一種微生物產酶發酵酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝的製作方法

2023-05-26 12:06:06

專利名稱：一種微生物產酶發酵酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝的製作方法
一種微生物產酶發酵酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝技術領域：
本發明屬於生化工程領域，涉及一種基因工程菌產酶發酵酶法生產 抗病毒藥物利巴韋林的工藝。背景技術：
利巴韋林(ribavirin)，化學名為1_β _D_呋喃核糖基-1H-1，2，4_三 氮唑-3-羧醯胺，別名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，對多種DNA和RNA病毒均有顯著抑 製作用，在抗病毒臨床實踐中得到廣泛應用。利巴韋林生產方法有化學合成法、發酵法和酶法三類。目前，國內在工業生產上 實施的化學合成法佔絕大多數，存在副產物多，產率低，操作步驟多，汙染嚴重，成本高等不 足。添加前體物發酵法(日本公開專利17830/1979 ；陳寧，200710057650)雖具有原料 成本低，來源廣泛，能耗低等優點，但是不足之處在於生產效率低，副產物多，利巴韋林分離 純化成本高，必須每次培養菌體且發酵時間長，生產成本高，目前仍處於實驗室研究階段。酶法由Witkowski等首創，在上個世紀80、90年代發展起來，先後經歷了三個主要 階段一是以純酶催化核糖-1-磷酸和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲醯胺)一步式生產利 巴韋林(US Patent 3，976，545/1976) ；二是以自然界篩選的或人工誘變育種獲得的微生物 菌體為酶源，肌苷、胞苷、鳥苷和腺苷等作為核糖供體酶促合成利巴韋林(FUjishima，1986 ； US Patent 4614719 ；US Patent5384251 ；Shirae, 1988 ；Pochodylo, 1989 ；邱蔚然，1997 ；陳 薇梅，02115486. 4/2002)；三是以基因工程菌菌體為酶源，以鳥苷和TCA為底物合成利巴 韋林。改進後的酶法具有以下優點①反應效率高，收率高；②反應時間短，副產物少，分 離精製容易；③三廢較易處理，對環境汙染較小；④酶源可以反覆連續使用；⑤在微生物不 增殖條件下，以較高的溫度(40 60°C )反應，幾乎沒有雜菌汙染；⑥核糖供體可以從多 種核苷、核苷酸中選擇，底物來源廣泛。但是，現有技術普遍存在的問題主要有三個一是 利巴韋林的產率受核苷磷酸化酶活性的限制，天然的或傳統誘變獲得的微生物中，核苷磷 酸化酶表達量仍舊很低；二是現有構建的基因工程菌需要昂貴的化學誘導劑異丙基-ι-硫 代-β-呋喃半乳糖苷(IPTG)的誘導才能高表達目的蛋白，增加了生產成本，不適合工業 化生產；三是現在作為酶源的嘌呤核苷磷酸化酶均為常溫酶，酶促反應溫度多在60°C 70°C，能耗較高。而將低溫嘌呤核苷磷酸化酶用於酶法合成利巴韋林的應用在國內外尚未見報導。 針對以上情況，構建具有高表達效率、高催化活性和較低最適反應溫度的非化學試劑誘導 型的利巴韋林工程菌，可進一步實現並提高酶法合成利巴韋林的效率和降低生產成本，並 可進一步開發利用低溫酶，拓寬其應用範圍，因此具有很高價值。
發明內容為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種高表達冷適 應嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌產酶發酵酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝，該工藝 縮提高了產酶量，降低了酶促反應溫度和能耗，縮短了生產周期，提高了生產效率，降低了 酶法生產成本。為達到上述目的，本發明採用以下技術措施，其步驟如下1、利用分子生物學技術構建高表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌 DH5a (pQF-XmPNP)利用同源序列 PCR 技術由低溫菌 Pseudoalteromonassp. XM2107 中擴增冷適應嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因，與啟動子部分經改造的表達載體PQE-30連 接，構建了具有較高表達效率和很高質粒穩定性的組成型表達載體PQF-XmPNP和工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)。(注編碼冷適應嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆表達、重組蛋白純化及酶學性質 研究曾於2010年2月在《微生物學報》第50卷第2期發表。經進一步改造獲得的高表達 冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)現保藏於天津科技大學代謝工程研 究室，公眾如有需要，可徑直與發明人聯繫。)2、工程菌高密度產酶發酵(1)產酶發酵培養基葡萄糖 4%，酵母膏0. 2% 0. 3%，豆濃 2%， 玉米漿 1% 2%，MgSO4 · 7Η20 0. 0. 15%，KH2PO4 0. 2% 0. 4%，FeS042 4mg/L, 微量元素混合液0. 2 0. 4 %，自來水96 % 98 %，培養基pH值為7. 4 7. 6。(2)發酵控制工藝採用5L發酵罐，發酵溫度33 35°C，空氣流量為0. 8 8. OL/min,罐壓0. 001 0. 006MPa,溶氧維持在15 40%，發酵pH值控制在7. 2 7. 5，發酵時間為12 20h。3、酶源製備將發酵完畢後發酵液離心，菌體用50mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7. 6) 洗滌兩遍後用25mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7. 6)重懸備用；4、酶促反應條件(1)反應底物鳥苷和TCA;(2)底物濃度50 300mmol/L ；(3)投料比，鳥苷TCA=I 1 1 1.3;(4)酶用量 30 120g(溼重)/L;(5)反應條件，50°C，20h ；5、產物利巴韋林定量分析反應完畢後離心，取上清液經無菌去離子水稀釋適當倍數，採用高效液相色譜 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)定量檢測利巴韋林。工作條件為 Agilent 1200型高效液相色譜儀；檢測器VWD (可變波長紫外檢測器)；檢測波長207nm ； 進樣器標準型自動進樣器；進樣量5 μ L ；色譜柱Kromasil C18，5 μ，250_Χ4. 6mm ；流動相 水乙腈=96 4(V/V)；柱溫 30°C ；流速 lml/min0利巴韋林轉化率定義
產物利巴韋林摩爾濃度 、AfW
,,女…、__χ 100%
轉化率(％)=
底物鳥苷摩爾濃度本發明的優點和積極效果1)採用高表達基因工程菌，目的蛋白(冷適應嘌呤核苷磷酸化酶)得以高效表達， 目的蛋白/菌體總蛋白達到16% 22%，菌體酶活力有較大提高。2)對載體啟動子和操縱基因進行了改造，賦予了該工程菌非誘導型高效表達目 的蛋白和較高質粒穩定性的一系列特徵，很大程度上滿足了工業化生產對基因工程菌的需要。
3)發酵周期短，菌體密度高，經16 20小時產酶發酵即可得到較高酶活的酶源細 胞，比現有技術中16 22小時的發酵時間縮短了 4 6小時。發酵液光密度值0D_最高 可達60。4)酶促反應溫度低，比現有技術中60 70°C的反應溫度降低了 10 20°C，降低 了能耗和生產成本。5) 75 80%的轉化率雖然較現有工藝(80 98% )低，但本發明底物鳥苷濃度高 達lOOmmol/L (現有技術為肌苷20mmol/L)，酶源用量僅為30 50g溼菌體/L反應液(現 有技術為50 200g溼菌體/L反應液)，反應20小時利巴韋林產量可達18. 3 19. 5/L， 酶源細胞反覆利用50次，轉化率仍可達70 75%。
具體實施方式實施例1構建高表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的組成型基因工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)採用相關分子生物學技術對高效表達載體pQE-30進行改造後命名為PQF，其具有 如下特點①用乳糖啟動子替換了來自噬菌體的T5強啟動子，以防因強啟動子過高的啟動 效率而使重組蛋白過快表達致使其來不及摺疊或摺疊錯誤而無酶活性；②兩個乳糖操縱基 因的去除賦予了載體在無化學誘導劑IPTG或乳糖誘導下也能高效表達的特性，這也使得 該載體只適合表達對菌體無毒害作用的蛋白；③合成的核糖體結合位點RBS II，保證高效 的翻譯；④兩個強而有利的轉錄終止子來自λ噬菌體的t0和來自大腸桿菌rrnB操縱元 的Tl，可以有效預防轉錄中的通讀現象並保證表達質粒的穩定性。採用PCR技術，將編碼冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的基因deo D從重組子pXMH 上克隆擴增，並與PQF重組，轉化E. C01 i DH5 α，經DNA測序和重組蛋白表達實驗證 明成功構建了高表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的組成型重組子PQF-XmPNP和工程菌 DH5α (pQF-XmPNP)。將工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)於LBAmplr平板上三區畫線，37°C恆溫箱培養16h獲 得單菌落用牙籤挑取單菌落到含有5mL LB/Ampr液體培養基的試管中，37 °C，200r/min培養 14h，取適量菌液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。發酵液酶活力測定以Iml發酵液離心後的 菌體為酶源，20mmol/L鳥苷和TCA為底物，25mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7. 6)反應液，60°C下 催化利巴韋林生成反應30min。每分鐘催化底物生成1 μ mol利巴韋林所需的酶量為一個酶 活單位。LB培養基培養14h，菌體密度OD6tltl最高可達3，其中目的蛋白/菌體總蛋白最高可 達18. 5%，產酶發酵液酶活力可達2600U/L。實施例2工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)質粒穩定性採用平板稀釋計數法。將凍存於-80°C甘油管中的工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)在 含ΙΟΟμ g/L氨苄青黴素的LB平板上三區劃線，37°C培養16h，挑取單菌落接種於5ml液體 選擇性培養基(LB/AmpD中，搖管培養12h後以的接種量轉入5ml液體非選擇性培養基 (LB)，開始連續搖管培養試驗。每12h轉種一次，接種量為1%，連續傳代30次，每隔5次 取樣進行平板稀釋檢測質粒的缺失程度。檢測時，取菌液Iml用無菌水逐級稀釋，取三個合 適的梯度，分別塗在固體選擇性培養基和非選擇性培養基平板上，每個處理三個重複。倒置 在37°C培養箱中培養16h，計算各皿中的菌落數。將選擇性培養基中的菌落數與非選擇性培養基中菌落數進行比較，即可計算出質粒的缺失率，見表1。表1工程菌DH5 α (pQF-XmPNP)質粒結構穩定性
權利要求
一種微生物產酶發酵酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的工藝，即利用自行構建的高表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF XmPNP)產酶發酵，以鳥苷和TCA(1，2，4 三氮唑 3 羧甲醯胺)為底物，微生物酶法生產利巴韋林，其特徵在於該生產工藝包括A.利用分子生物學技術構建高表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF XmPNP)利用同源序列PCR技術由低溫菌Pseudoalteromonas sp.XM2107中擴增冷適應嘌呤核苷磷酸化酶編碼基因，與啟動子部分經改造的表達載體pQE 30連接，構建了具有較高表達效率和很高質粒穩定性的表達載體pQF XmPNP和工程菌DH5α(pQF XmPNP)。B.工程菌高密度產酶發酵將步驟A中獲得的經擴大培養的菌種接入發酵培養基進行工程菌高密度產酶發酵，發酵培養基中碳源含量應為0.2％～4％，氮碳比N∶C應介於20∶100～80∶100之間，無機鹽含量應為0.1～12％，發酵培養基的初始pH7.2～7.8，培養溫度30℃～36℃，振蕩培養或發酵罐培養12～20h，接種量為2％～10％(V/V)；發酵過程中，添加氨水調節發酵液的pH值維持在7.2～7.5；C.酶源製備將步驟B發酵完畢後離心產酶發酵液，菌體用50mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7.6)洗滌兩遍後用25mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7.6)重懸備用；D.酶促反應條件鳥苷和TCA；底物濃度分別為50～300mmol/L；投料比，鳥苷∶TCA＝1∶1～1∶1.3；酶用量30～120g(溼重)/L；反應條件，50℃，20h；E.產物利巴韋林定量分析將步驟E反應完畢後離心，取上清液經無菌去離子水稀釋適當倍數，採用高壓高效液相色譜法定量檢測產物利巴韋林。
2.根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於B步發酵採用的基因工程菌，即高效表 達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的DH5 α (pQF-XmPNP)。
3.根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於B步產酶發酵採用的培養基葡萄糖 4%，酵母膏0. 2% 0. 3%，豆濃 2%，玉米漿 2%，MgS04 ·7Η20 0. 0. 15%, KH2PO4 0. 2% 0. 4%，FeSO4 2 4mg/L，微量元素混合液 0. 2 0. 4%，自來水 96% 98%，發酵pH值控制在7. 2 7. 5。
4.根據權利要求1所述的生產工藝，其特徵在於B步產酶發酵採用的控制工藝採用 5L發酵罐，發酵溫度33 35°C，空氣流量為0. 8 8. OL/min,罐壓0. 001 0. 006MPa,溶 氧維持在15 40%，發酵時間為12 20h。
全文摘要
一種利用基因工程菌產酶發酵，微生物酶法生產抗病毒藥物利巴韋林的生產工藝。構建高效表達冷適應嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌DH5α(pQF-XmPNP)，優化冷適應酶表達條件，採用該工程菌，以葡萄糖、酵母膏、豆濃、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、微量元素和自來水為原料，進行產酶發酵，以所得菌體為酶源，以鳥苷和TCA(1，2，4-三氮唑-3-羧甲醯胺)為底物，50℃反應生產利巴韋林。本發明降低了傳統酶法反應溫度，降低了能耗，產酶效率高，底物轉化率高，環境汙染程度低，工藝簡單，降低了生產成本。
文檔編號C12N15/55GK101974585SQ201010527428
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日 公開號201010527428.發明者劉淑雲, 夏俊剛, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學