「轉基因」)包括的第一個序列編碼一種或多種本文公開的殺蟲多肽。同樣，任何一代這樣的轉基因植物的後代(子代、後代等等)也代表本發明的一個重要方面。優選的是，這樣的後代包括所選轉基因，並遺傳了親本植物顯示出來的抗蟲性表型性狀。所有這些轉基因植物任何一代的種子也是本發明的一個重要方面。優選的是，種子中也包括所選基因，並賦予從種子長成的植物抗蟲性表型。包括一種或多種能編碼一種或多種本文公開多肽的轉基因的抗蟲雜交可育轉基因植物的製備方法主要包括獲得染色體上整合了編碼殺蟲多肽轉基因的可育轉基因植物，所轉基因與在植物中有活性的啟動子有效相連；將可育轉基因植物與沒有該轉基因的第二種植物雜交，得到第三種包括該轉基因的植物；將第三種植物回交，得到回交可育植物。以上情況中，轉基因可以通過父本遺傳也可通過母本遺傳。第二種植物可以是自交植物，而第三種植物可以是雜交種。同樣，抗蟲雜交轉基因植物的製備方法主要涉及使第一種自交植物和第二種自交植物雜交，其中，第一種植物和第二種植物中的其中之一或兩者均包括插入染色體上的轉基因，插入的轉基因編碼所選多肽，該轉基因與能使轉基因表達的的植物表達啟動子有效相連。在作為解釋說明的實施方案中，第一種自交植物和第二種自交植物可以選自於以下單子葉植物玉米、小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱、草坪草和甘蔗。在相關的實施方案中，本發明同時提供一種製備抗蟲轉基因植物的方法。該方法主要涉及在允許吸收DNA組分的條件下，將受體植物細胞與包括至少編碼殺蟲多肽的第一種轉基因的DNA組分接觸；選擇包含有插入染色體的編碼多肽的轉基因的受體細胞；從所選細胞再生出植物；鑑定出相對於對應未轉化植物來說抗蟲性有增強的可育轉基因植物。轉基因種子的產生方法主要涉及獲得其染色體上整合有轉基因的可育轉基因植物，所整合的轉基因編碼的多肽中包括本文公開的一種或多種胺基酸序列，轉基因可行地連接到能使轉基因在植物中表達的啟動子上；在合適的條件下種植植物，產生出轉基因種子。本發明中同時提供任何一代抗蟲性增強的可育轉基因植物後代的產生方法。該方法主要涉及收集來自於包括在其染色體上整合有轉基因的轉基因植物的轉基因種子，編碼所說多肽的轉基因與能在植物中表達轉基因的啟動子有效連接；種植所收集的轉基因種子；從轉基因種子長成後代轉基因植物。轉基因植物、轉基因後代以及轉基因種子的創造方法可以涉及使用熟知的植物細胞轉化過程如微粒轟擊(microprojectilebombardment)、電穿孔(electroporation)或農桿菌介導的轉化(Agrobacterium-mediatedtransformation)中的其中之一，使植物細胞與DNA組分接觸。從以下有本文所述益處的實施例和可以看出，本發明的這些實施方案以及其它實施方案對於那些本領域的技術人員來說是不難理解的。2.1多核苷酸區段本發明所提供的核酸區段從任何來源中分離，該核酸區段游離於總基因組DNA之外，且編碼本文公開的新的殺蟲多肽以及其肽片段。編碼這些肽和多肽的多核苷酸可以編碼有殺蟲活性的蛋白質或肽片段、多肽亞基、功能域，或者CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69CryET75、CryET39、CryET79、CryET74以及與本文公開多肽相關的晶體蛋白中的一種或多種類似物。此外，本發明包括可以通過本領域技術人員熟知的方法體外完全合成的那些編碼本文公開的新的多肽、肽、肽片段、亞基或功能域的核酸區段。本文所用的術語「核酸區段」或「多核苷酸」是指從特定物種的總基因組DNA中分離出來的核酸分子。因此，編碼內毒素多肽的核酸區段或多核苷酸是指包括至少第一種編碼晶體蛋白的序列核酸分子。編碼晶體蛋白的核酸序列是從某些物種的總基因組DNA中分離或純化來的。本文中的總基因組DNA是革蘭氏陽性細菌菌屬芽孢桿菌的基因組，特定的芽孢桿菌品種是蘇雲金芽孢桿菌。包括在術語「核酸區段」中的有多核苷酸區段和這些區段中較小的片段，以及重組載體，例如，包括質粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、噬菌體(phage)、毒粒(viron)、杆狀病毒(baculovirus)、人工染色體(artificialchromosome)、病毒(virus)等等。因此，與多核苷酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18的核酸序列或功能等同物相似性在大約70％與大約80％之間或更優選在大約81％與大約90％之間或甚至更優選在大約91％與大約99％之間的多核苷酸序列，即為「基本為SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中所列」序列。特別優選的序列是與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中的核苷酸序列有優選為大約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大約100％相同或功能相當的序列。編碼相關多肽序列的其它優選序列是那些與下文所列的一種序列或多種序列有大約81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％相同或功能相當的序列。同樣，我們認為那些與本文以下所列這些序列有大約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％相同或功能相當的序列在本發明的實踐中同樣有用。同樣，包括分離的、純化的或所選基因或序列區段的多核苷酸指的是包括除了編碼多肽的序列外某些其它元件，如調控序列，它們基本是從其它天然存在的基因或編碼蛋白質的序列中分離出來的。此處的術語「基因」單純是指編碼功能蛋白質的單位或編碼功能多肽的單位。正如那些本領域人員所能理解的那樣，這一功能術語既包括基因組序列、操縱基因序列，又包括人工改造的較小的基因區段，這些序列或區段能夠表達或能夠適用於表達蛋白質、多肽或肽。在某些實施方案中，核酸區段將包括至少編碼本文公開的一種或多種多肽的第一個基因。為使基因能夠表達，並使mRNA能夠翻譯成成熟多肽(maturepolypeptide)，核酸區段還優選包括與基因可行連接的至少第一個啟動子，啟動子能在用該核酸區段轉化的寄主細胞中表達基因產物。啟動子可以是內源啟動子，或者可以選擇能在一種或多種特定細胞類型中啟動基因表達的異源啟動子。例如，在創造包括所選基因的轉基因植物和多能植物細胞過程中，可以選擇在植物中表達的異源啟動子，而且許多情況下，所選異源啟動子優選的是組織特異性或細胞周期特異性。植物轉化領域中的技術人員熟知植物表達啟動子的選擇，本文對可以效仿的合適啟動子進行了描述。某些實施方案中，植物中表達的啟動子可以選自於玉米蔗糖合成酶1、玉米乙醇脫氫酶1(cornalcoboldehydrogenase1)、玉米集光複合體(cornlightharvestingcomplex)、玉米熱激蛋白質、豌豆小亞基RuBP羧化酶、Ti質粒甘露鹼合酶、Ti質粒胭脂鹼合酶、矮牽牛查爾酮異構酶(petuniachalconeisomerase)、菜豆富甘氨酸蛋白質1(beanglycinerichprotein1)、馬鈴薯Patatin、凝集素(lectin)、CaMV35S以及S-E9小亞基RuBP羧化酶的啟動子。「基本上從其它編碼序列中分離來的」的意思是說本文所關心的基因——編碼細菌晶體蛋白的基因——是DNA區段中編碼區的重要部分；DNA區段並不包含大部分天然存在的編碼DNA，如大的染色體片段或功能基因或操縱子編碼區。當然，這指的是原來分離的DNA區段，而並不排除後來由人工加到區段上的基因、重組基因、合成接頭或編碼區。特定的實施方案中，本發明涉及分離的多核苷酸(如DNA、RNA、反義DNA、反義RNA、核酶以及PNAs)以及重組載體，包括編碼本文公開的一種或多種多肽的多核苷酸序列。術語「基本上如在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO1O、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中所列的序列」是指基本上對應於SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19序列部分的序列，與這些序列中的任何一種只是有非常少的幾個胺基酸不同，或與這些序列中的任何一種的生物功能相當，或者就是這些序列中的任何一種。術語「生物功能相當」一詞的意思在本領域中是容易理解的，本文中還要進一步作詳細的定義(如，參照作為例釋的實施方案部分)。因此，與胺基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19的胺基酸序列相似性或功能等值在大約70％與大約80％之間或更優選在大約81％與大約90％之間或甚至更優選在大約91％與大約99％之間的序列，即為「基本為SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中所列」序列。特別優選的序列是與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中的胺基酸序列有優選為大約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大約100％相同或功能相當的序列。其它優選序列是那些與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中的胺基酸序列有大約81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％相同或功能相當的序列。同樣，我們認為那些與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中多肽序列有大約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％相同或功能相當的序列在本發明的實踐中同樣有用。可以理解的是，胺基酸序列和核酸序列可以包括額外的殘基，如N-末端胺基酸或C-末端胺基酸或者5』或3』序列，而且只要這些序列符合上文所列原則，這些序列基本上仍是下文所列本文公開序列中的其中之一，所列原則包括談到蛋白質表達時蛋白質生物活性的保持。添加的末端序列尤其適用於核酸序列，如可以包括位於編碼區5』或3』部分之側的多種非編碼序列，也可以包括多種內部序列(internalsequence)，即大家熟知的位於基因內部的內含子。本發明中的核酸區段，不論其編碼序列的長度如何，都可以與其它核酸序列如啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制酶位點、多克隆位點、其它編碼區段等等相連接，因此它們的總長度變化相當大。因此我們認為幾乎可以使用任意長度的核酸片段，其總長度優選容易製備。例如，可以製備出包括編碼在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中所公開肽序列的連續短片段在內的核酸片段，或者可以製備出與編碼在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中公開肽的核酸序列相同或互補的序列，或者可以特別製備出在SEQIDNO1、3、13、15或18中公開的核酸區段。例如，包括來自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中連續核苷酸序列的核酸序列或者編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中連續胺基酸序列的核酸序列如大約23個核苷酸長度及最長大約10000、5000、3000、2000、1000、500、200、100、50個以及大約23個鹼基對長度，尤其認為有用。容易理解的是，在談到多核苷酸序列或核酸序列或所公開基因所特異的引物(primer)或探針(probe)時提及的「中等長度」就是指在所引述範圍內的長度，如大約24、25、26、27、28、29等；30、31、32、33、34、35、36、37、38、39等；40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95等；100、101、102、103、104等；110、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、180、190等；包括所有在大約200-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-5000範圍內的所有整數；以及一直到並包括大約10000個或12000個核苷酸長度，等等。同樣容易理解的是，在談到多肽或肽時所提及的「中等長度」就是指在所引述連續胺基酸範圍內的任何長度。例如，在考慮公開的殺蟲多肽時，我們認為所有在大約7個到大約300個連續胺基酸序列之間的長度在本文所公開的特定實施方案中是有用的。例如，包括的連續胺基酸序列約為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65等，70、75等，80、85等；90、95等的肽，以及那些包括SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中至少大約96、97、98、99、100、101、102、103和104個或更多個連續胺基酸的多肽，毫無疑問都認為在本發明的範圍之內。另外，本領域的技術人員也容易理解的是，在談到有殺蟲活性的更大的多肽時所提及的「中等長度」指的是在所引述的包括此多肽的連續胺基酸範圍之間的任何長度。例如，在考慮本發明多肽時，我們認為在本文所公開的特定方案中所有大約100個到1000個連續胺基酸序列之間的長度都是有用的。例如，包括的連續胺基酸序列約為100、約101、約102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195等，200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、220、230、240、250、260、270、280、290等，300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400等；410、430、450、470、490等，500、525、550、575、600、650、675、700等，750等的肽，以及那些包括至少大約775個或更多個胺基酸的多肽，毫無疑問都認為在本發明的範圍之內。特別是有關包括SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中全部或部分胺基酸序列的融合蛋白質(fusionprotein)，更長一點兒的多肽序列可能是優選的，包括那些包括長度在大約760、770、780、790或800、或900個或更多個胺基酸的序列。同樣可以理解的是，本發明並不局限於編碼本發明肽的特定核酸序列或者編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中胺基酸序列的特定核酸序列，其包括在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18所特定公開的DNA序列。所以，重組載體和分離的DNA區段可分別包括編碼這些多肽的區段、在基本編碼區中有選擇性的變動或修飾的編碼區。這些重組載體和分離的DNA區段或者可以編碼包括這些肽編碼區在內的更大一點兒的多肽，或者可以編碼胺基酸序列變體的有相當生物功能的蛋白質或多肽。本發明中的DNA區段包含有相當生物功能的肽。這些序列的出現是因為密碼子的簡併性以及功能上的相當，已知這些情況天然發生在核酸序列及其所編碼蛋白質中。另外，可以通過使用重組DNA技術創造出功能相當的蛋白質或肽，在考慮所改變胺基酸的特性的基礎上可以對蛋白質結構的變化進行人工改造。可以應用定點誘變技術引入人為設計的變動，例如可以提高蛋白質的抗原性或者檢驗突變體以便在分子水平上檢測蛋白質的活性。此外，那些未知或未鑑定的天然多肽和/或者與本文公開序列結構相關和/或功能相關的多肽，也都認為在本發明的範圍之內。這些多核苷酸編碼的多肽與本文中具有編碼晶體蛋白特徵的多核苷酸所確定的多肽在結構上類似和/或功能上類似或相同。因為選擇「CryET39」、「CryET69」、「CryET71」、「CryET74」、「CryET76」、「CryET79」、「CryET80」、「CryET84」和「CryET75」這些任意名稱來隨意鑑定包括本文公開胺基酸序列的多肽，所以可以鑑定與這些序列高度同源(或者相同)的許多其它序列，但是從異種生物或來源或其它來源中分離的多肽可以完全從頭合成或部分從頭合成。因此，不論天然存在或人工創造的與本文所述一級胺基酸序列在結構上同源的所有多肽序列以及對本文公開的靶昆蟲有相似殺蟲活性的多肽序列，都認為在本公開內容的範圍之內。同樣，不論天然存在或人工創造的與本文公開的核酸序列在結構上同源的所有多核酸序列，或者編碼與本文公開胺基酸序列同源和有相當生物功能的多肽的核酸序列，也認為在本公開內容的範圍之內。根據需要，也可製備出融合蛋白質和融合多肽，例如有時將編碼肽的區段和其它有想要功能如為了純化或免疫檢測等目的的蛋白質或肽(如可以分別通過親和層析以及編碼酶標記的區段來純化的蛋白質)放在在同一個表達單位中。重組載體也是本發明的一些方面。我們認為尤其有用的載體中，DNA區段的編碼區無論其編碼全長的殺蟲蛋白質或較小一點兒的肽，放在啟動子的調控之下。啟動子的形式可以是與本發明中編碼肽的基因天然相連接的啟動子，這可以通過諸如使用重組克隆技術(recombinantcloningtechnology)和/或PCRTM技術，分離與本發明公開的組合物相關的位於編碼區段或外顯子(exon)上遊的5』非編碼序列。多數情況下，啟動子可以是天然的啟動子，或者可以是異源啟動子，如細菌來源的啟動子(包括來自其它晶體蛋白的啟動子)、真菌來源、病毒、噬菌體或噬菌粒來源的啟動子(包括象CaMV35S這樣的啟動子及其衍生物、T3、T7、λ以及φ啟動子等等)，或者植物來源的啟動子(包括組成型、誘導型和/或組織特異性啟動子，等等)。2.1.1從EG4851中分離出來的CryET76、CryET80、CryET84的特性本發明所提供的新多肽闡明的是蘇雲金芽孢桿菌CryET76、CryET84或CryET80晶體蛋白中的全部或一部分。優選實施方案中，本發明公開並申請專利的是所分離和純化的CryET76蛋白質。CryET76蛋白質是從EG4851中分離來的，它包括一個387個胺基酸的序列，計算其分子量大約為43800Da。計算出CryET76的等電常數等於5.39。優選實施方案中，本發明公開並申請專利的是所分離和純化的CryET80蛋白質。CryET80蛋白質是從EG4851中分離來的，它包括一個132個胺基酸的序列，計算其分子量大約為14800Da。計算出CryET80的等電常數等於6.03。優選實施方案中，本發明公開並申請專利的是所分離和純化的CryET84蛋白質。CryET84蛋白質是從EG4851中分離來的，它包括一個341個胺基酸的序列，計算其分子量大約為37884Da。計算出CryET84的等電常數等於5.5。在菌株EG4851中，cryET80基因和cryET76基因優選定位在一段DNA區段上，並且由大約95個核苷酸分隔開來。CryET76的基因從SEQIDNO5中的第514個核苷酸一直延續到第1674個核苷酸，而編碼CryET80的基因從SEQIDNO5中的第23個核苷酸一直延續到第418個核苷酸。本發明中的cryET80基因和cryET76基因優選定位在一段DNA區段上。在菌株EG4851中，cryET84基因的定位緊靠cryET80基因和cryET76基因的5』端附近。cryET84基因的核苷酸序列如SEQIDNO18所示，推斷出CryET84蛋白質的胺基酸序列如SEQIDNO19所示。本發明中的cryET80基因、cryET84基因以及cryET76基因可能優選定位在同一個DNA區段上(如SEQIDNO17)。2.2用作雜交探針和模板的核酸區段本文所述核酸序列除了能用於指導本發明中晶體蛋白或晶體多肽的表達外，還有其它多種用途。例如，在核酸雜交實施方案中它們有探針或引物的作用。本發明提供了檢測編碼δ-內毒素多肽的核酸序列的方法。該方法主要涉及獲得懷疑有編碼δ-內毒素多肽的樣品核酸；在使基本上互補的核酸能有效雜交的條件下，樣品核酸與包括本文公開序列之一在內的分離核酸區段相混合接觸；檢測所形成的雜交互補核酸。本文也提供了核酸檢測試劑盒，核酸檢測試劑盒中包括在合適容器中至少包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中至少23個連續核苷酸的至少第一種核酸區段，以及至少一種第一種檢測試劑。這些核酸探針能夠與編碼晶體蛋白的序列特異雜交，這就使得它們在檢測指定樣品中是否存在互補序列方面非常有用。當然，也可以設想出其它用途，包括使用序列信息製備突變引物或者使用引物製備其它遺傳構建體。序列區段由大約23個到50個或直至並包括大約100-200個與本文DNA序列相同或互補的連續核苷酸區段組成的核酸分子，將尤其作為諸如DNA印跡(DNAblotting)和RNA印跡(RNAblotting)中所用的雜交探針。中等大小的片段在雜交實施方案中通常也有用處，其中，連續互補區段的長度可能變化很大，如在大約25-30，或在大約30-40之間的核苷酸，但也可能用到長度更大的連續互補片段，如也可能用到那些長度從大約200-300，或長度從300-400或500個的核苷酸，這要根據想要檢測的互補序列的長度而定。也可能用到更加長一點兒的連續序列區段，包括那些包括本文公開序列之一中至少大約600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500個或更多個連續核苷酸的序列。當然，也可以通過其它技術如機械剪切或限制酶消化等製得片段。小的核酸區段或片段極易通過諸如直接用化學方法合成片段的方式製備，通常使用用自動化寡核苷酸合成儀來實現這一目的。片段的獲得方法可以使用核酸增殖技術如美國專利4683195和4683202中的PCRTM技術(各個專利的內容在此引入作為參考)，也可以通過將所選序列引入到重組載體中進行重組增殖，也可以通過分子生物學領域中技術人員所熟知的其它重組DNA技術產生出所需片段。因此，使用本發明中的核苷酸序列是因為它們能與DNA片段的互補區段選擇性地形成雙鏈分子。依據所能想到的不同應用，我們可以使用不同雜交條件得到針對靶序列的選擇性不同的探針。對於應用時需要高度選擇性的，我們將通常使用能形成雜種分子的相對嚴緊的條件。例如，「高度嚴緊性」的雜交條件通常使用相對低的鹽和/或高溫條件，如可以由在大約50℃～大約70℃時大約0.02M～大約0.15M的NaCl提供此條件。這樣的選擇條件只能忍受探針與模板或靶鏈存在非常低程度的錯配(當然，如果有的話)，這對於分離編碼晶體蛋白的DNA區段將尤其有用。對於本領域的熟練技術人員來說，通過雜交檢測DNA區段的方法是眾所周知的，美國專利4965188和5176995中的內容(兩個專利的內容在此引入作為參考)均是可以效仿的雜交分析方法。諸如Maloy等(1990)、Maloy(1994)、Segal(1976)、Prokop和Bajpai(1991)以及Kuby(1994)的文章內容是特別相關的內容。當然，對於有些應用，如在想要通過使用突變引物鏈與既定的(underlying)模板進行雜交時或在從相關品種中分離編碼晶體蛋白序列的等功能體等時，為使異源雙鏈形成通常將需要較低嚴緊性的雜交條件。此時，我們就想使用「低嚴緊性」或「嚴緊性降低的」的雜交條件，如在從大約20℃～50℃溫度範圍內波動的溫度條件下使用從0.15M～0.9M的鹽。因此，談到控制雜交時，我們將交叉雜交視作正雜交信號。無論如何，我們通常認為通過加入逐漸增高量的甲醯胺能使雜交條件變得更為嚴緊。甲醯胺以與升高溫度相同的方式達到使雜種雙鏈去穩定的效果。所以，雜交的條件是容易調控的，而且通常這就是依賴於想要的結果時所選擇的方法。不管在鹽(如NaCl或檸檬酸鈉等)、有機緩衝液(如，包括甲醯胺等)以及溫育或漂洗的溫度之間如何組合使用，熟練的技術人員會輕鬆地使用「高」、「中」或「低」嚴緊性的雜交條件，而且將能夠使用這些條件去解釋雜交分析結果，以便決定靶核酸序列與從SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中使用的特定新的多核苷酸探針序列之間的相對同源性。某些實施方案中，在控制雜交時聯合使用本發明的核酸序列和適當方法如標記將非常有利。在本領域中已知多種適當指示劑方法，包括螢光配體、放射性配體、酶促配體或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素能夠提供可檢測到的信號。優選實施方案中，我們可能喜歡使用螢光標記或酶標物，如脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶，而不是放射性或其它對環境不利的試劑。在酶標物中，已知的顯色指示底物可以用於給人眼或分光光度提供可見方法，這樣就能鑑定出與包含互補核酸的樣品進行的特定雜交。我們通常認為本文所述雜交探針既可以在溶液雜交中作為試劑，又可以在使用固相的實施方案中作為試劑使用。在涉及固相的實施方案中，待測DNA(或RNA)吸附到或固定到所選介質或表面上。隨後，在預定條件下，固定的單鏈核酸與所選探針進行特定雜交。在所需特定標準的基礎上，所選條件決定於特定的環境(如取決於G+C含量、靶核酸的類型、核酸來源、雜交探針的大小，等等)。漂洗雜交表面以便去除非特異結合的探針分子之後，使用標記對特異的雜交進行檢測甚或進行定量。2.3重組表達Cry相關多肽的載體和方法我們認為，其它實施方案中將編碼DNA的區段放在重組啟動子或異源啟動子的控制之下將有某些優點。正如本文所用的重組啟動子或異源啟動子一樣，重組啟動子或異源啟動子用來指在天然環境下一般並不與編碼晶體蛋白或多肽的DNA區段相連接的啟動子。這些啟動子中包括通常與其它基因相連接的啟動子和/或從任何細菌細胞、病毒細胞、真核細胞或植物細胞中分離的啟動子。當然，在選擇用於表達的細胞類型、生物甚或生物中使用能有效指導DNA區段表達的啟動子是非常重要的。對於分子生物學領域中的技術人員來說，一般都知道如何聯合使用啟動子和細胞類型來表達蛋白質，如可以參照Sambrook等(1989)。所用啟動子可以是組成型或誘導型的，在適當條件下可用於指導所導入DNA區段高水平的表達，這在產生大量重組蛋白質或肽時是有利的。我們認為用於高水平表達的合適啟動子系統包括但並不局限於Pichia表達載體系統(PharmaciaLKBBiotechnology)。關於用於製備重組蛋白質和重組肽的表達實施方案，我們認為更長的DNA區段使用的最多，其中編碼完整肽序列的DNA區段最優選。但是，我們認為使用更短的DNA區段指導晶體蛋白或表位核心區如可以用於產生抗-晶體蛋白抗體，也在本發明的範圍之內。我們認為編碼從大約8個到大約50個胺基酸長度、或更優選從大約8個到大約20個胺基酸長度肽抗原的DNA區段尤其有用。這些肽的表位可以是包括本文公開的連續胺基酸序列的胺基酸序列。2.4表達CryET多肽的轉基因植物另一方面，本發明提供能表達所選核酸區段的轉基因植物的產生方法，其中所選核酸區段中包括編碼本發明中新的內毒素多肽的序列區段。在本領域中，轉基因植物的產生方法是眾所周知的。該方法一般包括用包含啟動子的DNA區段轉化合適的植物寄主細胞，其中的啟動子與編碼一個或多個所公開多肽的編碼區可行地連接。編碼區一般與至少第一個轉錄終止區相連接，這樣啟動子才能驅動編碼區在細胞中的轉錄並因此提供細胞在體內產生多肽的能力。此外，在想要調控、調節或降低特定轉基因細胞中特定重組晶體蛋白的量時，本發明也提供了表達晶體蛋白反義mRNA的方法。使用反義mRNA作為控制或降低細胞中指定蛋白質的量的方法在本領域中是熟知的。本發明的另一個方面包括能表達編碼本文所公開一種或多種新多肽組分的基因、基因區段或序列區段的轉基因植物。正如本文所用的，術語「轉基因植物」指的是整合有DNA序列的植物，所整合的DNA序列中，包括但並不局限於通常不存在的基因、通常並不轉錄成RNA或並不翻譯(「表達」)成蛋白質的DNA序列，或者人們想要引入非轉基因植物的任何其它基因或DNA序列，如那些通常在非轉基因植物中存在的基因，人們想要將其進行遺傳改造或使其表達發生改變。我們認為，有時通過將一種或多種或天然存在或人工修飾或人工突變的編碼與本文所公開多肽同一或高度同源殺蟲多肽的轉基因穩定引入，將使本發明中轉基因植物的基因組得到改善。有時，要將不止一個轉基因整合到所轉化寄主植物細胞的基因組中。例如可以將不止一個編碼晶體蛋白的DNA區段整合到植物基因組中。這時，可能想要使一個、兩個、三個、四個或更多個蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白(要麼是天然存在的要麼是重組改造的)在所轉化轉基因植物中整合併進行穩定表達。此外，可以將第二個轉基因導入植物細胞，賦予植物其它表型形狀。這些轉基因可賦予植物對一種或多種昆蟲、細菌、真菌、病毒、線蟲或其它病原體的抗性。例如，可以導入的優選基因包括來源於細菌編碼晶體蛋白的DNA區段以及特別是本文所述從Bacillusspp中所得的一個或多個DNA區段。高度優選的核酸序列是從蘇雲金芽孢桿菌中所得的序列，或者是通過遺傳改造來降低或提高晶體蛋白在所轉化寄主細胞中的殺蟲活性的序列。轉化植物細胞的方法和製備多能植物細胞的方法以及從轉化的細胞、細胞培養物、胚或愈傷組織再生出轉基因細胞系的方法，在本領域中是熟知的，並且將在本文中進行討論。當然，在轉化這些細胞時所用的包括編碼殺蟲多肽的至少第一個核酸區段的載體(包括質粒、粘粒、噬菌體、噬菌粒、杆狀病毒、病毒、毒粒、BACs[細菌人工染色體]、YACs[酵母人工染色體])一般包括操縱子、基因或本發明中來自於基因的天然存在或者來自於合成的序列，以及編碼所公開晶體蛋白的序列。這些核酸構建體中還可以包括的結構有啟動子、增強子(enhancer)、多位點接頭、內含子、終止子(terminator)甚或對所述克隆δ-內毒素基因有正調節作用或負調節作用的基因序列。DNA區段或基因可以編碼天然存在的晶體蛋白或修飾的晶體蛋白，它們將在所得重組細胞中表達並/或將賦予包含該區段的轉基因植物以增強的表現型(此處是指植物對昆蟲攻擊、侵襲或集群的抗性增強)。為了提高或增強植物對靶昆蟲攻擊的抗性而進行製備包括至少一種編碼殺蟲多肽的序列的轉基因植物，代表本發明的一個重要方面。本發明尤其對抗蟲單子葉植物或抗蟲雙子葉植物的製備方法進行了描述，方法是將編碼對鞘翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲有毒性的一種或多種殺蟲多肽的轉基因DNA區段導入到植物中。本發明的有關方面也包括轉基因植物產生的種子、由這些種子所得的後代以及由最初的轉基因植物的後代所產生的種子，產生方法與以上過程一致。在這些後代及種子中，編碼晶體蛋白的轉基因穩定整合到基因組中，而且這些後代植物將以孟德爾方式遺傳由穩定的轉基因所給與的性狀。所有那些在其基因組中整合了編碼一種或多種晶體蛋白或多肽的轉基因DNA區段的轉基因植物都是本發明的內容。正如本領域中的技術人員所熟知，植物後代的意思就是來自於植物的任何子代或者後代。2.5篩選晶體蛋白和檢測晶體蛋白的試劑盒本發明涉及篩選那些懷疑包含晶體蛋白多肽或晶體蛋白相關多肽的樣品的方法和試劑盒，或者篩選產生這些多肽的細胞的方法和試劑盒。試劑盒中可能包含一種或多種對所公開胺基酸序列特異的抗體、或者一種或多種對衍生自所公開序列的肽所特異的抗體，試劑盒中還可能包含檢測樣品與本發明中的抗體之間相互作用的試劑。所提供試劑可能是放射性標記、螢光標記或者是酶促標記。試劑盒中可能包括一種已知的放射性標記物，它能與本發明中的核酸或抗體結合或與之發生作用。試劑盒中的試劑可能以液體溶液的方式提供，也可能與固相支持物相連，或者以乾粉形式提供。當試劑以液體溶液提供時，液體溶液優選為水溶液。當提供的試劑與固相支持物相連時，固相支持物可優選為層析介質、多孔檢測板或者顯微鏡載玻片。當提供的試劑是乾粉時，加入適當溶劑可使乾粉還原(reconstiture)，該溶劑也可能同時提供。另一個實施方案中，本發明涉及免疫檢測方法和與之相伴的試劑盒。一般認為，本發明中的晶體蛋白或肽可用於檢測與之有反應性的抗體，此外，根據本發明製備的抗體可用於檢測晶體蛋白或包含晶體蛋白相關表位的肽。一般而言，這些方法中將包括首先獲得懷疑含有該蛋白質、肽或抗體的樣品，在能使免疫複合物形成的有效條件下使樣品與與本發明一致的抗體或肽接觸，然後檢測免疫複合物(immunocomplex)的存在。一般而言，本領域中有關免疫複合物形成的檢測方法是熟知的，而且可以通過使用多種方法完成檢測過程。例如，本發明就涉及到使用ELISA、RIA、免疫印跡(如斑點印跡)、間接免疫螢光技術(indirectimmunofluorescencetechniques)等。檢測免疫複合物的形成通常要使用標記，如放射性標記或酶標物(如鹼性磷酸梅、辣根過氧化物酶等)。當然，通過使用第二種結合配體如二抗(secondantibody)或生物素/抗生物素蛋白質，我們會發現其它優點，在本領域中這一點是熟知的。以鑑定為目的，我們認為實際上任何要檢測的懷疑含有晶體蛋白或晶體多肽或晶體蛋白相關肽或抗體，都可以使用，正如本文所述。我們認為這些實施方案可能在測定抗原或抗體效價方面、在選擇雜交瘤等方面有應用。在相關實施方案中，本發明涉及試劑盒的製備方法，這些試劑盒可用於檢測樣品中晶體蛋白或相關肽以及/或抗體的存在。樣品可以包括懷疑含有晶體蛋白或晶體肽的細胞、細胞上清液、細胞懸液、細胞抽提物、酶組分、蛋白質抽提物或者其它無細胞組分。一般而言，與本發明一致的試劑盒中將包括合適的晶體蛋白、晶體肽或針對這樣蛋白質或肽的抗體，還有免疫檢測試劑以及盛放抗體或抗原以及試劑的裝置。免疫檢測試劑中總是包括一種與抗體或抗原結合的標記，或者是與第二種結合配體結合的標記。典型的配體可能包括針對第一種抗體的二抗或抗原或生物素或抗生物素蛋白質(或鏈黴抗生物素蛋白質)配體，它們都與標記連接。當然，正如上面注意到的，許多典型的標記在本領域中是熟知的，與本發明相關的所有這些標記均可使用。容器通常包括小管，抗體、抗原或檢測試劑可放在小管兒中，並且優選進行合適的等份分裝。本發明中的試劑盒也總是包括盛放抗體、抗原以及試劑容器的裝置，要求嚴格以便商售。容器中包括注射器(injection)或吹制模具的塑料容器(blow-moldedplasticcontainer)，其中所需小管置於其中。2.6殺蟲組合物及其使用方法本發明認為，本文所公開的多肽組分有特定用處，可用作殺蟲劑用於大田作物、草、水果及蔬菜、草坪、樹，和/或裝飾性植物進行局部使用和/或系統使用。此外，本文所公開的多肽可以製成噴霧、粉劑或水狀、噴霧狀或煙霧劑殺滅昆蟲或防治昆蟲種群。本文所公開的多肽組分可作預防用，或者可以施給環境，因為靶昆蟲如WCRW在特定環境中需要進行處理。多肽組合物可能包括一種單一的Cry多肽，也可能包含本文所公開多肽的多種組合。不管其使用方法如何，有效多肽組分的量用的是殺蟲有效量，這取決於的因素有所防治的特定靶昆蟲、特定的環境、位置、植物、作物或所處理的農業位點、環境條件，以及使用有殺蟲活性多肽組分的方法、效率、濃度、穩定性。製劑可能也會隨著氣候條件、環境因素和/或使用頻率和/或昆蟲侵襲的嚴重程度而有所不同。所述殺蟲組合物的製作方法可以是將細菌細胞、晶體懸液和/或芽孢懸液或者分離的蛋白質組分與想要的農業上可接受的載體製成製劑。在施用之前組合物可以用適當方法進行處理，如低壓凍幹、冷凍乾燥、脫水，或者製備在水溶性載體、培養基或適當稀釋液中，如鹽或其它緩衝液。所製成的組合物可以以粉劑或顆粒，或懸浮在油(植物油或礦物油)、水或油/水乳濁液中，或製成可溼性粉，或者與適合農業使用的其它載體一起使用。合適的農業載體可以是固體或液體，它們在本領域中是熟知的。術語「農業上可接受的載體」包含所有在殺蟲製劑技術中通常使用的佐劑、惰性組分(inertcomponent)、分散劑、表面活性劑、膠粘劑(tackifier)、粘合劑等；殺蟲製劑領域中的熟練人員對這些是熟知的。製劑可以與一種或多種固體佐劑或液體佐劑混合，製備方法有多種，如可使用常規製劑技術(conventionalformulationtechniques)將殺蟲組分與合適的佐劑進行均勻混合、混合和/或研磨。2.6.1流動油懸液(oilflowablesuspensions)在優選實施方案中，生物殺蟲劑組合物中包括表達本文所公開的新晶體蛋白的細菌細胞的流動油懸液。典型的細菌包括，如蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringeiensis)、B.megaterium、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、B.cereus、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、土壤農桿菌(Agrobacteriumspp.)、假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。2.6.2水分散微粒在另一個重要實施方案中，生物殺蟲劑組合物包括水分散顆粒。這些顆粒包括表達本文所公開新的晶體蛋白的細菌細胞。優選的細菌細胞包括，如B.megaterium、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、B.cereus、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、土壤農桿菌(Agrobacteriumspp.)、假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)，這些細菌細胞均用本文所公開的DNA區段進行了轉化，而且我們表達晶體蛋白也是有用的。2.6.3粉末製劑(powdersformulations)、粉劑(dustsformulations)和芽孢製劑(sporeformulations)在第三個重要的實施方案中，生物殺蟲劑組合物包括可溼性粉、粉劑、芽孢晶體製劑、細胞沉澱或膠態濃縮物。粉劑中包括表達本文所公開的新晶體蛋白的細菌細胞。優選的細菌細胞包括蘇雲金芽孢桿菌細胞(B.thuringeiensis)、或者B.megaterium、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、B.cereus、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏桿菌(Salmonellaspp.)、土壤農桿菌(Agrobacteriumspp.)、假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)等菌株的細胞，也可能用一種或多種本文所公開的區段進行了轉化。可以將這些乾粉形式的殺蟲組合物設計成即溼即溶，或者是以控釋方式(controlled-releasemanner)、持續釋放的方式(sustained-releasemanner)或其它依賴於時間的方式(time-dependentmanner)溶解。這些組合物可以用於靶昆蟲或由靶昆蟲攝食，這樣就可以在指定環境中防治昆蟲數目或防治這些昆蟲的擴散。2.6.4水懸液和細菌細胞濾液和細菌細胞裂解液在第四個重要的實施方案中，生物殺蟲劑組合物包括細菌細胞的水懸液或伴孢晶體的水懸液，或細菌細胞裂解液或細菌細胞濾液的水懸液等，如上文所述表達晶體蛋白的細菌。這些水懸液可以由濃縮的貯存液提供，在使用前進行稀釋，或者也可以由現成稀釋好的溶液提供。對於這些涉及到使用細菌細胞的方法，包含晶體蛋白基因的細胞寄主可以生長在任何方便的營養培養基上，其中的DNA構建體提供了選擇優勢，所提供的選擇培養基使得所有細胞均保留了蘇雲金芽孢桿菌基因。然後，用與常規方法一致的方法收穫細胞。另外，在收穫之前可以對細胞進行處理。當殺蟲組合物包括完整的表達所感興趣蛋白質的蘇雲金芽孢桿菌細胞時，對於這些細菌的製劑可以有多個方式。通過與各種不同惰性物質如無機礦質(葉矽酸、碳酸、硫酸、磷酸，等等)或者植物原料(玉米芯粉、水稻外殼、核桃殼，等等)混合，細菌細胞可以用作可溼性粉、顆粒或粉劑。製劑中可以包括展布劑-粘著劑佐劑(spreader-stickeradjuvants)、穩定劑或殺蟲添加劑，或者表面活性劑(surfactants)。液體製劑可以是水基或非水基，並用作泡沫、懸液、乳化的濃縮物等。配料中可能包括流變劑(rheologicalagents)、表面活性劑、乳化劑、分散劑或高聚物(ploymers)。此外，製備新的殺蟲多肽可以用天然細菌表達系統或體外重組細菌表達系統，分離後由於以後的大田。這些蛋白質在製作成活性殺蟲劑製劑之前，或者以粗製細胞裂解液、懸浮液、膠體等形式存在，或者也可以經過純化、提煉、緩衝並且/或進一步加工。同樣，有時我們想要從表達晶體蛋白的細菌培養物中分離晶體和/或芽孢，然後用這些晶體和/或芽孢的溶液製劑、懸浮液製劑或者膠體製劑作為有效的生物殺蟲劑組合物。2.6.5多功能製劑(multifunctionalformulations)某些實施方案中，想要防治多種昆蟲時，本文所述殺蟲製劑也可能包括一種或多種化學殺蟲劑，(如化學殺蟲劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺蟲劑等)，以及/或一種或多種有相同或不同殺蟲活性或殺蟲特異性的δ-內毒素多肽，正如本文所鑑定的殺蟲多肽一樣。也可以將殺蟲多肽與其它處理方法如肥料(fertilizers)、除莠劑(weedkiller)、抗凍劑(cryoprotectant)、表面活性劑(surfactant)、去汙劑(detergent)、殺蟲肥皂(insecticidalsoap)、休眠噴灑油(dormantoil)、聚合物和/或時間釋放製劑(time-releaseformulation)或生物降解載體製劑(biodegradblecarrier)一起使用，時間釋放製劑或生物降解載體製劑能使目標區域使用一次製劑後長期有劑量。同樣可以將製劑製備成可食性「誘餌」，或者將製劑做成昆蟲「陷阱」，能使靶昆蟲進食或攝食殺蟲製劑。本發明中的殺蟲組合物也可以單獨地連續或同時用於環境位點，或者與一種或多種附加殺蟲劑、農藥、化學藥品、肥料或其它化合物一起使用。2.6.6應用方法及其有效率本發明中的殺蟲組合物應用於靶昆蟲環境時，向來都是施到所保護植物或作物的葉上，所用方法為常規方法，優選噴灑方式。依照對特定害蟲的特異條件、所要處理的作物以及特定的環境條件去設置殺蟲應用的強度和延續時間。有效成分與載體之間相應的比例取決於殺蟲組合物的化學本質、溶解性和穩定性，以及所要採用的特定製劑。其它應用技術，包括撒粉、噴灑、浸泡土壤、土壤灌注、種子包被、幼苗包被、葉面噴灑、通氣、nisting、噴霧(atomizing)、薰煙aerosolizing等，也是可行的，可以要求在某些情況下使用，如當昆蟲導致根或莖的侵襲時，或者應用於嬌弱的植被或者修飾性植物時。對於本領域中的熟練技術人員來說，這些應用程式也是熟知的。也可以將本發明中的殺蟲組合物規劃設計預防性或防治性地應用於某一地區，有時可以用於寵物、家畜、動物的寢具或者用於農場設備、穀倉、住所或農業設施或工業設施之中或周圍，等等。用於環境應用、系統應用、局部應用或葉面應用時，殺蟲組合物的濃度將大大不同，這將取決於特定製劑、使用方法、環境條件以及殺蟲活性的程度。生物殺蟲劑組合物在所用製劑中的濃度一般是至少大約1％(按重量計)，最高並包括大約99％(按重量計)。多肽組合物的幹製劑(dryformulation)中蛋白質組分的重量百分比可能從大約1％到大約99％或更高，而液體製劑(liquidformulation)中一般將包括有效成分從大約1％到大約99％或更高(按重量計)。因此，可以製備出多種多樣的製劑，包括其殺蟲多肽的重量百分比從大約5％到大約95％或更高的製劑，包括其殺蟲多肽的重量百分比從大約10％到到約90％或更高的製劑。當然，包括殺蟲多肽的重量百分比從大約15％到大約85％或更高的製劑、包括殺蟲多肽的重量百分比從大約20％到大約80％或更高的製劑，也都考慮在本公開內容的範圍之內。就其中包括了包含殺蟲多肽的完整細菌細胞的組合物而言，雖然某些實施方案中可能會用到包含大約從102～104細胞/毫克的製劑，或者當想要更濃的製劑時也有可能用到包含大約從108至1010或1011細胞/毫克的製劑，但是製劑中一般將包含大約從104～108細胞/毫克。此外，可以製備有效多肽相當於從1012～1013細胞/毫克的細胞團(cellpaste)、芽孢濃縮液(sporeconcentrate)或晶體蛋白懸浮液濃縮液，在應用之前可將這些濃縮液稀釋。以上所述殺蟲製劑可以以所需一種或多種應用方式施給特定植物或目標區域，典型的每公頃大田應用率是其有效成分從大約50克/公頃～大約500克/公頃，或者可能使用從大約500克/公頃～大約1000克/公頃。有時，更想給目標區域施的殺蟲製劑其施用率是有效成分從大約1000克/公頃～大約5000克/公頃。實際上，在使用這些殺蟲製劑管理、防治並殺滅目標害蟲時，所用在從每公頃大約50克有效多肽到大約10000克/公頃之間範圍內的施用率都認為是有用的。因此，有效多肽大約100克/公頃、大約200克/公頃、大約300克/公頃、大約400克/公頃、大約500克/公頃、大約600克/公頃、大約700克/公頃、大約800克/公頃、大約900克/公頃、大約1千克/公頃、大約1.1千克/公頃、大約1.2千克/公頃、大約1.3千克/公頃、大約1.4千克/公頃、大約1.5千克/公頃、大約1.6千克/公頃、大約1.7千克/公頃、大約1.8千克/公頃、大約1.9千克/公頃、大約2.0千克/公頃、大約2.5千克/公頃、大約3.0千克/公頃、大約3.5千克/公頃、大約4.0千克/公頃、大約4.5千克/公頃大約6.0千克/公頃、大約7.0千克/公頃、大約8.0千克/公頃、大約8.5千克/公頃、大約9.0千克/公頃甚至最高並包括大約10.0千克/公頃或更高的應用率，可能會在本文以上所述殺蟲製劑的某些農業應用、工業應用、以及家庭應用上使用。2.7表位核心序列(epitopiccoresequences)本發明也涉及不含總細胞及其它肽的蛋白質組合物或肽組合物，所包括的純化肽中參入的表位，能與所公開多肽序列特異的一種或多種抗體發生免疫交叉反應。本發明尤其涉及來自於一種或多種本文所公開多肽的表位核心序列。本文所用術語「參入能與公開多肽序列特異的一種或多種抗體發生免疫交叉反應的表位」指的是一種肽抗原或蛋白質抗原，它包括與位於所公開多肽中的表位相似的一級結構(primarystructure)、二級結構(secondarystructure)或三級結構(tertiarystructure)。相似性水平的程度為晶體蛋白或晶體多肽的單克隆抗體(monoclonalantibodies)或多克隆抗體(polyclonalantibodies)也與發生交叉反應的肽抗原或蛋白質抗原相結合、反應，或者識別。多種免疫測定方法可以與這些抗體一起使用，如蛋白質印跡法(Westernblotting)、ELISA、RIA等，本領域中的熟練技術人員對所有這些方法是熟知的。適用於疫苗使用的鑑定免疫顯性表位(immunodominantepitopes)及/或其功能相當體的方法，是件非常簡單的事情。例如，可以使用美國專利4554101中所教的Hopp方法(在此引入作為參考)，該方法教我們在親水性基礎上從胺基酸序列確定並製備表位。其它幾篇論文中所述該方法，以及在此基礎上的軟體程序，也都可以用來鑑定表位核心序列(如，可參考Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；美國專利4554101)。通過使用肽合成技術或重組技術，就可以很容易地將這些「表位核心序列」的胺基酸合併到肽中。本發明的優選肽在使用時一般其長度在大約8個到大約20個胺基酸，更優選的長度為大約8個到大約15個胺基酸。我們認為，來自抗原晶體蛋白的較短肽有時會提供優點，如在免疫檢測分析時。典型的優點包括易於製備和純化、相對低的成本和生產的重複性提高，以及有利的生物分配(biodistribution)。我們認為，通過製備包括修飾的和/或增長的表位/免疫原性核心序列的合成肽，就可以認識到本發明的特定優點，修飾的和/或增長的表位/免疫原性核心序列將產生出針對晶體蛋白和相關序列的「通用」表位肽。本文對這些表位核心序列的特定方面如特定多肽抗原的親水區(hydrophilicregion)進行了鑑定。我們認為，這些區域所代表的區域很可能啟動T-細胞激活(T-cellstimulaion)或B-細胞激活(B-cellstimulation)，所以就能刺激特異抗體的產生。本文所用的表位核心序列是相當短的一段胺基酸，這段胺基酸與本文所公開晶體蛋白抗體上的抗原結合位點「互補」，並因此之結合。此外或除此之外，表位核心序列將刺激能與針對本發明多肽組分發生交叉反應的抗體的產生。不難理解的是，本公開內容中的術語「互補的」是指胺基酸或肽之間彼此有吸引力。所以，本發明中的某些表位核心序列在談到其與對應蛋白質的抗血清競爭結合想要蛋白質抗原或可能替代想要蛋白質抗原時，就能進行很好地定義了。一般而言，並不認為多肽抗原的大小有多關鍵，只要其至少足夠大攜帶了鑑定的核心序列或序列即可。本公開內容所期望的最小的有用核心序列其長度一般為8個胺基酸，序列更優選的長度是10到20個。因此，此大小與本發明所製備最小的肽抗原大致上相當。然而，如果需要的話，抗原的大小可以更大些，只要其包含基本的表位核心序列即可。表位核心序列的鑑定方法對於本領域中的熟練技術人員來說是熟知的，例如，正如美國專利4554101(在此引入作為參考)所述，該專利教給我們如何在親水性基礎上從胺基酸序列確定表位並製備表位。此外，可以使用許多電腦程式去預測蛋白質的抗原部分(參照Jameson和Wolf，1998；Wolf等，1988)。計算機化肽序列分析程序(如DNAStar軟體，DNAStar公司，Madison，WI)也可能在設計與本公開內容一致的合成肽時是有用的。使用常規合成技術(conventionalsynthetictechniques)如固相方法(solidphasemethod)(例如，可以使用可商購的肽合成儀如AppliedBiosystemsModel430A肽合成儀)，很容易完成表位序列或者序列中包括抗原表位的肽的合成工作。隨後可以將用此方式合成出來的肽抗原按預定量進行等份分裝，並以常規方式儲存，如以水溶液儲存，甚或更優選以粉末或以低壓凍幹狀態儲存直到使用時為止。一般而言，考慮到肽的相對穩定性，可以將它們在水溶液中儲存上相當長的時間，如，在實際任何水溶液中儲存6個月或更長時間並不會有什麼降解或抗原活性有所喪失。然而，當需要更長時間在水中儲存時，包括試劑如包括緩衝液如Tris緩衝液或磷酸緩衝液以保持約pH7.0～7.5將為可取。此外，可取的是包括能抑制微生物生長的試劑，如疊氮化鈉或硫柳汞。為長時間以水的狀態儲存，可取的是大約4℃儲存溶液或更優選冷凍。當然，當肽以低壓凍幹狀態或乾粉狀態儲存時，它們實際上可以無限期地儲存，例如可以以等份分裝形式儲存，使用之前可以用預定量的水(優選蒸餾水)或緩衝液重新水化。2.8定義下面詞語及短語有以下所列意思。表達(expression)胞內過程的組合，包括由編碼DNA分子如結構基因經過轉錄和翻譯產生多肽。多能的(pluripotent)該術語用於描述發育的可塑性(developmentalplasticity)。一個多能細胞能夠分化成許多不同細胞類型及譜系。例如，骨髓中的幹細胞能產生出許多不同循環血細胞系。這和已分化的細胞不同，分化的細胞一般歸屬於特定的分化途徑。啟動子DNA序列上的識別位點或一組DNA序列，為結構基因提供表達調控元件，RNA聚合酶特異地與之結合併起始該基因的RNA合成(轉錄)。再生從植物細胞(如植物原生質體或外植體)長成植物的過程。結構基因能表達產生多肽的基因。轉化將外源DNA序列(如載體、重組DNA分子)導入到細胞或原生質體中的過程，在細胞或原生質體中外源DNA能整合到染色體中或能夠進行自主複製(autonomousreplication)。轉化細胞由於外源DNA分子的導入細胞，DNA發生改變了後的細胞。轉基因細胞任何來自或再生自轉化細胞的細胞或者來自轉基因細胞的細胞。典型的轉基因細胞包括來自轉化植物細胞的植物愈傷組織，以及來自轉基因植物的特定細胞，如葉細胞、根細胞、莖細胞，如體細胞或生殖細胞。轉基因植物任何一代來自於轉化植物細胞或轉化原生質體的植物的植物或後代，其中植物核酸包括在原來同一品系中天然非轉基因植物中並不存在的外源選定的核酸序列區段。本領域中有時用術語「轉基因植物」和「轉化植物」作為定義其DNA中包括外源DNA分子的植物的同義詞。但是，更為科學正確的想法是，轉基因植物是指從轉基因植物細胞或轉基因原生質體或從轉化多能植物細胞等到的再生植物或愈傷組織。本發明中的轉基因植物優選包括的植物中包括編碼殺蟲多肽的至少第一種選定的多核苷酸。所選定的多核苷酸優選為至少與第一個啟動子相連的δ-內毒素編碼區(或基因)，在轉基因植物中啟動子表達編碼區產生殺蟲多肽。本發明中產生所編碼多肽的轉基因植物優選展示對靶害蟲抗性增強的表型。這些轉基因植物和它們的後代、子代以及任何一代的種子優選為抗蟲植物。載體能在寄主細胞中複製的核酸分子和/或其它核酸區段能與之進行可操作性連接能使連接上的片段進行複製。質粒、噬菌體、噬菌粒和粘粒都是典型的載體。許多實施方案中，使用載體作為媒介物將一種或多種所選定的多核苷酸導入到寄主細胞中去，以此產生「轉化」寄主細胞或「重組」寄主細胞。3.0附圖簡述圖畫是本詳述的一部分內容，並用於進一步說明本發明的某些方面。同時參考一個或多個圖畫和本文中特定實施方案的詳述部分，就能對本發明有更好的理解。圖1pEG1337的限制性酶切圖譜圖2pEG1921的限制性酶切圖譜圖3來自EG11658、EG12156和EG1215的C2培養物芽孢-晶體懸浮液的SDS-PAGE分析。用75μl無菌水稀釋25微升(μl)懸液，並為如實施例11中所述的電泳做準備。在15％丙烯醯胺凝膠上每個泳道上樣10微升。其中包括牛血清白蛋白質(BSA)的系列稀釋液作為標準物。泳道1-3，為EG11658；泳道4-6，為EG12156；泳道7-8，為EG12158。M＝分子量標準(SigmaM-0671)，單位為千道爾頓。對應於CryET76、CryET80和CryET84的條帶由箭頭標示出來。4.0實施方案的解釋說明4.1本發明的一些優點本發明提供對昆蟲如WCRW、SCRW和CPB有高度毒殺作用的新的δ-內毒素。這些蛋白質的胺基酸序列與對雙翅目或鞘翅目有毒殺作用的其它δ-內毒素的關係遙遠。在在蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白命名法(Crickmore等，1998)所建立的指導方針的基礎上，這些多肽中的其中兩個，稱為CryET76和CryET80，代表一個亞類對鞘翅目有效的殺蟲晶體蛋白。4.2害蟲幾乎所有的大田作物、植物以及商業耕作區對一種或多種害蟲的攻擊都很敏感。表1中所鑑定的鱗翅目害蟲和鞘翅目害蟲問題尤為嚴重。例如，蔬菜作物和涼菜作物如菊芋、球莖甘藍、芝麻菜、韭菜、蘆筍、扁豆、菜豆、萵苣(如頭、葉、romaine)、甜菜、bokchoy、暗綠葉黃體芋、嫩莖花椰菜、甜瓜(如香瓜、西瓜、crenshaw、甜味菸草、甜瓜)、球子甘藍、甘藍、cardoni、胡蘿蔔、蘿蔔、花椰菜、秋葵、洋蔥、芹菜、荷蘭芹、雞豆、防風草、菊苣、豌豆、中國甘藍、辣椒、羽衣甘藍、馬鈴薯、黃瓜、西葫蘆、葫蘆、小蘿蔔、幹球洋蔥、蕪菁甘藍、茄子、波羅門參、escarole、青蔥、菊萵苣、大豆、大蒜、菠菜、綠蔥、瓜類、青菜、甜菜、紅薯、蘿蔔、莙薘菜、馬蘿蔔、番茄、甘藍、蕪菁以及其它許多品種，對一種或多種下面的害蟲的侵襲是敏感的alfalfalooper、粘蟲、甜菜粘蟲、artichokeplumemoth、cabbagebudworm、粉紋夜蛾、玉米穗蟲、芹菜葉蟲、cross-stripedcabbageworm、歐洲玉米螟、diamondbackmoth、三葉草綠蟲、importedcabbageworm、melonworm、omnivorousleafroller、pickleworm、rindwormcomplex、saltmarshcaterpillar、大豆夜蛾、tobaccobudworm、tomatofruitworm、tomatohornworm、tomatopinworm、藜豆認蛾以及yellowstripedarmyworm。同樣，牧場作物和乾草作物如苜蓿、牧草和青貯飼料經常受到害蟲如粘蟲、beefarmyworm、alfalfacaterpillar、Europeanskipper、多種looper和結網毛蟲以及yellowstripedarmyworm的進攻。水果和藤類作物如蘋果、杏、櫻桃、油桃、桃子、梨、梅、李脯、杏仁、慄子、榛子、薄殼山胡桃、開心果、核桃、柑橘、黑莓、葡萄、鱷梨、香蕉、kiwi、柿子、石榴、菠蘿、熱帶水果，通常對achemaaphinxmoth、amorbia、粘蟲、citruscutworm、bananaskipper、blackheadedfireworm、bluebberryleafroller、尺蠖幼蟲、cherryfruitworm、filbertleafroller、filbertwebworm、fruittreeleafroller、grapeberrymoth、grapeleaffolder、grapeleafskeletonizer、greenfruitworm、gummosos-batrachedracommosae、gypsymoth、hickoryshuckworm、hornworms、loopers、navelorangeworm、obliquebandedleafrooler、omnivorousleafroller、omnivorouslooper、orangetortrix、orangedog、orientalfruitmoth、pandemisleafroller、peachtwigborer、pecannutcasebearer、redbandedleafroller、紅疣天社蛾、roughskinnedcutworm、鹽沼毛蟲、尺蠖、帳篷毛蟲、thecla-theclabaillides、菸草蚜蟲、tortrixmoth、tuftedapplebudworm、variegatedleafrooler、胡桃木毛蟲、westerntentcaterpillar以及yellowstrippedarmyworm的進攻和脫葉是敏感的。大田作物如油菜籽、月見草、meadowfoam、玉米(大田裡的、甜的、爆米花)、棉花、蛇麻草、jojoba、花生、水稻、紅花、穀物(大麥、燕麥、黑麥、小麥等)、高粱、大豆、向日葵以及菸草通常是昆蟲包括粘蟲、亞洲玉米螟和其它玉米螟、bandedsunflowermoth、甜菜粘蟲、棉鈴蟲、cabbagelooper、玉米根蟲(包括南方變種和西方變種)、cottonleafperforator、diamondbackmoth、歐洲玉米螟、greenclverworm、headmoth、headworm、importedcabbageworm、loopers(包括Anacamptodesspp.)、obilquebandedleafrooler、omnivorousleaftier、podworm、saltmarshcaterpillar、南方玉米螟、soybeanlooper、spottedcutworm、向日葵蛾、tobaccobudworm、菸草天蛾幼蟲、藜豆認蛾等侵襲的目標。寢具植物(beddingplant)、花、修飾性植物、蔬菜和容器原種經常被害蟲寄主如粘蟲、杜鵑花蛾、beetarmyworm、diamondbackmoth、ellomoth(hornworm)、佛羅裡達蕨毛蟲、Iomoth、loopers、夾竹桃蛾、omnivorousleafroller、omnivorouslooper和菸草蚜蟲等食用。森林、水果、修飾性樹木及結實樹木，以及其它苗木通常對多種昆蟲如避債蟲、blackheadedbudworm、browntailmoth、加裡弗尼亞橡樹蟲、douglasfirtussockmoth、elmspanworm、fallwebworm、fruittreeleafroller、greenstrippedmapleworm、gypsymoth、jackpinebudworm、mimosawebworm、pinebutterfly、紅疣天社蛾、saddlebackcaterpillar、saddleprominentcaterpillar、springandfallcankerworm、雲松蚜蟲、tentcaterpillar、捲葉蛾及westerntussockmoth的攻擊敏感。同樣，草坪草經常受到害蟲如粘蟲、sodwebworm及tropicalsodwebworm的攻擊。表1原鞘亞目和多食亞目鞘翅目害蟲的分類下目總科科亞科族屬種CupedidaePriacmaP.serrata(reticulatedbeetles)皮蠹科毛皮蠹屬二星毛皮蠹BostrichiformiaDermestidae(skinAttagenusA.pellloandlarderbeetles)天牛科(長角甲蟲)ChrysomeliformiaCerambycidae(long-AgapanthiaAgapanthiasp.hornedbeetles)花天牛亞科LepturinaeLepturaLepturasp.(flowerlong-hornedbeetle)RhagiumRhagiumsp.縊虎天牛屬刺槐天牛MegacylleneM.robiniae鋸天牛亞科PrioninaeDerobrachusD.geminatusTetraopesT.tropthalmus葉甲科Chrysomelidae(leafChlamisinaeExemaE.neglectabeetles)葉甲科ChrysomelinaeChrysomeliniChrysomelaC.tremula，Chrysomelasp.下目總科科亞科族屬種OreinaO.cacaliaeDoryphoriniChrysolineChrysolinasp.LeptinotarsaL.decemlineata(Cotoradopotatobeetle)GoniocteniniGonioctenaG.fornicata，G.holdausi，G.intermedia，G.interposita.Gkamikawai，G.linnaeana，G.nigroplagiata，G.occidentalis，G.olivacea，G.pallida，G.quin-quepunctata，G.rubripennis，G.rufipes，G.tredecim-maculata，G.variabilis，G.viminalisTimarchiniTimarchaTimarchasp.CriocerinaeOulemaOulemasp.GalerucinaeGaleruciniMonoxiaM.inornata，Monoxiasp.OphraellaO.arctica，O.artemisiae，O.bilineata，O.communa，O.conferta，O.cribrata，O.notata，O.notulata，O.nuda，O.pilosa，O.sexvittata，O.slobodkiniLuperiniCerotomaC.trifurcata下目總科科亞科族屬種DiabroticaD.barberi(northerncornrootworm)，D.undecimpunctata，(southemcornrootworm)，D.virgifera(westerncornrootworm)未分類LachnaiaLachnaiasp.ChrysomelidaeEpitrixE.cucumeris(Harris)(potatofleabeetle)，E.fuscala(eggplantfleabeetle)象蟲科象蟲亞科花象屬墨西哥棉玲象CurculionidaeCurculioninaeAnthonomusA.grandis(bollweevil)(weevils)EntiminaeNaupactiniAramigusA.conirostris，A.globoculus，A.intermedius，A.planioculus，A.tesselatusOtiorhynchusOtiorhynchussp.PhyllobiiniDiaprepesD.abbreviataPhyllobiusPhyllobiussp.GalapaganusG.galapagoensis下目總科科亞科族屬種葉象屬HyperinaeHyperaH.brunneipennis(Egyptianalfalfaweevil)，H.postica(alfalfaweevil)，H.punctata(cloverleafweevil)木蠹象屬MolytinaePissodesP.affinis，P.nemorensis，P.schwarzi，P.strobi，P.terminalis未象屬RhynchophorinaeSitophiliniSitophilusS.granarius(granaryweevil)，S.zeamais(maizeweevil)NemonychidaeLebanorhinusL.succinusScolytidaeIpsI.acuminatus，I.amitinus，I.cembrae，I.duplicatus，I.mannsfeldi，I.sexdentatus，I.typographus瘤小蠹屬OrthotomicusO.erosusTomicusT.minorCucujiformiaCoccinellidaeEpilachnaE.borealis(squashladybird(ladybirdbeetles)beetle)，E.varivstis(Mexicanbeanbeetle)扁谷盜屬Cucujidae(flatbarkCryptolestesC.ferrugineusbeetles)下目總科科亞科族屬種OryzaephilusO.surinamensis(saw-toothed(grainbeetles)grainbeetle)Lagriidae(long-LagriaLagriasp.joinedbeetles)豆芫菁屬Meloidae(blisterEpicautaE.funebrisbeetles)MeloeM.proscarabaeusRhipiphoridaeRhipiphorusR.fasciatus粉蟲屬TenebrionidaeAlphitobiusA.diaperinus(darklinggroundbeetles)(lessermealworm)HegeterH.amaroides，H.brevicollis，H.costipennis，H.fernandezi，H.glaber，H.gomerensis，H.gran-canariensis，H.impressus，H.intercedens，H.lateralis，H.plicifrons，H.politus，H.subrotundatus，H.tenui-punctatus，H.transversus，H.webbianusMisolampusM.goudoti下目總科科亞科族屬種PalorusP.ficicola，P.ratzeburgi粉盜屬(small-eyedflourbeetle)，P.subdepressus(depressedflourbeetle)PimeliaP.baetica，P.canariensis，P.criba，P.elevata，P.estevezi.P.fernan-dezlopezi，P.grandis，P.granulicollis，P.integra，P.interjecta，P.laevigata，P.lutaria，P.radula，P.sparsa，P.variolosa粉蟲屬TenebrioT.molitor(yellowmealworm)，T.obscurus(darkmealworm)TentyriaT.schaumi擬谷盜屬TriboliumT.brevicornis，T.castaneum(redflourbeetle)，T.confusum(confusedflourbeetle)，T.freemani，T.madensZophobasZ.atratusZ.rugipesElateriformiaElateroiOctinodesOctinodessp.dea下目總科科亞科族屬種PyrophorusP.plagio-phthalamusScarabaeiformiaLucanidae(StagDorcusD.parallelo-pipedusbeetles)LucanusL.cervus獨角仙屬獨角仙ScarabaeidaeAllomyrinaA.dichotoma(lamellicornbeetles)Cetoniinae(flowerPachnodaP.marginatabeetle)DynastinaeXyloryctesX.faunusGeotrupinaeGeotrupesG.stercorosus(earth-boringdungbeetles)MelonlonthinaeCostelytraC.ealandica(chafers)HolotrichiaH.diomphalia鰓金龜屬五月金龜子MelolonthaM.melolontha(cockchafer)OdontriaO.striataO.variegata下目總科科亞科族屬種ProdontriaP.bicolorata，P.capito.P.lewisi，P.tarsis，P.modesta，P.pinguis，P.praelatella，P.truncata，Prodontriasp.ScythrodesS.squalidusRutelinae(shiningPopilliaP.japonica(Japanesebeetle)leafchafers)ScarabaeinaeCoprisC.lunaris(blackdungbeetle)ScarabaeusScarabaeussp.(scarab)StaphyliniformiaHydrophilidaeCercyonCercyonsp.SilphidaeNicrophorusN.americanus，N.marginatus，N.orbicollis，N.tomentosusStaphylinidae(roveCarpelimusCarpelimussp.beetles)QuediusQ.mesomelinusTachyporusTachyporussp.XantholinusXantholinussp.4.3蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素的命名方法表2包含的是已知δ-內毒素的傳統命名法和目前認定命名法的一覽表。表中同時給出已測序多肽和多核苷酸的GenBank登錄號。表2已知蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素的命名A現在過去GenBank登錄號Cry1Aa1CryIA(a)M11250Cry1Aa2CryIA(a)M10917Cry1Aa3CryIA(a)D00348Cry1Aa4CryIA(a)X13535Cry1Aa5CryIA(a)D175182Cry1Aa6CryIA(a)U43605Cry1Aa7AF081790Cry1Aa8I26149Cry1Aa9AB026261Cry1Ab1CryIA(b)M13898Cry1Ab2CryIA(b)M12661Cry1Ab3CryIA(b)M15271Cry1Ab4CryIA(b)D00117Cry1Ab5CryIA(b)X04698Cry1Ab6CryIA(b)M37263Cry1Ab7CryIA(b)X13233Cry1Ab8CryIA(b)M16463Cry1Ab9CryIA(b)X54939Cry1Ab10CryIA(b)A29125Cry1Ab11I12419Cry1Ab12AF057670Cy1Ac1CryIA(c)M11068現在過去GenBank登錄號Cry1Ac2CryIA(c)M35524Cry1Ac3CryIA(c)X54159Cry1Ac4CryIA(c)M73249Cry1Ac5CryIA(c)M73248Cry1Ac6CryIA(c)U43606Cry1Ac7CryIA(c)U87793Cry1Ac8CryIA(c)U87397Cry1Ac9CryIA(c)U89872Cry1Ac10CryIA(c)AJ002514Cry1Ac11AJ130970Cry1Ac12I12418Cry1Ad1CryIA(d)M73250Cry1Ad2A27531Cry1Ae1CryIA(e)M65252Cry1Af1U82003Cry1Ag1AF081248Cry1Ba1CryIBX06711Cry1Ba2X95704Cry1Bb1ET5L32020Cry1Bc1CryIb(c)Z46442Cry1Bd1CryE1U70726Cry1Ca1CryICX07518Cry1Ca2CryICX13620Cry1Ca3CryICM73251Cry1Ca4CryICA27642Cry1Ca5CryICX96682Cry1Ca6CryICX96683Cry1Ca7CryICX96684現在過去GenBank登錄號Cry1Cb1CryIC(b)M97880Cry1Da1CryIDX54160Cry1Da2I76415Cry1Db1PrtBZ22511Cry1Ea1CryIEX53985Cry1Ea2CryIEX56144Cry1Ea3CryIEM73252Cry1Ea4U94323Cry1Ea5A15535Cry1Eb1CryIE(b)M73253Cry1Fa1CryIFM63897Cry1Fa2CryIFM63897Cry1Fb1PrtDZ22512Cry1Fb2Z22512Cry1Fb3AF062350Cry1Fb4I73895Cry1Ga1PrtAZ22510Cry1Ga2CryIMY09326Cry1Gb1CryH2U70725Cry1Ha1PrtCZ22513Cry1Hb1U35780Cry1Ia1CryVX62821Cry1Ia2CryVM98544Cry1Ia3CryVL36338Cry1Ia4CryVL49391Cry1Ia5CryVY08920Cry1Ia6AF076953Cry1Ib1CryVU07642現在過去GenBank登錄號Cry1Ic1AF056933Cry1Ja1ET4L32019Cry1Jb1ET1U31527Cry1Jc1AF056933Cry1Ka1U28801Cry2Aa1CryIIAM31738Cry2Aa2CryIIAM23723Cry2Aa3D86084Cry2Aa4AF047038Cry2Aa5AJ132464Cry2Aa6AJ1324635Cry2Aa7AJ132463Cry2Ab1CryIIBM23724Cry2Ab2CryIIBX55416Cry2Ac1CryIICX57252Cry3Aa1CryIIIAM22472Cry3Aa2CryIIIAJ02978Cry3Aa3CryIIIAY00420Cry3Aa4CryIIIAM30503Cry3Aa5CryIIIAM37207Cry3Aa6CryIIIAU10985Cry3Aa7AJ237900Cry3Ba1CryIIIBX17123Cry3Ba2CryIIIBA07234Cry3Bb1CryIIIB2M89794Cry3Bb2CryIIIC(b)U31633Cry3Bb3I15475Cry3Ca1CryIIIDX59797現在過去GenBank登錄號Cry4Aa1CryIVAY00423Cry4Aa2CryIVAD00248Cry4Ba1CryIVBX07423Cry4Ba2CryIVBX07082Cry4Ba3CryIVBM20242Cry4Ba4CryIVBD00247Cry5Aa1CryVA(a)L07025Cry5Ab1CryVA(b)L07026Cry5Ac1I34543Cry5Ba1PS86Q3U19725Cry6Aa1CryVIAL07022Cry6Ba1CryVIBL07024Cry7Aa1CryIIICM64478Cry7Ab1CryIIICbU04367Cry7Ab2U04368Cry8Aa1CryIIIEU04364Cry8Ba1U04365Cry8CalU04366Cry8Ba1CryIIIGU04365Cry8Ca1CryIIFU04366Cry9Aa1CryIGX58120Cry9Aa2CryIGX58534Cry9Ba1CryIXX75019Cry9Ca1CryIHZ37527Cry9Da1N141D85560Cry9Da2AF042733Cry9Ea1Cry10Aa1CryIVCM12662現在過去GenBank登錄號Cry10Aa2E00614Cry11Aa1CryIVDM31737Cry11Aa2CryIVDM22860Cry11Ba1Jeg80X86902Cry11Bb1AF017416Cry12Aa1CryVBL07027Cry13Aa1CryVCL07023Cry14AalCryVDU13955Cry15Aal34kDaM76442Cry16Aa1cbm71X94146Cry17Aa1cbm71X99478Cry18Aa1CryBP1X99049Cry19AalJeg65Y08920Cry20Aa1U82518Cry21Aa1I32932Cry22Aa1I34547Cry23Aa1AF03048Cry24Aa1U88188Cry25Aa1U88189Cry26Aa1AF122897Cry27Aa1AB023293Cry28Aa1AF132928Cyt1Aa1CyryX03182Cyt1Aa2CytAX04338Cyt1Aa3CyryY00135Cyt1Aa4CytAM35968Cyt1Ab1CytMX98793Cyt1Ba1U37196現在過去GenBank登錄號Cyt2Aa1CytBZ14147Cyt2Ba1「CytB」U52043Cyt2Ba2「CytB」AF020789Cyt2Ba3「CytB」AF022884Cyt2Ba4「CytB」AF022885Cyt2Ba5「CytB」AF022886Cyt2Ba6AF034926Cyt2Bb1U82519Cyt2Bb1U82519a摘自http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/toxins.html(1999年4月27日的)4.4探針和模板另一方面，本發明所提供的DNA序列信息考慮到相當短的DNA(或RNA)序列的製備方法，這些序列能與本文所公開的選擇序列的基因序列特異雜交。在這些方面，適當長度的核酸探針是在考慮所選編碼晶體蛋白的基因序列如本文所公開的某一序列的基礎上製備的。這些DNA和核酸探針能夠與編碼晶體蛋白的基因序列特異雜交，使得它們在多個實施方案中有特定的應用。最為重要的是，這些探針可以用在用於檢測指定樣品中是否存在互補序列的多種分析方法當中。在某些實施方案中使用寡核苷酸引物是有利的。用本發明中的多核苷酸涉及這些引物序列，使用PCRTM技術從蘇雲金芽孢桿菌中檢測、擴增或突變晶體蛋白基因的已知區段。使用這些引物通過PCRTM也可以擴增出其它種中相關晶體蛋白基因的區段。提供與本發明一致的某些優點，用於雜交研究或鑑定的優選核酸序列中包括那些與至少大約23到大約40個核苷酸長度的晶體編碼序列互補的序列，如本文所示。大小至少大約為14個或15個核苷酸長度的序列可以確保是能形成既穩定又有選擇性的雙鏈分子的足夠長度的片段。雖然有時為了增強雜交體的穩定性和選擇性需要提高所得雜交分子的質量和程度，但是互補序列長度大於約23個鹼基的分子通常優選。我們通常喜歡設計基因互補片段大約為14個到大約20個核苷酸的核酸分子，有時需要的互補片段更長。可以輕而易舉地製備出這些片段，例如可以通過化學方式應用核酸擴增技術如美國專利4683195和4683202(在此特別引入作為參考)中的PCRTM技術直接合成，或者可以從包含合適插入片段和合適限制位點的重組質粒中將所選DNA片段切除下來。4.5表達載體本發明涉及包括在一個或多個表達載體中本發明中的多核苷酸。因此，在一個實施方案中表達載體包括的核酸區段包括與表達該基因的啟動子可操作性連接的晶體蛋白編碼基因。此外，編碼區也可能與轉錄終止區(transcription-terminatingregion)可操作性地相連接，由此啟動子驅動編碼區的轉錄而轉錄終止區在編碼區的某一3』點處終止轉錄。本文所用術語「可操作性連接」意思是，啟動子與編碼區以這樣一種方式向連，編碼區的轉錄受到啟動子的控制和調節。在本領域中將啟動子與編碼區進行可操作性連接的方法是熟知的。在優選實施方案中，編碼本發明中晶體蛋白的DNA的重組表達較適合在芽孢桿菌(Bacillis)寄主細胞中進行。優選的寄主細胞包括蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、B.megaterium、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)及相關桿菌，其中蘇雲金芽孢桿菌高度優選。在細菌中有功能的啟動子在本領域中是眾所周知的。來自芽孢桿菌的晶體蛋白的典型並優選的啟動子包括任何已知晶體蛋白基因的啟動子，包括cry基因的啟動子。此外，可以通過人工方法改造出誘變處理啟動子或重組啟動子，用於啟動本文所公開的新基因區段的表達。在某一實施方案中，用轉化的革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌(E.coli)寄主細胞或假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)寄主細胞重組表達編碼本發明晶體蛋白的DNA。在大腸桿菌寄主細胞或其它革蘭氏陰性寄主細胞中能行使功能高水平表達目標蛋白質的啟動子在本領域中是眾所周知的。在用本發明中的表達載體轉化植物時，選擇能在植物中驅動表達的啟動子。植物中有功能的啟動子在本領域中使眾所周知的。在植物中表達多肽的啟動子中有用的是所述可誘導的、病毒的、組成型的啟動子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)，以及受溫度調節的、受空間調節的和受時空調節的啟動子(Chau等，1989)。選擇啟動子是因為它能夠給編碼區指導轉化的植物細胞或轉基因植物的轉錄活性。在植物組織中結構基因可以由多種啟動子驅動。啟動子可以是近組成型的(near-constitutive)如CaMV35S啟動子，或者是影響雙子葉植物或單子葉植物的組織特異性啟動子(tissue-specificpromoter)或發育特異性啟動子(developmentallyspecificpromoter)。談到近組成型的啟動子如CaMV35S時，在多種轉化植物組織(如，愈傷組織、葉片、種子和根)中發現其增強了多肽的表達。此外，通過使用包含組織特異性啟動子的植物整合載體，可以將轉化效果指向特定的植物組織。典型的組織特異性啟動子是凝集素啟動子，為種子組織特異性的。大豆種子中凝集素蛋白質由單基因(Le1)編碼，該基因只有在種子成熟過程中表達，佔種子總mRNA的大約2％到大約5％。凝集素基因和種子特異性啟動子的特性都已完全分析清楚，在轉基因菸草植物中用它們指導了種子特異性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。將包含編碼感興趣多肽的編碼區的表達載體改造後使之位於凝集素啟動子控制之下，用例如原生質體轉化方法(protoplasttransformationmethod)(Dhir等，1991a)將該載體導入到植物中。在轉基因植物的種子中特異指導多肽的表達。將從用組織特異性啟動子轉化的植物細胞產生出的本發明中的轉基因植物，與從用不同組織特異性啟動子轉化的植物細胞發育出的第二種轉基因植物雜交，產生出的轉基因植物顯示出在多於一種特定組織中有表達結果。典型的組織特異性啟動子為玉米蔗糖合成酶1啟動子(Yang等，1990)、玉米乙醇脫氫酶1啟動子(Vogel等，1989)、玉米集光複合體啟動子(Simpson等，1986)、玉米熱激蛋白質啟動子(Odell等，1985)、豌豆小亞基RuBP羧化酶啟動子(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)、Ti質粒甘露氨酸合酶啟動子(Langridge等，1989)、Ti質粒胭脂鹼合酶啟動子(Langridge等，1989)、矮牽牛查爾酮異構酶啟動子(VanTunen等，1988)、菜豆富甘氨酸蛋白質1啟動子(Keller等，1989)、CaMV35S轉錄本啟動子(Odell等，1985)以及馬鈴薯patatin的啟動子(Wenzler等，1989)。優選的啟動子為花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子以及S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。選擇哪一個表達載體以及最終選擇哪一個啟動子與多肽編碼區進行可操作性連接直接取決於所想要的功能特性如蛋白質表達的定位和定時以及所要轉化的寄主細胞。這些在構建重組DNA分子領域中均是熟知的固有限制因素。然而，在實踐本發明中有用的載體能夠指導與之進行可操作性連接的多肽編碼區的表達。在高等植物中進行基因表達時有用的典型載體在本領域中是熟知的，包括來自於所述根癌農桿菌根癌誘導(Ti)質粒的載體(Rogers等，1987)。但是，已知其它幾個植物整合載體能在植物中行使功能包括所述的pCaMVCN轉移控制載體(Fromm等，1985)。PCaMVCN(可以從Pharmacia，Piscataway，NJ得到)包括花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子。在優選實施方案中，用於表達多肽的載體包括在植物細胞中有效的選擇標記，優選為抗藥性選擇標記(drugresistanceselectionmarker)。其中一個優選的抗藥性標記是其基因的表達能產生卡那黴素抗性的基因，即包括所述胭脂鹼合酶啟動子、Tn5新黴素磷酸轉移酶II(nptII)以及胭脂鹼合酶3』端非翻譯區(Rogers等，1988)在內的嵌合基因。RNA聚合酶轉錄編碼DNA序列將通過存在聚腺苷酸化的位點。通常情況下，位於聚腺苷酸化位點下遊幾百鹼基對處的DNA序列負責終止轉錄。這些DNA序列在本文中指的是轉錄終止區。轉錄出的信使RNA(mRNA)進行高效的聚腺苷酸化需要這些區段。在本領域中表達載體的製備方法是眾所周知的。在美國專利號4971908、4940835、4769061和4757011中對用於轉化植物的表達(轉化載體)以及這些載體的製作方法進行了描述，這些專利的公開內容在此特別引入作為參考。將這些載體進行修飾後可以包括與本發明一致的編碼區。已經發展出種種方法可以通過互補粘性末端或平頭末端將DNA區段可操作性地插入到載體中。例如，可以將互補同聚物序列加入到將要插入的DNA區段中以及載體DNA中。隨後通過同聚核苷酸尾之間的氫鍵將載體區段和DNA區段結合在一起，形成重組DNA分子。編碼有能力賦予細胞抗蟲活性的多肽的編碼區優選為蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白編碼基因。在優選的實施方案中，此多肽有本文所公開序列之一的胺基酸殘基序列或者為其功能相當體。與這些實施方案一致，包括這樣序列的DNA序列的編碼區同樣優選。4.8新蛋白質的命名方法發明者給本發明中的新的蛋白質隨意指派了名稱。同樣，也給編碼這些多肽的新的核酸序列指派了任意的基因名稱。在晶體蛋白內毒素修正後的命名基礎上將由蘇雲金芽孢桿菌命名委員會給基因和蛋白質名稱指派正式名稱，以便對蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白進行系統分類。發明者認為，本發明中任意指派的名稱將由指派給這些序列的正式命名所取代。4.9轉化寄主細胞和轉基因植物用一種或多種包括晶體蛋白編碼基因的表達載體轉化細菌、酵母細胞、植物細胞或完整植物的方法和組成，也是本公開內容的方面。由這些轉化過程所得的轉基因細菌、轉基因酵母細胞、轉基因植物細胞以及轉基因植物或來自這樣的轉基因植物的後代和種子，也是本發明的實施方案。在本領域中，轉化細菌細胞和酵母細胞的方法是眾所周知的。轉化方法一般與用於轉化其它細菌或酵母如大腸桿菌(E.coli)或Saccharomycescerevisiae的已知方法相類似。用DNA轉化植物細胞的方法包括農桿菌介導的植物轉化方法(Agrobacterium-mediatedplanttransformation)、原生質體轉化方法(protoplasttransformation)、基因向花粉中的轉移(genetransferintopollen)、基因向生殖器官中的注射(injectionintoreproductiveorgans)、基因向未成熟胚中的注射(injectionintoimmatureembryos)以及粒子轟擊(particlebombardment)。這些方法中的每一種方法各有優缺點。因此，向某一特定植物品系中導入基因的特定方法對於另一種植物品系來說並不是最為有效的，但是我們已經指導對於某一特定植物品系那些方法是有用的。將轉化的DNA區段導入細胞中有許多方法，但並不是所用方法都適合於向植物細胞中送遞DNA。我們認為合適的方法實際上包括可以將DNA導入到細胞中的任何方法，如通過農桿菌侵染，DNA的直接送遞如，例如通過PEG介導的原生質體轉化(Omirulleh等，1993)、通過脫水/抑制介導的DNA吸收法、通過電穿孔、通過siliconcarbidefiber的攪拌、通過包被了DNA的顆粒的加速作用等。在某些實施方案中，加速方法是優選的，包括如微粒轟擊(microprojectilebombardment)等。將DNA導入到細胞中的技術對於本領域中的熟練技術人員來說是眾所周知的。四種將基因送遞到細胞中的一般方法已經作過描述(1)化學方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5384253)以及基因槍(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；Eglitis等，1988)；(4)受體介導的機制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。4.9.1電穿孔(electroporation)給多種動物細胞和植物細胞使用瞬間高壓電脈衝，在質膜上形成納米大小的孔洞。DNA通過這些孔洞直接進入細胞胞質中或者是因為伴隨著孔洞的關閉膜組分進行了重分配DNA直接進入了細胞胞質中。電穿孔的效率非常高，既可用於克隆基因的瞬時表達，又可用於攜帶所感興趣基因插入拷貝的細胞系的建立。電穿孔與磷酸鈣介導的轉染(calciumphosphate-mediatedtransfection)及原生質體融合(protoplastfusion)相反，經常產生攜帶一個或最多數個外源DNA插入拷貝的細胞系。用電穿孔導入DNA的方法對於本領域中的熟練技術人員來說是眾所周知的。在該方法中，使用某些降解細胞壁的酶(cellwall-degradingenzyme)如降解果膠的酶可以使目標受體細胞比未處理細胞對電穿孔轉化更敏感。此外，通過機械創傷(mechanicalwounding)可以使受體細胞對轉化更為敏感。為了實現電穿孔轉化，我們要麼可以使用易碎組織如細胞懸浮培養物或胚性愈傷組織(embryogeniccallus)，要麼也可以直接轉化未成熟胚或其它活體組織。我們可以通過將所選細胞暴露在降解果膠的酶中(果膠酶)或以調控方式對之機械創傷，從而使所選細胞的細胞壁部分降解。這些細胞隨後將作為用電穿孔進行DNA轉移的受體，在該階段可以進行電穿孔DNA轉移，然後用適當的選擇程序或篩選程序對轉化後的細胞進行鑑定，選擇何種程序取決於最新摻入DNA的特性。4.9.2微粒轟擊(microprojectilebombardment)將轉化DNA區段送遞到植物細胞中去的另一種有利方法是微粒轟擊。在該方法中，顆粒可以用核酸包裹，通過推進力將其送遞到細胞中。典型的顆粒包括由鎢、金、鉑等組成的顆粒。除了作為能重複穩定轉化單子葉植物的有效方法之外，微粒轟擊的另一個優點是，既不需要分離原生質體(Cristou等，1988)也不需要農桿菌侵染的敏感性。用加速作用將DNA送遞到玉米細胞中的方法的說明性實施方案為BiolisticsParticleDeliverySystem，使用此系統可以推進用DNA或細胞包被的顆粒通過阻攔網如不鏽鋼阻攔網或Nytex阻攔網到達覆蓋有懸浮液中培養的玉米細胞的濾紙表面。阻攔網能使顆粒分散，以使顆粒不會以聚集物形式送遞到受體細胞。我們認為，位於發射裝置和要轟擊的細胞之間的阻攔網能減小微粒聚集物的大小，並能通過降低太大的微粒對受體細胞造成損傷有助於更為高效的轉化。對轟擊來說，懸浮液中的細胞優選濃縮到濾紙上或固體培養基上。此外，可以將未成熟胚或其它靶細胞排列在固體培養基上。將要轟擊的細胞放置在顆粒阻擋盤之下適當距離處。願意的話，也可以將一個或多個阻攔網放置在加速裝置和要轟擊的細胞之間。通過使用本文所列技術我們可以獲得最多1000或更多個表達標記基因的轉化細胞。每轟擊一次，轟擊48小時之後表達外源基因產物的細胞數目通常從1個變化到10個，平均1個到3個。在轟擊轉化中，我們可以優化轟擊前的培養條件和轟擊參數，就能產生出最大數量的穩定轉化體。在該技術中，轟擊的物理參數和生物參數都很重要。物理因素為涉及操作DNA/微粒沉澱的因素，或者影響大顆粒或微粒飛行和速度的因素。生物因素包括所有轟擊前和轟擊隨後涉及的細胞操作，為幫助減輕伴隨轟擊產生出的創傷而對靶細胞進行的滲透調節，以及所轉化DNA的特性如線形化DNA或完整的超螺旋質粒。我們認為，轟擊前的操作過程對於幼胚的成功轉化尤其重要。因此，我們認為，我們可以在小量研究中調整各種轟擊參數以便使條件完全優化。我們可能特別希望調整物理參數如間距(gapdistanceO、飛行距離(flightdistance)、組織距離(tissuedistance)以及氦氣壓力(heliumpressure)。我們可以通過對影響受體細胞生理狀態並因此影響轉化效率和整合效率的條件進行修飾，以便也將使創傷減小因子(traumareductionfactors，TRFs)降低到最小。例如，可以調整受體細胞的滲透狀態、組織水合以及繼代培養狀態或細胞周期到最適合轉化的狀態。就本公開內容來看，其它常規調整的完成對於本領域中的熟練技術人員來說是熟知的。4.9.3農桿菌介導的轉移(Agrobacterium-mediatedtransfer)對於將基因導入植物細胞來說，農桿菌介導的轉移為廣泛應用的系統，這是因為，DNA可以導入到完整的植物組織中，因此避免了從原生質體再生完整植物的需要。本領域中對於使用農桿菌介導的植物整合載體將DNA導入到植物細胞中是眾所周知的。參照，如所述方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是了解相對清楚的過程，很少產生重排(rearrangement)。要轉移的DNA區由邊界序列(bordersequences)定義，間插DNA(interveningDNA)通常插入到植物基因組中(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。現在的農桿菌轉化載體能在大腸桿菌中複製也能在農桿菌中複製，便於操作(Klee等，1985)。此外，在農桿菌介導的基因轉移有關載體方面的新的技術進展，增加了載體中基因和限制位點的排列，使得能表達各種多肽編碼基因的載體易於構建。所述載體(Rogers等，1987)中在啟動子和聚腺苷酸化位點兩側有方便的多接頭區，可以直接表達所插入的多肽編碼基因，適合本目的。另外，包含帶甲Ti基因(armedTigene)以及卸甲Ti基因(disarmedTigeng)的農桿菌均可以用於轉化。對於農桿菌介導的轉化有效的植物品系來說，選擇該方法是因為改基因轉移容易操作和容易獲得的特性。農桿菌介導的葉盤轉化以及其它組織如子葉(cotyledon)和下胚軸(hypocotyl)的轉化似乎局限於農桿菌天然侵染的植物。農桿菌介導的轉化在雙子葉植物中非常有效。只有個別單子葉植物似乎是農桿菌的天然寄主，雖然用農桿菌載體在蘆筍中產生出轉基因植物(Bytebier等，1987)。因此，有商業價值的重要穀物如水稻、玉米以及小麥通常需要用其它方法轉化。然而，正如上文所提及的，也可以用農桿菌完成蘆筍的轉化(參考，如Bytebier等，1987)。用農桿菌轉化方法所得的轉基因植物一般在其中一條染色體上包含單個基因。轉基因植物對所加基因來說可以是雜合的。但是，由於「雜合」一詞通常含義是在一對染色體的第二條染色體的同一基因座上存在互補基因且包含這樣一個附加基因的植物中沒有此基因，所以一般認為對於這樣植物更為精確的名字是獨立分離子，因為附加的外源基因在有絲分裂和減數分裂過程中獨立分離。更為優選的是對於附加結構基因來說純合的轉基因植物，也就是在轉基因植物中包含2個附加基因，在染色體對兒的每條染色體的同一基因座上各有一個基因。獲得純合轉基因植物的方法可以是將包含單個附加基因的獨立分離子轉基因植物(independentsegreganttransgenicplant)進行有性交配(自交)，使產生出的一些種子萌發，並分析所得植物相對於對照(天然的、非轉基因的)植物或獨立分離子轉基因植物羧化酶活性的增強情況。我們知道，也可以將兩種不同的轉基因植物交配，產生出包含兩個對立分離的附加外源基因的後代。合適的後代自交後能產生出對於編碼感興趣多肽的兩個附加外源基因均純合的植物。同時可以考慮與親本植物回交以及與非轉基因植物遠源雜交(out-crossing)。4.9.4其它轉化方法使用磷酸鈣沉澱(calciumphosphateprecipitation)、聚乙二醇處理(polyethyleneglycoltreatment)、電穿孔(electroporation)以及這些處理方法一起處理(參照，如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)的基礎上的方法可以完成植物原生質體的轉化。將這些系統應用到不同植物品系中，取決於從原生質體再生特定植物品系的能力。有人對從原生質體再生殼類植物的典型方法進行了描述(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。對於不能從原生質體成功再生的植物品系，可以使用將DNA導入完整細胞或組織的其它方法轉化這些植物。例如，可以象所述那樣(Vasil，1988)從未成熟胚或外植體再生出穀類作物。此外，可以使用「基因槍」(particlegun)或高速微粒技術(high-velocitymicroprojectiletechnology)(Vasil等，1992)。使用後一種技術時，正如所述那樣(Klein等，1987；Klein等，1988；McCabe等，1988)，在微小金屬顆粒表面上的DNA通過細胞壁進入細胞質。金屬顆粒可以穿過數層細胞，所以可以轉化組織外植體中的細胞。4.9.5基因在植物中的表達儘管近年來在有關能表達細菌蛋白質如蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白的植物製備方面已經取得了很大進展，但是天然細菌基因在植物中的表達結果總是令人失望。與微生物遺傳學不同，早期的植物遺傳學家對影響外源基因在植物中進行異源表達的因素知之甚少。然而，近年來，已經發現幾種潛在因素負責不同程度地從特定編碼序列表達蛋白質。例如，科學家們現在知道，維持細胞中特定mRNA在相當水平才是真正的關鍵因素。不幸的是，導致編碼外源蛋白質的mRNA低穩定態的原因有多個。首先，全長RNA的合成可能並不以高頻率發生。這可能，例如，是由於在轉錄過程中RNA提前終止所致(prematuretermination)，或者由於轉錄過程中mRNA發生了預想不到的加工。第二，植物細胞中可能產生出全長RNA，但是隨後在核中發生加工(剪接、polyA的加入)產生出非功能性的mRNA。如果RNA非恰當地合成、終止以及聚腺苷酸化，它就不能移到胞質中進行翻錄。同樣，如果胞質中的mRNA半壽期(由一級序列或二級序列決定)降低，則將產生非充足的蛋白質產物。此外，翻譯效率對mRNA半壽期的影響，其大小難以確定。另外，每個RNA分子摺疊成特定結構或可能是結構家族，這由其序列決定。任何RNA的特定結構在胞質中的穩定性增強或降低。結構本身也可能是核中mRNA加工的決定因素。不幸的是，不可能預測或幾乎不可能確定體外或體內任一種RNA(除tRNA外)的結構。但是，有可能的是，明顯改變RNA的序列將對其摺疊結構有相當大的影響。結構本身或特定結構特徵在決定RNA的穩定性方面也有作用。為了克服在外源基因表達中的這些限制條件，研究人員已經鑑定出RNA中有可能對RNA穩定性有特定影響的特定序列以及信號。因此，在本發明中的某些實施方案中，我們想優化所公開核酸序列在植物中的表達。其中一個特定方法是，改變細菌基因，去除掉能降低轉化的植物細胞表達的序列或基序(motif)。通常將改造編碼序列優化其在植物中表達的過程稱為「植物化」DNA序列(」plantizing」aDNAsequence)。尤其麻煩的是A+T富含序列。不幸的是，因為蘇雲金芽孢桿菌的基因組富含A+T，所以天然的晶體蛋白基因序列通常必須經過修飾以便在植物中最優化表達。已經確定序列基序ATTTA(或在RNA以AUUUA形式出現)在哺乳動物細胞mRNA中為去穩定序列(destabilizingsequence)(Shaw和Kamen等，1986)。許多短暫mRNA的3』非翻譯區富含A+T，這些區段中經常有A+T序列，有時以多拷貝或多聚體形式(如，ATTTATTTA……)出現。Shaw和Kamen證明，將不穩定mRNA的3』末端移植到穩定RNA(球蛋白質或VAl)中，將明顯降低穩定RNA的半壽期。他們還證明，ATTTA五聚體對穩定信使有極強的去穩定效果(destabilizingeffect)，無論該信號位於3』末端或者位於編碼序列中它都能行使其作用。然而，ATTTA序列的數目及/或它們左右附近的序列在決定是否作為去穩定序列行使功能方面似乎也起重要作用。Shaw和Kamen證明，ATTTA三聚體比五聚體對mRNA穩定性的影響小，而二聚體或單體對穩定性沒有影響(Shaw和Kamen等，1987)。我們注意到，ATTTA多聚體如五聚體必定產生A+T富含區。研究表明該過程為胞質影響，而在核中沒有影響。其它的不穩定mRNA中ATTTA序列可能以單拷貝形式出現，但通常包含在A+T富含區中。從目前收集的動物細胞的數據來看，ATTTA似乎至少在某些左右附近中對穩定性有重要作用，但是還不可能預測哪些出現的ATTTA是去穩定元件或不可能預測能在植物中看到哪些影響。對動物細胞中mRNA降解進行的一些研究也表明，有些情況下RNA降解可能開始於對A+T富含區的核溶解攻擊(nucleolyticattack)。還不清楚裂解是否發生在ATTTA序列。也有些mRNA例子，它們的穩定性取決於表達它們的細胞類型或取決於在那一階段它們進行表達。例如，組蛋白質mRNA在DNA合成過程中是穩定的，但是當DNA合成被攪亂時它們就不穩定了。有些組蛋白質mRNA的3』末端似乎負責該效果(Pander和Marzluff，1987)。既不似乎是ATTTA介導該效果，又不清楚是什麼控制這些mRNA不同的穩定性。另一個例子是在B細胞成熟過程中B淋巴細胞中IgGmRNA的差別穩定性(Genovese和Milcarek，1988)。這些例子提供的證據都說明，mRNA穩定性可能由細胞類型或細胞周期特異因子介導。另外，還沒有將這種去穩定性與特定序列相聯繫。出於這些不確定性，我們還不能預測指定細胞中哪些RNA可能不穩定。此外，即使是ATTTA基序作用也可能不同，取決於RNA所在細胞的本質。Shaw和Kamen(1987)報導，蛋白質激酶C的激活能夠阻斷由ATTTA介導的降解。對於大多數真核生物mRNA，包括植物和動物，3』加入聚腺苷酸化鏈是常見的。當前接受的polyA附加的觀點是，新生轉錄本延伸超過成熟的3』末端。包含在轉錄本中的是聚腺苷酸化信號以及適當3』末端形成的信號。3』末端的加工涉及mRNA的裂解和成熟3』末端polyA的附加。通過在植物和動物的mRNA中polyA尾附近尋找共有序列(consensussequence)，可能鑑定出明顯參與polyA附加和3』末端裂解的共有序列。同一共有序列好像對於這兩個過程都很重要。這些序列通常是序列AATAAA的變體。在動物細胞中已經鑑定出有功能的該序列的一些變體；在植物細胞中似乎有更廣範圍的功能序列(Wickens和Stephenson，1984；Dean等，1986)。因為這些共有序列是AATAAA的變體，所以它們都是A+T富含序列。研究發現此序列在成熟mRNA中polyA尾之前15到20個bp處。動物細胞中的研究表明，該序列既參與polyA的附加又參與3』端成熟過程。該序列中的定點突變能破壞這些功能(Conway和Wickens，1988；Wickens等，1987)。然而，已經觀察到同時還需要假定的polyA信號3』端50到100個bp；也就是說，有正常的AATAAA但下遊發生取代或破壞的基因不能進行正常的聚腺苷酸化(Gil和Proudfoot，1984；Sadofsky和Alwine，1984；McDevitt等，1984)。也就是說，要進行徹底和正確的加工，僅有polyA信號本身是不夠的。我們還不知道除了polyA信號外還需要哪些特定下遊序列，或是否有具有此功能的特異序列。因此，只有通過序列分析才能鑑定出潛在的polyA信號。我們觀察到在發生正常聚腺苷酸化的天然存在的mRNA中，要麼通過改變polyA信號要麼通過改變mRNA中的其它序列可以破壞此過程，這時可以極大地影響功能性mRNA的水平。已經在數種天然存在的mRNA中觀察到此結果，且結果是基因特異性的。研究表明，在天然mRNA中，正確的聚腺苷酸化對於mRNA的積累是重要的，而破壞該過程能顯著影響mRNA水平。然而，要在正常基因中預測變化後的結果還並沒有足夠的知識。在異源基因中推測結果就更難了。雖然如此，但是可能的情況是鑑定出的假定位點是無功能的。也就是說，這些位點並不是適當的polyA位點，而是作為異常位點(aberrantsite)行使功能產生不穩定的mRNA。AATAAA是動物細胞系統中在polyA的mRNA上遊中鑑定出的最為常見的信號，但是也已經發現至少4種變體(Wickens和Stephenson，1984)。在植物中還沒有做過如此多的分析，但清楚的是，可以使用類似於AATAAA的多個序列。表3中的稱作主要或次要的植物位點僅僅是指Dean等(1986)的研究，該研究中只對三種植物基因進行了分析。將聚腺苷酸化位點稱為主要或次要位點僅僅是指在分析過的天然存在基因中它們作為功能性位點出現的頻率。就植物而言，這寫只是非常有限的數據。很難肯定地預測稱為主要或次要的位點可能或很少可能在異源基因如編碼本發明中晶體蛋白的基因中能否部分行使功能或完全行使功能。表3植物基因中的聚腺苷酸化位點PAAATAAA主要共有位點P1AAATAAT主要植物位點P2AAACCAA主要植物位點P3AATATAA＂P4AAATCAA＂P5AATACTA＂P6AATAAAA＂P7AATGAAA＂P8AAAGCAT＂P9AATTAAT＂P10AATACAT＂P11AAAAATA＂P12AATTAAA次要動物位點P13AAATTAA＂P14AAATACA＂P15ACATAAA＂本發明提供製備合成植物基因的方法，這些基因表達它們蛋白質產物的水平比野生型基因的明顯升高，在此之前通常使用這些野生型基因。另一方面，本發明也提供編碼非植物蛋白質的新合成的植物基因。正如上文所述，在植物中表達天然蘇雲金芽孢桿菌基因通常很難。蘇雲金芽孢桿菌基因編碼區本質使它們與植物基因以及在植物中表達的外源基因區別開來。尤其是蘇雲金芽孢桿菌基因非常富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)而植物基因以及在植物中表達的大多數其它細菌基因等級為45-55％A+T。由於遺傳密碼的兼併性以及對於任一胺基酸可供選擇的數目有限，發現在有些芽孢桿菌的結構編碼區中在密碼子的第三位有許多「多餘」的A+T。也就是說，有些芽孢桿菌基因中多個密碼子中第三位的核苷酸為A或T。所以，A+T含量部分決定密碼子選擇的偏愛性(codonusagebias)。此外，清楚的是，基因在其進化的生物中進化產生出最大功能。這就意味著，一種生物的基因中特定的核苷酸除編碼特定胺基酸區段外可能不再有作用，在另一種生物中可能是基因調控元件(如轉錄啟動子或終止子、polyA附加位點、內含子剪接位點或特異的mRNA降解信號)。可能令人吃驚的是這些密碼錯讀信號並不是異源基因表達的常見特徵，但這可以由許多生物中相對均一的A+T含量(50％)進行部分解釋。A+T含量加上遺傳密碼的本質使得有可能產生任何特定的寡核苷酸序列。所以，來自大腸桿菌有50％A+T含量的基因，很少有可能比來自蘇雲金芽孢桿菌的基因包含更多某一特定A+T富含區段。通常情況下，為了在植物中獲得δ-內毒基因的高水平表達，將編碼δ-內毒的結構編碼序列(「結構基因」)作如下修飾通過定點突變包括結構基因的DNA將ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信號去除掉。最為優選的是，雖然僅僅部分去除以上鑑定序列時觀察到表達水平有所增強但是基本上要將所有聚腺苷酸化信號和ATTTA序列去除掉。此外，製備編碼想要蛋白質的合成基因時，選擇密碼子避開ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信號。本發明中假定的聚腺苷酸化信號包括但並不局限於AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAG(AT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA以及CATAAA。在取代ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信號時，優選使用的密碼子是避開在植物中罕見的密碼子。掃描所選DNA序列確認那些多過四個連續腺嘌呤(A)核苷酸或胸腺嘧啶(T)核苷酸的區段。掃描A+T區段，尋找假定的聚腺苷酸化信號。雖然不存在5個或更多個連續A或T核苷酸時可排除掉許多植物聚腺苷酸化信號，但是，如果在10個核苷酸中確認出有不止一個次要聚腺苷酸化信號，那麼該區段核苷酸序列優選改變，在保持原始編碼胺基酸序列的情況下去除掉這些信號。第二步是考慮在第一步中確認的A+T富含區周圍大約15到大約30個核苷酸殘基。如果周圍區段A+T含量低於80％，就要對該區檢查有無聚腺苷酸化信號。在聚腺苷酸化信號基礎上對該區進行的變更取決於(1)聚腺苷酸化信號的數目，以及(2)主要聚腺苷酸化信號的存在。檢查延伸區植物聚腺苷酸化信號的存在。通過DNA序列的定點突變去除聚腺苷酸化信號。也要在延伸區檢查多拷貝的ATTTA序列，也要通過突變去除掉。同時優選的是，破壞包括多個連續A+T或G+C鹼基的區段，因為推測這些區段很可能由於自身的互補性而形成髮夾結構。因此，不均一鹼基對的插入將降低形成自身互補二級結構的可能性，而已知自身互補二級結構的存在在某些生物中可以抑制轉錄和/或翻譯。許多情況下，使用不包含多於5個連續A+T或G+C的序列可以將不利效果降低到最小。4.9.6以突變為目的而合成的寡核苷酸在突變中使用寡核苷酸時，值得做的是在修飾基因中不引入常見限制位點如BglII、HindIII、SacI、KpnI、EcoRI、NcoI、PstI和SalI的情況下保持正確的胺基酸序列和閱讀框。在許多克隆載體的多位點接頭中有這些限制位點。當然，同時應該避免引入新的聚腺苷酸化信號、ATTTA序列或多於5個A+T或G+C的連續區段。寡核苷酸的優選大小為大約40個到大約50個鹼基，但是有人使用過從大約18個到大約100個鹼基的片段。許多情況下，與模板DNA合成片段兩端同源最低需要大約5個到大約8個鹼基，以使引物與模板能進行適當雜交。寡核苷酸應該避免長度超過5個鹼基對的A+T或G+C。可能的話，在野生型密碼子的替換中所用的密碼子應該優選避開TA或CG雙聯體。從植物偏愛密碼子表(如下面的表4)中選擇密碼子，避免使用植物基因組中罕見的密碼子，應該儘量選擇密碼子以便將G+C含量優選調整到大約50％。表4植物優選使用的密碼子胺基酸密碼子植物使用的百分比ARGCGA7CGC11CGG5CGU25AGA29AGG23LEUCUA8CUC20CUG10CUU28UUA5UUG30SERUCA14UCC26UCG3UCU21AGC21AGU15胺基酸密碼子植物使用的百分比THRACA21ACC41ACG7ACU31PROCCA45CCC19CCG9CCU26ALAGCA23GCC32GCG3GCU41GLYGGA32GGC20GGG11GGU37ILEAUA12AUC45AUU43VALGUA9GUC20GUG28GUU43LYSAAA36AAG64ASNAAC72AAU28胺基酸密碼子植物使用的百分比GLNCAA64CAG36HISCAC65CAU35GLUGAA48GAG52ASPGAC48GAU52TYRUAC68UAU32CYSUGC78UGU22PHEUUC56UUU44METAUG100TRPUGG100推測有許多連續A+T鹼基或G+C鹼基的區段很有可能由於自身互補性(self-complementarity)而形成髮夾結構(hairpinstructure)。通過插入均一鹼基對破壞這些區段是優選的，應該降低形成自身互補二級結構如髮夾的可能性，因為已知這些結構在某些生物中可以抑制轉錄(轉錄終止子)和翻譯(衰減子)。此外，可以製備指定胺基酸序列的完全合成的基因，避開有5個或更多個連續A+T或G+C核苷酸的區段。在選擇密碼子時密碼子中應儘可能避開TA和CG雙聯體。可以按照植物優選密碼子使用表(如表4)使密碼子使用標準化，優選將G+C含量調整到大約50％。檢查所得序列，應確保有最少的植物聚腺苷酸化信號和ATTTA序列。在通常使用的克隆載體中發現的限制位點同時優選避開。然而，在整個基因中放入數個單一限制位點在分析基因表達或構建基因變體時是有用的。4.10抗蟲轉基因植物的產生方法用包含cry基因的重組區段轉化合適的寄主細胞如植物細胞，表達編碼的晶體蛋白(即對鞘翅目昆蟲有殺蟲活性的細菌晶體蛋白或多肽)即形成抗蟲植物。作為實施例，我們可以使用如粒子轟擊方法(Maddock等，1991；Vasil等，1992)用包含蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白編碼區和合適選擇性標記基因的表達載體轉化胚性植物細胞懸液如小麥細胞或玉米細胞，將包被在微粒上的DNA送遞到受體細胞中。隨後從表達殺蟲蛋白質的轉化胚性愈傷組織再生轉基因植物。也可以使用本領域中熟知的其它細胞轉化方法如農桿菌介導的DNA轉移(Fraley等，1983)形成轉基因植物。此外，通過將DNA直接轉移到花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988)、通過將DNA注射到植物生殖器官(Pena等，1987)或通過將DNA直接注射到未成熟胚細胞中隨後使乾燥的胚發生水合作用(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)，可以將DNA導入到植物中。本領域中對於從單個植物原生質體轉化體或各種轉化外植體再生、發育及培養植物是熟知的(Weissoach和Weissbach，1988)。再生過程和生長過程通常包括的步驟是轉化細胞的選擇、培養細胞經過通常的胚胎發育階段到小植株生根階段。同樣再生出轉基因胚和轉基因種子。此後將所得轉基因生根幼苗種植在合適的植物生長培養基如土壤中。通過農桿菌將編碼感興趣多肽的外源基因導入到葉片外植體中，包含該外源基因的植物的發育方法和再生方法在如所述的本領域中(Horsch等，1985)是熟知的。該方法中，在存在選擇劑的能誘導所述轉化植物品系再生出苗的培養基中培養轉化體(Fraley等，1983)。用該方法通常在2到4個月中產生出苗，隨後將這些苗轉移到包含選擇劑和能抑制細菌生長的抗生素的合適生根誘導培養基上。然後將在存在選擇劑情況下形成的小植株移栽到土壤或其它培養基中使根能夠形成。這些流程依賴於所使用的特定植物品系而有所不同，本領域中對那些變動是熟知的。正如前面所討論的一樣，再生植物優選自花授粉以提供純合轉基因植物。另外，將來自再生植物的花粉與農藝重要的優選自交繫結實植物雜交。反之，用來自那些重要品系植物的花粉給再生植物授粉。使用本領域中熟練技術人員所熟知的方法耕種本發明中包含想要的多肽的轉基因植物。本發明中的轉基因植物中編碼本文所公開多肽的編碼區(如基因)的量有所升高。優選的轉基因植物是獨立分離子(independentsegregant)，能夠將此基因及其活性傳遞給後代。更優選的轉基因植物對該基因是純合的，有性交配時將該基因傳遞給所有後代。來自轉基因植物的種子可以生長在大田或溫室中，所得性成熟轉基因植物自花傳粉產生出真正的育種植物。這些轉基因植物的後代形成真正的育種品系，以實施例方式對多種環境條件優選大田中對鞘翅目昆蟲的殺蟲能力的提高進行評估。發明者認為本發明在創造有商業利益轉基因植物方面將有特定應用，包括各種草坪草和牧草、黑麥、小麥、玉米、木棉、亞麻、水稻、大麥、燕麥、甘蔗、棉花、番茄、馬鈴薯、大豆及其它豆科植物、菸草、高粱及多種修飾性植物包括仙人掌和肉質植物、水果、漿果、蔬菜及多種結堅果和結水果的樹木及植物。包括編碼本文所述多肽的一種或多種轉基因的轉基因植物優選顯示出的表型為對本文所述目標鞘翅目昆蟲和鱗翅目昆蟲的抗蟲性提高或增強。這些植物優選年提供轉基因種子，可用所得種子創造轉基因植物家系(即原始轉基因植物的後代)，可以用轉基因植物家系產生種子或者用作動物或人類的食物，或者可用於生產纖維、油、水果、穀物或其它商業上重要的植物產品或植物成分。其中，轉基因植物任何一代的後代或種子將包含整合於染色體上的編碼本發明中δ-內毒素的所選轉基因。可以將本發明中的轉基因植物與帶有目的性狀的一種或多種植物雜交形成雜交系或自交系。有時，我們想要創造出包含除編碼本發明多肽的轉基因外的一種或多種整合到基因組中的其它轉基因的轉基因植物、種子及後代。例如，轉基因植物中可以包含編碼相同或不同抗蟲多肽的第二個基因，或者植物中可以包含一種或多種附加轉基因，例如能賦予植物除草劑抗性、真菌抗性、細菌抗性、脅迫耐受性、耐鹽性或乾旱耐受性、提高莖或根抗倒伏能力、提高澱粉、穀粒、油、碳水化合物、胺基酸、蛋白質產量等的轉基因。4.11同源基因和同源基因片段的分離與本發明相關的基因和δ-內毒素不但包括本文公開的全長序列，而且包括這些序列的片段或融合蛋白(fusionprotein)，這些融合蛋白保留本文特別列舉序列的典型殺蟲活性。對本領域中的熟練技術人員來說顯而易見的是，可以通過數種方法確定δ-內毒素和獲得δ-內毒素。特定基因或其部分可以從培養物保藏者處獲得，或者用合成方式構建，例如使用基因合成儀(genemachine)。使用標準點突變技術可以毫不費力地構建出這些基因的變體。同樣，可以使用可商購的外切核酸酶或內切核酸酶根據標準方法製備這些基因片段。例如，使用酶如Bal31或定點突變技術可以從這些基因的末端徹底切除核苷酸。同樣，使用其它各種限制酶可以獲得編碼活性片段的基因。使用蛋白酶可以直接得到這些δ-內毒素的活性片段。使用本文提供的技術可以從芽孢桿菌菌株及/或DNA文庫中分離等效δ-內毒素和/或編碼這些等效δ-內毒素的基因。例如，可以使用本文公開和聲明的δ-內毒素的抗體從蛋白質混合物中鑑定分離其它δ-內毒素。可以特異產生幾乎恆定並與其它蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素幾乎截然不同的δ-內毒素部分的抗體。然後，使用這些抗體通過免疫沉澱法(immunoprecipitation)、酶聯免疫測定(ELISA)或蛋白質印跡法(Westernblotting)特異鑑定出有特定殺蟲活性的等效δ-內毒素。鑑定本發明中δ-內毒素和基因的另一個方法是通過使用寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe)。探針核苷酸序列上有可以檢測的標記。正如本領域中眾所周知的一樣，如果探針分子和核酸樣品通過在兩個分子間形成強鍵而發生雜交，我們就可以合理假定探針和樣品基本相同。探針上的檢測標記提供決定雜交是否發生的方法。這樣的探針分析法提供了快速鑑定本發明中δ-內毒素基因的方法。用作本發明探針的核苷酸區段可以使用DNA合成儀(DNAsynthesizer)用標準方法合成。使用核苷酸區段作為探針時，用本領域中熟練技術人員熟知的合適標記標記特定探針，包括放射性標記以及非放射性標記。典型的放射性標記包括32P、125I、35S等。用放射性同位素標記的探針可以使用Dnase和DNA聚合酶通過常規的切口平移反應(nicktranslationreaction)從與DNA樣品互補的核苷酸序列構建。隨後在雜交緩衝溶液中混合探針和樣品，保持適當溫度直至退火。此後，將其它物質從膜上漂洗掉，通常通過放射自顯影(autoradiography)及/或液體閃爍計數(liquidscintllationcounting)對樣品和結合態探針分子檢測並定量。非放射性標記包括，例如，配體如生物素或甲狀腺素，以及酶如水解酶(hydrolase)或過氧化物酶(peroxidase)，或各種化學發光物質如螢光素(luciferin)或螢光化合物如螢光素(fluorescein)及其衍生物。為易於分離，可以在探針的兩個末端用不同類型的標記進行標記，如在上文所提及的末端用同位素標記而在另一端使用生物素標記。雙鏈分子的形成及穩定性取決於雜交體兩條鏈之間的大致互補性，而正如上文中注意到的，可以忍受一定程度的錯配(mismatch)。因此，本發明中的探針包括所述序列的突變(既有單位點突變又有多位點突變)、缺失、插入及其組合，其中所說的突變、插入和缺失可以與目標多核苷酸形成穩定雜交分子。在指定多核苷酸中產生突變、插入以及缺失可以有許多方式，如可以通過當前普通技工熟知的方法以及將來可能變得熟知的其它方法產生。所列探針中潛在的變體的產生，部分是由於遺傳密碼的冗餘性(redundancy)。由於遺傳密碼的冗餘性，即用於製造蛋白質的胺基酸中大部分都可以使用不止一個編碼核苷酸三聯體(密碼子)。因此，不同的核苷酸序列可以編碼一種特定胺基酸序列。所以，蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素和肽的胺基酸序列可以由編碼相同蛋白質或肽胺基酸的等效核苷酸序列製備。因此，本發明包括這些等效核苷酸序列。反向序列和互補序列也是本發明的一個方面，本領域中的熟練技術人員可以輕而易舉地使用這些序列。此外，研究表明，如果胺基酸序列的改變並未使蛋白質二級結構發生改變，那麼確定結構和功能的蛋白質可以通過改變胺基酸序列構建(Kaiser和Kezdy，1984)。所以，本發明包括本文所示胺基酸序列的突變體，這些突變體並不改變蛋白質的二級結構，或者如果結構發生改變，但大體保留了其生物活性。另外，本發明還包括帶有本發明基因編碼的所有或部分δ-內毒素的生物突變體。通過本領域中熟練技術人員熟知的技術可以製得這些突變體。例如，可以使用UV輻射(UVirradiation)製備寄主生物的突變體。同樣，突變體中可能包括無孢子寄主細胞(asporogenoushostcell)，通過本領域中熟知的方法可以製備這些無孢子寄主細胞。4.13重組寄主細胞可以將本發明中的核苷酸序列導入到多種微生物寄主和真核生物寄主中。重組表達Cry多肽的寄主中尤其引人注目的是原核生物和低等真核生物，如真菌。典型的原核生物，既有革蘭氏陰性又有革蘭氏陽性，包括腸細菌(Enterobacteriaceae)，如大腸桿菌(Escherichia)、歐氏桿菌(Erwinia)、志賀菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)及變形桿菌屬(Proteus)、芽孢桿菌屬(Bacillaceae)；根瘤菌屬(Rhizobiceae)，如根瘤菌(Rhizobium)；螺旋菌屬(Spirillaceae)，如發光細菌(photobacterium)，發酵單胞菌屬(Zymomonas)、Serratia、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)、Desulfovibro、螺旋菌屬(Spirillum)；乳酸菌屬(Lactobacillaceae)；假單胞菌(Pseudomonadaceae)，如假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)；固氮細菌(Azotobacteraceae)、放線菌(Actinomycetales)和硝化細菌屬(Nitrobacteraceae)。其中的真核生物有真菌(fungi)，如藻狀菌屬(Phycomycetes)和子囊菌(Ascomycetes)，包括酵母如酵母菌屬(Saccharomyces)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，以及擔子菌綱(Basidiomycetes)酵母如Rhodotorula、金白蘑菇(Aureobasidium)、Sporobolomyces等。選擇寄主細胞時特別感興趣的特性包括易於將本發明中的遺傳構建體導入到寄主細胞中，表達系統的有效性，表達效率，目的基因在寄主中的穩定性以及輔助遺傳能力的存在。已知居住在多種重要作物葉面(植物葉子的表面)及/或根際(植物根周圍的土壤)的大量微生物也可能是所公開遺傳構建體操作、繁殖、儲存、送遞和/或突變的寄主細胞。這些微生物中包括細菌、藻類及真菌。特別引人注目的有微生物，如細菌如芽孢桿菌屬(包括B.thuringiensiskurstakiHD-1，B.thuringiensiskurstakiHD-73，B.thuringiensissotto，B.thuringiensisberliner，B.thuringiensisthuringiensis，B.thuringiensistolworthi，B.thuringiensisdendrolimus，B.thuringiensisalesti，B.thuringiensisgalleriae，B.thuringiensisaizawai，B.thuringiensissubtoxicus，B.thuringiensisentomocidus，B.thuringiensistenebrionis及B.thuringiensissandiego的種和亞種)、假單胞桿菌屬、歐氏桿菌、Settatia、克雷伯氏桿菌屬、Zanthomonas、鏈黴菌屬、根癌菌屬、紅假單胞菌、Methylophilius、土壤桿菌屬、醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬、節桿菌屬、固氮菌屬、嗜檸檬酸明串球菌屬和Alcaligenes，如真菌尤其是酵母如酵母菌屬、隱球酵母菌屬、克魯維酵母菌屬、Sporobolomyees、Rhodotorula及金白蘑菇菌屬。尤其引人注目的是植物圈細菌如Pseudomonassyringae、螢光假單胞桿菌、Serratiamarcescens、Acetobacterxylinum、根癌農桿菌、Rhodobactersphaeroides、Xanthomonascampestris、Rhizobiummelioti、Alcaligeneseutrophus及Azotobactervinlandii，以及植物圈酵母如Rhodotorularubra、R.glutinis、R.marina、R.aurantiaca、Cryptococcusalbidus、C.diffluens、C.laurentii、Saccharomycesrosei、S.pretoriensis、啤酒酵母、Sporobolomycesroseus、S.odorus、Kluyveromycesveronae及Aureobasidiumpollulans。選擇寄主細胞時特別感興趣的特性包括易於將所選遺傳構建體導入到寄主中，表達系統的有效性，表達效率，多核苷酸在寄主中的穩定性以及輔助遺傳能力的存在。其它考慮因素包括易於製作和處理、經濟、儲存穩定性等。4.14多核苷酸序列在向受體植物細胞中送遞過程中、多能植物細胞的世代中以及最終產生抗蟲轉基因植物過程中特別優選的是編碼本發明中殺蟲活性多肽的DNA組分。例如，可以使用的DNA區段以載體和質粒的形式使用或以線性DNA片段形式使用，有時僅包含要在植物細胞中表達的DNA元件等等。當然，在用編碼δ-內毒素的多核苷酸轉化細胞時使用的載體、質粒、噬菌粒、粘粒、病毒載體、穿梭載體、杆狀病毒載體、BACs(細菌人工染色體)、YACs(酵母人工染色體)及DNA區段，通常包括編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO19的多肽的至少第一個基因，或者包括的基因所編碼的多肽與在SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO19中公開的胺基酸序列的同一性至少為大約80％或85％或90％或95％。這些核酸構建體可以包括一個或多個想要導入受體細胞中去的基因。DNA構建體中可以包括諸如啟動子、增強子、多位點接頭或調節基因等想要的結構。導入細胞時選擇的DNA區段或基因通常編碼的多肽在所得重組細胞中表達，可以產生可以篩選的性狀或可以選擇的性狀，以及/或可以賦予轉化寄主細胞增強的表型。另外，核酸構建體可以包含反義構建體或核酶編碼區。4.15突變多核苷酸的製備方法有時，為了改變或變更編碼多肽的殺蟲活性或殺蟲特異性，我們可能想要修飾或改變本文公開的一個或多個多核苷酸序列中的一個或多個核苷酸。然後擴增突變序列。突變DNA區段及擴增DNA區段的方法對本領域中的熟練技術人員來說是熟知的。通過隨機突變方法或位點特異性突變方法可以製備出突變DNA區段。通過在編碼殺蟲活性多肽的序列中進行一個或多個核苷酸的附加、缺失或取代可以對多核苷酸進行修飾。在本發明的實踐中有用的特定突變方法和擴增方法由Tomic等、Upender等、Kwoh等、Frohman等、0hara等、Wu等、Walker等、美國專利4683195、4683202、4800159、4883750及EP320308、EP329822、GB2202328、PCT/US87/00880、PCT/US89/01025、WO88/10315、WO89/06700等進行了描述，各文內容在此完整引入作為參考。4.16影響植物中轉基因表達的轉錄後事件許多情況下，指定寄主細胞中特定轉基因的轉錄水平並不總表示轉化寄主細胞中產生蛋白質的量。這通常是由於轉錄後過程的緣故，如剪接、聚腺苷酸化、翻譯的適當起始及RNA穩定性，影響轉錄本產生蛋白質的能力。這些因素也可能影響指定轉基因產生的mRNA的穩定性和量。因此，我們通常通過特定分子生物學技術改變翻譯後事件。發明者認為，某些情況下，我們可以通過改變本發明中編碼多肽的核酸構建體的轉錄及/或表達，來增強、降低或調節或調控在特定寄主細胞和/或轉基因植物中的構建體。4.16.1蛋白質翻譯的有效起始真核生物mRNA的5』前導區(5』-UTL)在翻譯效率中發揮重要作用。許多早期的嵌合轉基因使用的是病毒啟動子，將轉錄起始位點後任意長度的病毒序列與編碼區AUG融合。近來的研究表明，5』-UTL序列及AUG周圍的序列對寄主細胞和特別是某些植物品種中的翻譯效率影響很大，影響大小依賴於表達信使的特定細胞或組織而有所不同。在許多真核生物mRNA中，翻譯起始點發生在緊鄰轉錄本5』帽子的AUG密碼子處。對植物mRNA序列進行比較及定點誘變實驗證明在植物起始密碼子周圍存在共有序列，5』-UAAACAAUGGCU-3』(Joshi，1987；Lutcket等，1987)。然而，共有序列在不同植物品種中是明顯的。例如，從85個玉米基因中發現起始密碼子周圍的一套序列為5』-(C/G)AUGGCG-3』(Luehrsen等，1994)。在菸草原生質體中，當將基因的天然序列變成編碼5』-ACCAUGG-3』時，編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)和細菌幾丁質酶的轉基因表達水平分別增強4倍和8倍(Gallie等，1987；Jones等，1988)。產生嵌合轉基因(即包括連接在一起的不同來源DNA區段)時通常使用植物病毒5』-UTL。研究表明，苜蓿花葉病毒(AMV)外殼蛋白和雀麥草花葉病毒(BMV)外殼蛋白的5』-UTL能使mRNA電擊後的菸草原生質體中增強8倍(Gallie等，1987a；1987b)。研究表明，將菸草花葉病毒RNA(TMV)5』-UTL的67核苷酸衍生物(Ω)與氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因和GUS基因融合後使報告基因體外翻譯增強(Gallie等，1987a；1987b；Sleat等，1987；Sleat等，1988)。用包含與報告基因CAT、GUS和LUC融合的TMV前導序列的轉錄體電擊菸草葉肉原生質體，使表達水平分別增強33倍、21倍和36倍(Gallie等，1987a；1987b；Gallie等，1991)。同樣也是在菸草中的研究表明，馬鈴薯病毒XRNA的83-nt5』-UTL能使新黴素磷酸轉移酶II(NptII)的表達增強4倍(Poogin和Skryabin，1992)。5』-UTL的影響依賴於植物尤其是雙子葉植物和單子葉植物而有所不同。研究表明，TMV5』-UTL在菸草原生質體中(Gallie等，1989)比在玉米原生質體中(Gallie和Young，1994)更為有效。同樣，來自TMVΩ(Gallie等，1988)、AMV外殼(Gehrke等，1983；Jobling和Gehrke，1987)、TMV外殼(Goelet等，1982)以及BMV外殼(French等，1986)的5』-UTL在玉米中的作用很小，相對於螢光素酶基因的天然前導序列來說能抑制螢光素酶基因在玉米中的表達(Koziel等，1996)。但是，來自花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉錄體和玉米基因谷蛋白(Boronat等，1986)、PEP羧化酶(Hudspeth和Grula，1989)以及核酮糖二磷酸羧化酶中的5』-UTL相對於螢光素酶基因的天然前導序列來說使螢光素酶基因的表達有相當大的增強(Koziel等，1996)。這些5』-UTL在菸草中的效果不同。與在玉米中的相反，TMVΩ5』-UTL和AMV外殼蛋白5』-UTL在菸草中能增強表達，而谷蛋白5』-UTL、玉米PEP羧化酶5』-UTL和玉米核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶5』-UTL相對於螢光素酶5』-UTL並未增強(Koziel等，1996)。只有CaMV35S5』-UTL既能在玉米中增強螢光素酶的表達又能在菸草中增強螢光素酶的表達(Koziel等，1996)。另外，TMV外殼蛋白5』-UTL和BMV外殼蛋白5』-UTL既在玉米原生質體又在菸草原生質體中有抑制作用(Koziel等，1996)。4.16.2使用內含子增強表達雖然並不是所有的內含子都有刺激效果而且刺激程度千差萬別，但是已經發現在基因的轉錄部分中包括一個或多個內含子，能增強多種植物系統中異源基因的表達(Callis等，1987；Maas等，1991；Mascerenhas等，1990；McElroy等，1990；Vasil等，1989)。內含子的增強效果似乎在單子葉植物中比在雙子葉植物中更為明顯。Tanaka等(1990)研究表明，使用從蓖麻子中分離的過氧化氫酶內含子1能增強基因在水稻中的表達。同樣，研究表明，乙醇脫氫酶1(Adh1)的第一個內含子能增強包括內源啟動子的基因組克隆在轉化玉米細胞中的表達(Callis等，1987；Dennis等，1984)。能增強包括內含子的轉基因表達的其它內含子，包括Adh1的內含子2和6(Luehrsen和Walbot，1991)、過氧化氫酶內含子(Tanaka等，1990)、玉米bronze1基因的內含子1(Callis等，1987)、玉米蔗糖合成酶內含子1(Vasil等，1989)、水稻肌動蛋白基因的內含子3(Luehrsen和Walbot，1991)、水稻肌動蛋白內含子1(McElroy等，1990)以及玉米泛素外顯子1(Christensen等，1992)。通常情況下，為使得優化表達，考慮到剪接點序列所選內含子應該以正確方向放在5』轉錄單元中(Cailis等，1987；Maas等，1991；Mascerenhas等，1990；Oard等，1989；Tanaka等，1990；Vasil等，1989)。研究表明，當將Adh1的內含子9放在目的基因的3』端(或下遊)時能增強外源基因的表達(Cailis等，1987)。4.16.3使用合成基因增強植物中異源基因的表達當將原核生物基因導入到真核生物寄主中或在非天然寄主中表達真核生物基因時，必須對基因序列進行改變或變更才能使來自該基因的轉錄本進行有效翻譯。我們已經在植物中表達蘇雲金芽孢桿菌基因時獲得了用合成基因增強目的蛋白表達的大量經驗。天然蘇雲金芽孢桿菌基因在雙子葉植物中有時在幾乎所有許多單子葉植物中通常只有低水平的表達(Koziel等，1996)。天然基因中密碼子使用與典型植物基因中密碼子使用有相當大的不同，而植物基因G+C含量更為高些。增強這些基因在植物中表達的策略通常就是改變基因總的G+C含量。例如，合成編碼蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白質的基因，顯著提高了這些基因在多種作物包括棉花(Perlak等，1900；Wilson等，1992)、番茄(Perlak等，1991)、馬鈴薯(Perlak等，1993)、水稻(Cheng等，1998)和玉米(Koziel等，1993)中的表達。同樣，發明者認為，由於本發明中的遺傳構建體包含細菌來源的一個或多個基因，所以有時可以改變這些遺傳構建體，以增強來自原核生物的這些基因在包含這些構建體的特定真核寄主細胞及/或轉基因植物中的表達。使用本領域中熟練技術人員熟知的分子生物學技術，我們可以改變特定Cry編碼基因序列的編碼序列或非編碼序列，以適用於預防或降低這些轉基因植物對昆蟲侵襲或攻擊的水平優化或促進其在轉化植物細胞中的表達。4.16.4葉綠體匯集(chloroplastsequestering)和葉綠體導向(chloroplasttargeting)增強A+T富含基因在植物中表達的另一個方法已經在菸草葉綠體轉化中作過說明。McBride等(1995)已經報導過在菸草中高水平表達非修飾性蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白編碼基因。.此外，已經發展出將蛋白質導向葉綠體的方法。該技術使用豌豆葉綠體轉運肽，將聚羥基丁酸合成途徑中的酶導向葉綠體(Nawrath等，1994)。同時，該技術除需要加入合適的導向序列外，去除掉修飾編碼區的必要性。美國專利5576198(在此特別引入作為參考)公開了植物細胞遺傳工程中有用的組合物和方法，提供一種方法控制插入在植物質體基因組中的外源DNA序列表達的定時性或組織方式。構建體包括用於核轉化的構建體，給病毒單亞基RNA聚合酶提供植物組織中的表達，並能將表達出的聚合酶蛋白導向植物細胞的質體中。同時包括質體表達構建體，在該構建體中包括RNA聚合酶特異的啟動子區，而RNA聚合酶是從上文所述核表達構建體中表達出來的，質體表達構建體中還包括要在轉化的質體細胞中表達的異源目的基因。另外，基因可以轉化/定位到葉綠體/質體基因組中並用本領域中熟知的啟動子從該處表達。4.16.53』區對轉基因表達的影響研究發現，轉基因的3』末端區對植物中轉基因的表達有很大影響(Ingelbrecht等，1989)。在該研究中，將不同的3』末端連接到新黴素磷酸轉移酶II(NptII)報告基因上，並在轉基因菸草中表達。所用不同的3』末端分別來自於章魚鹼合酶基因、來自擬南芥的2S種子蛋白、來自擬南芥的rbcS小亞基、來自胡蘿蔔的伸展蛋白以及來自矮牽牛的查爾酮合成酶。在穩定的菸草轉化體中，表達最好的構建體(小亞基rbcS3』末端)與表達最差的構建體(查爾酮合成酶3』末端)之間的差別大約為60倍。表5植物啟動子啟動子參考文獻a病毒玄參花葉病毒(FMV)美國專利5378619花椰菜花葉病毒(CaMV)美國專利5530196美國專利5097025美國專利5110732植物延長因子美國專利5177011番茄聚半乳糖醛酸酶美國專利5442052擬南芥組蛋白H4美國專利5491288菜豆蛋白美國專利5504200組分2美國專利5608144泛素美國專利5614399P119美國專利5633440α-澱粉酶美國專利5712112病毒增強子/植物啟動子CaMV35S增強子/甘露鹼美國專利5106739合成酶啟動子a各參考文獻在此特別完整引入作為參考表6組織特異性植物啟動子組織特異性啟動子組織參考文獻aBlec表皮美國專利5646333蘋果酸合酶種子、幼苗美國專利5689040異檸檬酸裂合酶種子、幼苗美國專利5689040patatin塊莖美國專利5436393ZRP2根美國專利5633363ZRP2(2.0)根美國專利5633363ZRP2(1.0)根美國專利5633363RB7根美國專利5459252根美國專利5401836果實美國專利4943674分生組織美國專利5589583保衛細胞美國專利5538879雄蕊美國專利5589610SodA1花粉、藥壁中層、花葯裂口VanCamp等，1996SodA2維管束、氣孔、腋芽、中柱鞘、VanCamp等，1996花葯裂口、花粉CHS15花、根尖Faktor等，1996Psam-1韌皮組織、皮層、根尖Vander等，1996ACT11正在伸長的組織和器官、花粉、Huang等，1997胚珠zmGBS花粉、胚乳Russell和Fromm，1997zmZ27胚乳Russell和Fromm，1997osAGP胚乳Russell和Fromm，1997osGT1胚乳Russell和Fromm，1997RolC韌皮組織、維管束鞘、維管薄Graham等，1997壁組織Sh韌皮組織Graham等，1997CMd胚乳Grosset等，1997Bnml花粉Treacy等，1997水稻tungro杆狀病毒韌皮部Yin等，1997a；1997bS2-Rnase花粉Ficker等，1998LeB4種子Baumlein等，1991Gf-2.8種子、幼苗Berna和Bernier，1997a各參考文獻在此特別完整引入作為參考在植物中以組織特異性方式表達基因的能力導致雄性不育植物和雌性不育植物的產生。雄性不育植物的產生通常涉及到使用花葯特異性啟動子，而該啟動子與能破壞花粉形成的基因相連接(美國專利5689051、5689049、5659124，各專利在此引入作為參考)。美國專利5633441(特別在此引入作為參考)公開產生雌性遺傳不育性植物的方法。該方法包括使用使用花柱細胞、柱頭細胞或花柱細胞及柱頭細胞特異性啟動子表達多肽，多肽在植物細胞中表達後，能殺死或明顯破壞細胞的代謝、功能性或發育。表7誘導型植物啟動子啟動子參考文獻a熱激啟動子美國專利5447858Em美國專利5139954Adh1Kyozoka等，1991HMG2美國專利5689056肉桂乙醇脫氫酶美國專利5633439天冬醯胺合成酶美國專利5595896GST-H-27美國專利5589614a各參考文獻在此特別完整引入作為參考4.18抗體組合物及其製備方法特定的實施方案中，發明者考慮到抗體的用途，這些單克隆抗體(monoclonalantibodies)或多克隆抗體(polyclonalantibodies)與本文公開的一種或多種多肽結合。製備抗體的方法以及鑑定抗體特性的方法在本領域中是眾所周知的(如可以參考Harlow和Lane，1988；在此引入作為參考)。單克隆抗體(mAbs)的產生方法通常開始的流程與製備多克隆抗體的相同。簡言之，多克隆抗體的製備方法是，用本發明中的免疫原性組分免疫接種動物，然後從免疫動物中收集抗血清。多種動物可以用於抗血清的產生。通常用於產生抗血清的動物為兔子、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。由於兔子的血液體積相對較大，所以產生多克隆抗體時兔子為優選選擇。通過使用已知技術可以輕而易舉地製備出mAbs，如美國專利4196265中列舉的技術，其內容在此引入作為參考。該技術通常涉及到用所選免疫原組分如純化或部分純化的晶體蛋白、多肽或肽免疫接種合適動物。免疫組分以能有效刺激抗體生成細胞的方式給藥。嚙齒類動物如小鼠和大鼠為優選動物，當然也有可能使用兔子、綿羊或青蛙細胞。使用大鼠可以提供某些優點(Goding，1986，pp.60-61)，但優選小鼠，而BALB/c鼠最優選，因為慣例使用最多並且一般都能產生更高程度的穩定融合。4.19ELISAs和免疫沉澱法(immunoprecipitation)可以將mAbs與本發明一起使用。ELISAs或使用ELISAs的試劑盒的產生和用途對於本領域中的熟練技術人員是眾所周知的。4.20蛋白質印跡本發明中的組合物在免疫印跡或蛋白質印跡分析中有非常大的用途。抗肽抗體可以作為高親和性的初級試劑(primaryreagent)，用於鑑定固定在固相支持物如硝酸纖維素、尼龍(nylon)或二者結合起來上的蛋白質。凝膠電泳後結合免疫沉澱法，這些組合物可以作為單步驟試劑(singlestepreagent)，用於檢測抗原，而用於檢測抗原的第二種試劑會導致不利背景。當所研究抗原為免疫球蛋白時(避免在使用免疫球蛋白時結合細菌細胞壁組分)、所研究抗原與檢測試劑發生交叉反應時或它們以與交叉反應信號相同的相同分子量遷移時，這就變得尤其有用了。我們認為，結合包括酶標記、放射性標記或螢光標記的內毒素部分的二抗使用以免疫為基礎的檢測方法在這方面尤其有用。4.21生物功能等效體(biologicalfunctionalequivalents)在本發明中的多肽以及編碼多肽的DNA區段結構中可以修飾和改變，這樣就能得到編碼想要特定蛋白質或肽的功能性分子。以下討論內容的基礎是，改變蛋白質的胺基酸產生出等效甚或增強的第二代分子。我們認為，在本發明的特定實施方案中，突變晶體蛋白在增強蛋白質的殺蟲活性方面並因此增強重組轉基因在植物細胞中的殺蟲活性及/或表達水平方面是有用的。根據表8中給出的密碼子，可以通過改變DNA序列中的密碼子完成胺基酸的變動。表8胺基酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU穀氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸IleIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬醯胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU穀氨醯胺GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU例如，當與諸如抗體中抗原結合區或底物結合位點等結構相互結合能力沒有明顯喪失的情況下，可以將蛋白質結構中的某些胺基酸替換成其它胺基酸。因為蛋白質的相互作用能力和本質決定蛋白質的生物功能活性，所以蛋白質序列中可以進行某些胺基酸序列的替換，當然其DNA編碼序列中也將進行某些替換，從而得到有類似特性的蛋白質。所以，發明者認為，在不喪失其生物功效或活性的情況下，在所公開組分的肽序列或對應的編碼所說肽的DNA序列中可以有各種變動。作以上變動時，可以考慮胺基酸的親水指數(hydropathicindex)。本領域通常對胺基酸親水指數賦予蛋白質生物功能方面的重要性是了解的(Kyte和Doolittle，1982，在此引入作為參考)。一般認為，胺基酸的相對親水特性促使所得蛋白質形成二級結構，而蛋白質的二級結構決定蛋白質與其它分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等之間的相互作用。各個胺基酸在其疏水性和電荷特性的基礎上均指定了親水指數(Kyte和Doolittle，1982)，分別為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；穀氨酸(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。在本領域中已知某些胺基酸可以由有相近親水指數或分數的其它胺基酸取代，仍可以得到有相似生物活性的蛋白質，即能得到生物功能等效蛋白質。在作這些變動時，取代親水指數在±2內的胺基酸是優選的，在±1內的尤其優選，在±0.5內的甚至更尤其優選。本領域中同時可以理解的是，可以在親水性(hydrophilicity)基礎上有效取代相似胺基酸。在此將美國專利4554101引入作為參考，該專利認為，蛋白質的最大局部平均親水性由其相鄰胺基酸的親水性決定，與蛋白質的生物特性相關。正如美國專利4554101所詳述的那樣，分別給胺基酸殘基指定了以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；穀氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+3.0)；天冬醯胺(+2.0)；穀氨醯胺(+2.0)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。一般認為，胺基酸可以替換成有相近親水性值的另一個胺基酸，這樣仍可以得到生物等效體尤其是免疫等效蛋白質。在這些變動中，取代親水性指數在±2內的胺基酸是優選的，在±1內的尤其優選，在±0.5內的甚至更尤其優選。正如上文略述，胺基酸取代的基礎通常是胺基酸側鏈取代的相對相似性如疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮到前面所述內容，典型的取代對本領域中的熟練技術人員是熟知的，包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。5.0實施例以下實施例展示的是本發明的優選實施方案。本領域中的熟練技術人員應該了解，以下實施例中所公開的技術代表的是發明者發現的能在本發明實踐中有作用的技術，考慮其可以組成本發明實踐的優選方法。但是，就本公開內容來說，本領域中的熟練技術人員應該知道，在此公開的特定實施方案中可以有多種變動，在不違反本發明精神和範圍的情況下也能獲得類似或相似結果。5.1實施例1——蘇雲金芽孢桿菌EG4550菌株和EG5899菌株的分離作物塵土樣品取自從美國到國外的多種不同來源，通常取自穀物儲藏設施。將作物塵土樣品處理後分散在瓊脂平板上，按照美國專利5187091所述分離單個芽孢桿菌菌落如蘇雲金芽孢桿菌，該專利內容在此特別完整引入作為參考。使用相差顯微技術用視覺認定在處理後長出的菌落中鑑定有晶體內含體的細胞。用Gonzalez等(1982)所述改動過的Eckhardt瓊脂糖凝膠電泳對產晶體的菌株進行鑑定。使用該方法可以將蘇雲金芽孢桿菌菌株中天然質粒的陣列顯示出來。將質粒陣列與蘇雲金芽孢桿菌已知血清型比較，可以幫助鑑定野生型菌株(Carlton和Gonzalez，1985)。產晶體蘇雲金芽孢桿菌菌株EG4550是從紐約作物塵土樣品中分離出來的。形成芽孢的EG4550中的晶體內含體有截然不同的形態學，呈棒狀。EG4550的質粒陣列與蘇雲金芽孢桿菌的任何已知血清型(serovar)均無相似性。產晶體蘇雲金芽孢桿菌菌株EG5899是從加裡弗尼亞作物塵土樣品中分離出來的。形成芽孢的EG5899的晶體內含體是不同尋常的，因為這些晶體內含體好象以不規則形態形成的多附著晶體。EG5899的質粒陣列與蘇雲金芽孢桿菌的任何已知血清型均無相似性。對蘇雲金芽孢桿菌菌株EG4550和EG5899進行的昆蟲生物測定(insectbioassay)表明，這些菌株對包括SCRW在內的鞘翅目昆蟲幼蟲有毒殺作用，這說明在這些菌株的晶體中包含新的殺蟲蛋白。用ARSPatentCultureCollection沉澱EG4550和EG5899，其NRRL號分別指定為B-21784和B-21783。表9中所列是本發明中的這些菌株及其它菌株。表9野生型細菌菌株和重組細菌菌株a菌株NRRLNRRL生物質粒克隆片段載體已知cry質粒索取號保藏日期基因抗生素標記EG4550B-217845-30-97蘇雲金芽孢桿菌---cryET39，74，75-EG5899B-217835-30-97蘇雲金芽孢桿菌---cryET39，74，75-EG11582--大腸桿菌pEG13378.4-kbHindIIIpUC18cryET39，74，75AmpEG11525--大腸桿菌pEG13218.4-kbHindIIIpEG597cryET39，74，75AmpEG11529B-219172-12-98蘇雲金芽孢桿菌pEG13218.4-kbHindIIIpEG597cryET39，74，75CmEG11521--大腸桿菌pEG13198.4-kbHindIIIpBluescriptcryET39，74，75AmpEG11934--蘇雲金芽孢桿菌pEG19184.5-kbHindIIIpHT315cryET75ErythEG11935--蘇雲金芽孢桿菌pEG19193.2-kbHindIII-EcoRIpHT315cryET74ErythEG11936--蘇雲金芽孢桿菌pEG19203.7-kbHindIIIpHT315cryET39，74ErythEG11937--蘇雲金芽孢桿菌pEG19211.4-kbHindIIIpEG1915cryET39ErythEG4100B-217865-30-97蘇雲金芽孢桿菌---cryET69-EG11647B-217875-30-97蘇雲金芽孢桿菌pEG1820MbolpartialpHT315cryET69ErythEG9444B-217855-30-97蘇雲金芽孢桿菌---cryET7l，79-EG11648B-217885-30-97蘇雲金芽孢桿菌pEG1821MbolpartialpHT315cryET71，79ErythEG4851B-219152-12-98蘇雲金芽孢桿菌---cryET76，80，84-EG11658B-219162-12-98蘇雲金芽孢桿菌pEG1823MbolpartialpHT315cryET76，80，84Erytha以上所列構建體詳細內容見下面的實施例。b實驗培養物，在保證在本專利未決期間，對於由專利及商標委員會按照37C.F.R.1.14和35U.S.C.122給予此權利的主體可以獲得培養物的條件下保藏。在本申請的相應申請，或其子代已提交的國家，按外國專利法請求本儲藏物也是可以得到的。然而，應當理解，獲得此保藏物並不構成許可實施本發明以損害由政府行為授予的專利權。按照布達佩斯微生物保藏條約，本培養物保藏物將被儲存並可為公眾所得。即，將盡謹慎保持其在最近一次請求提供保藏樣品五年內，並在任何情況下，在保藏之日，或任何公開了該培養物的專利的有效期起至少30年存活且不被汙染。儲存者明白置換保藏物的責任使得當請求時，由於保藏條件的原因，保藏機構不能提供樣品。當公開此保藏的專利被授權時，所有對於公眾獲得此培養物保藏物的限制將被不可逆撤消。表3所示的培養物按照布達佩斯條約被保藏在AgriculturalReseachServiceCultureCollection，NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，1815N.UniversityStreet，Peoria，IL61604。5.2實施例2——對EG4550和EG5899的晶體蛋白的評定於30℃在C2芽孢形成培養基(Donovan等，J.Biol.Chem.，263561-567，1988)中培養菌株EG4550和EG58993天，培養物在該過程中生長到穩定期(stationaryphase)，隨後形成芽孢，培養物裂解後將蛋白質內含物釋放到培養基中。培養物經離心收集包含芽孢和晶體的細胞沉澱。將沉澱懸浮在0.005％TritonX-100溶液中進行漂洗，隨後離心。將漂洗後的沉澱重新懸浮在1/10體積原體積的0.005％TritonX-100中。通過將芽孢-晶體懸液於100℃溫育在增溶緩衝液中5分鐘使晶體蛋白增溶。用12.5％丙烯醯胺凝膠通過SDS-PAGE將溶解後的晶體蛋白按大小進行分離。蛋白質按大小進行分離後，通過用考馬斯亮藍R-250染色顯色。菌株EG4550顯示出的蛋白質的分子量大約為45kDa和15kDa。菌株EG5899顯示出的蛋白質的分子量大約為160kDa、45kDa、35kDa和15kDa。5.3實施例3——EG4550的CryET39晶體蛋白的特性將EG4550約45kDa的蛋白質氨基末端序列稱為CryET39，並確定了該序列。EG4550的芽孢培養物經過漂洗並重新懸浮。懸液中的晶體蛋白溶解後按照SDS-PAGE分析法在10％丙烯醯胺凝膠上跑電泳。電泳之後，使用標準蛋白質印跡方法將蛋白質轉移到BioRadPVDF膜上。轉移後，蒸餾水中漂洗膜3次後使用醯胺黑1013(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)染色1分鐘。濾膜在5％乙酸中脫色1分鐘後用蒸餾水漂洗3次。用剃鬚刀片將包含約45kDaCryET39條帶的濾膜部分切掉。使用該方法得到純化的CryET39，該蛋白質條帶印跡在PVDF膜上(BioRad，Hercules，CA)。在TuftsMedicalSchoo(Boston，MA)的生理系中，使用艾德曼降解方法(Edmandegradationprocedures)確定固定在膜上的純化CryET39蛋白質氨基末端的胺基酸序列。其胺基酸序列確定為123456789101112131415MetLeuAspThrAsnLysValTyrGluIleSerAsnHisAlaAsn(SEQIDNO20)使用計算機算法(Korn和Queen，1984)將CryET39蛋白質氨基末端序列與發明者所知的所有蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白胺基酸比較，包括科技文獻、國際專利申請或發行專利中公開的所有蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白序列。序列公開並給予基因/蛋白質命名的晶體蛋白一覽表如表2所示。5.4實施例4——分離包括cryET39基因的DNA片段為了鑑定編碼CryET39的基因，設計蛋白質氨基末端胺基酸序列特異的寡核苷酸探針。使用通常在蘇雲金芽孢桿菌內毒素基因中發現的密碼子，通過IntegratedDNATechnologies，Inc.(Coraville，IA)合成出41核苷酸的寡核苷酸並稱為wd271。wd271的序列為5′-ATGTTAGATACAAATAAAGTATATGAAATTTCAAATCATGC-3′(SEQIDNO21)按照下文所述在Southern雜交實驗中使用放射性標記的wd271為探針，確定包含cryET39基因的限制片段。通過以下步驟從菌株EG4550和EG5899中提取總DNA。將營養細胞重新懸浮在裂解緩衝液中，緩衝液中包含50mM葡萄糖、25mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA和4mg/ml溶菌酶。將懸浮液在37℃溫育1小時。溫育後，懸浮液用等體積的苯酚抽提1次，然後用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次。加入1/10體積的3M乙酸鈉及2倍體積100％乙醇，從水相中沉澱DNA。通過離心收集沉澱的DNA，沉澱DNA用70％乙醇漂洗並重新懸浮在蒸餾水中。然後使用製造商建議的條件在不同反應體系中用各種限制性內切酶(restrictionendonuclease)包括EcoRI和HindIII(PromegaCorp.，Madison，WI)消化提取出的DNA。通過1×TBE(0.089MTris-硼酸，0.089M硼酸，0.002MEDTA)中的0.8％瓊脂糖凝膠按2伏/釐米膠長電泳過夜，按大小分離消化後的DNA。然後，根據Southern(1975)的方法將分離後的DNA片段轉移到MilliporeImmobilon-NC硝酸纖維素濾膜(MilliporeCorp.，Bedford，MA)上。在真空烘箱中80℃烘烤濾膜，將DNA片段固定到硝酸纖維素濾膜上。使用寡核苷酸wd271作雜交探針完成對包含編碼CryET39蛋白質氨基末端的序列(參照實施例3)的DNA片段的確認。放射性標記探針時，在包含[γ-32P]ATP(3μl3000Ci/mmol，20μl反應體系中為10mCi/ml)、10×反應緩衝液(700mMTris-HCl(pH7.8)、100mMMgCl2、50mMDTT)及10個單位的T4多核苷酸激酶(PromegaCorp.)的反應中加入1～5pmolwd271。在37℃溫育反應20分鐘，使放射性磷酸轉移到寡核苷酸的5』末端，得到有用的雜交探針。標記好的探針在3×SSC、0.1％SDS、10×Denhardt’s試劑(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2mg/ml肝素中與硝酸纖維素濾膜於45℃溫育過夜。溫育後，於45℃用3×SSC、0.1％SDS漂洗濾膜數次。吸乾濾膜，於-70℃在有DuPontCronex增感屏的情況下將濾膜過夜暴光於KodakX-OMATARX-射線膠片(EastmanKodakCompany，Rochester，NY)，得到放射自顯影圖。放射自顯影圖確認出菌株EG4550DNA中有大約2.5kbwd271雜交EcoRI片段。菌株EG5899中有大約8.4kb的HindIII片段，該片段與標記的wd271特異雜交。結果表明，EG4550和EG5899均包含與cryET39基因相關甚或相同的拷貝。5.5實施例5——cryET39基因的克隆首次克隆研究包括EG4550的2.5kbEcoRI片段的分離，以便表達並鑑定EG4550的CryET39蛋白質。然而，當在蘇雲金芽孢桿菌重組菌株中克隆並表達該片段時，僅僅產生出15kDa的蛋白質，這表明在2.5kbEcoRI片段中並不包含完整且有功能的cryET39基因。該結果也表明，15kDa晶體蛋白和CryET39的基因相當接近。產生15kDa蛋白質的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株稱作EG11467，對SCRW幼蟲無毒殺作用。按照5.4部分中所述從總基因組DNA中分離包含EG5899cryET39基因的大約8.4kbHindIII限制片段。用HindIII消化DNA後，通過0.8％瓊脂糖、1×TBE凝膠在2伏/釐米膠長的情況下電泳。凝膠用溴化乙錠染色，這樣消化後的DNA在暴露於長波UV光時就變得可見了。然後，使用Geneclean流程(Bio101，Vista，CA)從凝膠切片中純化DNA片段。將分離的DNA片段連接到噬菌粒pBluescriptIISK+(Stratagene，LaJolla，CA)中，得到的大腸桿菌文庫中的有按大小進行選擇的HindIII限制片段。噬菌粒DNA載體pBluescriptIISK+能在大腸桿菌中以高拷貝數進行複製，攜帶有抗生素氨苄青黴素抗性基因，可以用作選擇標記。將片段與用HindIII消化的pBluescriptIISK+混合，而後者預先用細菌鹼性磷酸酶(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)處理以從消化的質粒中去除5』磷酸，這樣處理可以抑制載體本身的自連。在包含消化質粒與按大小進行選擇的HindIII片段的反應中加入T4連接酶和連接緩衝液(PromegaCorp.)。反應混合物於室溫條件下溫育1小時，使HindIII片段插入並連接到pBluescriptIISK+載體中。按照製造商所述流程將連接混合物導入到轉化感受態大腸桿菌DH5αTM細胞(GibcoBRL)中。將轉化後的大腸桿菌細胞鋪板到包含50μl/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，並於37℃溫育過夜。在每個平板上長出數百個氨苄青黴素抗性菌落，說明在每一個這些菌落中的細胞中都有重組質粒的存在。為了分離帶有包含cryET39基因的克隆8.4kbHindIII片段的菌落，首先將菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上。將圓形濾紙(MilliporeHATF08525，MilliporeCorp.，Bedford，MA)直接放到包含轉化菌落的LB-氨苄青黴素瓊脂糖平板上，即可完成該過程。當從平板上慢慢揭下濾膜時菌落粘附到濾膜上，即正確產生出原來平板上菌落排列方式的影印。平板上每個菌落都留下充足的細胞，37℃培養5-6個小時後即能恢復菌落。然後將平板保存在4℃備用。隨後將帶有轉移菌落的硝酸纖維素濾膜按菌落面向上的方式，放置到LB-氨苄青黴素瓊脂糖平板上，37℃培養直到菌落長到直徑約為1毫米為止。為使DNA從重組大腸桿菌細胞中釋放出來，將硝酸纖維素濾膜按菌落面向上的方式放置到用0.5NNaOH、1.5MNaCl浸泡過的2片Whatman3MM層析紙(WhatmanInternationalLtd.，Maidstone，England)上15分鐘。此處理能裂解細胞並能變性釋放出的DNA，將DNA固定到硝酸纖維素濾膜上。隨後將濾膜中和將濾膜菌落面向上放置到用1M乙酸銨、0.02MNaOH浸泡過的2片Whatman紙上10分鐘。然後用3×SSC漂洗濾膜，空氣中乾燥後在真空烘箱中於80℃烘烤1小時，以備雜交使用。cryET39基因特異的氨基末端寡核苷酸wd271，按如上所述用γ-32P和T4多核苷酸激酶標記其5』末端。濾膜放在3×SSC、0.1％SDS、10×Denhardt’s試劑(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2mg/ml肝素中，加入標記探針後於40℃溫育過夜。選擇這些條件，是因為這些條件可以使標記的寡核苷酸與轉化大腸桿菌菌落的硝酸纖維素印跡上的相關序列進行雜交。溫育之後，濾膜於45℃用3×SSC、0.1％SDS漂洗數次。吸乾濾膜，於-70℃在有DuPontCronex增感屏的情況下將濾膜過夜暴光於KodakX-OMATARX-射線膠片(EastmanKodak)。該轉化中有數個菌落與wd271雜交。確認這些菌落將放射自顯影圖上的信號與原始轉化平板上的菌落排列比較。隨後，分離出的菌落在LB-氨苄青黴素液體培養基中培養，培養基中的細胞收穫後可以用標準鹼裂解小量製備方法(Maniatis等，1982)製備重組質粒。分離出的質粒用限制性酶HindIII消化，表明EG5899DNA中的克隆片段為預計大小，即8.4kb。6個雜交菌落中的HindIII消化質粒DNA通過瓊脂糖凝膠電泳後，按如上所述轉移到硝酸纖維素上。隨後，印跡與寡核苷酸wd271雜交，而後者在此之前其5』末端已經用γ-32P和T4多核苷酸激酶進行放射性標記。所有這6個消化質粒中的大約8.4kb的插入片段均與wd271雜交，證明存在cryET39基因。其中一個質粒中8.4kb插入片段包含cryET39基因，將該質粒稱為pEG1319。包含pEG1319的大腸桿菌菌株稱作EG11521。5.6實施例6——來自EG11529的重組蛋白的表達為了了解CryET39蛋白質的特性，有必要在不產生晶體蛋白的蘇雲金芽孢桿菌細胞(Cry-)中表達克隆的cryET39基因。為此，將來自pEG1319中的克隆的8.4kbHindIII片段插入到能在蘇雲金芽孢桿菌中複製的質粒中，這樣就能表達cryET39基因並產生出編碼的蛋白質。用HindIII消化pEG1319，切除克隆的8.4kb片段。消化後的質粒在瓊脂糖凝膠上進行分離，並切除包含8.4kb片段的凝膠切片。使用GeneClean方法(Bio101)從凝膠切片中純化8.4kbHindIII片段。將該片段連接到蘇雲金芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體中，而穿梭載體在此之前已經用HindIII消化並用細菌鹼性磷酸酶處理。Baum等(1990)對稱為pEG597的穿梭載體進行了描述。pEG597既能在大腸桿菌中複製又能在蘇雲金芽孢桿菌中複製，賦予大腸桿菌以氨苄青黴素抗性，賦予蘇雲金芽孢桿菌以氯黴素抗性。使用製造商所述轉化方法(GibcoBRL)將連接混合物引入到大腸桿菌DH5αTM細胞中。從AmpR轉化體中製備質粒DNA，用限制性酶分析法證實構建正確。將包含插入到pEG597中的8.4kbHindIII片段的質粒命名為pEG1321。將帶有pEG1321的大腸桿菌菌株命名為EG11525。通過電穿孔(Macaluso和Mettus，1991)將pEG1321引入到Cry-蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10368中。通過在包含3μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上溫育過夜，選擇出轉化了氯黴素抗性的細胞。從數個蘇雲金芽孢桿菌轉化體中分離質粒DNA。分離出的質粒用HindIII消化並通過瓊脂糖凝膠電泳。所有轉化體都有對應於8.4kbcryET39基因片段和pEG597載體的限制片段。為了證實質粒構建的正確，將限制片段印跡到硝酸纖維素濾膜上後，按上文所述濾膜與cryET39特異的寡核苷酸wd271雜交。wd271探針與克隆的8.4kbHindIII片段雜交，證實pEG1321包含cryET39基因且已經成功引入到蘇雲金芽孢桿菌中。將包含pEG1321的蘇雲金芽孢桿菌重組菌株命名為EG11529。用NRRL沉澱EG11529，指定保藏號為B-21917。EG11529在包含5μg/ml氯黴素的DSM+葡萄糖芽孢形成培養基培養上於30℃培養3天，培養過程中培養物生長到穩定期，形成芽孢後細胞裂解，將蛋白質內含體釋放到培養基中。通過離心收穫培養物。包含芽孢和蛋白質晶體的沉澱用0.005％TritonX-100、2mMEDTA溶液漂洗後離心。將漂洗後的沉澱重新懸浮在1/10原體積的0.005％TritonX-100、2mMEDTA中。通過將懸浮液在溶解緩衝液中於100℃溫育5分鐘使晶體蛋白從芽孢-晶體懸浮液中溶解出來。溶解後的晶體蛋白通過SDS-PAGE按大小進行分離。按大小分離後，通過用考馬斯亮藍R-250染色的方法使蛋白質顯色。分析表明，在菌株EG11529中產生了3中截然不同的晶體蛋白。除產生44kDa的CryET39外，還產生了大約15kDa和35kDa的多肽。通過用如5.12部分中所述蔗糖分級梯度(分級55％、68％、72％、79％)離心法，可以將蘇雲金芽孢桿菌中表達的35kDa晶體蛋白與44kDa(CryET39)和15kDa蛋白質分離開來。使用5.3部分中所述方法完成對分離的35kDa蛋白質氨基末端胺基酸序列的確定工作。35kDa蛋白質氨基末端胺基酸序列如下所示SILNLQDLSQKYMTAALNKI(SEQIDNO22)將35kDa蛋白質氨基末端與推斷出的CryET39胺基酸序列進行比較，證實35kDa蛋白質並不是CryET39蛋白質的加工形式。將大約為35kDa的蛋白質命名為CryET75，將編碼該蛋白質的基因(該基因位於EG5899的8.4kb片段上)命名為cryET75。含有CryET39蔗糖梯度級分也含有大約15-kDa蛋白，稱為CryET74。按照5.3的關於CryET39的方法確定CryET74的氨基末端序列。分離的CryET74蛋白的氨基末端序列是SARQVHIQINNKTRH(SEQIDNO23)該序列與CryET39CryET75的序列比較表明CryET74是由第3個基因，稱之為CryET74，編碼的，它存在於EG5899的8.4kb的HindIII片段上。5.7實施例7——cryET39基因的序列測定及其所編碼多肽胺基酸序列的確定為了測定cryET39、cryET74和cryET75基因的序列，將pEG1319中的8.4kbHindIII片段亞克隆到HindIII消化後的pUC18(Yanisch-Perron等，1985)中。將該質粒命名為pEG1337，如圖1所示。使用標準鹼裂解法或Qiagen質粒試劑盒(QiagenInc.，Chatworth，CA)完成對pEG1337雙鏈質粒模板DNA的製備工作。按照製造商指定程序使用SequenaseTMVersion2.0DNA測序試劑盒(UnitedStatesBiochemical/AmershamLifeScienceInc.，Cleveland，OH)並使用35S-[dATP]標記同位素(DuPontNENResearchProducts，Boston，MA)進行測序反應。反應在6％(wt./vol.)丙烯醯胺、42％(wt./vol.)尿素測序膠上進行變性凝膠電泳。在室溫下將幹膠過夜暴光於KodakX-OMATARX射線膠片(EastmanKodak)。將氨基末端特異的寡核苷酸wd271作為測序起始引物。使用如上所述流程確定cryET39基因的全序列。從前套反應的測序參數中設計出用於引發測序反應的連續寡核苷酸。這樣，DNA序列測定將同時沿著cryET39基因的上鏈和底鏈分段進行。在CryET75蛋白質氨基末端胺基酸序列基礎上設計寡核苷酸引物，用於cryET75基因的序列測定。將寡核苷酸命名為MR51，其序列為5′-TCACAAAAATATATGAACAGC-3′(SEQIDNO24)使用如上所述DNA測序程序，確定cryET75基因的部分核苷酸序列時使用自動測序完成序列的測定工作。根據製造商指定流程使用ABIPRISMDyeDeoxy測序試劑(AppliedBiosystems，Inc.，CA)測定DNA樣品的序列。反應結束後在ABI377自動DNA測序儀上電泳。使用Sequencherv3.0DNA分析軟體(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)對DNA序列資料進行分析。然後通過翻譯cryET75的開放閱讀框推斷出CryET75蛋白質的胺基酸序列。所確定的CryET75的氨基末端序列，與由核苷酸序列得出的氨基末端胺基酸序列相同。如5.11部分中所述，將來自EG44529的8.4kbHindIII片段進一步消化後將片段亞克隆，分別單獨或一同表達晶體蛋白。CryET39蛋白質的表達取決於將cryET74基因克隆在同一限制片段上。這表明，cryET74基因位於cryET39基因的上遊，cryET74基因的啟動子也能指導cryET39基因的表達。設計cryET39基因5』端DNA序列特異寡核苷酸作為自動測序的引物。在各套測序反應數據的基礎上設計連續引物。這樣，cryET39的上遊區段可以分段進行測序。DNA序列的翻譯找出編碼CryET74蛋白質的開放閱讀框。確定出在推斷出的胺基酸序列中有一個區段與CryET74氨基末端胺基酸序列相同，證明此開放閱讀框是cryET74基因。5.7.1CryET39CryET39基因的DNA序列如SEQIDNO7所示，編碼CryET39多肽的胺基酸序列如SEQIDNO8所示。5.7.1.3從EG5899分離的CryET39多肽的特性CryET39多肽包括有385個胺基酸的序列，其分子量計算值為44246Da，其PI計算值為5.47。表11中給出CryET39多肽的胺基酸組成。表11CryET39的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala61.5Leu338.5Arg30.7Lys3910.1Asn318.0Met82.0Asp235.9Phe61.5Cys20.5Pro164.1Gln174.4Ser307.7Glu277.0Thr369.3Gly194.9Trp71.8His82.0Tyr246.2Ile328.3Val184.6酸性胺基酸(Asp+Glu)50鹼性胺基酸(Arg+Lys)42芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)37疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)1265.7.2CryET74CryET74基因的DNA序列如SEQIDNO5所示，編碼CryET74多肽的胺基酸序列如SEQIDNO6所示。5.7.2.3CryET74多肽的特性CryET74多肽包括有119個胺基酸的序列，其分子量計算值為13221Da，其PI計算值為6.21。表12中給出CryET74多肽的胺基酸組成。表12CryET74的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala43.3Leu65.0Arg65.0Lys75.8Asn65.0Met21.6胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Asp75.8Phe43.3Cys10.8Pro32.5Gln32.5Ser1310.9Glu86.7Thr1210.0Gly108.4Trp10.8His54.2Tyr43.3Ile97.5Val86.7酸性胺基酸(Asp+Glu)15鹼性胺基酸(Arg+Lys)13芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)9疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)345.7.3CryET75CryET75基因的DNA序列如SEQIDNO15所示，編碼CryET75多肽的胺基酸序列，如SEQIDNO16所示。5.7.3.3CryET75多肽的特性SEQIDNO15多肽包括有310個胺基酸的序列，其分子量計算值為34259Da，其PI計算值為5.67。表13中給出GryET75多肽的胺基酸組成。表13CryET75的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala154.8Leu247.7Arg51.6Lys299.3Asn154.8Met72.2Asp175.4Phe113.5Cys20.6Pro92.9Gln113.5Ser3410.9Glu227.0Thr3310.6Gly175.4Trp10.3胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％His61.9Tyr113.5Ile227.0Val196.1酸性胺基酸(Asp+Glu)39鹼性胺基酸(Arg+Lys)34芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)23疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)955.8實施例8——CryET39的同源性分析用推斷出的CryET39蛋白質的胺基酸序列查詢相關蛋白質同源性的電子序列數據。使用FASTA3.15版本(Pear和Lipman，1988)在歐洲生物信息協會FASTA伺服器上以以下參數(matrix＝pam150，ktup＝2，gapcost＝-12，gapxcost＝-2)查詢SWISS-PROTALL(swall)數據。數據查詢結果顯示，CryET39與來自B.sphaericus的42kDa殺蚊晶體蛋白322個胺基酸區有～25％胺基酸序列相似性。CryET39與來自B.sphaericus的51kDa晶體蛋白343個胺基酸區有～20％胺基酸序列相似性。數據中再沒有其它蛋白質序列與CryET39序列有明顯的序列相似性。使用BLASTP2.0版本(Altschul等，1997)運用以下參數matrix＝blosum62、gappedalignment、otherparameters＝defaultsettings，再用CryET39的胺基酸序列查詢國家中心生物技術信息(NCBI)的冗餘(nr)數據。nr數據包括來自於GenBank的PDS、SWISS-PROT、PIR及CDS轉換的序列結果。查詢結果與使用FASTA查詢所得結果一致。5.9實施例9——CryET74相關蛋白質的數據查詢同樣，利用5.8中所述的FASTA和BLASTP，用推斷的CryET74的胺基酸序列查詢SWISS-PROTALL數據和nr數據。沒有發現與CryET74有明顯序列相似性的蛋白質。5.10實施例10——CryET75相關蛋白質的數據查詢同樣，利用5.8中所述的FASTA和BLASTP，用推斷的CryET75的胺基酸序列查詢SWISS-PROTALL數據和nr數據。FASTA查詢結果顯示，CryET75與Cry15Aa(GenBank登陸號M76442)在121個胺基酸的序列上有28.1％的序列同一性。BLASTP分析表明，在231個胺基酸的區域上有23％的序列同一性。5.11實施例11——cryET39基因和cryET74基因的亞克隆和表達從EG11529裂解培養物中獲得的伴胞晶體蔗糖梯度組分中，既包括CryET39多肽又包括CryE74多肽。對CryET39和CryE74製劑進行生物鑑定，表明該製劑與由EG11529製備的總晶體蛋白一樣，對WCRW有毒殺作用。為單獨確定CryET39蛋白質的殺蟲活性，有必要從另一個啟動子下遊克隆cryET39基因。正如下文所述，該過程是通過使用PCRTM來完成的，擴增蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白Cry2Ac(Wuetal.，1991)的啟動子區，並放置在穿梭載體中PCRTM擴增的cryET39基因的上遊，僅使CryET39蛋白質在重組蘇雲金芽孢桿菌菌株中表達。設計寡核苷酸作為PCRTM擴增及隨後cry2Ac基因調控區克隆的引物；包括開放閱讀框ORF1和ORF2、核糖體結合位點以及Cry2Ac的起始密碼子。寡聚物mr47包括cry2Ac編碼區起始密碼子上遊2124個鹼基對處的EcoRI限制位點。mr47的序列為5′-ATATCTATAGAATTCGCAATTCGTCCATGTG-3′(SEQIDNO25)EcoRI互補的寡核苷酸引物，mr43，由cry2Ac基因核糖體結合位點和起始密碼子(Met)的倒轉互補序列組成。在RBS與Met密碼子之間插入了一個HindIII位點，可以插入cryET39基因序列的讀框。mr43的序列為5′-CAGTATTCATATAAGCTTCCTCCTTTAATA-3′(SEQIDNO26)MetHindIIIRBS擴增cryET39基因的PCRTM反應由以下組成四種脫氧核苷三磷酸——dATP、dTTP、dCTP、dGTP，最終濃度200μM；5μL10×TaqExtendTMBuffer(StratageneCloningSystem)，終濃度為1×；10ngpEG1273，cry2Ac基因克隆到pUC18後構成pEG1273；寡核苷酸引物mr47和mr43的終濃度各為2.5μM；2.5個單位的TaqExtendTM(StratageneCloningSystem)；2.5個單位的TaqPolymerase(PromegaCorp)；加dH2O至最終反應體系50μl。反應在PowerBlockTMEasyCyclerTMSeries溫度循環儀(Ericomp，Inc.，SanDiego，CA)中進行。循環條件由94℃2min變性步驟組成，變性步驟之後為30個循環的94℃1min、50℃退火1min及72℃延伸10min。循環之後取5μl反應產物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，證實由PCRTM產生出一條大約2-kb的產物條帶。在製造商的指導下(QIAGEN，Inc.)使用QIAquickTMspin柱將剩下的反應產物純化。隨後將PCRTM擴增出的cry2Ac啟動子克隆到E.coli/B.thuringiensis穿梭載體pHT315(Arantes和Lereclus，1991)中。該過程是通過將pHT315和PCRTM產物在分開的反應中用限制性酶EcoRI和HindIII消化來完成的。這些酶在pHT315的多克隆區中及PCRTM產物末端附近切割，在由寡核苷酸mr47和mr43限定的序列中切割。通過瓊脂糖凝膠分離消化過的PCRTM產物，然後使用Geneclean方法(Bio101)將大約2kb的片段純化。用類似方法純化消化了的pHT315。然後，在包含T4DNA連接酶和連接緩衝液的反應中(PromegaCorp)將片段連接到消化了的pHT315之中。參照製造商所述的方法將連接混合物導入到轉化-感受態E.coliDH5αTM細胞(GibcoBRL)中。E.coli細胞在包含50μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上鋪板，37℃培育過夜。pHT315包含能賦予已經成功轉化該質粒的重組細胞氨苄青黴素抗性的基因。從數個抗氨苄青黴素的克隆中製備質粒DNA，用EcoRI和HindIII消化來證實2kb插入片段的存在。使用其中的一個命名為pEG1915的質粒進行cryET39基因的克隆和表達。使用PCRTM從pEG1337中的克隆8.4kb片段中擴增cryET39。設計寡核苷酸引物使cryET39插入到pEG1915中，以便基因能夠從cry2Ac啟動子表達。cryET39特異的寡核苷酸，mr44，包括cryET39的起始密碼子(Met)，同時將HindIII位點人工改造到起始密碼子中。mr44的序列為5′-AAGGTGAAGCTTTTATGTTAGATACTAATAAAGTTTATG-3′(SEQIDNO27)HindIIIMet設計第二種引物，稱為mr45。設計該引物與cryET39編碼區3』末端212個鹼基對互補。將HindIII位點引入到mr45的序列之中。5′-CCGGAATAGAAGCTTTGCATATGG-3′(SEQIDNO28)HindIII用mr44和mr45作為引物所產生的cryET39PCRTM產物用HindIII切割並插入到質粒pEG1915中由mr43確定的HindIII位點之中。這就取代了克隆cry2Ac啟動子核糖體結合位點下遊7鹼基處的cryET39基因中的Met密碼子。預想這樣的構型可以使重組CryET39蛋白質有效表達。用將cryET39基因插入到pEG1915中去的連接反應轉化E.coliDH5αTM細胞產生氨苄青黴素抗性。製備質粒DNA，用限制性酶分析鑑定出一個克隆cryET39基因已經以適當方向插入到了pEG1915中。為使有效轉錄發生，cryET39的有意義鏈有必要以與cry2Ac啟動子調控區相同的方向定向。用圖2中所示酶進行酶切消化後，鑑定出其中一個質粒中以合適方向包含cryET39。將該質粒命名為pEG1921。導入pEG1921將蘇雲金芽孢桿菌的一個Cry-菌株轉化成紅黴素抗性。重組菌株命名為EG11937，生長在C2芽孢形成培養基中直到形成芽孢、形成晶體。用相差顯微鏡明顯鑑定出培養基中晶體包含體的形狀為伸長的長方形或針形。通過離心收集芽孢、晶體以及未裂解的孢子囊。沉澱中的物質用0.005％TritonX-100、10mMTris-HClpH7.5溶液漂洗2次，然後懸浮在1/2體積的原漂洗溶液中。用SDS-PAGE顯示晶體中的蛋白質。在100μl樣品中加入25μl0.5NNaOH抑制蛋白質水解作用，因為在晶體溶解後蛋白質水解作用將破壞蛋白質。室溫中2.5min後，在樣品中加入65μl3×Laemmlisamplebuffer(30％甘油、15％2-巰基乙醇、3％SDS、0.1875MTris、0.01％溴酚藍)。樣品加熱到100℃5min，短暫離心後去除掉不溶物質，在丙烯醯胺凝膠上上樣。用考馬斯亮藍R-250染色使蛋白質條帶顯色。分析結果表明，EG11937表達的是44kDaCryET39蛋白質，而並不是如重組菌株EG11529所產生的13kDa(CryET74)蛋白質或34kDa(CryET75)蛋白質。對由PCRTM產生的pEG1921中cryET39基因的拷貝進行序列測定，證實與來自pEG1377的野生型拷貝相同。培養菌株EG11937，並準備對WCRW幼蟲的生物鑑定。未曾料到的是，來自EG11937的晶體蛋白對昆蟲沒有活性。該結果表明，要麼CryET39蛋白質的毒殺作用需要CryET74的存在，要麼CryET74為有效毒素蛋白質。用限制性內切酶HindIII和EcoRI消化pEG1377，釋放出大約3.2kb的片段中包含cryET74基因以及一小部分的cryET39基因。在瓊脂糖凝膠上分離該片段並純化，然後使用上文中所述方法將該片段克隆到用HindIII和EcoRI消化過的穿梭載體pHT315中。將所得質粒稱作pEG11935，通過電穿孔導入到Cry-蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10650中，轉化重組細胞成紅黴素抗性。將命名為EG11935的轉化體培養在C2芽孢形成培養基中，以確定所克隆的cryET74基因是否能夠指導晶體蛋白的表達。收集培養物，通過如上所述的SDS-PAGE分析晶體蛋白。EG11935隻產生CryET74，且對WCRW幼蟲沒有活性。觀察到單獨的CryET39與CryET74對WCRW幼蟲都沒有活性，這表明這兩種蛋白質相互作用相成毒素蛋白質組分。使用PCRTM產生出包含CryET39基因和CryET74基因的DNA片段，但是在8.4kbpEG1377片段(參照pEG1377的圖譜)上並沒有CryET75基因。使用m13/pUC正向測序引物(GibcoBRL)和mr45擴增出大約為3.7kb包含cryET74和cryET39的產物。用pEG1377作為模板，使用如上所述條件進行PCRTM。PCRTM產物用凝膠純化，用HindIII消化，然後克隆到用HindIII切割過並用細菌鹼性磷酸酶處理過的pHT315中。將所得質粒稱作pEG1920，用此質粒轉化Cry-蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10650中產生紅黴素抗性。培養命名為EG11936的重組體，估計晶體蛋白產量。EG11936既產生44kDa的CryET39多肽，又產生大約為13kDa的CryET74多肽。與在重組菌株EG11529中所觀察到的活性相比，EG11936產生的晶體蛋白對WCRW幼蟲有活性。5.12實施例12——晶體蛋白對昆蟲的毒殺性5.12.1EG11529晶體蛋白對SCRW幼蟲的毒殺性對表達CryET39多肽、CryET74多肽和CryET75多肽的重組菌株EG11529對SCRW(Diabroticaundecimpunctaiahowardi)幼蟲的毒性進行了檢測。EG11529於30℃在C2培養基中培養3天，直到芽孢形成、溶菌發生。離心收集培養物，在1×原體積的0.005％TritonX-100中漂洗2次，然後懸浮在1/10原體積的0.005％TritonX-100中。與EG11535比較，將表達鞘翅目毒性蛋白質Cry3B2(Donovan等，1992)的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株培養後以相同方式收集。使用SDS-PAGE顯示晶體中的蛋白質。在製造商的方法指導下，使用求積光密度計Model300A(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)通過與標準上樣已知量的牛血清白蛋白質(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)比較對蛋白質定量。通過與Marrone等(1992)類似的方法(無福馬林)用表面汙染人工飼餵方式生物測定SCRW幼蟲。每個生物測定由8種連續水稀釋液構成，在食物表面使用等分試樣。稀釋液(0.005％TritonX-100水溶液)涼幹後，在食物上放置一齡幼蟲並於28℃溫浴。每一劑量檢測32頭幼蟲。7天後計算死亡率。從重複的生物測定中收集數據進行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用對照死亡校對，而對照僅為稀釋液(Abbot，1925)。對導致LC50的每孔晶體蛋白的量，即殺死50％待測昆蟲所需的濃度，進行報導。同時報導置信區間。表14EG11529對SCRW幼蟲的殺蟲活性樣品LC5095％C.I.(μg蛋白質/孔)EG1152934.128-41EG11535(Cry3B2)49.533-83上表所示結果表明，EG11529晶體蛋白對SCRW幼蟲有顯著活性。EG11529的LC50值比在Cry3B2對照蛋白質中所見的低，雖然95％置信區間的確重疊，這表明差異可能並不顯著。5.12.2CryET39和CryE74對WCRW幼蟲的毒殺性確定EG11529對WCRW幼蟲(Diabroticavirgiferavirgifera)的毒性，以及構建的產生單個EG11529晶體蛋白的重組菌株對WCRW幼蟲的毒性。重組菌株及其產生的晶體蛋白如表15所示。表15Bt重組菌株表達的晶體蛋白MW(kDa)*EG11529CryET3944kDaCryET7413kDaCryET7534kDaEG11934CryET7534kDaEG11935CryET7413kDaEG11936CryET39+CryET7444kDa+13kDaEG11937CryET3944kDa*分子量是通過SDS-PAGE凝膠上蛋白質的遷移率以及與已知分子量標準比較估計出來的。用基本上如所述SCRW分析方法進行一系列生物鑑定以確定晶體蛋白的活性，不同的是用的是新生幼蟲而不是一齡幼蟲。使用蔗糖分級梯度製備第一次分析的純化晶體蛋白。於C2芽孢形成培養基中在30℃培養3天。形成芽孢且裂解的培養物通過離心收集，並用等體積漂洗緩衝液(10mMTris-HCl，pH7.5，0.005％TritonX-100)漂洗2次，然後懸浮在1/10原體積漂洗溶液中。蔗糖分級梯度的製備方法是，於25×89mmUltra-Clear離心管(BeckmanInstruments，Inc.，PaloAlto，CA)中，在漂洗溶液中鋪入濃度逐漸降低的蔗糖溶液。製作步驟由7.5ml每種以下濃度的蔗糖(從底部到頂部)構成79％-72％-68％-55％。將5ml芽孢/晶體懸液鋪到梯度的頂部。在L8-70M超速離心機(BeckmanInstruments)中，於18000rpm4℃過夜離心梯度。EG11529的晶體蛋白分離成2條明顯不同的條帶。一條條帶位於68％-72％界面，僅包含CryET75蛋白質。第二條條帶位於72％-79％界面，既包含CryET39又包含CryET74。用移液管將條帶吸出，並在漂洗緩衝液中漂洗2次。隨後蛋白質樣品跑第二次梯度，確保CryET75與CryET39+CryET74完全分離。蛋白質樣品在SDS-PAGE凝膠上跑樣，以證實樣品的完整性。隨後按照製造商方法，使用標準蛋白質分析法(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)對樣品定量。CryET39+CryET74純化晶體蛋白樣品以及CryET75純化晶體蛋白樣品對WCRW幼蟲的毒性與EG11529的毒性進行分析比較。將EG11529製備成芽孢/晶體懸液，通過SDS-PAGE以及光密度測定法確定蛋白質的量。從分析結果中收集數據進行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用對照死亡校對，而對照僅為稀釋液(Abbot，1925)。對導致LC50的每孔晶體蛋白的量(175mm2食物表面)，即殺死50％待測昆蟲所需的濃度，進行報導。同時在表16中報導95％置信區間。表16EG11529蛋白質對WCRW幼蟲的殺蟲活性樣品LC5095％C.I.(μg蛋白質/孔)CryET75無活性*EG115298.66.6-10.6CryET39+CryET749.77.2-12.7*劑量為45μg/孔時的死亡率為6％分析結果明顯表明，純化的CryET75蛋白質對WCRW幼蟲沒有毒殺作用。包含CryET39和CryET74混合物的樣品與EG11529有相似的活性，這表明在EG11529對WCRW幼蟲的毒性中CryET75沒有協同作用。為了確定CryET74是否是EG11529菌株的毒性組分，將僅產生CryET74的EG11935的芽孢/晶體懸液，與既產生CryET39又產生CryET74的EG11529和EG11936的芽孢/晶體懸液比較生物鑑定。從重複的生物測定中收集數據進行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用對照死亡校對，而對照僅為稀釋液(Abbot，1925)。對導致LC50的每孔晶體蛋白的量(175mm2食物表面)，即殺死50％待測昆蟲所需的濃度，進行報導同時在下面的表17中報導95％置信區間。表17蘇雲金芽孢桿菌蛋白質對WCRW幼蟲的殺蟲活性樣品LC5095％C.I.(μg/孔)EG11935在80μg/孔時無活性*EG115299.786.9-12.5EG1193614.59.7-19.5EG11935產生的CryET74蛋白質對WCRW幼蟲沒有活性，表明CryET39蛋白質，或單獨或與CryET74一起，負責如EG11529和EG11936中所見到的殺蟲活性。將僅產生CryET39晶體蛋白的EG11937的芽孢/晶體懸液與EG11936和EG11937的懸液進行分析比較。本分析方法中也包括50∶50EG11935+EG11937的混合物，以觀察CryET39與CryET74的混合物是否有與EG11936類似的活性。數據(表18)所表示的是百分數，為指定劑量校對了稀釋液對照中對照死亡率後的死亡率。為了重複，製備了2個相同的EG11937樣品。表18樣品Dose(μg/孔)百分數EG11935800EG119351600EG1193680100EG11936160100EG11937(1)8010.5EG11937(1)1606.7EG11937(2)8013.3EG11937(2)1600EG11935+EG11937(1)80100EG11935+EG11937(1)160100EG11935+EG111937(2)80100EG11935+EG11937(2)16093.3此測定結果清楚地表明，EG11937中表達的單獨CryET39蛋白質本身並不能解釋在EG11936或EG11529中所見到的活性。然而，將CryET74加入到CryET39蛋白質中後所得組合物對WCRW幼蟲有毒殺作用。這些資料表明，CryET39和CryET74相互作用形成有毒組分——EG11529和EG11936。5.12.3晶體蛋白EG11529對CPB幼蟲的毒殺性按如上所述收穫形成芽孢的EG11529培養物並漂洗和重懸，並確定EG11529所產生的晶體蛋白對馬鈴薯甲蟲(CPB)的幼蟲是否有毒殺作用。使用與在SCRW測定中類似的技術對CPB幼蟲進行測定實驗，唯一的區別是將人工飼料替換成BioServe’s#9380昆蟲食物(添加馬鈴薯片)。第3天時計算死亡率(而不是在第7天)。該測定中每140μg/孔的單一劑量中使用16隻昆蟲。在這種劑量下100％的幼蟲被殺死，這說明EG11529對CPB幼蟲有毒殺作用。5.13實施例13——編碼相關δ-內毒素多肽的基因的鑑定形成芽孢的培養物中的伴胞晶體通過SDS-PAGE分析，證明蘇雲金芽孢桿菌產生的晶體蛋白大小為40-50kDa。按照如上所述流程提取總DNA，用限制性內切酶HindIII消化後通過瓊脂糖凝膠電泳分離限制片段並印跡到硝酸纖維素濾膜上進行DNA印跡分析。使用PCRTM技術擴增cryET39基因的區段，用此片段作為雜交探針從這些蘇雲金芽孢桿菌菌株中鑑定和克隆相關毒素基因。PCRTM片段從cryET39編碼區的第176個核苷酸一直延伸到距離基因3』末端200核苷酸處，該片段是使用反向引物mr13和mr24並以質粒pEG1337為模板產生的。mr135』-TGACACAGCTATGGAGC-3』(SEQIDNO33)mr245』-ATGATTGCCGGAATAGAAGC-3』(SEQIDNO34)使用α-32P-ATP和隨機引物標記試劑盒(Prime-a-GeneLabelingSystem；PromegaCorporation，Madison，WI)對擴增出的DNA片段進行放射性標記。濾膜和cryET39特異雜交探針溫育後在中等嚴格條件下(如在0.1X-1.0XSSC中於55℃漂洗)，用X膠片暴光得到鑑定包含cryET39相關序列的DNA片段的放射自顯影圖。數個菌株中產生出與EG5899不同的雜交模式。將這3個菌株分別命名為EG4100、EG4851和EG9444，並作進一步鑑定。使用5.4部分、5.5部分及5.6部分中所述流程，完成對來自菌株EG4100、EG4851和EG9444的基因的克隆和表達。從菌株中製備DNA，用限制酶MboI部分消化後產生出基本隨機分布的DNA片段。MboI片段在瓊脂糖凝膠上分離後純化大小在6-10kb之間的片段。隨後將純化出的MboI片段連接到蘇雲金芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體pHT315中，而該穿梭載體預先用BamHI消化並用鹼性磷酸酶處理。然後用連接混合物轉化大腸桿菌產生氨苄青黴素抗性，這樣就構建出了代表各個不同蘇雲金芽孢桿菌菌株基因組的克隆片段的文庫。將大腸桿菌文庫鋪在含有50μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板上並將菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上。為了鑑定cryET39相關序列，濾膜要麼用如5.4部分和5.5部分中所述的放射性標記寡核苷酸wd271雜交(EG9444文庫)，要麼按如上所述cryET39特異雜交探針雜交(EG4100和EG4851文庫)。從雜交的大腸桿菌文庫中分離質粒DNA，並轉化acrystalliferous蘇雲金芽孢桿菌寄主菌株產生紅黴素抗性。將重組蘇雲金芽孢桿菌克隆培養在C2培養基中形成芽孢，按如5.6部分中所述將晶體蛋白進行SDS-PAGE分析。按如上所述方式從EG4100文庫中鑑定出的克隆片段編碼大約60kDa的晶體蛋白，將其命名為CryET69(SEQIDNO14)。DNA序列分析表明cryET39基因(SEQIDNO13)編碼含有520個胺基酸殘基的蛋白質。CryET69蛋白質與CryET39有～23％的序列相似性。將表達CryET69的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株命名為EG11647，而將包含cryET39基因的重組質粒命名為pEG1820。用ARSPatentCultureCollection保藏EG4100和EG11647，指定其NRRL保藏號分別為B-21786和B-21787。按如上所述從EG9444文庫中分離的克隆片段編碼大約為45kDa的晶體蛋白，將該蛋白質命名為CryET71，與CryET39相關；克隆片段還編碼大約為14kDa的晶體蛋白，將該蛋白質命名為CryET79，與CryET74相關。DNA序列分析表明，cryET71基因(SEQIDNO11)編碼含有397個胺基酸的蛋白質，而cryET79基因(SEQIDNO9)編碼含有123個胺基酸的蛋白質。CryET71蛋白質(SEQIDNO12)與CryET39有78％的序列相似性，而CryET79蛋白質(SEQIDNO10)與CryET74有80％的序列相似性。將表達CryET71和CryET79的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株命名為EG11648，同時將包含cryET71基因和cryET79基因的重組質粒命名為pEG1821(圖9)。EG11648對WCRW幼蟲有毒殺作用。通過它們與相關CryET39蛋白質和CryET74蛋白質的相似性，可以推斷完全的WCRW毒殺性既需要CryET71又需要CryET79。於ARSPatentCultureCollection保藏EG9444和EG11648，指定其NRRL保藏號分別為B-21785和B-21788。按如上所述從EG4851文庫中分離的克隆片段編碼大約為44kDa的晶體蛋白，將該蛋白質命名為CryET76，與CryET39相關；克隆片段還編碼大約為15kDa的晶體蛋白，將該蛋白質命名為CryET80，與CryET74相關。DNA序列分析表明，cryET76基因(SEQIDNO1)編碼含有387個胺基酸的蛋白質，而cryET80基因(SEQIDNO3)編碼含有132個胺基酸的蛋白質。CryET76蛋白質(SEQIDNO2)與CryET39有61％的序列相似性，而CryET80蛋白質(SEQIDNO4)與CryET74有52％的序列相似性。將表達CryET76和CryET80的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株命名為EG11658，同時將包含cryET76基因和cryET80基因的重組質粒命名為pEG1823(圖9)。EG11658對WCRW幼蟲有毒殺作用。通過它們與相關CryET39蛋白質和CryET74蛋白質的相似性，可以推斷完全的WCRW毒殺性既需要CryET76又需要CryET80。於ARSPatentCultureCollection保藏EG4851和EG11658，指定其NRRL保藏號分別為B-21915和B-21916。基於這些結果，發明者認為，使用與本文所述類似的流程可以發現並分離其它蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白毒素。可以從寡核苷酸、PCRTM產物及限制片段製備出基於本文公開新序列的DNA探針，並用於鑑定與本文所述序列相關的其它基因。同時可以克隆得到這些新基因，並通過序列測定進行鑑定，而它們所編碼的蛋白質可以利用本文所述方法對多種害蟲進行生物測定的評估。反過來，正如上面的實施例中所見，新的基因也可以用於鑑定新的相關基因家族。5.14實施例14——相關Cry基因的序列測定5.14.1CryET71利用寡核苷酸wd271作為測序引物並使用5.7部分中所述流程，得到cryET71基因的原始核苷酸序列。根據最初序列測定的結果設計出用於引發測序反應的連續寡核苷酸，以獲得cryET71基因的全序列。CryET71基因的DNA序列如SEQIDNO11所示，編碼CryET71多肽的胺基酸序列如SEQIDNO12所示。5.14.1.4CryET71多肽的特性CryET71多肽包括有397個胺基酸的序列，其分子量計算值為45576Da，其PI計算值為4.75。表19中給出CryET71多肽的胺基酸組成。表19CryET71的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala112.7Leu317.8Arg82.0Lys307.5Asn389.5Met82.0Asp287.0Phe61.5Cys20.5Pro164.0Gln256.2Ser297.3Glu225.5Thr338.3Gly194.7Trp71.7His51.2Tyr246.0Ile4110.3Val143.5酸性胺基酸(Asp+Glu)50鹼性胺基酸(Arg+Lys)38芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)37疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)1315.14.2CryET79從完成的cryET71序列設計寡核苷酸引物，利用該引物得到cryET79基因上遊原始序列。根據製造商指定流程，使用ABIPRISMTMDyeDeoxy序列測定化學試劑盒(AppliedBiosystems)測定DNA樣品序列。反應完成後，在ABI377自動化DNA測序儀上電泳。使用Sequencherv3.0DNA分析軟體(GeneCodesCorp.)分析DNA序列結果。根據最初序列測定的結果設計出用於引發測序反應的連續寡核苷酸，以獲得cryET79基因的全序列。5.14.2.3CryET79多肽的特性CryET79多肽包括有123個胺基酸的序列，其分子量計算值為13609Da，其PI計算值為6.32。表20中給出CryET79多肽的胺基酸組成。表20CryET79的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％氨暴酸殘基個數佔總數的％Ala54.0Leu43.2Arg43.2Lys64.8Ash129.7Met21.6Asp54.0Phe32.4Cys00Pro32.4Gln64.8Ser1310.5Glu75.6Thr1310.5Gly1310.5Trp10.8His64.8Tyr86.5Ile64.8Val64.8酸性胺基酸(Asp+Glu)12鹼性胺基酸(Arg+Lys)10芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)12疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)305.14.3CryET69使用5.3部分中所述流程確定所分離CryET69蛋白質氨基末端胺基酸序列。所分離蛋白質氨基末端序列為1234567891011MetAsnValAsnHisGlyMetSerCysGlyCys(SEQIDNO29)根據CryET69蛋白質氨基末端胺基酸序列設計寡核苷酸引物，用於cryET69的序列測定。將該寡核苷酸命名為crc12，其序列為5′-ATGAATGTAAATCATG-GGATGWSNTGT-3′(SEQIDNO30)其中，W＝A或T，S＝C或G。使用crc12作為測序引物並利用5.7部分中所述方法得到原始核苷酸序列。根據最初序列測定結果設計用於引發測序反應的連續寡核苷酸。使用自動化序列測定方法完成對序列的測定工作。根據製造商指定流程，使用ABIPRISMTMDyeDeoxy序列測定化學試劑盒(AppliedBiosystems)測定DNA樣品序列。反應完成後，在ABI377自動化DNA測序儀上電泳。使用Sequencherv3.0DNA分析軟體(GeneCodesCorp.)分析DNA序列結果。5.14.3.3CryET69多肽的特性CryET69多肽包括有520個胺基酸的序列，其分子量計算值為58609Da，其PI計算值為5.84。表21中給出CryET69多肽的胺基酸組成。表21CryET69的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala244.6Leu315.9Arg305.7Lys152.8Asn6011.5Met101.9Asp275.1Phe203.8Cys91.7Pro244.6胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Gln326.1Ser397.5Glu244.6Thr489.2Gly326.1Trp61.1His91.7Tyr224.2Ile244.6Val346.5酸性胺基酸(Asp+Glu)51鹼性胺基酸(Arg+Lys)45芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)48疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)1475.16實施例16——CryET69相關蛋白質的數據查詢使用如5.8部分中有關CryET39中所述的FASTA和BLASTP，用推斷出的CryET69胺基酸序列查詢SWISS-PROTALL和nr資料庫不同之處是以blosum50比較矩陣作FASTA查詢。FASTA查詢結果表明CryET69在338個胺基酸的區段上與B.sphaericus42kDa殺蚊晶體蛋白有～32％的序列相似性，而在其440個胺基酸的區段上與B.sphaericus51kDa殺蚊晶體蛋白有～30％的序列相似性。5.17實施例17——CryET71相關蛋白質和CryET79相關蛋白質的數據查詢使用如5.8部分中有關CryET39中所述的FASTA和BLASTP，用推斷出的CryET71和CryET79胺基酸序列查詢SWISS-PROTALL和nr資料庫。FASTA查詢結果表明CryET71在323個胺基酸的區段上與B.sphaericus42kDa殺蚊晶體蛋白有～25％的序列相似性，而在其388個胺基酸的區段上與B.sphaericus51kDa殺蚊晶體蛋白有～25％的序列相似性。FASTA和BLASTP查詢結果沒有找到與CryET79有明顯序列相似性的蛋白質。5.18實施例18——cryET76基因和cryET80基因的序列測定按照建立起的雙脫氧鏈終止DNA序列測定程序(Sanger等，1977)確定克隆在pEG1823上的基因部分DNA序列。按照製造商指定流程使用WizardSV少量製備試劑盒(PromegaCorp.)或者按照製造商指定程序使用Qiagen質粒試劑盒(QiagenInc.)完成雙鏈質粒模板DNA的製備工作。隨後用苯酚∶氯仿∶異戊醇(50∶48∶2)抽提一次，再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。按照製造商指定流程，使用SequenaseTMVersion2.0DNA測序試劑盒(UnitedStatesBiochemical/AmershamLifeScienceInc.)並使用35S-[dATP]作為標記同位素(DuPontNENResearchProducts)進行測序反應。在6％(wt./vol.)丙烯醯胺、42％wt./vol.)尿素測序凝膠上或在CastAwayTMPrecast6％丙烯醯胺測序凝膠(Stratagene)上進行反應的變性凝膠電泳。幹膠在室溫下過夜暴光在KodakX-OMATARX射線膠片(EastmanKodak)，得到放射自顯影圖。使用如上所述流程得到pEG1823上cryET76基因和cryET80基因的部分DNA序列。使用cryET39特異寡核苷酸mr18作為最初序列測定的引物。mr18的序列為5′-GTACCAGAAGTAGGAGG-3′(SEQIDNO.31)根據最初序列測定結果設計用於引發測序反應的連續寡核苷酸。使用自動化序列測定方法完成對序列的測定工作。根據製造商建議的流程，使用ABIPRISMTMDyeDeoxy序列測定化學試劑盒(AppliedBiosystems)測定DNA樣品序列。反應完成後，在ABI377自動化DNA測序儀上電泳。使用Sequencherv3.0DNA分析軟體(GeneCodesCorp.)分析DNA序列結果。CryET76(SEQIDNO1)和cryET80(SEQIDNO3)的DNA序列如下文所示。推斷出CryET76蛋白質(SEQIDNO2)和CryET80蛋白質(SEQIDNO4)的胺基酸序列也如下文所示。完整測序區段如(SEQIDNO17)中所示。5.18.1CryET76CryET76基因的DNA序列如SEQIDNO1所示，編碼CryET76多肽的胺基酸序列如SEQIDNO2所示。5.18.1.3CryET76多肽的特性CryET76多肽包括有387個胺基酸的序列，其分子量計算值為43812Da，其PI計算值為5.39。表22中給出CryET76多肽的胺基酸組成。表22CryET76的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala143.6Leu348.7Arg71.8Lys276.9Asn3910.0Met51.2Asp174.3Phe82.0Cys10.2Pro102.5Gln174.3Ser307.7Glu225.6Thr4712.1Gly225.6Trp82.0His41.0Tyr246.2Ile318.0Val205.1酸性胺基酸(Asp+Glu)39鹼性胺基酸(Arg+Lys)34芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)40疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)1305.18.2CryET80CryET80基因的DNA序列如SEQIDNO3所示，編碼CryET80多肽的胺基酸序列如SEQIDNO4所示。5.18.2.3CryET80多肽的特性CryET80多肽包括有132個胺基酸的序列，其分子量計算值為14839Da，其PI計算值為6.03。表23中給出CryET80多肽的胺基酸組成。表23CryET80的胺基酸組成胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Ala75.3Leu64.5Arg86.0Lys43.0Asn139.8Met21.5胺基酸殘基個數佔總數的％胺基酸殘基個數佔總數的％Asp86.0Phe21.5Cys10.7Pro32.2Gln32.2Ser118.3Glu86.0Thr118.3Gly96.8Trp10.7His86.0Tyr64.5Ile139.8Val86.0酸性胺基酸(Asp+Glu)16鹼性胺基酸(Arg+Lys)12芳香族胺基酸(Phe+Trp+Tyr)9疏水性胺基酸(芳香胺基酸+Ile+Leu+Met+Val)385.18.3從EG4851(SEQIDNO17)中分離的CryET76基因、CryET80基因和CryET84基因的特性包含CryET76、CryET80和CryET84編碼區的完整三個基因操縱子的DNA序列如SEQIDNO17所示。菌株EG4851中，cryET84基因的位置緊靠cryET80和cryET76基因的5』端。cryET84基因開始於核苷酸656，結束於核苷酸1678。cryET80基因開始於核苷酸1773，結束於核苷酸2168。CryET76基因開始於核苷酸2264，結束於核苷酸3424。5.19實施例19——序列同源性分析5.19.1CryET76相關蛋白質和CryET80相關蛋白質的數據查詢由核苷酸序列的翻譯推斷出CryET76蛋白質和CryET80蛋白質的胺基酸序列，並用推斷出的序列查詢相關蛋白質序列的序列資料庫。用歐洲生物技術學會(http//www.ebi.ac.uk)的FASTA伺服器所提供的FASTAversion3.15(Pearson和Lipman，1988)查詢SWISS-PROTALL資料庫，使用參數如下library＝swall，matrix＝pam150，ktup＝2，gapcost＝-12，gapxcost＝-2。同樣使用BLASTPversion2.0(Altschul等，1997)用CryET76和CryET80的胺基酸序列查詢國家生物技術信息學中心(NCBI)的non-redundant(nr)資料庫，使用參數如下matrix＝blosum62，gappedalignment、otherparameters＝defaultsettings。FASTA分析結果表明CryET76在320個胺基酸的區段上與B.Sphaericus的42kDa殺蚊晶體蛋白有～27％的序列相似性，而CryET80與SWISS-PROTALL中的序列沒有明顯的序列相似性。BLASTP查詢結果與FASTA查詢結果大致一致。沒有找到與CryET80有明顯序列相似性的蛋白質。5.19.2與Cry蛋白質的序列比較將CryET39、CryET74、CryET75、CryET71、CryET79、CryET76、CryET80和CryET69序列，與最新發表的專利申請中的序列進行對比。對比時使用PC/GENEversion6.85序列分析軟體包(IntelligeneticsCorp.MountainView，CA)中的PALIGN。排列配對時使用如下參數comparisonmatrix＝unitary、opengapcost＝3、unitgapcost＝1。5.19.2.1CryET39將CryET39序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET39和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的11、38和43號鑑定序列之間有序列相似性。CryET39與11號序列有99.2％的序列相似性，與38號序列有78.6％的序列相似性，而與43號序列有79.9％的序列相似性。5.19.2.2CryET74將CryET74序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET74和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的32、36和41號鑑定序列之間有序列相似性。CryET74與32號鑑定序列有100％的序列相似性，與36號鑑定序列有80.7％的序列相似性，而與申請中的41號序列有77.3％的序列相似性。5.19.2.3CryET75將CryET75序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET75與Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/17600中公開的鞘翅目毒性蛋白質CryET33有26％的序列相似性。5.19.2.4CryET71將CryET71序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET71和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的11、38和43號鑑定序列之間有序列相似性。CryET71與11號鑑定序列有78.4％的序列相似性，與38號鑑定序列有91.9％的序列相似性，而與申請中的43號序列有97.4％的序列相似性。5.19.2.5CryET79將CryET79序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET79和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的32、36和41號鑑定序列之間有序列相似性。CryET74與32號鑑定序列有79.8％的序列相似性，與36號鑑定序列有95.9％的序列相似性，而與申請中的41號序列有91％的序列相似性。5.19.2.6CryET76將CryET76序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET76和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的11、38和43號鑑定序列之間有序列相似性。CryET76與11號鑑定序列有60.8％的序列相似性，與38號鑑定序列有61.6％的序列相似性，而與申請中的43號序列有61.9％的序列相似性。5.19.2.7CryET80將CryET80序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET80和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的32、36和41號鑑定序列之間有序列相似性。CryET80與32號鑑定序列有52.1％的序列相似性，與36號鑑定序列有56.1％的序列相似性，而與申請中的41號序列有54.5％的序列相似性。5.19.2.8CryET69將CryET69序列與最新發表的專利申請中的序列進行排列比較，表明CryET69和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO97/40162中的11、38和43號鑑定序列之間僅僅有23-25％的序列相似性。該晶體蛋白與B.Sphaericus的殺蚊晶體蛋白之間比與蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白之間有更高程度的同源性。5.19.3概述以上分析結果表明，CryET69、CryET75、CryET76和CryET80的胺基酸序列與以前所述殺蟲晶體蛋白之間明顯不同。使用建立的有關蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白命名法(Crickmore等，1988)，CryET76和CryET80將被指定新的二次排列，而CryET69和CryET75將被指定新的初級排列。5.20實施例20——重組CryET76多肽和重組CryET80多肽的表達為了鑑定CryET76蛋白質和CryET80蛋白質的特性，有必要在並不產生其它晶體蛋白的蘇雲金芽孢桿菌菌株(即Cry-菌株)中表達克隆出的cryET76基因和cryET80基因。正如上文所述，在包含克隆的cryET76基因和克隆的cryET80基因的質粒pEG1823中，既包含蘇雲金芽孢桿菌複製起始位點又包含能在大腸桿菌中指導複製的起始位點。通過電穿孔(Macaluso和Mettis，1991)用pEG1823轉化Cry-蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10650，產生紅黴素抗性(EmR)。通過在含有25μg/ml紅黴素的LB瓊脂平板上培養過夜，從而篩選出轉化有紅黴素抗性的細胞。選擇每次轉化後的EmR菌落，進行進一步分析。將其中分離出的一個菌落命名為EG11658。於25℃下在含有25μg/ml紅黴素的C2芽孢形成培養基中培養4天，此時芽孢形成，細胞開始裂解。對產生芽孢的培養物進行顯微鏡觀察，結果表明重組菌株正在產生伴胞內含體。用離心法收穫EG11658產生芽孢的培養物，漂洗後重懸在1/10原體積的水中。懸浮液中的晶體蛋白用SDS-PAGE分析鑑定，結果表明產生了大約44kDa和15kDa的蛋白質。5.21實施例21——CryET76和CryET80對昆蟲的毒殺性確定CryET76和CryET80對WCRW的毒殺作用。於25℃下在C2培養基中培養4天，直到芽孢形成，細胞開始裂解。通過離心收穫培養物，用約2.5倍原體積的蒸餾水漂洗後重懸在1/10原體積的0.005％TritonX-100中。為便於與EG11658進行比較，以相同方式培養並收穫產生WCRW毒性蛋白質CryET39和CryET74的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株EG11529以及產生WCRW毒性蛋白質CryET71和CryET79的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株EG11648。按照所述方法(Brussock和Currier，1990)用SDS-PAGE對樣品中的毒素蛋白質進行定量。對該流程的改動是去除掉用3MHEPES的中和步驟。通過在人工食物(每升中含20g瓊脂、50g麥胚、39g蔗糖、32g酪蛋白、14g纖維、9gWesson鹽混合物、1g甲基對羥基苯甲酸酯、0.5g山梨酸、0.06g膽固醇、9gVanderzant’s維生素混合物、0.5ml亞麻子油、2.5ml磷酸/丙酸)上進行表面培養的方式對WCRW幼蟲進行生物測定。在對EG11658(CryET76和CryET80)、EG11529(CryET39和CryET74)以及EG11648(CryET71和CryET79)的每個生物測定實驗中，都包括將8種連續水稀釋液按等份試樣加到食物的表面。當稀釋液(含有0.005％TritonX-100的水溶液)幹後，將新生幼蟲放到食物表面並在28℃下溫育。每劑量處理中檢測32隻幼蟲。7天後計算死亡率。收集重複生物測定中的數據進行概率分析(Daum，1970)，其中死亡率用對照死亡率校對而對照僅為稀釋液(Abbott，1925)。結果按照每孔(食物表面為175mm2)中導致LC50的晶體蛋白的量即殺死50％待測昆蟲的濃度來報導。同時對於LC50值報導95％置信區間(表24)。表24晶體蛋白對WCRW幼蟲的殺蟲活性樣品晶體蛋白LC5095％C.I.LC95(μg蛋白質/孔)(μg蛋白質/孔)EG11658CryET7610.72.2-18.946CryET80EG11648CryET715.30.9-10.127CryET79EG11936CryET3912.312.5-14.332CryET74表24中所示結果表明，CryET76蛋白質和CryET80蛋白質對WCRW有明顯的殺蟲活性。5.22實施例22——CryET69對昆蟲的毒殺性使用5.21部分中所述流程確定CryET69對WCRW的毒殺性。結果按照每孔(食物表面為175mm2)中導致LC50的晶體蛋白的量即殺死50％待測昆蟲的濃度來報導。同時對於LC50值報導95％置信區間(表25)。表25CryET69對WCRW幼蟲的殺蟲活性樣品晶體蛋白LC5095％C.I.LC95(μg蛋白質/孔)(μg蛋白質/孔)EG112.4Cry3B213.83.2-30.1502EG11647CryET69147.373-12926190對照死亡率＝22％這些結果表明，CryET69比Cry3B2對WCRW的活性明顯要低。5.23實施例23——菌株EG12156和菌株EG12158的構成構建出產生CryET76或產生CryET80的重組蘇雲金芽孢桿菌菌株。將一個移碼突變引入到pEG1823上的cryET76編碼區中，產生的重組質粒僅僅能夠指導CryET80的產生。通過計算機分析技術對確定出的cryET76核苷酸序列進行分析，在cryET76編碼區中鑑定出一個獨一無二的AgeI限制位點。隨後用AgeI消化pEG1823證明該限制位點對於此質粒來說是獨一無二的。為了在該位點產生一個移碼突變，pEG1823用AgeI消化後在有dNTPs存在下用T4聚合酶對其DNA末端進行平端化處理。隨後通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離線性DNA片段，用剃鬚刀片切除DNA條帶，再用Qiagen凝膠抽提試劑盒進行純化。使用T4連接酶使純化出的DNA自連，並用於轉化大腸桿菌菌株DH5α，產生氨苄青黴素抗性。對從數個氨苄青黴素抗性菌落中所得DNA進行限制性酶分析，證明pEG1823上的AgeI位點已被破壞掉。將從這樣的一個克隆中所得重組質粒命名為pEG2206。隨後，通過電穿孔用pEG2206轉化acrystalliferous蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10650，產生紅黴素抗性。將含有pEG2206的重組Bt菌株命名為EG12156。在pEG1823上的cryET80編碼區中引入一個缺失突變，產生的重組質粒僅僅能夠指導CryET80的產生。通過計算機分析技術對確定出的cryET80核苷酸序列進行分析，在cryET80編碼區中鑑定出一個獨一無二的DraIII限制位點。隨後用DraIII消化pEG1823證明該限制位點對於此質粒來說是獨一無二的。為了在該位點產生一個突變，pEG1823用DraIII消化後在有dNTPs存在下用T4聚合酶對其DNA末端進行平端化處理。隨後通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離線性DNA片段，用剃鬚刀片切除DNA條帶，再用Qiagen凝膠抽提試劑盒進行純化。使用T4連接酶使純化出的DNA自連，並用於轉化大腸桿菌菌株DH5α，產生氨苄青黴素抗性。對從數個氨苄青黴素抗性菌落中所得DNA進行限制性酶分析，證明pEG1823上的DraIII位點已被破壞掉。將從這樣的一個克隆中所得重組質粒命名為pEG2207。隨後，通過電穿孔用pEG2207轉化acrystalliferous蘇雲金芽孢桿菌菌株EG10650，產生紅黴素抗性。將含有pEG2207的重組菌株命名為EG12158。用菌株EG11658、EG12156以及EG12158接種含有10μg/ml紅黴素的100mlC2肉湯培養基。在500ml帶擋板搖瓶中於28-30℃下將肉湯培養基振蕩培養3天，此時培養物完全形成芽孢，孢子囊裂解。在JA14轉頭中於4℃條件下通過在8000rpm(～9800×g)離心20分鐘沉澱芽孢和晶體。將沉澱重懸在50ml的10mMTris-HCl、50mMNaCl、1mMEDTA、0.005％TritonX-100(pH7.0)中。在BeckmanGPR離心機中於4℃條件通過在3750rpm(～3200×g)離心1小時，再次沉澱芽孢和晶體。將沉澱重懸在10ml的10mMTris-HCl、50mMNaCl、1mMEDTA、0.005％TritonX-100(pH7.0)中並保存在4-8℃。這些培養物所產生的晶體蛋白通過SDS-PAGE電泳檢測後隨後按照5.11部分中所述用考馬斯亮藍R-250染色。分析結果證實，菌株EG12156產生CryET80而並不產生CryET76，而菌株EG12158產生CryET76而並不產生CryET80(圖3)。因此，每種晶體蛋白都能獨立於其它晶體蛋白單獨產生。每種晶體蛋白在影響對WCRW毒殺性中的功能現在可以作更為細緻的研究。圖3中所述SDS-PAGE分析結果表明，在EG12156及EG12158晶體製劑中都存在另外一種蛋白質。該蛋白質的表觀分子量大約為35kDa，將其命名為CryET84。對pEG1823中克隆的插入片段作進一步的DNA序列分析後發現第三個開放閱讀框，該閱讀框編碼～38kDa的蛋白質(SEQIDNO19)。此編碼區位置緊靠cryET80基因5』端。因此，cryET84、cryET80和cryET76可能組成一個操縱子。從EG4851分離的CryET84蛋白質包括341個胺基酸組成的序列，計算其分子量大約為37884Da。CryET84的等電常數(pI)計算值為5.5。對如5.21部分所述WCRW生物測定中所用的EG11658晶體蛋白進行SDS-PAGE分析，沒有檢測到CryET84蛋白質條帶。很顯然，在菌株培養過程中或在收穫及漂洗芽孢-晶體懸浮液過程中的微細差別都有可能丟失CryET84。按照實施例8中所述，利用Blast2.0和FASTA3進行序列比較，結果表明在CryET84和所有已知蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白之間沒有發現明顯的序列相似性。5.24實施例24——抗蟲轉基因植物的製備5.24.1植物轉基因構建在以雙鏈DNA形式存在的植物轉基因表達過程中涉及在RNA聚合酶作用下，從一條DNA鏈轉錄出信使RNA(mRNA)，以及隨後在核內進行的mRNA初級轉錄本的加工過程。該加工過程包括將聚腺苷酸核苷酸加入到RNA3』末端形成3』非翻譯區。DNA轉錄成mRNA的過程受通常稱之為「啟動子」的DNA區段的調節。啟動子區包含的一段鹼基序列提供RNA聚合酶與DNA結合的信號，並利用一條DNA鏈為模板起始mRNA的轉錄過程，形成RNA的互補鏈。文獻中已經描述過在植物細胞中有活性的多個啟動子。可以從植物或植物病毒中得到這些啟動子，啟動子中包括但不局限於胭脂鹼合酶(NOS)和章魚鹼合酶(OCS)的啟動子(由根癌農桿菌致瘤質粒攜帶)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子和35S啟動子、來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)的光誘導啟動子及玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子。所有這些啟動子都已用於產生各種類型DNA構建體，這些構建體已在植物中進行表達(如可參照美國專利5463175，在此特別引入作為參考)。所選特定啟動子應該能夠使酶編碼區充分表達，產生出有效量的蛋白質。有一套優選啟動子為組成型啟動子如CaMV35S啟動子或FMV35S啟動子能在許多植物器官中產生高水平表達(美國專利5378619，在此特別引入作為參考)。還有一套優選啟動子為根增強或特異的啟動子如CaMV衍生出的4as-1啟動子或小麥POX1啟動子(美國專利5023179，在此特別引入作為參考；Hertig等，1991)。在用轉基因玉米防治玉米根蟲(Diabroticusspp.)時，根增強或根特異啟動子將尤其優選。本發明DNA構建體中所用的啟動子在需要時可以修飾，修飾後能影響它們的調控特性。例如，在沒有光時ssRUBISCO基因部分抑制ssRUBISCO的表達，可以將CaMV35S啟動子與ssRUBISCO基因部分相連接，所得啟動子在葉片中而不是在根中有活性。可以按照本文所述使用所得啟動子。為此，短語「CaMV35S」啟動子包括CaMV35S啟動子變體，例如通過與操縱子區連接的方式或隨機突變或控制性突變所得啟動子。另外，啟動子改變後可以包含多個「增強子序列」，可以促進基因的表達。本發明DNA構建體產生出的RNA也包含5』非翻譯前導序列。該序列可以來自選擇用於表達基因的啟動子，可以經過特定修飾以增強mRNA的轉錄。5』非翻譯區也可以來自於病毒RNA，可以來自於合適的真核基因或來自於合成基因序列。本發明並不局限於以下構建體該構建體中非翻譯區來自於與啟動子相伴的5』非翻譯區。為了在單子葉植物如玉米中進行優化表達，DNA表達構建體中可以同時包括內含子。內含子通常放在mRNA5』附近的非翻譯區中。內含子可以來自但不局限於以下一套內含子，包括玉米hsp70內含子(美國專利5424412，在此特別引入作為參考)或水稻Actin1啟動子(McElroy等，1990)。正如上文所注意到的一樣，本發明中植物嵌合基因的3』非翻譯區包含聚腺苷酸化信號，此信號在植物中能使腺苷酸核苷酸加入到RNA3』末端。優選的3』非翻譯區為(1)包含土壤農桿菌致瘤(Ti)質粒基因如胭脂鹼合成酶(NOS)的聚腺苷酸化信號的3』轉錄非翻譯區及(2)植物基因如豌豆ssRUBISCOE9基因(Wong等，1992)。5.24.2植物轉化和表達可以通過適當方法如本文詳述方法，將包含本發明δ-內毒素編碼區的轉基因插入到植物基因組中。合適的植物轉化載體包括來自於根癌農桿菌Ti質粒的質粒，同時包括由Herrera-Estrella(1983)、Bevan等(1983)、Klee(1985)及Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0120516公開的載體。除了來自於根癌農桿菌的Ti質粒或毛根誘導(Ri)質粒的植物轉化載體外，可以使用其它將本發明DNA構建體插入到植物細胞中。這些方法可能涉及，例如使用脂質體、電穿孔、增強DNA吸收的化學物質，通過微粒轟擊的游離DNA的送遞以及利用載體或花粉的轉化方法(Fromm等，1986；Fromm等，1990)。在4.0部分中對這些方法進行了詳細介紹。5.24.3植物表達載體的構建為使本文公開多肽在轉基因植物中有效表達，所選編碼殺蟲多肽的序列區段必須有合適的序列組成(Diehn等，1996)。例如，為了將一個或多個本文所述cry基因放置到適合在單子葉植物中表達的載體中(例如，在增強型花椰菜花葉病毒35S啟動子的控制之下，並連接到hsp70內含子後連接美國專利5424412中的胭脂鹼合酶聚腺苷酸化位點，該專利在此特別引入作為參考)，可以用合適酶如NcoI和EcoRI消化載體。隨後，將大約4.6kb的載體大片段電泳後純化，並用T4DNA連接酶將載體片段與包含植物化cry基因的合適限制片段連接。然後將連接混合物轉化到大腸桿菌中，羧苄青黴素抗性菌落長出後通過DNA小量製備程序提取質粒DNA。然後用諸如NcoI和EcoRI(一起)、NotI和PstI的酶對DNA進行限制性內切酶分析，鑑定出包含在增強型CaMV35S啟動子控制下與hsp70內含子融合的cry基因編碼區的克隆。為了將δ-內毒素基因放置在適合於穩定轉化並適合於產生抗蟲植物的載體中，可以通過電泳和純化過程分離得到pMON33708限制片段，該片段中包含在增強型CaMV35S啟動子控制下與hsp70內含子融合的賴氨酸氧化酶編碼區。然後將該片段與諸如pMON30460的載體連接，而後者預先用NotI和小牛小腸鹼性磷酸酶處理過(pMON30460包含在CaMV35S啟動子控制下的新黴素磷酸轉移酶編碼區)。然後，通過將連接混合物轉化到大腸桿菌中得到卡那黴素抗性菌落，用限制性內切酶消化小量製備的質粒DNA，對所得質粒進行鑑定。可以使用諸如NotI、EcoRV、HindIII、NcoI、EcoRI和BglII的限制酶，鑑定出包含正確插入到pMON30460對應位點中的限制片段的適當克隆，插入方向為兩個基因串聯排列(換句話說，cry基因表達盒的3』末端與nptII表達盒的5』末端連接)。然後，通過電穿孔將載體引入到植物原生質體中並通過蛋白質印跡和ELISA分析，證實所得載體在植物原生質體中的表達出Cry蛋白質。通過微粒槍轟擊隨後用巴龍黴素篩選的方法可以將該載體引入到植物胚如玉米的基因組DNA中，得到表達基本上如美國專利5424412(特別將該專利引入作為參考)中所述cry基因的玉米植株。本實施例中，載體引入的方法是，載體與賦予潮黴素抗性的質粒通過共轟擊方法進入到玉米未成熟胚的盾片(scutella)中，接著用潮黴素篩選，然後再生。然後，通過ELISA分析法對表達所選Cry蛋白質的轉基因植物系進行鑑定。隨後，檢測所得後代種子能否防止易感昆蟲的進食。5.25實施例25——為在植物中表達對細菌基因進行修飾5.25實施例25——為在植物中表達對細菌基因進行修飾已知許多編碼細菌晶體蛋白的野生型基因在植物中以全長基因或截短基因形式表達時表達都很差。通常情況下，cry基因的G+C含量低(37％)，經常包含許多個A+T富含區、潛在的聚腺苷酸化位點及多個ATTTA序列。表26顯示的是當製備「植物化」基因構建體時應該避免的潛在聚腺苷酸化序列一覽表。表26潛在的聚腺苷酸化信號序列一覽表AATAAA*AAGCATAATAAT*ATTAATAACCAAATACATATATAAAAAATAAATCAAATTAAA**ATACTAAATTAA**ATAAAAAATACA**ATGAAACATAAA***顯示的是潛在的植物主要聚腺苷酸化位點**顯示的是潛在的植物次要聚腺苷酸化位點其它均為潛在的植物次要聚腺苷酸化位點。可以按照下面所述方式選擇用於突變的區段。在cry基因DNA序列中尋找包含5個或更多個連續A或T鹼基對的所有區段。多於20-30個鹼基對區段上的周圍序列按A+T的最高百分比和長度進行排名。在DNA中分析可能包含聚腺苷酸化位點或ATTTA序列的區段。然後設計寡核苷酸，其中最大限度地減少包含一個或多個聚腺苷酸化位點或ATTTA序列的A+T連續區。在已發表的研究報告中，發現2個潛在的植物聚腺苷酸化位點比較關鍵。選擇能提高G+C含量但並不產生克隆和裝配修飾基因時用到的限制酶位點(例如BamHI、BglII、SacI、NcoI、EcoRV等)的密碼子。同樣避免使用包含雙聯體TA或GC的密碼子，因為研究報導這樣的密碼子在植物中出現的頻率很低。雖然CaMV35S啟動子在多種植物組織中通常為高水平組成型啟動子，但是在花組織中由CaMV35S啟動子驅動的基因表達水平比在葉組織中所見水平相對要低。因為受某些昆蟲破壞的經濟重要目標是花部分或來自花的部分(如棉花的蕾和棉桃、菸草的芽、番茄的芽和果實)，所以在這些組織中用CaMV35S啟動子獲得高水平表達的晶體蛋白通常是有利的。玄參花葉病毒(FMV)的35S啟動子與CaMV35S啟動子類似。已經將該啟動子分離並人工改造到植物轉化載體中。FMV35S啟動子相對於CaMV啟動子來說能在花組織中高水平表達，同時在其它組織如葉片中仍能提供類似高水平的基因表達。可以構建出其中的一個或多個全長天然δ-內毒素編碼基因或植物化δ-內毒素編碼基因由FMV35S啟動子驅動的植物轉化載體。例如，可以用這樣的載體轉化菸草植株，並通過蛋白質印跡或ELISA免疫測定法比較葉組織和/或花組織中晶體蛋白的表達情況。已經用FMV啟動子在花組織中產生出比CaMV相對高水平的晶體蛋白。5.26實施例26——帶有ssRUBISCO啟動子及葉綠體轉運肽的天然cry基因或植物化cry基因的表達植物中編碼RUBISCO小亞基(SSU)的基因通常進行高水平表達，並受光照調節，而且有時為組織特異性。這些表達特性主要歸因於這些基因的啟動子序列。有可能通過SSU啟動子的使用在植物中表達異源基因。植物通常包含多個SSU基因，而且不同SSU基因的表達水平和組織特異性有所不同。SSU蛋白質由核編碼，在胞質中以前體形式合成，在蛋白質前體中包含氨基末端延伸部分即葉綠體轉運肽(CTP)。CTP使前體指向葉綠體並促使SSU蛋白質進入葉綠體中。在該過程中，CTP從SSU蛋白質上裂解下來。已經使用這些CTP序列將異源蛋白質指導進入到轉化植物的葉綠體中。在植物中表達異源基因時SSU啟動子可能有多個優點。有些SSU啟動子進行非常高水平的表達，可能產生出與用CaMV35S啟動子觀察到的一樣高水平或更高水平的表達。SSU啟動子表達的組織分布與CaMV35S啟動子的不同，所以為了防治有些害蟲，將晶體蛋白的表達指向SSU高效表達的細胞中可以能有利的。例如，雖然CaMV35S啟動子相對為組成型，但是葉中CaMV35S啟動子在維管組織中比在葉的其它一些部位中更能高效表達，而大多數SSU啟動子在葉的葉肉細胞中能夠高效表達。有些SSU啟動子是高度組織特異性的，所以如果發現在某些細胞中表達蛋白質後對這些細胞產生有害作用，就可以利用特定SSU啟動子在植物組織的某些亞型中表達本發明中的蛋白質。例如，為了防治馬鈴薯中的馬鈴薯甲蟲，用SSU啟動子將晶體蛋白的表達指向葉片而不是可以食用的塊莖可能是有利的。利用SSUCTP序列將晶體蛋白定位到葉綠體中同樣可能有利。將蘇雲金芽孢桿菌晶體蛋白定位到葉綠體中，就可以保護這些蛋白質不受胞質中發現的蛋白酶的影響。這樣就可以使蛋白質變得穩定起來，並可以更高水平地積累活性毒素。包含CTP的cry基因可以與SSU啟動子或諸如CaMV35S的其它啟動子聯合使用。5.27實施例27——使用信號肽向胞外空間或液泡引入δ-內毒素多肽可以將本文所述蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素多肽定位在轉化植物細胞的胞質中，胞質定位後可能產生出抗蟲植物。然而，在某些實施方案中，將蘇雲金芽孢桿菌多肽的定位或產生指向植物的某一區室或多個區室中或指向特定植物細胞類型中可能是有利的。將蘇雲金芽孢桿菌蛋白質定位於區室而不是胞質中，就可以使蘇雲金芽孢桿菌蛋白質少些暴露於胞質蛋白酶，使蛋白質進行更多的積累，從而產生強的殺蟲活性。細胞外定位可以使某些昆蟲更有效地暴露於蘇雲金芽孢桿菌蛋白質，從而產生更高的效能。如果發現某種蘇雲金芽孢桿菌蛋白質對植物細胞功能有害，那麼將蛋白質定位於非胞質區室就能夠保護這些細胞免受蛋白質的毒性作用。在植物及其它真核生物中，定位於細胞外或定位於特定區室中的蛋白質在合成時通常帶有氨基末端胺基酸延伸部分即信號肽。信號肽指引蛋白質進入區室化途徑，通常從成熟蛋白質上裂解下來作為區室化中的早期步驟。對於細胞外蛋白質，分泌途徑一般涉及共翻譯插入進入內質網，信號肽的裂解就發生在此階段。隨後成熟蛋白質通過高爾基體進入小泡中，小泡與質膜融合後將蛋白質釋放到胞外空間。安排到其它區室中的蛋白質遵循類似途徑。例如，安排到內質網或高爾基體中的蛋白質即遵循此方案，但是它們特定滯留在適當的區室中。植物中的某些蛋白質同樣定向到液泡中。液泡是許多植物細胞的胞質中存在的另一種膜結合區室。定向於液泡的蛋白質在高爾基體中與上述途徑不同，在高爾基體中蛋白質進入小泡中後小泡與液泡融合。蛋白質定向的共同特徵是起始區室化過程的信號肽。許多情況下，將信號肽與蛋白質融合後將使蛋白質定向到內質網中。該步驟的效率可能同時取決於成熟蛋白質的序列。我們對將蛋白質指向特定區室而不是胞外空間中的信號了解的還不太清楚。看起來許多將蛋白質指向特定區室的信號包含在成熟蛋白質的胺基酸序列中。對於某些定向液泡的蛋白質的確如此，但是還不可能對這些序列進行精確定義。看起來對於包含信號序列而不包含其它區室化信號的蛋白質來說，分泌到胞外空間是一「錯誤」途徑。因此，將蘇雲金芽孢桿菌蛋白質指向胞質外的策略是，將合成的蘇雲金芽孢桿菌基因與編碼已知植物信號肽的DNA序列融合。這些融合基因將產生進入分泌途徑的蘇雲金芽孢桿菌蛋白質，使蛋白質胞外分泌或胞外定向到液泡或其它區室中。已經對多個植物基因的信號肽進行了描述。其中的一個序列是菸草致病相關蛋白PR1b的信號肽，已經有人對此信號肽進行了描述(Cornelissen等，1986)。PR1b蛋白質通常定位於胞外空間。其它類型的信號肽包含在豆科植物種子儲藏蛋白中。這些蛋白質定位於種子的蛋白體中，所謂的蛋白體是種子中發現的類似於液泡的區室。有人對普通菜豆(Phaseolusvulgaris)7S儲藏蛋白β亞基PvuB的信號肽DNA序列進行了描述(Doyle等，1986)。在已公開的序列基礎上，可以使用編碼PR1b和PvuB信號肽的寡核苷酸化學合成基因。有時為了完成異源蛋白質的分泌或區室化，除了包括信號肽正常裂解位點外可能有必要包括某些胺基酸序列。保證信號肽的正確裂解可能是必要的。6.0參考文獻以下參考文獻中提供本文所列方法外值得模仿的方法或其它詳細內容，在此特別引入作為參考U.S.Patent4,196,265，issuedApr.1，1980.U.S.Patent4,237,224，issuedDec.2，1980.U.S.Patent4,554,101，issuedNov.19，1985.U.S.Patent4,683,195，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,683,202，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,757,011，issuedJul.12，1988.U.S.Patent4,766,203，issuedAug.23，1988.U.S.Patent4,769,061，issuedSep.6，1988.U.S.Patent4,800,159，issuedJan.24，1989.U.S.Patent4,883,750，issuedNov.28，1989.U.S.Patent4,940,835，issuedFeb.23，1990.U.S.Patent4,943,674，issuedJul24，1990.U.S.Patent4,965,188，issuedOct.23，1990.U.S.Patent4,971,908，issuedNov.20，1990.U.S.Patent4,987,071，issuedJan.22，1991.U.S.Patent5,023,179，issuedJun11，1991.U.S.Patent5,097,025，issuedMar17，1992.U.S.patent5,106,739，issuedApr21，1992.U.S.Patent5,110,732，issuedMay5，1992.U.S.Patent5,139,954，issuedAug19，1992U.S.Patent5,176,995，issuedOct.15，1991.U.S.Patent5,177,011，issuedJan5，1993.U.S.Patent5,187,091，issuedOct.15，1991.U.S.Patent5,334,711，issuedAug.2，1994.U.S.Patent5,378,619，issuedJan3，1995.U.S.Patent5,384,253，issuedJan.24，1995.U.S.Patent5,401,836，issuedMar.28，1995.U.S.Patent5,424,412，issuedJun13，1995.U.S.Patent5,436,002，issuedJul25，1995.U.S.Patent5,436,393，issuedJul25，1995.U.S.Patent5,442,052，issuedAug15，1995.U.S.Patent5,447,858，issuedSept5，1995.U.S.Patent5,459,252，issuedOct17，1995.U.S.Patent5,463,175，issuedOct31，1995.U.S.Patent5,491,288，issuedFeb13，1996.U.S.Patent5,504,200，issuedApr2，1996.U.S.Patent5,530,196，issuedJun25，1996.U.S.Patent5,538,879，issuedJul23，1996.U.S.Patent5,576,198，issuedNov19，1996.U.S.Patent5,589,583，issuedDec31，1996.U.S.Patent5,589,610，issuedDec31，1996.U.S.Patent5,589,614，issuedDec31，1996U.S.Patent5,595,896，issuedJan21，1997.U.S.Patent5,608,144，issuedMar4，1997.U.S.Patent5,614,399，issuedMar25，1997.U.S.Patent5,631,359，issuedMay20，1997.U.S.Patent5,633,363，issuedMay27，1997.U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catttccaaagaaagacttcaaaatcttaaaaacaattggaaaaa3420aagataaaatatatatagagttaaaagttccgtaaggaacggggagtgtttttgagaaga3480acactaaaaaagtcggttttttaattttcacctaaaggcaaagacaatccctcagaagcg3540tctagaagcttgtatagagcgtttaaaagtatgtttagataaaatactagggaaaagtag3600tgaattc3607210182111026212DNA213蘇雲金芽孢桿菌40018atgtgtttaagtttgactatcataaatatattagattatgcagattcttatttaagagct60gctattaaaaaatatggaggatacccaagttctagtaaagctagattcttatctactcca120aaaatttcagaaccagagtggtattaccctgctaaagaatctgttaatgcatatgaaatt180ggtaaacaatctggttcgtatcctaatcattcttctacatctcaaaattttaatgtacca240attcgttatcctgtttccactactagttcaacaaaaactataaatggttttaaaacagat300aaaagtatttctaaaaatttaaatcttaacttagggataaatgcaaaaatacctaatata360aatattcctggtggctttgaaattgaagttaaacctggagctgaggtttcaagaaatgtt420aaaacgaatcaaacagtagactttagtagtacttctgaaaaaacacaaaatacaaatgac480actccatctgacacaactcaatctttctcttgtcctcctaacacaaaagcaacatatata540gttatttatttcgggggagaacctaaagtagaagttacagctgtaacagatataatagga600aatggatctggaataggaacagatcctactactggtcaagaaaaatcgcaaagaaatgtt660ttagcaactttagattacagtaaagaaggtcaagctggtaaaaaatatactatgatggta720actgcagatcaattagcaactaaaatacctggatataatcctccaccaagagtcgaacaa780gatcgtagtcataatgcattaactattcatagtgaccttatagtaaatttaaaagaagat840tttgcatatgaaataattgtaaaatttgaaaatttatcttattcgacactttttaatgaa900gatctctttatttatagattcgacaaaaatcataatcttcttatagaaaaaacagttgga960tcattatttgaaactaatctacatgcagatattttttatgaacatattgaaagtgaatta1020gaataa102621019211341212PRT213蘇雲金芽孢桿菌40019MetCysLeuSerLeuThrIleIleAsnIleLeuAspTyrAlaAspSer151015TyrLeuArgAlaAlaIleLysLysTyrGlyGlyTyrProSerSerSer202530LysAlaArgPheLeuSerThrProLysIleSerGluProGluTrpTyr354045TyrProAlaLysGluSerValAsnAlaTyrGluIleGlyLysGlnSer505560GlySerTyrProAsnHisSerSerThrSerGlnAsnPheAsnValPro65707580IleArgTyrProValSerThrThrSerSerThrLysThrIleAsnGly859095PheLysThrAspLysSerIleSerLysAsnLeuAsnLeuAsnLeuGly100105110IleAsnAlaLysIleProAsnIleAsnIleProGlyGlyPheGluIle115120125GluValLysProGlyAlaGluValSerArgAsnValLysThrAsnGln130135140ThrValAspPheSerSerThrSerGluLysThrGlnAsnThrAsnAsp145150155160ThrProSerAspThrThrGlnSerPheSerCysProProAsnThrLys165170175AlaThrTyrIleValIleTyrPheGlyGlyGluProLysValGluVal180185190ThrAlaValThrAspIleIleGlyAsnGlySerGlyIleGlyThrAsp195200205ProThrThrGlyGlnGluLysSerGlnArgAsnValLeuAlaThrLeu210215220AspTyrSerLysGluGlyGlnAlaGlyLysLysTyrThrMetMetVal225230235240ThrAlaAspGlnLeuAlaThrLysIleProGlyTyrAsnProProPro245250255ArgValGluGlnAspArgSerHisAsnAlaLeuThrIleHisSerAsp260265270LeuIleValAsnLeuLysGluAspPheAlaTyrGluIleIleValLys275280285PheGluAsnLeuSerTyrSerThrLeuPheAsnGluAspLeuPheIle290295300TyrArgPheAspLysAsnHisAsnLeuLeuIleGluLysThrValGly305310315320SerLeuPheGluThrAsnLeuHisAlaAspIlePheTyrGluHisIle325330335GluSerGluLeuGlu3402102021115212蛋白質213蘇雲金芽孢桿菌40020MetLeuAspThrAsnLysValTyrGluIleSerAsnHisAlaAsn1510152102121141212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40021atgttagatacaaataaagtatatgaaatttcaaatcatgc2102221120212蛋白質213蘇雲金芽孢桿菌40022SerIleLeuAsnLeuGlnAspLeuSerGlnLysTyrMetThrAlaAla151015LeuAsnLysIle202102321115212蛋白質213蘇雲金芽孢桿菌40023SerAlaArgGlnValHisIleGlnIleAsnAsnLysThrArgHis1510152102421121212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40024tcacaaaaatatatgaacagc212102521131212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40025atatctatagaattcgcaattcgtccatgtg312102621130212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40026cagtattcatataagcttcctcctttaata302102721139212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40027aaggtgaagcttttatgttagatactaataaagtttatg392102821124212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40028ccggaatagaagctttgcatatgg242102921111212蛋白質213蘇雲金芽孢桿菌40029MetAsnValAsnHisGlyMetSerCysGlyCys15102103021127212DNA213人工序列220221misc_feature222(22)223W＝AorT/U220221misc_feature222(23)223S＝GorC220221misc_feature222(24)223N＝A，C，GorT/U220223人工序列的特點人工合成40030atgaatgtaaatcatgggatgwsntgt272103121112212RNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40031uaaacaauggcu122103221117212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40032gtaccagaagtaggagg172103321117212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40033tgacacagctatggagc172103421120212DNA213人工序列220223人工序列的特點人工合成40034atgattgccggaatagaagc20權利要求1.包括SEQIDNO2中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少15個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少15個連續胺基酸的分離多肽。2.權利要求1中的多肽，包括SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸。3.權利要求1中的多肽，包括SEQIDNO2中至少50個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少50個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少50個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少50個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少50個連續胺基酸。4.權利要求1中的多肽，包括SEQIDNO2中至少100個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少100個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少100個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少100個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少100個連續胺基酸。5.權利要求1中的多肽，包括選自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO19中的胺基酸序列。6.權利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQIDNO1中的至少45個連續核苷酸、SEQIDNO3中的至少45個連續核苷酸、SEQIDNO13中的至少45個連續核苷酸、SEQIDNO15中的至少45個連續核苷酸、SEQIDNO17中的至少45個連續核苷酸、SEQIDNO18中的至少45個連續核苷酸編碼。7.權利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQIDNO1中的至少90個連續核苷酸、SEQIDNO3中的至少90個連續核苷酸、SEQIDNO13中的至少90個連續核苷酸、SEQIDNO15中的至少90個連續核苷酸、SEQIDNO17中的至少90個連續核苷酸、SEQIDNO18中的至少90個連續核苷酸編碼。8.權利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQIDNO1中的至少150個連續核苷酸、SEQIDNO3中的至少150個連續核苷酸、SEQIDNO13中的至少150個連續核苷酸、SEQIDNO15中的至少150個連續核苷酸、SEQIDNO17中的至少150個連續核苷酸、SEQIDNO18中的至少150個連續核苷酸編碼。9.權利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQIDNO1中的至少300個連續核苷酸、SEQIDNO3中的至少300個連續核苷酸、SEQIDNO13中的至少300個連續核苷酸、SEQIDNO15中的至少300個連續核苷酸、SEQIDNO17中的至少300個連續核苷酸、SEQIDNO18中的至少300個連續核苷酸編碼。10.權利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18編碼。11.包含至少一種多肽的組合物，其中的多肽包括SEQIDNO2中的至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中的至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中的至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中的至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中的至少30個連續胺基酸。12.權利要求11中的組合物，其中的多肽包括選自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO19的胺基酸序列。13.權利要求11中的組合物，其中的組合物包括3種或更多種多肽，而這3種多肽是SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO19。14.權利要求11中的組合物，其中的組合物包括2種或更多種多肽，而這2種多肽是SEQIDNO2和SEQIDNO4。15.權利要求11中的組合物，包括蘇雲金芽孢桿菌EG4550，EG5899，EG11529，NRRLB-21784，NRRLB-21783，NRRLB-21917，NRRLB-21786，NRRLB-21787，NRRLB-21785，NRRLB-21788，NRRLB-21915或NRRLB-21916細胞的細胞抽提物、細胞懸浮液、細胞勻漿、細胞裂解物、細胞上清液、細胞濾液或細胞沉澱。16.權利要求15中的組合物，其中所說的組合物為粉末、粉劑、片劑、顆粒、噴霧、乳劑、膠體或溶液。17.權利要求15中的組合物，其中該組合物是由蘇雲金芽孢桿菌細胞的培養物經過乾燥、冷凍乾燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮製備產生的。18.權利要求15中的組合物，包括的多肽從大約1％～大約99％(按重量計)。19.殺蟲多肽，其製備過程包括以下步驟(a)在能有效產生殺蟲多肽的條件下培養蘇雲金芽孢桿菌EG4550，EG5899，EG11529，NRRLB-21784，NRRLB-21783，NRRLB-21917，NRRLB-21786，NRRLB-21787，NRRLB-21785，NRRLB-21788，NRRLB-21915或NRRLB-21916細胞；及(b)從所說的細胞中獲得產生出的殺蟲多肽。20.權利要求19中的多肽，其中所說的多肽包括SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸。21.蘇雲金芽孢桿菌細胞的NRRL保藏號為NRRLB-21784，NRRLB-21783，NRRLB-21917，NRRLB-21786，NRRLB-21787，NRRLB-21785，NRRLB-21788，NRRLB-21915或NRRLB-21916。22.編碼SEQIDNO2中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少15個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少15個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少15個連續胺基酸的分離多核苷酸。23.權利要求22中的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼包括SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19中胺基酸序列的多肽。24.權利要求22中的多核苷酸，其中的該多核苷酸編碼包括SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO19中胺基酸序列的多肽。25.權利要求22中的多核苷酸，其中的多核苷酸編碼包括SEQIDNO2、SEQIDNO4中胺基酸序列的多肽。26.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1中至少45個連續核苷酸、SEQIDNO3中至少45個連續核苷酸、SEQIDNO13中至少45個連續核苷酸、SEQIDNO15中至少45個連續核苷酸、SEQIDNO17中至少45個連續核苷酸或SEQIDNO18中至少45個連續核苷酸。27.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO3中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO13中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO15中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO17中至少90個連續核苷酸或SEQIDNO18中至少90個連續核苷酸。28.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1中至少150個連續核苷酸、SEQIDNO3中至少150個連續核苷酸、SEQIDNO13中至少150個連續核苷酸、SEQIDNO15中至少150個連續核苷酸、SEQIDNO17中至少150個連續核苷酸或SEQIDNO18中至少150個連續核苷酸。29.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1中至少300個連續核苷酸、SEQIDNO3中至少300個連續核苷酸、SEQIDNO13中至少300個連續核苷酸、SEQIDNO15中至少300個連續核苷酸、SEQIDNO17中至少300個連續核苷酸或SEQIDNO18中至少300個連續核苷酸。30.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18中的核苷酸序列。31.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1、SEQIDNO3和SEQIDNO18中的核苷酸序列。32.權利要求22中的多核苷酸，包括SEQIDNO1和SEQIDNO3中的核苷酸序列。33.權利要求22中的多核苷酸，進一步鑑定為RNA或DNA。34.權利要求22中的多核苷酸，其中所說的分離核苷酸與第一個啟動子可操作性地相連接。35.權利要求34中的多核苷酸，其中所說的啟動子為異源啟動子。36.權利要求34中的多核苷酸，其中所說的異源啟動子為可在植物中表達的啟動子。37.權利要求36中的多核苷酸，其中所說的可在植物中表達的啟動子選自於玉米(corn)蔗糖合成酶1啟動子、玉米乙醇脫氫酶1啟動子、玉米集光複合物啟動子、玉米熱激蛋白啟動子、豌豆小亞基RuBP羧化酶啟動子、Ti質粒甘露鹼合酶啟動子、Ti質粒胭脂鹼合酶啟動子、矮牽牛查爾酮異構酶啟動子、菜豆甘氨酸富含蛋白1啟動子、馬鈴薯patatin啟動子、凝集素啟動子、CaMV35S啟動子以及S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。38.檢測編碼δ-內毒素多肽的核酸序列的方法，包括以下步驟a)獲得懷疑是編碼δ-內毒素多肽的樣品核酸；b)在能使基本互補的核酸有效發生雜交的條件下，使所說的樣品核酸與權利要求35中的的多核苷酸相接觸；及c)檢測所形成的雜交互補核酸。39.核酸檢測試劑盒，在合適容器裝置裡，至少包括根據權利要求22的第一種核酸區段以及至少第一種檢測試劑。40.包括編碼多肽的至少第一種序列區段的核酸載體，多肽中包括SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸。41.權利要求40中的載體，其中所說的第一種序列區段編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4或SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19。42.權利要求40中的載體，其中所說的第一種序列區段編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO19。43.權利要求40中的載體，其中的第一種序列區段編碼SEQIDNO2和SEQIDNO4。44.權利要求40中的載體，進一步定義為質粒載體、杆狀病毒載體、人工染色體載體、毒粒(virion)載體、粘粒載體噬菌粒載體、噬菌體載體或病毒載體。45.包括編碼SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸的核酸的轉化寄主細胞。46.權利要求45中的轉化寄主細胞，其中的核酸編碼SEQIDNO2，SEQIDNO4，SEQIDNO14，SEQIDNO16，或SEQIDNO19。47.權利要求45中的轉化寄主細胞，其中的核酸編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO19。48.權利要求45中的轉化寄主細胞，其中的核酸編碼SEQIDNO2和SEQIDNO4。49.權利要求45中的轉化寄主細胞，進一步定義為原核寄主細胞或真核寄主細胞。50.權利要求45中的轉化寄主細胞，進一步定義為細菌細胞或植物細胞。51.權利要求50中的轉化寄主細胞，其中所說的細菌細胞是蘇雲金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、Bacillusmegaterium細胞、Bacilluscereus細胞、埃希氏菌、沙門氏菌、農桿菌或假單胞菌細胞。52.權利要求50中的轉化寄主細胞，其中該細菌細胞是蘇雲金芽孢桿菌EG4550，EG5899，EG11529，NRRLB-21784，NRRLB-21783，NRRLB-21917，NRRLB-21786，NRRLB-21787，NRRLB-21785，NRRLB-21788，NRRLB-21915或NRRLB-21916細胞。53.權利要求50中的轉化寄主細胞，其中的細菌細胞是根癌農桿菌細胞。54.權利要求50中的轉化寄主細胞，進一步定義為單子葉植物細胞或雙子葉植物細胞。55.權利要求54中的轉化寄主細胞，其中所說的植物細胞選自於玉米細胞、小麥細胞、大豆細胞、燕麥細胞、棉花細胞、水稻細胞、黑麥細胞、高粱細胞、甘蔗細胞、番茄細胞、菸草細胞、木棉細胞、亞麻細胞、馬鈴薯細胞、大麥細胞、草坪草細胞、牧草細胞、漿果細胞、水果細胞、莢果細胞、蔬菜細胞、裝飾性植物細胞、灌木細胞、仙人掌細胞、肉質植物細胞和樹木細胞。56.權利要求54中的轉化寄主細胞，其中該植物細胞為玉米細胞、小麥細胞、水稻細胞或甘蔗細胞。57.權利要求54中的轉化寄主細胞，其中的植物細胞為大豆細胞、棉花細胞、馬鈴薯細胞、番茄細胞或菸草細胞。58.包括編碼SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸的多核苷酸的植物愈傷組織或植物胚。59.權利要求58中的植物愈傷組織或植物胚，其中所說的多核苷酸編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19。60.權利要求58中的植物愈傷組織或植物胚，其中該多核苷酸編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO19。61.權利要求58中的植物愈傷組織或植物胚，其中的多核苷酸編碼SEQIDNO2和SEQIDNO4。62.基因組中整合了所選多核苷酸的轉基因植物，多核苷酸中包括編碼SEQIDNO2中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO4中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO14中至少30個連續胺基酸、SEQIDNO16中至少30個連續胺基酸或SEQIDNO19中至少30個連續胺基酸的第一種序列區段。63.權利要求62中的轉基因植物，其中所說的第一種序列區段編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO14、SEQIDNO16或SEQIDNO19。64.權利要求62中的轉基因植物，其中該第一種序列區段編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4或SEQIDNO19。65.權利要求62中的轉基因植物，其中的第一種序列區段編碼SEQIDNO2和SEQIDNO4。66.權利要求62中的轉基因植物，其中的第一種序列區段包括SEQIDNO1中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO3中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO13中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO15中至少90個連續核苷酸、SEQIDNO17中至少90個連續核苷酸或SEQIDNO18中至少90個連續核苷酸。67.權利要求62中的轉基因植物，其中的第一種序列區段包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO18。68.權利要求62中的轉基因植物，其中的第一種序列區段包括SEQIDNO1、SEQIDNO3和SEQIDNO18。69.權利要求62中的轉基因植物，其中的第一種序列區段包括SEQIDNO1和SEQIDNO3。70.權利要求62中的轉基因植物，進一步定義為單子葉植物。71.權利要求62中的轉基因植物，進一步定義為玉米、小麥、燕麥、水稻、大麥、草坪草或牧草。72.權利要求62中的轉基因植物，進一步定義為雙子葉植物。73.權利要求62中的轉基因植物，進一步定義為莢果、大豆、菸草、番茄、馬鈴薯、棉花、水果、漿果、蔬菜或樹木。74.任何一代權利要求62中轉基因植物的後代，其中所說的後代包括所說的第一種選擇序列區段。75.任何一代權利要求62中植物的種子，其中所說的種子包括所說的第一種序列區段。76.任何一代權利要求74中後代的種子，其中該種子包括第一種序列區段。77.任何一代權利要求75或76中種子的植物，其中所說的植物包括第一種序列區段。78.製備抗蟲植物的方法包括(a)使植物細胞與至少包括編碼權利要求1中多肽的第一種核酸序列的多核苷酸組合物接觸；(b)選擇包括第一種核酸序列的受體植物細胞；及(c)從選擇出的細胞再生植物；其中所說的植物相對於非轉化植物抗蟲性增強。全文摘要本文公開了新的殺蟲多肽以及包括這些多肽的組合物、包括其肽片段的組合物,及其特異性抗體。本文也公開了包含編碼公開的δ－內毒素(δ－endotoxin)多肽核酸區段的載體、轉化的寄主細胞以及轉基因植物。本文還公開了有關多肽和多核苷酸的鑑定方法、包括這些多肽序列的轉基因細胞的製備方法和使用方法,以及昆蟲群體如馬鈴薯甲蟲(Coloradopotatobeetle)、南方玉米根蟲(Southerncornrootworm)和西方玉米根蟲(westerncornrootworm)的防治方法,以及賦予植物對靶昆蟲抗性的方法。文檔編號C12N1/21GK1360632SQ00809985公開日2002年7月24日申請日期2000年5月3日優先權日1999年5月4日發明者M·J·魯帕,W·P·多諾範,C·－R·楚,E·佩斯,Y·譚,A·C·斯拉尼,T·M·馬爾瓦,J·A·鮑姆申請人:孟山都技術有限公司