人生長激素糖基化突變體的製備方法和組合物的製作方法

2023-06-27 21:09:16 4

專利名稱：人生長激素糖基化突變體的製備方法和組合物的製作方法
背景技術：
人生長激素(hGH)和其激動劑變體是重組蛋白質家族的成員，如U.S.專利號4,658,021和U.S.專利號5,633,352中所述。在US.專利號4,342,832，4,601,980；U.S.專利號4,898,830；U.S.專利號5,424,199以及U.S.專利號5,795,745中詳細描述了它們的重組生產和使用方法。人生長激素參與正常人生長發育調控的多個方面。通過與它的受體相互作用，這個22kDa的垂體激素調節許多生物學效應，例如線性生長(軀體發生)、哺乳、巨噬細胞的活化、和胰島素樣和致糖尿病效應。Chawla，Annu.Rev.Med.，34519(1983)；Edwards等，Science，239769(1988)；Isaksson等，Annu.Rev.Physiol.，47483(1985)；Thorner和Vance，J.Clin.Invest.，82745(1988)；Hughes和Friesen，Annu.Rev.Physiol.，47469(1985)。
在醫藥領域中眾所周知給予糖基化的和非糖基化的肽可產生特定的生理反應。純化和重組hGH都已經用來治療由於hGH缺乏導致的病症和疾病，例如兒童侏儒症。限制了治療性多肽的應用的一個主要因素是大多數肽的免疫原性。在患者中，對給予多肽的免疫原性應答能夠使該肽失效和/或導致患者中變態反應的形成。其他的治療性糖肽的缺陷包括亞最優的效力和快速的清除率。現有技術認識到了肽治療學所固有的問題，並且已經研究了消除該問題的多種方法，例如，為提供可溶性肽療法，已經將合成聚合物粘附於肽主鏈。
聚(乙二醇)(「PEG」)是一種已經與多肽連接的示例性的聚合物。利用PEG衍生肽療法已經顯示減少了肽的免疫原性。例如U.S.專利號4,179,337(Davis等)涉及非免疫原性多肽。例如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇連接在一起的酶和肽類激素。每摩爾多肽使用了10和100摩爾之間的聚合物，且至少維持15％的生理活性。另外，由於所述多肽與PEG連接而大小增加導致循環清除時間的延長。Davis等公開的方法是化學聚乙二醇化法。
肽的化學修飾常常導致肽活性的不希望的損失，可歸因於用於修飾多肽的化學作用的非選擇性能。例如，當修飾基團是水溶性肽如PEG時，PEG和它的衍生物與肽連接的主要模式是通過肽胺基酸殘基而非特異性結合。對水溶性聚合物和白介素2(Fisher等，Br.J.Haematol.，82654(1992))，粒細胞集落刺激因子(Satake-Ishikawa等，Cell Struct.Funct.，17157(1992))，腫瘤壞死因子(Tsutsumi等，Br.J.Cancer，71963(1996))和人生長素(Clark，等，J.Biol.Chem.，27121969(1996))結合的研究已經揭示這些蛋白質的化學聚乙二醇化降低了該肽的體內受體結合活性。
在許多化學聚乙二醇化方法中，實質上聚乙二醇是以隨機地、非特異性的方式加入肽主鏈上的反應性殘基的。為了生產治療性肽，利用導致特異性標記的形成的、易於鑑定的、基本上均質的產品的衍生化策略顯而易見是可取的。一種製備特異性標記肽的有前途的方案通過利用糖基轉移酶等酶向肽附加修飾的糖部分。
基於酶的合成具有區域選擇性和立體選擇性的優勢。而且，酶催化合成使用無保護底物進行。有三種主要類別的酶用於碳水化合物的合成，糖基轉移酶(例如，唾液酸轉移酶、寡糖轉移酶、N-乙醯氨基葡糖轉移酶)和糖苷酶。糖苷酶更進一步地分類為外切糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶)和內切糖苷酶(例如，Endo-A、Endo-M)。這些類別的每一種酶都已經成功地用於合成碳水化合物。作為通常的總結，請參見Crout等，Curr.Opin.Chem.Biol.298-111(1998)。
糖基轉移酶修飾了糖肽的寡糖結構，產生具有良好立體化學的和區域化學控制的特定產物。用糖基轉移酶製備寡糖並修飾N-和O-連接的碳水化合物結構，特別是在哺乳動物細胞中產生的糖肽上。例如，糖肽的末端寡糖已經完全地唾液酸化和/或巖藻糖化，提供了更一致的糖結構，改善了糖肽藥效學和各種其他生物學特性。例如，採用β-1，4-半乳糖基轉移酶合成乳糖胺是糖基轉移酶在合成碳水化合物方面的應用的例證(例如參見，Wong等，J.Org.Chem.475416-5418(1982))。而且，許多的合成步驟已經利用α-唾液酸轉移酶將唾液酸從胞嘧啶核苷-5-單磷酸-N-乙醯神經氨酸轉移到半乳糖的3-OH或6-OH(例如，參見Kevin等，Chem.Eur.J.21359-1362(1996))。巖藻糖轉移酶可用於從鳥嘌呤核苷-5』-二磷酸巖藻糖向糖類受體的特定的羥基轉移巖藻糖單位。例如，Ichikawa通過涉及用克隆的巖藻糖基轉移酶將唾液酸化的乳酸胺巖藻糖基化而製備了唾液酸Lewis-X(Ichikawa等，J.Am.Chem.Soc.1149283-9298(1992))。為討論治療性應用的糖綴合物的合成的新發展，參見Koeller等，Nature Biotechnology 18835-841(2000)，同時參見U.S.專利號No.5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/9831826。
糖苷酶還可以用來製備糖類。糖苷酶通常催化糖苷鍵的水解，然而在合適的條件下，它們可用於形成該鍵。用於碳水化合物合成的大多數的糖苷酶是外切糖苷酶；糖基的轉移發生在底物的非還原末端。糖苷酶在糖基-酶中間體中獲取糖基供體，由水攔截產生水解產物或通過受體產生新的糖苷或者寡糖。一種利用外切糖苷酶的示例性的途徑是所有的N-連接糖肽的核心三糖的合成，包括困難的β-甘露糖苷鍵，它由β-甘露糖苷酶的作用形成(Singh等，Chem.Commun.993-994(1996))。
在另一個示例性的利用糖苷酶形成糖苷鍵的應用中，製備突變體糖苷酶，其中將活性部位內的正常的親核胺基酸轉換為非親核胺基酸。該突變體酶不水解糖苷鍵，但是仍然能夠形成它們。利用α-糖基氟化物供體和糖苷受體分子將突變體糖苷酶用來製備寡糖(Withers等，U.S.專利號5,716,812)。儘管突變體糖苷酶具有形成游離寡糖的用途，這種酶是否能夠將糖基供體附加到糖基化的或非糖基化的肽上還有待於證明，這些酶也還沒有和未活化的糖基供體一同使用。
儘管它們的應用比外切糖苷酶少，內切糖苷酶也用於製備碳水化合物。基於內切糖苷酶的利用的方法有下列好處，即轉移了寡糖而不是單糖。已經應用內切-β-N-乙醯葡糖胺，如endo-F、endo-M，將寡糖片段加到底物上(Wang等，Tetrahedron Lett.371975-1978)；和Haneda等，Carbohydr.Res.29261-70(1996))。
除了在製備碳水化合物中的應用外，上述討論到的酶也用於糖肽的合成。已經發表了均一糖形式的核糖核酸酶B的合成(Witte K.等，J.Am.Chem.Soc.1192114-2118(1997))。通過用內切糖苷酶H處理糖肽分裂了核糖核酸酶B的高甘露糖核心。分裂在兩個核心GlcNAc殘基之間特異性地發生。然後通過相繼應用β-1，4-半乳糖基轉移酶、α-2，3-唾液酸轉換酶和α-1，3-巖藻糖基轉移酶V，在均一蛋白殘存GlcNAc錨位點上用酶重建四糖唾液酸Lewis X。各酶催化步驟以高產量進行。
此外已知組合化學和酶催化合成元素的方法。例如，Yamamoto和其合作者(Carbohydr.Res.305415-422(1998))報導了應用一種內切糖苷酶進行糖肽即糖基化的肽T的化學酶合成。N-乙醯基葡萄糖胺肽是完全通過化學方法合成的。隨後用人運鐵蛋白糖肽的寡糖對肽進行酶促修飾。通過用一種內切β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶將糖類部分加到肽鏈。產生的糖基化的肽高度穩定，與肽T和N-乙醯基葡萄糖胺肽T相比，對蛋白水解作用有抵抗力。
已經研究了利用糖基轉移酶用報導基團修飾肽結構。例如，Brossmer等(U.S.專利號5,405,753)公開了螢光標記的唾液酸的胞苷單磷酸(「CMP」)衍生物的形成和螢光糖苷在測定唾液酸轉移酶活性和細胞表面、糖蛋白和神經節苷脂螢光標記中的應用。Gross等(Analyt.Biochem.186127(1990))描述了一種類似的試驗。Bean等人(U.S.專利號5,432,059)公開了一種將不充分糖基化蛋白再糖基化的糖基化缺陷失調試驗。將有缺陷的蛋白質用螢光標記的CMP糖苷再糖基化。用螢光部分在位點9或在唾液酸中通常乙醯化的胺上取代每一螢光唾液酸衍生物。利用螢光唾液酸衍生物的方法是檢測糖基轉移酶或非糖基化的或不正確糖基化的糖蛋白的存在的試驗。該試驗在生物學來源的樣品中的少量酶或糖蛋白上實施。還沒有公開或暗示利用修飾的唾液酸的製備性的或工業規模的糖基化或非糖基化的肽中的酶促生產。
酶促法也已經用來活化糖肽上的糖基殘基，進行隨後的化學修飾。一般利用半乳糖氧化酶活化糖基殘基，它將末端半乳糖轉變為相應的醛。隨後該乙醛與含有胺的修飾基團連接在一起。例如，Casares等人(Nature Biotech.19142(2001))已經將阿黴素與重組體MHCII-肽嵌合體的氧化半乳糖殘基連接。
也已經修飾糖基殘基用於負載酮基，例如，Mahal和其同事(Science 2761125(1997))已經製備了N-乙醯丙醯(levulinoyl)甘露糖胺(「ManLev」)，其在天然底物通常被乙醯基佔據的位點具有酮類官能團。用ManLev處理細胞，由此在細胞表面整合了酮基。另外參見Saxon等人，Science 2872007(2000)；Hang等人，J.Am.Chem.Soc.1231242(2001)；Yarema等人，J.Biol.Chem.27331168(1998)；以及Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。
通過幾種方式將碳水化合物連接到糖肽上，其中N-連接的天冬醯胺和粘蛋白型O-連接的絲氨酸和蘇氨酸的粘蛋白型O對於重組體糖蛋白治療劑是最相關的。蛋白質的糖基化起始的一個決定因素是一級序列，儘管顯而易見蛋白質區域和構象之類的其他因素也發揮作用。N-連接的糖基化發生在共有序列NXS/T，其中X可以是除脯氨酸外的任何胺基酸。
上述討論的方法沒有提供獲得產業上適用的大量的基本上保持它們未改變的類似物的藥理學活性的修飾肽的途徑。而且，該方法也不允許修飾糖對肽或糖肽的位點特異性的結合。該方法也沒有提供製備在非天然的位點糖基化的或糖綴合的修飾肽的方式。
本發明通過提供含有新導入的N-連接的或O-連接的糖基化位點的hGH突變體，提供這些重組hGH突變體的糖基化和/或糖聚乙二醇化的靈活性解決了這些需要。而且，本發明提供了一種用修飾基團如水溶性聚合物、治療性部分、生物分子等等修飾N-或O-連接的突變體hGH肽的產業上實用的方法。特別重要的是該方法中修飾的突變體hGH具有改善的性狀，提高了它的作為治療性或診斷藥劑的應用。
發明簡述一方面，本發明提供了一種分離的含有編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列的核酸。該突變體人生長激素包括野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化位點。在一些具體實施方式
中，野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素包括SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了含有一種包括編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列的核酸例如分離的核酸的表達盒或細胞，該突變體人生長激素包括野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化位點。
另一方面，本發明提供了一種突變體人生長激素，包括在野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化的位點。在一些具體實施方式
中，野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種生產突變體人生長激素的方法，該突變體人生長激素包括在野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接的糖基化位點。該方法包括重組生產突變體人生長激素，以及在新的糖基化位點糖基化該突變體人生長激素的步驟。在一些具體實施方式
中，野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種具有治療有效量的突變體人生長激素的藥物組合物，該突變體人生長激素包括在野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接的糖基化位點。在一些具體實施方式
中，野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種在患者中治療人生長激素缺乏的方法。該方法包括給予患者適量的對治療或改善生長激素缺乏有效的突變體人生長激素。用於本方法的突變體人生長激素包括在相應的野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化位點。在一些具體實施方式
中，相應的野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
在如上所述的每一方面，突變體人生長激素與一個或多個修飾基團可選地連接，優選藉助於糖連接在糖基化位點以及修飾基團之間產生糖基連接基團。一種示例性的修飾基團是聚(乙二醇)。
附圖簡述

圖1是GH-N(垂體來源的hGH)和GH-V(胎盤來源的hGH)的胺基酸序列。箭頭顯示突變導入的(GH-N)或天然存在的(GH-V)N-連接的糖基化位點的胺基酸位置。
圖2是糖基化的GH-N突變體hGH(Lys140變成Asn140)和它的受體多肽的晶體結構圖。
圖3是昆蟲細胞和哺乳動物細胞生產的hGH N-連接的聚糖突變體的糖聚乙二醇化方案。
圖4顯示了大腸桿菌產生的hGH O-連接的聚糖突變體的糖聚乙二醇化。
圖5顯示了導入糖基化位點的GH-N的可選(alternate)突變體。箭頭顯示了可以導入糖基化位點的GH-N蛋白質環區域。
圖6是可以導入垂體來源的hGH(GH-N)的六(6)個不同的O-連接糖基化位點的胺基酸序列。也顯示了GH-N的野生型胺基酸序列以進行對比。箭頭顯示了將發生O-連接糖基化的GH-N聚糖突變體的蘇氨酸殘基。
圖7是hGH O-連接GH-N突變體134(rtg)→ttt和hGH O-連接5′GH-N突變體的胺基酸序列，其中胺基酸-3到-1(ptt)插入氨基末端，導致產生194胺基酸的hGH多肽。
圖8是hGH O-連接GH-N突變體134(rtg)→ttg和hGH O-連接5′GH-N突變體的胺基酸序列，其中胺基酸-3到-1(mvt)插入氨基末端，導致產生194胺基酸的hGH多肽。
圖9A描述了成熟人生長激素(GH-N)的胺基酸序列(SEQ ID NO1)。圖9B描述了成熟人生長激素(GH-V)的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。圖9C描述了人生長激素突變體1的胺基酸序列(SEQ ID NO3)。圖9D描述了人生長激素突變體2的胺基酸序列(SEQ ID NO4)。圖9E描述了人生長激素突變體3的胺基酸序列(SEQ ID NO5)。圖9F描述了人生長激素突變體4的胺基酸序列(SEQ ID NO6)。圖9G描述了人生長激素突變體5的胺基酸序列(SEQ ID NO7)。圖9H描述了人生長激素突變體6的胺基酸序列(SEQ ID NO8)。圖9I描述了人生長激素突變體7的胺基酸序列(SEQ ID NO9)。
發明詳述定義術語「核酸」或「多核苷酸」指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限定，該術語包括含有已知的具有與參考核酸類似的結合性狀和以類似於天然存在的核苷酸的方式代謝的天然核苷酸的類似物的核酸。除非另有陳述，特定的核酸序列也隱含包括其保守修飾的變體(例如簡併密碼子替換)、等位基因、直向同源物(Ortholog)、SNPs和互補序列以及明確地表示的序列。特定的，可以通過產生其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三位點用混合鹼基和/或脫氧次黃苷殘基代替而實現簡併密碼子的替換(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。術語核酸與基因、cDNA、以及基因編碼的mRNA可互換使用。
術語「基因」表示涉及產生多肽鏈的DNA片段。它可以包括在編碼區之前和之後的區域(前導和尾部)以及在獨立編碼段(外顯子)之間的插入順序(內含子)。
當應用於核酸或蛋白質時，術語「分離的」表示基本上沒有在自然狀態與其結合的其它細胞部件的核酸或蛋白質。優選處於均態，儘管它可以是乾燥或者水溶液的狀態。一般使用如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜法等分析化學技術確定純度和均一性。在制品中以優勢存在的種類的蛋白質是基本純化的。具體地，分離的基因與位於該基因側翼並編碼非目的基因的蛋白的開放讀碼框分離。術語「純化的」表示在電泳凝膠中基本上產生一個條帶的核酸或蛋白。特別指的是該核酸或蛋白具有最少85％的純度，更優選至少95％的純度，最優選至少99％的純度。
術語「胺基酸」指天然存在和合成的胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸的方式發揮功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸為由遺傳密碼編碼的胺基酸，以及隨後修飾的胺基酸，例如，羥(基)脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物指與天然存在的胺基酸具有相同的基本化學結構的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基團結合的α碳，例如同型絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶等等。這種類似物具有改變的R基團(例如正亮氨酸)或改變的肽鏈，但是保持了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。「胺基酸模擬物」指具有不同於胺基酸通常的化學結構的化合物，但以類似於天然存在的胺基酸的方式發揮作用。
在現有技術中有多種已知的方法可以以位點特異性方式將非天然的胺基酸衍生物或類似物整合入多肽鏈，例如參見WO02/086075。
此處胺基酸可以由通常已知的IUPAC-IUB生物化學命名法委員會推薦的三個字母符號或由一個字母符號代表。同樣，核苷酸可以由它們的通常承認的一個字母代碼表示。
「保守修飾變體」同時應用於胺基酸和核酸序列。對於特定的核酸序列，「保守修飾變體」指編碼同樣的或基本上同樣的胺基酸序列的核酸，或當該核酸不編碼胺基酸序列時，表示基本上同樣的序列。由於遺傳密碼的簡併性，許多功能上相同的核酸編碼任意給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因而，在每個由密碼子確定的丙氨酸位點，該密碼子可以改變為上述的任何相應的密碼子而不改變編碼的多肽。這種核酸變異為「沉默變異」，是保守變化的一種。在這裡每個編碼多肽的核酸序列也描述每個可能的核酸沉默變體。熟練技術人員將認識到核酸中的每個密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一的密碼子，以及TGG，其通常是色氨酸唯一的密碼子)均可以改變而產生功能上相同的分子。相應地，編碼多肽的核酸的每個沉默變體均暗含在每個描述的序列中。
至於胺基酸序列，熟練技術人員將認識到在編碼序列中改變、增加或刪除單個胺基酸或小百分比的胺基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質序列的單個的置換、缺失或添加是一種「保守修飾變體」，其中該改變導致用化學性質上類似的胺基酸取代一種胺基酸。保守置換目錄提供了在本領域中為大家所熟知的功能上類似的胺基酸。這種保守修飾變體補充且不排除本發明的多態變體、種間同系物以及等位基因。
下列八個組均含有相互保守置換的胺基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)；3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(例如參見，Creighton，Proteins(1984))。
此處胺基酸可以由通常已知的IUPAC-IUB生物化學命名法委員會推薦的它們的三個字母符號或由一個字母符號代表。同樣，核苷酸可以由它們的通常承認的一個字母代碼表示。
在本申請中，胺基酸殘基依照其在未改變的野生型多肽序列中相對於最左側的殘基編號，該最左側的殘基編號為1。
此處採用的「靠近脯氨酸殘基」指與脯氨酸殘基相距大約10個胺基酸以內的胺基酸，優選與脯氨酸殘基相距大約9、8、7、6或5個以內的胺基酸，更優選與脯氨酸殘基相距大約4、3、2或1個以內的殘基。「靠近脯氨酸殘基」的胺基酸可以在脯氨酸殘基的C或N末端側。
此處採用的「多肽」、「肽」和「蛋白質」指胺基酸殘基的聚合物，可互換使用。這三個術語都適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。此處使用的該術語包括任何長度的胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中胺基酸殘基由共價肽鍵連接。
用於向野生型人生長激素導入附加的N-或O-連接糖基化位點的情形的術語「突變」指通過化學的、酶促的或任何其他的方式分別在編碼野生型人生長激素的多核苷酸序列或野生型人生長激素的胺基酸序列進行任意的核苷酸或胺基酸殘基的缺失、插入、或取代，由此產生的人生長激素的胺基酸序列含有至少一個在相應的野生型人生長激素中不存在的N-或O-連接糖基化位點。在胺基酸取代的情況下，保守和非保守取代都可用來產生含有新的N-或O-連接糖基化位點的hGH突變體。
導入新的N-或O-連接糖基化位點的突變的位點可以位於多肽的任何位置。示例性的人生長激素突變體的胺基酸序列在SEQ ID NOs3-9中描述。本發明的「突變體人生長激素」因而含有至少一個突變胺基酸殘基。另一方面，在本申請中改變了其編碼序列而產生突變體人生長激素的野生型人生長激素稱為「相應的野生型人生長激素」，例如，SEQ ID NO1是具有胺基酸序列SEQ ID NO3-9的突變體人生長激素的相應的野生型人生長激素的胺基酸序列。
此處使用的術語「有效量」指給與一種物質而產生治療性效應的量。該效應包括疾病/病症和相關的併發症的症狀的任何可檢測程度的預防、矯正或抑制。準確的量取決於治療的目的，並可以由本領域技術人員採用已知的技術確定(例如，參見Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar，Dosage Calculations(1999))。
此處使用的術語「修飾糖」指在本發明的過程中在肽的胺基酸或糖基殘基上用酶學方法加入的天然或非天然存在的碳水化合物。修飾糖是從許多酶底物選擇的，包括但不限於糖核苷酸(單、雙和三磷酸)，活化糖(例如，糖基滷化物、糖基甲磺酸)和既非活化也非核苷酸的糖。該「修飾糖」採用「修飾基團」共價地官能化。可利用的修飾基團包括但不限於，水溶性聚合物、治療性部分、診斷部分、生物分子等等。修飾基團優選並非天然存在，或一種未改變的碳水化合物。選擇用修飾基團功能化的位點，使其不阻止「修飾糖」酶促加入肽中。
術語「水溶性」指在水中具有一定的可檢測的溶解度的部分。現有技術中水溶性檢測和/或定量的方法為眾所周知。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖類、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。肽可以具有由單個胺基酸組成的混合序列，例如聚(賴氨酸)。一種示例性的聚糖是聚(唾液酸)，一種示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如，m-PEG。聚乙烯亞胺是一種示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是一種典型的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，很清楚其他相關聚合物也適合用於本發明的實踐中，且術語PEG或聚(乙二醇)的在這方面的應用定是開放的和不是排它性的。術語PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、雙功能的PEG、多臂PEG、分岔PEG、分枝的PEG、具側鏈(pendent)PEG(即具有一個或多個懸掛於該聚合物骨架的功能性基團的PEG或相關聚合物)，或其中具有可降解的鍵的PEG。
聚合物骨架可以是直線的或分枝的。分支聚合物主鏈通常在現有技術中是已知的。分支聚合物一般具有一個中心支型核心部分和與中心支型核心連接的多個線型聚合物鏈。PEG通常以分枝形式使用，可以通過向多種多元醇如甘油、季戊四醇和山梨糖醇添加環氧乙烷製備。該中心分支部分還可以來自幾個胺基酸，例如賴氨酸。分支聚(乙二醇)通常可以表示為R(-PEG-OH).sub.m.的形式，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，m代表臂的數目。例如在U.S.專利號5,932,462中描述的多臂PEG分子也可以用作聚合物骨架，這裡將該文獻整體作為參考引入。
許多其他的聚合物也適於本發明。具有從2到大約300個末端的非肽類和水溶性的聚合物骨架特別適用於本發明。適宜的聚合物的實例包括但是不限於其他聚(亞烷基)二醇、例如聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇共聚物等等，聚(乙氧基化的多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羥丙基甲基丙烯醯胺)、聚(α-羥酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)、例如在U.S.專利號5,629,384中描述的，此處將其整體引入作為參考，以及共聚物、三元共聚物和其混合物。儘管聚合物骨架的各鏈的分子量可以不同，一般在大約100Da到大約100,000Da的範圍內，常常在大約6,000Da到大約80,000Da。
此處給與患者肽藥品的情形中使用的「曲線下面的面積」或「AUC」定義為在描述作為從零到無窮大的時間的函數的藥品在患者中體循環的濃度曲線下面的總面積。
此處在給與患者肽藥品的情形中使用的術語″半衰期″或″t 1/2″定義為藥品在患者中的血漿濃度減少為一半需要的時間。可能有與肽藥品相關的多於一個的半衰期，其取決於多種清除機制、重新分配及其他現有技術眾所周知的機制。通常α和β半衰期定義為α階段與重新分配相關，β階段與清除率相關。然而，對於大部分限於血流內的蛋白藥品可以有至少兩種清除半衰期。對一些糖基化肽，通過識別末端的半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺、N-乙醯葡糖胺、甘露糖或巖藻糖的巨噬細胞或內皮細胞上的受體可以介導迅速的β階段清除率。經由腎臟對具有有效半徑＜2nm(大約68kD)的分子的腎小球濾過作用和/或組織中特異的或非特異性的攝取和代謝可以發生較慢的β階段清除率。糖聚乙二醇化可以覆蓋末端糖(例如，半乳糖或N-乙醯半乳糖胺)，並因此經由識別這些糖的受體阻斷迅速的α階段清除率。此外可能給與更大的有效半徑，從而減少分配的體積和組織攝取，從而延長晚期β階段。因而，糖聚乙二醇化對α階段和β階段半衰期的準確的影響隨著大小、糖基化狀態及其他參數而變化，如現有技術中眾所周知的。在Pharmaceutical Biotechnology中具有對「半衰期」的更進一步的說明(1997，DFA Crommelin and RD Sindelar，eds.，HarwoodPublishers，Amsterdam，pp 101-120)。
此處使用的術語「糖綴合」指酶促介導的將修飾糖類與多肽的胺基酸或糖基殘基綴合，例如，本發明的突變體人生長激素。「糖綴合」的一個亞類是「乙二醇-聚乙二醇化」，其中修飾糖的修飾基團為聚(乙二醇)和烷基衍生物(例如m-PEG)或其反應性的衍生物(例如H2N-PEG、HOOC-PEG)。
術語「大規模」和「工業規模」可互換使用，指完成單個反應周期產生至少大約250mg，優選至少大約500mg，更優選至少大約1克的糖綴合物的反應周期。
此處使用的術語「糖基連接基團」指共價連接了修飾基團(例如PEG部分、治療性部分、生物分子)的糖基殘基；該糖基連接基團將修飾基團連接到綴合物的剩餘部分。在本發明的方法中，「糖基連接基團」共價地與糖基化的或未糖基化的肽連接，從而將該試劑連接到肽的胺基酸和/或糖基殘基上。「糖基連接基團」通過將「修飾糖」用酶與肽的胺基酸和/或糖基殘基連接而通常來源於「修飾糖」。糖基連接基團可以是一個在修飾基團-修飾糖盒形成期間降解(例如氧化→席夫鹼形成→還原)的糖類衍生結構，或該糖基連接基團可以保持完整。「保持完整的糖基連接基團」指來源於糖基部分的連接基團，其中連接修飾基團和綴合物的剩餘部分的糖類單體沒有降解，例如氧化，例如，由偏過磺酸鈉氧化。本發明的「完整的糖基連接基團」可以來源於天然地存在的寡糖，即從親代糖結構中添加糖基單位或除去一個或多個糖基單位。
此處使用的術語「靶向部分」指選擇性的定位於機體特定的組織或區域的種類。定位由分子決定簇的特異性識別、靶向試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等介導。將試劑定向給與特定的組織或區域的其他機制為本領域技術人員已知。示例性的靶向部分包括抗體、抗體片段、運鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。
此處使用的「治療性部分」表示任何可用於治療的試劑，包括但不限於抗生素、消炎藥、抗腫瘤藥、細胞毒素和放射性試劑。「治療性部分」包括生物活性試劑的前體藥物，其中由超過一個治療性部分結合於載體的構建體，例如，多價試劑。
治療性部分也包括蛋白質和包含蛋白質的構建體。示例性的蛋白質包括但是不限於紅細胞生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、幹擾素(例如幹擾素-α、β、γ)、白細胞介素(例如白細胞介素II)、血清蛋白(例如凝血因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成激素(LH)和抗體融合蛋白(例如腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結構域融合蛋白))。
此處使用的「抗腫瘤藥」表示任何可用於抗癌的試劑，包括但不限於細胞毒素和例如抗代謝物、烷化劑、蒽環黴素、抗生素、抗有絲分裂劑、丙卡巴肼、羥基脲、天冬醯胺酶、皮質甾類、幹擾素和放射性試劑之類的試劑。也包括在術語「抗腫瘤藥」的範圍內的是具有抗腫瘤活性的肽綴合物，例如TNF-α。綴合物包括但是不限於在本發明的治療性蛋白質和糖蛋白之間形成的綴合物，一種典型的綴合物是PSGL-1和TNF-α之間形成的。
此處使用的「細胞毒素或細胞毒素試劑」指對細胞有害的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、tenoposide、長春花新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥anthracinedione、米託蒽醌、普卡黴素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、和嘌呤黴素和其類似物或同源物。其它毒素包括如蓖麻蛋白、CC-1065和類似物、阿黴素，其它毒素包括白喉毒素、和蛇毒(例如眼鏡蛇毒)。
此處使用的「放射性試劑」包括在腫瘤確診或摧毀中有效的任何放射性同位素。實例包括但是不局限於銦-111、鈷-60。另外，天然存在的放射性元素，例如一般代表放射性同位素的混合物的鈾、鐳和釷是適宜的放射性試劑的實例。金屬離子一般與有機螯合部分螯合。
現有技術中已知許多有用的螯合基團，冠醚、穴狀配體等等，它們可以併入本發明的化合物(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等等及其膦酸酯類似物，例如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等等)，例如參見，Pitt等，「The Design of Chelating Agents for the Treatmentof Iron Overload」，In，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY ANDMEDICINE；Martell，Ed.；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Duga s，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，以及其中含有的參考文獻。
另外，本領域技術人員已知有多種途徑可以將螯合劑、冠醚和環糊精與其它分子連接。例如，參見，Meares等，「Properties of In VivoChelate-Tagged Proteins and Polypeptides」，In，MODIFICATIONOF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS；Feeney等，Eds.，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等，Bioconjugate Chem.，9108-117(1998)；Song等，Bioconjugate Chem.，8249-255(1997)。
此處使用的「藥學上可接受的載體」包括當與綴合物組合時保持綴合物的活性，且對患者的免疫系統沒有反應的任何材料。實例包括但是不局限於任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、如油/水乳劑的乳劑以及各種類型的溼潤劑。其它載體也可以包括無菌溶液、片劑(包括糖衣片劑)和膠囊。通常這種載體含有賦形劑，如澱粉、乳汁、糖、一定類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鈣或鎂、滑石、植物脂肪或油、樹膠、二元醇或其它已知的賦形劑。這種載體也可以包括香味和顏色添加劑或其它成分。含有這種載體的組合物用眾所周知的習用方法配製。
此處使用的「給藥」表示口服、吸入、作為栓劑給藥、局部接觸、靜脈內、腹膜內、肌肉內、病灶內、鼻內或皮下給藥，或緩釋裝置的植入，例如給患者採用微滲透泵。給藥可通過任意的途徑，包括非腸道和經黏膜(例如，口、鼻、陰道、直腸或透皮)。腸胃外給藥法包括例如靜脈內、肌內、動脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內和顱內。而且，當注射是治療腫瘤時，例如誘導凋亡，給藥可以直接地給與腫瘤和/或給與腫瘤周圍的組織。其它給藥方式包括但是不局限於利用脂質體製劑、靜脈內輸注、透皮貼劑等。
術語「分離的」指充分地或基本上不含某些成分的材料，其中所述成分是用來產生該材料的。對本發明的肽綴合物，該術語「分離的」指充分地或基本上不含某些組分的材料，所述組分通常伴隨著用於製備肽綴合物的混合物中的材料。「分離」和「純化」可以互換使用。通常，本發明的分離的肽綴合物具有表示為一定範圍的優選的純度水平。肽綴合物純度範圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，純度範圍的上限大約為70％、大約80％、大約90％或高於大約90％。
當肽綴合物高於大約90％純度時，它們的純度也優選表示為一定的範圍。該純度範圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。該純度範圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％。
純度由本領域已知的任何分析方法確定(例如，銀染凝膠上的譜帶強度、聚丙烯醯胺凝膠電泳、HPLC或類似的方式)。
此處使用的「該群體的基本上各個成員」描述了本發明的肽綴合物的群體的特徵，其中將選定比率的被加到肽上的修飾糖加到肽鏈上的多個相同的受體部位。「該群體的基本上各個成員」指與修飾糖綴合的肽上位點的均一性，指本發明的綴合物最少大約80％，優選至少大約90％以及更優選至少大約95％的均一性。
「均一性」指修飾糖綴合的受體部分群體的結構一致性。因此，在本發明的肽綴合物中，各個修飾糖部分所連接的受體部位與每個其它修飾糖部分所連接的受體部位相同時，則該肽綴合物為大約100％均一的。均一性通常表示為一個範圍，肽綴合物均一性範圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，純度範圍的上限大約為70％、大約80％、大約90％或高於大約90％。
當肽綴合物高於或等於大約90％均一時，它們的均一性也優選表示為一定的範圍。該均一性範圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。純度範圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％。肽綴合物的純度通常由一種或多種本領域技術人員已知的方法確定，例如，液相色譜-質譜學(LC-MS)、基質輔助雷射解吸飛行時間質譜測定法(MALDITOF)、毛細管電泳等等。
當涉及糖肽種類時，「基本統一的糖形式」或「基本統一的糖基化模式」，指由目的糖基轉移酶(例如巖藻糖基轉移酶)糖基化的受體部分的百分比。例如，對α1、2巖藻糖基轉移酶而言，如果在本發明的肽綴合物中基本上全部的(如下文所定義的)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸化類似物是巖藻糖化的，則存在基本上統一的巖藻糖基化模式。本領域技術人員將理解，起始材料可以含有糖基化的受體部分(例如巖藻糖化Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算的糖基化百分比包括通過本發明的方法糖基化的受體部分，以及在起始材料中已經糖基化的受體部分。
上述定義的「基本統一」中的術語「基本上」通常表示至少大約40％、至少大約70％、至少大約80％、或更優選至少大約90％，更優選至少大約95％的特定的糖基轉移酶的受體部分是糖基化的。
從下面的詳細說明中顯而易見本發明的其它對象、方面和優勢。縮寫PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基聚(丙二醇)；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙醯半乳糖基氨基；Glc，葡糖基；GlcNAc，N-乙醯基葡萄糖胺；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖氨基醋酸；Sia，唾液酸；以及NeuAc，N-乙醯神經胺。
簡介為了提高用於治療目的的重組人生長激素的效果，本發明提供了人生長激素的遺傳工程突變體，含有天然存在的人生長激素中不存在的N-連接或O-連接的糖基化位點。雖然這些hGH突變體基本上保留了野生型激素的生物活性，新導入的糖基化位點使重組產生的hGH突變體以多種模式糖基化。而且，非天然的糖基化位點提供了肽與修飾基團的綴合位點，例如，通過糖綴合。一種示例性的修飾基團是水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)。修飾hGH突變體可以提高重組體hGH在患者循環中的穩定性和保留時間，降低它們的抗原性，並提高它們靶向需要治療的特定組織的能力。
突變體本發明提供了hGH的突變體，其包括在野生型肽中未發現的一個或多個O-或N-連接糖基化位點。該突變體是在野生型肽中通常不會糖基化，或可能很少糖基化的一個或多個位點上酶促糖基化的底物，因此，該突變體改變了糖基殘基或糖基連接基團的位點以獲得具有選擇的合乎需要的性狀的肽。除了糖基殘基或糖基連接基團的位點和數目外，可以利用本發明的突變體和方法改變的其他性狀包括藥物代謝動力學、藥效學、對蛋白質水解的抵抗力、免疫原性、通過網狀內皮組織系統的識別、組織分配等等。
因此，一方面本發明提供了一種分離的含有編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列的核酸。該突變體人生長激素包括在相應的野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化位點。在一些具體實施方式
中，相應的野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列，在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了含有一種包括編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列的核酸(例如分離的核酸)的表達盒或細胞，該突變體人生長激素包括在相應的野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化位點。
另一方面，本發明提供了一種突變體人生長激素，其包括野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接的糖基化位點。在一些具體實施方式
中，相應的野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列，在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供了一種生產突變體人生長激素的方法，該突變體包括相應野生型人生長激素中不存在的N-連接或O-連接糖基化的位點。該方法包括重組生產突變體人生長激素，以及在新的糖基化位點糖基化該突變體人生長激素的步驟。在一些具體實施方式
中，相應的野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。在一些優選方案中，突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
hGH編碼序列的獲得常規重組技術本發明基於重組遺傳學領域的常規技術。基本的文獻公開了本發明中採用的常規方法，包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3rd ed.2001)；Kriegler，Gene Transfer andExpressionA Laboratory Manual(1990)；以及Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
對於核酸，大小以千鹼基對(kb)或鹼基對(bp)表示，這些都來自瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、測序的核酸或公開的DNA序列的估計。對於蛋白質，大小以千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數表示，蛋白質大小都從凝膠電泳、測序的蛋白、獲得的胺基酸序列或公開的蛋白質序列估計。
不能從市場上買到的寡核苷酸可以以化學方法人工合成，例如，根據Beaucage Caruthers，Tetrahedron Lett.221859-1862(1981)中首先描述的固相亞磷醯胺三酯方法，使用Van Devanter等在Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)中描述的自動合成裝置。寡核苷酸的純化可使用任意的現有技術已知策略進行，例如Pearson Reanier在J.Chrom.255137-149(1983)中描述的自然丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC。
克隆的野生型人生長激素基因的序列、編碼突變體人生長激素的多核苷酸以及合成的寡核苷酸可以在克隆後驗證，例如使用Wallace等Gene 1621-26(1981)中的雙鏈模板測序的鏈終止法。
野生型hGH編碼序列的克隆和亞克隆一些編碼野生型人生長激素的多核苷酸序列，例如GenBank登錄號NM 000515、NM 002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM 022560、NM 022561和NM 022562，已經確定並可以從商業供應者獲得。
對人基因組研究的迅速進展已經取得了可能的克隆方法，其中可以在人DNA序列資料庫中搜索與已知的核苷酸序列具有一定的序列同源性百分比的任意的基因片段，例如一個編碼已知的人生長激素的基因。如此識別的任意的DNA序列可以隨後通過化學合成和/或聚合酶鏈式反應(PCR)技術例如重疊延伸方法獲得。對於較短的序列，完全可以全部從頭合成；然而使用合成的探針從人cDNA或基因組文庫中更進一步地分離全長編碼序列對獲得更大的基因可能是必需的。
另外，編碼人生長激素的核酸序列可以使用規範的克隆技術例如聚合酶鏈式反應(PCR)從人cDNA或基因組DNA文庫中分離，其中基於同源性的引物往往可以來自編碼人生長激素的已知的核酸。為了這個目的最常使用的技術在標準化的書籍中有所描述，例如，Sambrook和Russell，同上。
適用於獲得野生型人生長激素編碼序列的cDNA文庫可以市場上買到或可以構建。分離mRNA、通過反轉錄產生cDNA、連接cDNA進入重組載體、轉染入重組體宿主進行繁殖、篩查和克隆的一般方法是眾所周知的(例如參見Gubler和Hoffman，Gene，25263-269(1983)；Ausubel等，同上)。在通過PCR獲得擴增的核苷酸序列的片段後，該片段可以進一步用作探針從cDNA文庫中分離編碼野生型人生長激素的全長多核苷酸序列。合適的步驟的一般說明可以在Sambrook和Russell，同上中找到。
可以從人基因組文庫實行類似的步驟獲得編碼野生型人生長激素的全長序列，例如任何一個上述的GenBank登錄號的序列。人基因組文庫可以從市場上購買獲得，或可以根據多種現有技術已知的方法構建。通常，為構建基因組文庫，首先從一種可能找到人生長激素的組織中提取DNA，然後將該DNA機械地切斷或用酶消化產生大約12-20kb長度的片段，隨後通過梯度離心從不想要的大小的多核苷酸片段中分離片段並插入噬菌體λ載體，這些載體和噬菌體在體外包裝。通過Benton和Davis，Science，196180-182(1977)描述的噬斑雜交分析重組噬菌體，菌落雜交按照Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)中描述的進行。
基於序列同源性，可以設計簡併寡核苷酸作為引物對，而可以在適宜條件下進行PCR(例如參見White等人，PCR ProtocolsCurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCRTechnology，CRC Press Inc.1994)來從cDNA或基因組文庫擴增核苷酸序列片段。使用擴增的片段作為探針，獲得編碼野生型人生長激素的全長核酸。
獲得編碼野生型人生長激素的核酸序列後，可以將編碼序列亞克隆入載體，例如，一種表達載體，因此可以從獲得的構建體中產生重組野生型人生長激素。可以隨後進一步改變野生型人生長激素的編碼序列，例如，進行核苷酸取代以改變分子的特性。
向hGH序列中導入突變從一種編碼多核苷酸序列可以確定野生型人生長激素的胺基酸序列，例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。隨後，通過在胺基酸序列中的不同位置上導入另外的糖基化位點可以修飾這些胺基酸序列以改變蛋白質的糖基化模式。
現有技術中眾所周知幾種類型的蛋白質糖基化位點，例如，在真核生物中，N-連接糖基化發生在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬醯胺上，其中Xaa是除脯氨酸外的任意的胺基酸(Kornfeld等，Ann Rev Biochem 54631-664(1985)；Kukuruzinska等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842145-2149(1987)；Herscovics等，FASEB J7540-550(1993)；以及Orlean，Saccharomyces Vol.3(1996))。O-連接糖基化發生在絲氨酸或蘇氨酸殘基上(Tanner等，，Biochim.Biophys.Acta.90681-91(1987)；以及Hounsell等，Glycoconj.J.1319-26(1996))。其它糖基化模式由糖基磷脂醯肌醇與蛋白質的羧基末端羧基連接而形成(Takeda等，Trends Biochem.Sci.20367-371(1995)；以及Udenfriend等，Ann.Rev.Biochem.64593-591(1995)。基於這些知識，因此可以向野生型人生長激素序列引入適宜的突變以形成新的糖基化位點。
儘管人生長激素多肽序列內的胺基酸殘基的直接改變可以適於導入新的N-連接或O-連接糖基化位點，然而更多的情況是導入新的糖基化位點常常藉助於編碼人生長激素的多核苷酸序列的突變。這可以通過使用任何已知的誘變方法實現，其中有一些將在下文討論。示例性的人生長激素的改變包括SEQ ID NO3或SEQ ID NO4中說明的。
現有技術中描述了多種產生突變的方法。例如，參見，Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-4509(1997)；以及Stemmer，Nature，370389-391(1994)。該方法可以分別或聯合用於生產一組核酸的變體，以及由此編碼的多肽變體。誘變、文庫構建及其他多樣性產生方法的試劑盒均可從市場上購買得到。
舉例來說，產生多樣性的突變方法包括定點誘變(Botstein和Shortle，Science，2291193-1201(1985))，使用含有尿嘧啶的模板的誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))，寡核苷酸指導的誘變(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，106487-6500(1982))，硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等，Nucl.Acids Res.，138749-8764和8765-8787(1985))，以及使用缺口雙鏈DNA的誘變(Kramer等，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984))。
其它產生突變的合適的方法包括點錯配修復(Kramer等，Cell，38879-887(1984))，使用修復缺限宿主株的誘變(Carter等，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985))，缺失誘變(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制選擇和限制純化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317415-423(1986))，通過總基因合成的誘變(Nambiar等，Science，2231299-1301(1984))，雙鏈中斷修復(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986))，多核苷酸鏈終止法誘變(U.S.專利號5,965,408)，以及易錯聚合酶鏈式反應(Leung等，Biotechniques，111-15(1989))。
改變核酸以適合於宿主生物體中的偏愛密碼子利用此外可以改變編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列以符合特定宿主的偏愛密碼子利用。例如，細菌細胞株偏愛密碼子利用可用於得出編碼本發明的突變體人生長激素的多核苷酸，且包括該菌株偏愛的密碼子。宿主細胞顯示出的偏愛密碼子利用的頻率可以通過由宿主細胞表達的大量的基因中的偏愛密碼子利用的平均頻率計算(例如，從日本Kazusa DNA研究所的網址可獲得計算服務)。這些分析優選限於宿主細胞高度表達的基因。例如U.S.專利號5,824,864提供了雙子葉植物和單子葉植物顯示出的高表達基因的密碼子使用的頻率。
修飾完成後，通過測序確定突變體人生長激素的編碼序列，然後亞克隆入一種合適的表達載體以和野生型人生長激素同樣的方法進行重組體生產。
突變體hGH的表達和純化測序證實後，可以使用重組遺傳學領域的常規技術依靠此處公開的編碼多肽的多核苷酸序列生產本發明的突變體人生長激素。
表達系統為了獲得編碼本發明的突變體人生長激素的核酸的高水平表達，通常將編碼突變體人生長激素的多核苷酸亞克隆入一種含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子和轉錄起始的核糖體結合位點的表達載體中。現有技術中眾所周知適宜的細菌的啟動子，例如Sambrook和Russell，見上文，以及Ausubel等，見上文等都有所描述。表達野生型或突變體人生長激素的細菌表達系統在大腸桿菌、芽孢桿菌、沙門氏菌和柄桿菌屬等都可獲得。用於這種表達系統的試劑盒可在市場上購買得到。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核生物表達系統在現有技術中眾所周知，也可從市場上購買獲得。在一個具體實施方式
中，真核生物表達載體是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或逆轉錄病毒載體。
用於指導異源性核酸表達的啟動子取決於特定的應用。啟動子與異源性轉錄起始位點的距離可選地與在它的天然環境中相距轉錄起始位點的距離幾乎相同。然而如現有技術中已知的，可以允許這一距離的一些改變而不損失啟動子功能。
除了啟動子外，該表達載體通常包括轉錄單位或表達盒，含有在宿主細胞中表達突變體人生長激素所需要的全部附加元件。因此典型的表達盒含有與編碼突變體人生長激素的核酸序列可操作性地連接的啟動子以及轉錄本有效地聚腺苷酸化需要的信號、核糖體結合位點和翻譯終止位點。編碼人生長激素的核酸序列通常與可裂解的信號肽序列連接，以促進轉化細胞分泌人生長激素。這種信號肽包括來自組織纖溶酶原激活物、胰島素、和神經元生長因子，以及煙芽夜蛾(Heliothis virescens)保幼激素酯酶的信號肽。該盒的其它元件可以包括增強子，並且如果基因組DNA用作結構基因，則還可以包括具有功能性剪接供體和受體位點的內含子。
除了啟動子序列外，在表達盒結構基因的下遊也含有轉錄終止區域，以提供有效終止。終止區域可以與啟動子序列獲自相同的基因，或可以從不同的基因中獲得。
用於將遺傳信息輸送到細胞的特定的表達載體並不特別嚴格，可以使用用來在真核或原核細胞表達的任何常規載體。標準細菌表達載體包括例如基於pBR322的質粒、pSKF、pET23D之類的質粒以及例如GST和LacZ的融合表達系統。還可以向重組體蛋白質加入抗原決定簇標籤，例如c-myc，以提供分離的便利方法。
含有來自真核病毒的調控元件的表達載體通常用於真核生物的表達載體，例如SV40載體、乳頭瘤病毒載體、以及來源於EB病毒的載體。其它示例性的真核載體包括pMSG、pAV009/A、pMT010/A、pMAMneo-5、杆狀病毒pDSVE以及在SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳腺腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其它顯示在真核細胞中有效表達的啟動子指導下允許蛋白表達的任意的其它載體。
一些表達系統具有提供基因擴增的標記物，如胸苷激酶、潮黴素B磷酸轉移酶和二氫葉酸還原酶。另外，不涉及基因擴增的高產表達系統也適宜，例如昆蟲細胞中的杆狀病毒載體，具有在多角體蛋白啟動子或其它強杆狀病毒啟動子指導下的編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列。
通常包含在表達載體內的元件也包括在大腸桿菌中行使功能的複製子、編碼抗生素抗性以對含有重組質粒的細菌進行選擇的基因，以及在質粒的非必需區的唯一的限制性位點，以允許真核生物序列的插入。選擇的特定的抗生素抗性基因並不嚴格，任何現有技術中已知的許多抗性基因都是適宜的。如有必要，選擇原核生物序列，使它們不幹涉真核細胞中DNA的複製。類似於抗生素抗性選擇標記物，基於已知的代謝途徑的代謝選擇標記物也可以用作選擇轉化的宿主細胞的手段。
當需要重組蛋白質(例如本發明的hGH突變體)的周質表達時，表達載體此外含有編碼分泌信號的序列，例如大腸桿菌OppA(周質寡肽結合蛋白)分泌信號或其修飾形式，其直接地與表達的蛋白質的編碼序列的5′連接。這個信號序列指導細胞質中產生的重組蛋白質通過細胞膜進入周質間隙。該表達載體此外可以包括信號肽酶1的編碼序列，當重組蛋白質進入周質間隙時它能夠酶促分裂信號序列。重組蛋白質的周質生產的更詳細說明可以在Gray等，Gene 39247-254(1985)、U.S.專利號6,160,089和6,436,674中找到。
正如以上討論的，所屬領域的技術人員將認識到可以對野生型或突變體人生長激素或它的編碼序列進行各種保守取代，而仍然保留人生長激素的生物活性。而且，也可以按照特定的表達宿主中的偏愛密碼子利用情況進行多核苷酸編碼序列的修飾，而不改變產生的胺基酸序列。
轉染方法採用標準轉染方法生產表達大量突變體人生長激素的細菌、哺乳動物、酵母、昆蟲、或植物細胞系，然後使用標準技術純化(例如參見，Colley等，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根據標準技術實行真核生物和原核細胞的轉化(例如參見，Morrison，J.，Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss Curtiss，Methods in Enzymology 101347-362(Wu等，eds，1983)。
可以使用任何眾所周知的向宿主細胞中導入外來核苷酸序列的方法。這包括利用磷酸鈣轉染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、原生質體融合、電穿孔法、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒載體和向宿主細胞中導入克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外來的遺傳物質的任何其它的眾所周知的方法(例如，參見，Sambrook和Russell，如上所述)。唯一需要的一點是特定的遺傳工程方法能夠向能夠表達突變體人生長激素的宿主細胞成功地導入至少一個基因。
在宿主細胞中檢測突變體hGH的表達在表達載體被導入合適的宿主細胞後，在有利於突變體人生長激素表達的條件下培養轉染的細胞，然後篩選細胞中重組體多肽的表達，隨後使用標準技術從培養基中回收重組體多肽(例如參見，Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；U.S.專利號4,673,641；Ausubel等，如上所述；以及Sambrook和Russell如上所述)。
本領域熟練技術人員眾所周知篩選基因表達的一些一般方法。首先，可以在核酸水平檢測基因表達，通常使用利用核酸雜交技術的許多特異的DNA和RNA測定方法(例如Sambrook和Russell，見上文)。一些方法涉及電泳分離(例如檢測DNA的Southern印跡和檢測RNA的Northern印跡)，但是DNA或RNA的檢測也可以不進行電泳(例如通過斑點印跡)。轉染的細胞中編碼突變體人生長激素的核酸的存在還可以利用序列特異的引物通過PCR或RT-PCR檢測。
第二，可以在多肽水平檢測基因表達。本領域技術人員通常採用多種免疫學分析測定基因產物的水平，特別是利用與本發明的突變體人生長激素特異性地作用的多克隆或單克隆抗體，例如具有SEQ ID NO3、4或5的胺基酸序列的多肽(例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975))。這種技術需要通過選擇特異性針對突變體人生長激素或其抗原部分的高特異性抗體。已經良好建立了生產多克隆和單克隆抗體的方法，它們的說明可以在文獻中找到，例如參見Harlow和Lane，見上文；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)。隨後的部分將提供製備針對本發明的突變體人生長激素的抗體和實施免疫學測定檢測突變體人生長激素的更詳細說明。
重組產生的突變體hGH的純化一旦證實了轉染的宿主細胞中重組突變體人生長激素的表達，為了純化重組體多肽的目的，將宿主細胞以適當規模培養。
在細菌中生產的重組突變體hGH的純化通常在啟動子誘導後(儘管表達可以是組成性的)，當轉化的細菌大量地生產本發明的突變體人生長激素時，蛋白質可以形成難溶的集合體。有一些適用於純化蛋白質包涵體的方法，例如，純化集合體蛋白質(以下稱包涵體)通常涉及通過裂解細菌細胞而提取、分離和/或純化包涵體，例如通過在含有大約100-150ug/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40的非離子型洗滌劑緩衝液中孵育。可以使用Polytron研磨機(Brinkman Instruments，Westbury，NY)研磨細胞懸液。另外，可以將細胞在冰上超聲降解。分解細菌的其它方法在Ausubel等以及Sambrook和Russell，見上文中描述，並且對本領域技術人員是顯而易見的。
通常將細胞懸液離心，含有包涵體的沉澱在緩衝液中再懸浮，該緩衝液不溶解包涵體但是洗滌該包涵體，例如20mM Tris-HCl(pH7.2)，1mM EDTA，150mM NaCl和2％ Triton-X 100即一種非離子型洗滌劑。可能需要重複洗滌步驟以儘可能多地除去細胞碎屑。包涵體的殘存顆粒可以在適當的緩衝液中再懸浮(例如，20mM磷酸鈉，pH6.8，150mM NaCl)。其它合適的緩衝液對本領域技術人員是顯而易見的。
洗滌步驟後，通過添加溶劑溶解包涵體，該溶劑同時是強的氫受體以及強的氫供體(或各具有一個這樣性狀的溶劑的聯合)。可以通過用相容的緩衝液稀釋或透析使形成該包涵體的蛋白質復性。適宜的溶劑包括但是不局限於尿素(從大約4M到大約8M)、甲醯胺(至少大約80％體積/體積)、以及鹽酸胍(從大約4M到大約8M)。由於蛋白質可能不可逆變性，並伴有免疫原性和/或活性的缺失，一些能夠溶解形成集合體的蛋白質的溶劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)和70％甲酸可以不適於這個方法。儘管鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，該變性作用並非不可逆轉的，通過除去(例如通過透析)或稀釋該變性劑可以發生復性，使目的蛋白質的免疫和/或生物學活性重新形成。溶解後，可以通過標準分離技術從其它細菌蛋白中分離該蛋白質。從細菌包涵體純化重組體人生長激素的進一步說明可參見Patra等，ProteinExpression and Purification 18182-190(2000)。
另外，可能從細菌周質中純化重組體多肽，例如突變體人生長激素。當重組蛋白質輸入細菌的周質時，除了本領域技術人員已知的其它方法外，可以通過冷滲透壓休克分離細菌的周質級份(例如參見Ausubel等，見上文)。為了從周質分離重組體蛋白質，離心細菌細胞形成沉澱，把該沉澱在含有20％蔗糖的緩衝液中再懸浮。為了裂解細胞，把細菌離心，將沉澱在冰冷的5mM MgSO4中再懸浮，並在冰浴中保持大約10分鐘。將該細胞懸液離心，並將上清移入其他容器保存。可以通過本領域技術人員眾所周知的標準分離技術從宿主蛋白中分離存在於上清液的重組體蛋白。
用於純化的標準蛋白分離技術當重組體多肽，例如本發明的突變體人生長激素在宿主細胞中以可溶形式表達時，它的純化可以按照如下所述的標準蛋白純化方法進行。
溶度分級經常作為起始步驟，並且如果蛋白混合物很複雜，初始的分級鹽析可以從例如本發明的突變體人生長激素的目的重組蛋白質中分離出許多不需要的宿主細胞蛋白質(或來源於細胞培養基的蛋白質)。優選的鹽是硫酸銨，硫酸銨通過有效地降低蛋白混合物中的水的量而沉澱蛋白質，蛋白質則根據它們的溶解度沉澱。蛋白的疏水性越大，它將越可能在較低的硫酸銨濃度下沉澱。一種典型的步驟是向蛋白溶液中加飽和硫酸銨使獲得的硫酸銨濃度在20-30％之間。這將沉澱最疏水性蛋白質。把沉澱丟棄(除非目的蛋白是疏水性的)，並向上清液中加入硫酸銨達到已知能沉澱目的蛋白的濃度。然後把沉澱溶解在緩衝液中，如有必要通過透析或者滲濾法除去過量的鹽。依賴蛋白質的可溶性的其它方法，例如冷乙醇沉澱法，對本領域技術人員是眾所周知的，可用於分離複雜的蛋白混合物。
大小差異過濾基於計算的分子量，可以通過不同的孔徑大小的膜(例如，Amicon或Millipore膜)的超濾作用分離具有較大和較小尺寸的蛋白。作為第一步，把蛋白混合物通過具有比目的蛋白，例如突變體人生長激素的分子量較低的分子量截止孔徑大小的膜進行超濾。然後用具有大於目的蛋白的分子量的分子截止值的膜超濾前一步的超濾液。重組蛋白質將通過該膜進入濾液，然後按照下述方法層析分離濾液。
柱層析法還可以根據它們的大小、淨表面電荷、疏水性、或配基親合力分離目的蛋白質(例如本發明的突變體人生長激素)。另外，人生長激素抗體可以與柱基質連接，人生長激素被免疫純化。所有這些方法在現有技術中是眾所周知的。
對技術人員顯而易見色譜技術可以以任意的規模使用和用來自許多不同的廠商(例如Pharmacia Biotech)的設備實行。
檢測突變體hGH表達的免疫分析為了證實重組突變體人生長激素的產生，免疫分析可以用於在樣品中檢測多肽的表達，免疫分析也可用於量化重組體激素的表達水平。針對突變體人生長激素的抗體是實現這些免疫分析所必需的。
針對突變體hGH的抗體的生產生產與目的免疫原特異性地反應的多克隆的和單克隆抗體的方法對本領域技術人員是已知的(例如參見，Coligan，CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene，NY，1991；Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY，1989；Stites等(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的參考文獻；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.)Academic Press，New York，NY，1986；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497，1975)。上述的技術包括通過從噬菌體或類似的載體中的重組體抗體庫選擇抗體的抗體製備(參見，Huse等，Science 2461275-1281，1989；以及Ward等，Nature 341544-546，1989)。
為了生產含有具有所需特異性的抗體的抗血清，目的多肽(例如本發明的突變體人生長激素)或其抗原性片段可用於免疫適當的動物，例如小鼠、兔子或靈長類動物。可按照標準的免疫步驟使用標準佐劑，例如弗氏佐劑。另外，來自特定的多肽的合成抗原肽可以與載體蛋白連接並隨後用作免疫原。
通過取得化驗血液並測定對目的抗原的反應性滴度來監控動物對免疫原製品的免疫反應。當獲得了抗體對抗原適當高的滴度時，從動物收集血液並製備抗血清。接著可以施行抗血清的進一步分級以富集對抗原特異性反應的抗體並可以進行進一步的抗體純化，參見Harlow和Lane，見上文，以及上文提供的蛋白純化的一般說明。
使用為本領域技術人員熟知的多種技術獲得單克隆抗體。通常把來自用所需抗原免疫的動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合而永生化(參見Kohler和Milstein，Eur J.Immunol.6511-519，1976)。永生化的其它方法包括例如用EB病毒、癌基因或逆轉錄病毒轉化，或現有技術中眾所周知的其它方法。篩查來自單個永生化細胞的克隆的具有需要的特異性和對抗原的親和性的抗體的產生，可以通過多種技術提高這種細胞生產的單克隆抗體的產量，包括注射入脊椎動物宿主的腹膜腔。
另外，通過根據Huse等(如上文)描述的一般方法篩選人B細胞cDNA文庫，鑑定編碼需要的特異性的抗體或這種抗體的結合片段的核酸序列，從而可以重組生產單克隆抗體，上述討論的重組體多肽生產的一般原則和方法適用於通過重組方法生產抗體。
當需要時，可以測試能夠特異性地識別本發明的突變體人生長激素的抗體對野生型人生長激素的交叉反應性，從而與野生型蛋白的抗體相區別。例如，從用突變體人生長激素免疫的動物中獲得的抗血清可以通過固定了野生型人生長激素的柱子，通過柱子的抗血清部分僅僅識別突變體人生長激素，而不識別野生型人生長激素。類似地，還可以篩查突變體人生長激素的單克隆抗體的僅僅識別突變體而不是野生型人生長激素的排他性。類似地，還可以篩查突變體人生長激素的單克隆抗體的僅僅識別突變體而不識別野生型人生長激素的專一性。
僅僅特異性地識別本發明的突變體人生長激素而不識別野生型人生長激素的多克隆或單克隆抗體可用於從野生型蛋白中分離突變體蛋白，例如通過將樣品與固定在固體載體上的突變體人生長激素特異的多克隆或單克隆抗體孵育。
檢測突變體hGH表達的免疫測定一旦可獲得本發明的突變體人生長激素的特異性抗體，可以通過各種向熟練的技術人員提供定性和定量結果的免疫測定方法檢測多肽在樣品(例如溶胞產物)中的數量。對一般的免疫學的和免疫測定方法的綜述參見，例如Stites，見上文；U.S.專利號4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168。
免疫分析的標記免疫測定常常利用與抗體和靶蛋白形成的結合複合物特異性地結合併標記的標記試劑。標記試劑本身可以是一個含有抗體/靶蛋白複合物的部分，或可能是第三部分，例如與抗體/靶蛋白複合物特異性地結合的另一個抗體。可以通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢測標記。實例包括但是不局限於磁珠(例如DynabeadsTM)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅、羅丹明等等)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如通常用於ELISA的辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等等)，以及比色標記例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等等)珠。
有時標記試劑是帶有可檢測的標記的第二抗體。另外，第二抗體可以沒有標記，但是它可以隨後由標記的特異性針對第二抗體來源的物種的抗體的第三抗體結合。第二抗體可以用可檢測的部分修飾，例如生物素，第三標記分子例如酶標鏈黴抗生物素可以特異性地與之結合。
其它能夠特異性地結合免疫球蛋白恆定區的蛋白，例如A蛋白或G蛋白，也可以用作標記試劑。這些蛋白質是鏈球菌細胞壁的正常組分。它們顯示出與來自各種物種的免疫球蛋白的恆定區的強非免疫原性反應性(通常參見，Kronval，等，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；以及Akerstrom，等，J.Immunol.，1352589-2542(1985))。
免疫測定形式檢測來自樣品的感興趣的目標蛋白(例如突變體人生長激素)的免疫測定可以是競爭性的或非競爭性的。非競爭性免疫測定是直接測量俘獲的靶蛋白的數量的分析。例如，在一種優選的「三明治」分析中，靶蛋白的特異性抗體可以與固定抗體的固體基質直接結合。然後俘獲試驗樣品中的靶蛋白。如此固定的抗體/靶蛋白複合物然後由標記試劑，例如如上所述的帶有標記物的第二或第三抗體結合。
在競爭分析法中，通過測量由存在於樣品中的靶蛋白從特異於所述靶蛋白的抗體取代(或競爭掉)加入的(外源性的)靶蛋白的數量而間接測量靶蛋白的數量，在一個這種分析的典型實例中，固定抗體並標記外源性的靶蛋白。由於與抗體結合的外源性的靶蛋白的數量與存在於樣品中的靶蛋白的濃度成反比，因此基於與抗體結合從而固定的外源性靶蛋白的數量可以確定樣品中靶蛋白的水平。
有時，採用western雜交(免疫印記)檢測和定量樣品中突變體人生長激素的存在。該技術通常包括由凝膠電泳根據分子量分離樣品蛋白，把分離的蛋白轉移到適當的固體載體(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜、或衍生的尼龍膜)，以及把樣品與特異性地與靶蛋白結合的抗體進行孵育。這些抗體可以直接標記或可以使用特異性地與突變體人生長激素的抗體結合的標記的抗體(例如標記的羊抗小鼠抗體)隨後檢測。
其它的分析形式包括脂質體免疫測定(LIA)，其使用設計成能結合特定分子(例如抗體)並釋放密封的試劑或標記的脂質體，然後根據標準技術檢測釋放的化學製劑(參見Monroe等，Amer Clin.Prod.Rev.，534-41(1986))。
突變體hGH的糖基化和糖綴合酶促糖基化和糖綴合肽的表達後體外修飾是一種補救依賴於操縱表達系統控制糖基化的方法的缺陷的吸引人的策略；包括聚糖結構的改變或在新的位點導入聚糖。可利用廣泛的轉移糖供體部分的酶，使得可以體外酶促合成具有定製設計的糖基化模式和糖基結構的糖綴合物，例如參見，U.S.專利號5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及公開的專利申請WO 98/31826；WO 01/88117；WO 03/031464；WO03/046150；WO 03/045980；WO 03/093448；WO 04/009838；US2002/142370；US2003/040037；US2003/180835；US2004/063911；US2003/207406；以及US2003/124645。
本發明提供製備糖基化的和非糖基化的突變體人生長激素的綴合物的方法，該突變體人生長激素具有相應野生型hGH不存在的新的糖基化位點。上述的綴合可以直接發生在糖基化的突變體hGH的合適的糖單位上，或在除去(即去除)任意的不需要的糖單位後發生。綴合形成在肽和例如水溶性聚合物、治療性部分、診斷部分、靶向部分等的不同種類之間。也提供了包括兩個或更多的通過連接臂連接的肽的綴合物，即多功能綴合物。本發明的多功能綴合物可以包括兩個或更多的拷貝的同樣的肽或各種有不同的結構和/或性質的肽的集合。
本發明的綴合物通過將修飾糖與糖基化的或非糖基化的肽酶促連接而形成。當修飾糖插入肽和糖上的修飾基團之間時變成這裡所稱的「完整的糖基連接基團」。使用酶的敏銳的選擇性，例如糖基轉移酶，本方法提供了在一個或多個特定位點具有所需基團的肽。因而，根據本發明，把修飾糖直接與肽鏈上選擇的位點連接，或者修飾糖附加在糖肽的碳水化合物部分。其中修飾糖同時與糖肽碳水化合物連接和直接與肽骨架的胺基酸殘基連接的肽也在本發明的範圍內。
與已知的化學和酶促肽加工策略相反，本發明的方法使把肽和具有基本上相同的衍生模式的糖肽組合起來成為可能；用於本發明的酶通常對特定胺基酸殘基或肽的胺基酸殘基的結合具有選擇性。本方法對修飾的肽和糖肽的大規模生產也是實用的。因此，本發明的方法提供了具有預選的統一的衍生模式的糖肽的大規模製備的實用方式。本方法特別適合治療性肽的修飾，包括但不限於在細胞培養的細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或原核細胞)或轉基因植物或動物生產期間不完全地糖基化的糖肽。
本發明的方法此外提供了由於降低的清除率或降低的免疫或網狀內皮系統(RES)的攝取等而具有提高的治療性半衰期的糖基化的和非糖基化肽的綴合物。此外，本發明的方法提供了屏蔽肽上的抗原決定簇的方式，因此降低或消除針對該肽的宿主免疫應答。靶試劑的選擇性連接還可以用來使肽靶向至對所述特定靶試劑特異性的特定的組織或細胞表面受體。
綴合物第一方面，本發明提供了在選擇的修飾基團和具有野生型肽中不存在的糖基化位點的hGH突變體肽之間的綴合物。修飾基團可以與突變體糖基化位點或存在於野生型肽的位點連接。
肽和修飾基團之間的連接包括插入肽和選擇的部分之間的糖基連接基團。如此處論述的，選擇的部分實質上是可以連接於糖單位從而產生可以被合適的轉移酶識別的修飾糖的任意種類，該轉移酶將修飾糖與肽連接。當修飾糖的糖組分插入肽和選擇的部分之間時，變成「糖基連接基團」，例如「完整的糖基連接基團」。糖基連接基團由任意單糖或寡糖組成，在用修飾基團修飾後，其是向肽的胺基酸或糖基殘基添加修飾糖的酶的底物。
該糖基連接基團可以是或可以包括在添加修飾基團期間降解性修飾的糖部分。例如，糖基連接基團可以來自由完整的糖氧化降解為相應的醛時產生的糖殘基，例如通過偏過碘酸鹽的作用，隨後用合適的胺變為席夫鹼，然後還原成相應的胺。
本發明的綴合物通常符合下列結構 其中符號a、b、c、d和s代表非零的正整數；t是0或正整數。「試劑」是治療劑、生物活性試劑、可檢測的標記、水溶性部分(例如PEG、m-PEG、PPG、和m-PPG)等等。「試劑」可以是一種肽，例如酶、抗體、抗原等等。該連接子可以是任何廣泛系列的連接基團，如下所述。另外，連接子可以是單鍵或「零級連接子」。
在一種示例性的具體實施方式
中，選擇的修飾基團是一種水溶性聚合物，例如m-PEG。水溶性聚合物經由糖基連接基團與肽共價連接。該糖基連接基團共價附著於肽的胺基酸殘基或糖基殘基。本發明此外提供了其中用糖基連接基團修飾胺基酸殘基和糖基殘基的綴合物。
一種示例性的水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)。用於本發明的聚(乙二醇)不局限於任何特定形式或分子量範圍。聚(乙二醇)分子量優選在500和100,000之間，優選採用500-60,000的分子量，優選為1,000-40 000，更加優選分子量從大約5,000到大約40,000。
在另一個具體實施方式
中聚(乙二醇)是一種具有多於一個連接的PEG部分的分支PEG。分支PEG的實例在下列文獻中描述U.S.專利號5,932,462；U.S.專利號5,342,940；U.S.專利號5,643,575；U.S.專利號5,919,455；U.S.專利號6,113,906；U.S.專利號5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；以及Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。在一個優選的方案中每個分支PEG的聚(乙二醇)分子量是5,000-20,000。
除提供通過酶促添加糖基連接基團形成的綴合物外，本發明提供了取代模式高度均一的綴合物。使用本發明的方法，可能形成基本上所有本發明的綴合物的群體中修飾糖部分與多個結構相同的胺基酸或糖基殘基連接的肽綴合物。因此，第二方面，本發明提供了具有水溶性聚合物部分群體的肽綴合物，該水溶性聚合物部分通過完整的糖基連接基團與肽共價結合。在一個本發明優選的綴合物中，該群體的基本上每個成員都經由糖基連接基團與肽的糖基殘基連接，且糖基連接基團連接的肽的每個糖基殘基都具有同樣的結構。
此外提供了一種具有通過糖基連接基團與之共價結合的水溶性聚合物部分群體的肽綴合物。在一個優選的方案中，該水溶性聚合物部分群體的基本上每個成員都經由糖基連接基團與肽的胺基酸殘基連接，且每個具有糖基連接基團連接的胺基酸殘基都具有同樣的結構。
本發明此外提供了上述的綴合物的類似物，其中肽經由完整的糖基連接基團與治療性部分、診斷部分、靶向部分、毒素部分綴合。每一上述的部分可以是小分子、天然聚合物(例如多肽)或合成聚合物。
在一種示例性的具體實施方式
中，突變體人生長激素經由雙功能的連接子與運鐵蛋白連接，該連接子在每個PEG部分的端點包含完整的糖基連接基團(方案1)。例如，PEG連接子的一個端點用完整的唾液酸連接子功能化，該唾液酸連接子與運鐵蛋白連接，另一個端點用完整的GalNAc連接子功能化，該GalNAc連接子與突變體hGH連接。
本發明的綴合物可以包括單價或多價的完整糖基連接基團(例如觸角結構)。因此，本發明的綴合物包括兩種種類，其中選擇的部分經由單價糖基連接基團與肽連接。其中多於一個選擇的部分經由多價的連接基團與肽連接的綴合物也包括在本發明的範圍內。
在另一
具體實施例方式
中，本發明提供了由於作為綴合物組分的靶向試劑的存在而選擇性地定位在特定組織的綴合物。在一種示例性的具體實施方式
中，靶向試劑是一種蛋白。示例性的蛋白包括運鐵蛋白(大腦、血液庫)、HS-糖蛋白(骨、大腦、血液庫)、抗體(大腦、具有抗體特異的抗原的組織、血液庫)、凝血因子V-XII(損傷的組織、凝塊、癌、血液庫)、血清蛋白，例如α-酸糖蛋白、胎球蛋白、α-胎兒蛋白(大腦、血液庫)、β2-糖蛋白(肝臟、動脈粥樣硬化斑、大腦、血液庫)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO(免疫刺激、癌、血液庫、血紅細胞過度生成、神經保護)、白蛋白(半衰期增大)和脂蛋白E。
方法除上述討論到的綴合物外，本發明提供了製備這些及其他綴合物的方法。因此，另一方面，本發明提供了一種在選擇的部分和肽之間形成共價綴合物的方法。另外，本發明提供了將本發明的綴合物定向於機體的特定組織或區域的方法。而且，本發明提供了一種通過向有發病風險的個體或具有疾病的個體給與本發明的綴合物而預防、治療或改善疾病狀態的方法。
在示例性的具體實施方式
中，綴合物在水溶性聚合物、治療性部分、靶向部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的肽之間形成。聚合物、治療性部分或生物分子與肽經由插入中間並與肽和修飾基團(例如水溶性聚合物)共價結合的完整糖基連接基團結合。該方法包括使肽與含有修飾糖和糖基轉移酶的混合物接觸，所述糖基轉移酶的底物是所述修飾糖。反應在使修飾糖和肽之間足夠形成共價鍵的條件下進行。修飾糖的糖部分優選從核苷酸糖、活化糖、和既非核苷酸糖也非活化的糖中選擇。
受體肽(糖基化的或非糖基化的)一般從頭人工合成，或在原核細胞中重組表達(例如細菌細胞，如大腸桿菌)或在真核細胞如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細胞中表達。肽可以是全長蛋白或者片段。此外肽可以是野生型或者突變肽。在一種示例性的具體實施方式
中，肽包括向肽序列中加入一個或多個共有糖基化位點的突變。
本發明的方法也提供重組生產的不完全糖基化的肽的修飾。許多重組生產的糖蛋白是不完全糖基化的，暴露出可能具有不合需要的性質例如由RES識別的免疫原性的碳水化合物殘基。在本發明的方法中採用修飾糖，肽可以同時進一步糖基化和用例如水溶性聚合物、治療劑等等衍生化。修飾糖的糖部分可以是與充分糖基化的肽中的受體適當地綴合的殘基，或另一個具有合乎需要性質的糖部分。
用本發明的方法修飾的肽可以是合成或野生型肽，或可以是由本領域已知的方法如定點誘變生產的突變肽。肽的糖基化一般是N-連接或者O-連接的。一種示例性的N連接是修飾糖與天門冬醯胺殘基側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意胺基酸，是碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列任何一個的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指單糖(例如N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)與羥基胺基酸側鏈的羥基，優選絲氨酸或蘇氨酸連接，但也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
向肽或其它的結構添加糖基化位點是通過改變胺基酸序列使它含有一個或多個糖基化位點而便利地完成的。該添加也可以通過在肽序列內引入一個或多個(O-連接糖基化位點)具有OH基團的種類，優選絲氨酸或蘇氨酸殘基而完成。該添加可以通過突變或肽的全部化學合成而完成。肽胺基酸序列優選通過在DNA水平改變，特別通過在預選的編碼肽的DNA鹼基進行突變，使產生的密碼子翻譯成需要的胺基酸。DNA突變優選使用本領域已知的方法完成。
在一種示例性的具體實施方式
中，糖基化位點是通過重排多核苷酸而添加的。編碼候選肽的多核苷酸可以用DNA重排方法調整。DNA重排是一種循環的重組和突變方法，通過隨機片段化相關基因庫進行，然後通過聚合酶鏈反應樣的方法對片段進行重新裝配。例如參見，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；以及U.S.專利號5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
本發明此外提供了向肽添加(或除去)一個或多個選擇的糖基殘基的方式，其後向肽的至少一個選擇的糖基殘基綴合修飾糖。本具體實施方式
可應用於，例如肽上不存在糖基殘基或者不以要求的量存在時，需要向選擇的糖基殘基連接修飾糖的情況。因此，向肽結合修飾糖之前，通過酶促的或化學偶合向肽綴合選擇的糖基殘基。在另一個具體實施方式
中，在連接修飾糖之前通過從糖肽除去碳水化合物殘基而改變糖肽的糖基化模式。例如參見WO 98/31826。
添加或除去糖肽上存在的任何碳水化合物部分是用化學或酶學方法完成的。化學去糖基化優選通過將多肽變體暴露於化合物三氟甲磺酸或等價的化合物完成。這一處理導致除連接糖外(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)的大多數或全部糖裂解，而留下完整的肽。Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)以及Edge等，Anal.Biochem.118131(1981)描述了化學去糖基化。多肽變體上碳水化合物部分的酶催裂解可以通過利用各種各樣的內切-和外切-糖苷酶完成，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)所描述的。
糖基部分的化學添加通過任意公認的技術方法進行。糖部分的酶促添加優選使用此處闡明的方法的改進方法完成，用天然糖基單位取代用於本發明的修飾糖。添加糖部分的其它的方法在U.S.專利號5,876,980、6,030 815、5,728,554、和5,922,577中公開。
選擇的糖基殘基的示例性的連接點包括但不局限於(a)N-連接糖基化和O-連接糖基化的共有位點；(b)作為糖基轉移酶受體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬醯胺和組氨酸；(d)自由羧基；(e)自由硫氫基如半胱氨酸的硫氫基；(f)自由羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(g)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的那些殘基；或(h)穀氨醯胺的醯胺基。可用於本發明的示例性的方法在WO 87/05330，
公開日Sep.11，1987，以及Aplin和Wriston，CRCCRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中描述。
在一個
具體實施例方式
中，本發明提供了一種通過連接基團連接hGH和一個或多個肽的方法。連接基團是任意的可採用的結構，可以從直鏈和支鏈結構中選擇，優選每個與肽連接的連接子的末端包括修飾糖(即初期的完整糖基連接基團)。
在一種本發明的示例性的方法中，經由包括PEG連接子的連接子部分把二個肽連接起來。構造與上述的圖片表示的一般結構相符。如此處描述的本發明的構造包括二個完整的糖基連接基團(即s+t＝1)。重點放在包括二個糖基基團的PEG連接子上是為了清晰的目的，不應該解釋為限制本發明的具體實施方式
中採用的連接子臂的性質。
因此，用第一糖基單位在第一端點，用第二糖基單位在第二端點功能化PEG部分。第一和第二糖基單位優選是不同的轉移酶的底物，允許第一個和第二個肽分別與第一和第二糖基單位直角連接。在實踐中，(糖基)1-PEG-(糖基)2連接子與第一個肽和以第一糖基單位為底物的第一轉移酶接觸，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然後從反應混合物中選擇性地除去糖基轉移酶和/或未反應的肽。把第二個肽和以第二糖基單位為底物的第二轉移酶加入(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2。本領域技術人員將理解上述的方法也可適用於在多於二個肽之間形成綴合物，例如通過利用分支PEG、樹枝狀聚合物、聚(胺基酸)、多糖物質等等。
在一種示例性的具體實施方式
中，突變體人生長激素經由雙功能的連接子與運鐵蛋白連接，該連接子在每個PEG部分的末端包含完整的糖基連接基團(方案1)。由於綴合物更大的分子大小，hGH綴合物具有比單獨的hGH增加的體內半衰期。此外，hGH與運鐵蛋白的綴合使綴合物選擇性地以腦為靶標。例如，PEG連接子的一個末端用CMP唾液酸功能化，另一個末端用UDP GalNAc功能化。在GalNAc轉移酶存在的情況下，該連接子與hGH結合，導致連接子臂的GalNAc與hGH上的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基連接。
方案1
如上所述的工序可以進行任意多的循環數完成，且不局限於在二個肽之間用單個連接子形成綴合物。此外，本領域技術人員將理解用肽使PEG(或其它的)連接子末端的完整糖基連接基團功能化的反應可以在同-反應容器中同時發生，或它們可以以逐步方式進行。當反應是以逐步方式進行時，在每個步驟生產的綴合物可選地從一個或多個反應組分(例如酶、肽)中純化。
另一示例性的具體實施方式
在方案2中闡述，方案2顯示一種製備將選擇的蛋白例如人生長激素靶向骨以及增加選擇的蛋白的循環半衰期的方法。
方案2 其中G是在活化糖部分(例如糖核苷酸)上的糖基殘基，其在綴合物中轉變成完整糖基連接子。當s大於0時，L是如GalNAc、或GalNAc-Gal的糖基連接基團。
利用PEG(或其它的連接子)的反應性衍生物向連接子添加一個或多個肽部分在本發明的範圍內。本發明不限於反應性PEG類似物的性質，許多聚乙二醇的活化衍生物都可以在商業上和在文獻中獲得。選擇和必要時人工合成一種合適的活化PEG衍生物以製備用於本發明的底物完全在技術人員的能力範圍內。參見，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，tresylate(Nilsson等，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基琥珀醯衍生的活性酯(Buckmann等，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，PlenumPress，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，咪唑基甲酸(Beauchamp等，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等，Blood，711641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等，Bioconjugate Chem.，4.314-318(1993))，異氰酸(Byun等，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和環氧化物(U.S.Pat.No.4,806,595，授予Noishiki等，(1989)。其它的連接基團包括氨基基團和活化PEG之間的尿烷連接，參見Veronese，等，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985).
在另一個示例性的具體實施方式
中，本發明提供了一種延長選擇的肽的血循環半衰期的方法，實質上使肽靶向血液庫，通過將足夠大小的合成或天然聚合物(例如白蛋白)與肽連接以延遲蛋白通過腎小球的濾過作用，參見方案3。本發明的這個具體實施方式
在方案3中說明，其中hGH與白蛋白經由PEG連接子利用化學和酶促修飾的組合進行連接。
方案3 因此如方案3所示，用反應性的PEG衍生物例如X-PEG-(CMP-唾液酸)改變白蛋白的殘基(例如胺基酸側鏈)，其中X是一種活化基團(例如活化酯、異硫氰酸酯等等)。把PEG衍生物和hGH組合併與以CMP-唾液酸為底物的轉移酶接觸。在另外一個說明性的具體實施方式
中，賴氨酸的ε-胺與PEG連接子的N-羥基琥珀醯亞胺酯反應，以形成白蛋白綴合物。連接子的CMP-唾液酸與hGH上的合適的殘基例如Gal或GalNAc酶促連接，從而形成綴合物。技術人員將理解上述的方法不局限於闡述的反應物，而且該方法可以形成包括多於二個蛋白部分的綴合物，例如通過利用具有多於二個末端的分支的連接子。
修飾糖修飾的糖基供體種類(「修飾糖」)優選從修飾的糖核苷酸、活化的修飾糖和既非核苷酸也非活化的單糖類的修飾糖中選擇。可以使用本發明的方法向肽加入任意要求的碳水化合物結構。通常，該結構是單糖，但本發明不局限於利用修飾的單糖；也可採用寡糖和多糖。
修飾基團與糖部分通過酶促方式、化學方法或其組合連接，從而生產修飾糖。該糖在供修飾部分連接的任意位點取代，然而仍然允許糖作為用於連接修飾糖和肽的酶的底物發揮作用。在一個優選的方案中，當糖是唾液酸時，用修飾基團在pyruvyl側鏈位點9或在唾液酸中通常乙醯化的胺部分的位點5上取代唾液酸。
在某些本發明的具體實施方式
中，使用修飾的糖核苷酸向肽添加修飾糖。用於本發明的示例性的修飾型糖核苷酸包括核苷酸單、雙或三磷酸或其類似物。在一個優選的方案中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更加優選，修飾的糖核苷酸選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸、或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙醯胺衍生物也可用於本發明的方法中。
本發明也提供了使用修飾糖合成修飾的肽的方法，例如修飾的半乳糖、巖藻糖、GalNAc、和唾液酸。當採用修飾的唾液酸時，唾基轉移酶或轉唾液酸酶(僅用於α2，3-連接的唾液酸)可用於這些方法。
在其它的具體實施方式
中，修飾糖是一種活化的糖。用於本發明的活化的修飾糖一般是糖苷，已經人工改變為含有活化的離去基團。此處採用的術語「活化的離去基團」指在酶調節的親核取代反應中容易被置換的部分。本領域已知許多活化的糖。例如參見Vocadlo等，In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY，Vol.2，Ernst等Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，Germany，2000；Kodama等，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed，等，J.Biol.Chem.27437717(1999))。
活化基團(離去基團)的實例包括氟代、氯代、溴基、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯(triflate ester)等等。優選的用於本發明的活化的離去基團是那些空間結構上對糖苷向受體酶促轉移沒有顯著阻礙的活化離去基團。因此，活化糖苷衍生物的優選方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，而更優選糖基氟化物。在糖基氟化物中，最優選α-半乳糖氟化物、α-甘露糖氟化物、α-葡糖基氟化物、α-巖藻糖基氟化物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸氟化物、α-N-乙醯基葡糖胺氟化物、α-N-乙醯基半乳糖胺氟化物、β-半乳糖氟化物、β-甘露糖氟化物、β-葡糖基氟化物、β-巖藻糖基氟化物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸氟化物、β-N-乙醯基葡糖胺氟化物和β-N-乙醯基半乳糖胺氟化物。
作為示例，糖基氟化物可以通過首先使糖乙醯化然後用HF/吡啶處理而從自由糖製備得到。這產生了熱力學上最穩定的保護的(乙醯化的)糖基氟化物端基異構體(即α-糖基氟化物)。如果需要較不穩定的端基異構體(即β-糖基氟化物)，可以通過用HBr/HOAc或用HCI改變過乙醯化的糖產生異頭溴化物或氯化物而製備該端基異構體。這個中間物與如氟化銀的氟化物鹽類反應產生糖基氟化物。乙醯化的糖基氟化物可以通過與甲醇中溫和的(催化的)鹼(例如NaOMe/MeOH)反應而去保護。另外市場上可買到許多糖基氟化物。
其它的活化的糖基衍生物可以使用本領域技術人員已知的慣用方法製備，例如，糖基甲磺酸酯可以通過用甲磺醯氯處理充分地苄化的半縮醛形式的糖，然後催化氫化除去苯甲基而製備。
在另一個示例性的具體實施方式
中，修飾糖是一種具有觸角結構的寡糖。在一個優選的方案中，一個或多個觸角的末端帶有修飾部分。當多於一個修飾部分與具有觸角結構的寡糖連接時，寡糖可用於「擴增」修飾部分；每個與肽連接的寡糖單位將多個拷貝的修飾基團與肽連接。上述的圖中闡述的本發明的典型螯合物的一般結構包括源於利用觸角結構製備本發明的綴合物的多價種類。本領域已知許多有觸角的糖結構，本方法可以沒有限制地用它們實施。
示例性的修飾基團在下文論述。可以按照它們給予多肽一個或多個合乎需要的性質的能力而選擇修飾基團，示例性的性質包括但不局限於增強的藥物動力學、提高的藥效學、改善的生物分布、提供多價種類、改善水溶性、提高或減少親脂性以及組織靶向。
水溶性聚合物通過用極性分子如含有胺、酯、羥基以及多羥基的分子結合選擇的肽而提高肽的親水性。代表性的實例包括但不局限於聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、以及聚醚，例如聚(乙二醇)、m-聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、m-聚(丙二醇)及其它O-烷基聚(亞烷基二醇)部分。優選的水溶性聚合物基本不發螢光，或發射小量的螢光，而不適於用作分析中的螢光標記。而且，通常優選採用不是天然存在的糖的聚合物。一種這種優選的例外情況是利用由另一個實體(例如，聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、生物分子、治療性部分、診斷部分等等)共價附著的天然存在的糖。在另一個示例性的具體實施方式
中，治療性糖部分與連接子臂連接，隨後經由本發明的方法將糖-連接子臂盒與肽連接。
水溶性聚合物和糖的活化方法和化學作用以及把糖和聚合物與不同的種類連接的方法在文獻中描述。通常採用的活化聚合物的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、二環氧化物(biepoxides)、表氯醇、二乙烯碸、碳二亞胺、磺醯滷化物、三氯三嗪等活化官能團(參見，R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALS ANDAPPLICATIONS，MarcelDekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITYLIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium SeriesVol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)許多水溶性聚合物是本領域技術人員已知的並可用於本發明的實踐中。術語水溶性聚合物包括如糖(例如葡聚糖、直鏈澱粉、透明質酸、聚(唾液酸)、乙醯肝素、肝素等等)；聚(胺基酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)、聚(醚)、例如聚(乙二醇)；肽、蛋白等等的種類。本發明可以用任意的水溶性聚合物實踐，唯一的限制是聚合物必須包括其餘的綴合物可以連接的點。
活化聚合物的方法還可以在WO 94/17039、U.S.專利號5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、U.S.專利號5,219,564、U.S.專利號5,122,614、WO 90/13540、U.S.專利號5,281,698以及WO 93/15189中找到，以及活化的聚合物和肽之間的結合，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(U.S.專利號4,412,989)、核糖核酸酶以及超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
優選的水溶性聚合物是那些聚合物樣品中大部分的聚合物分子具有大約相同的分子量的聚合物；這樣的聚合物稱為「單分散」。本發明通過聚(乙二醇)或單甲氧聚(乙二醇)(m-PEG)綴合物進一步進行說明。可以獲得一些PEG功能化和綴合的綜述和專題論文。例如參見，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 13530-65(1987)；Wong等，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；以及Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)。
可用於形成本發明的綴合物的聚(乙二醇)是線性的或分枝的。
例如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG的水溶性聚合物也可以提高治療性糖肽的體內半衰期或曲線下面積(AUC)，例如，蛋白的PEG(PEG化)或m-PEG(m-PEG化)化學修飾可以提高它們的分子大小和減少它們的表面可接近性和功能基團的可接近性，這都取決於與蛋白連接的PEG的大小。這導致了提高的血漿半衰期或AUC以及蛋白水解穩定性，並導致免疫原性和肝臟攝取的降低(Chaffee等，J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等，Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29113-127(1980))。已經報導白介素-2的PEG化提高了它的體內抗腫瘤潛能(Katre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))以及來源於單克隆抗體A7的F(ab』)2的PEG化提高了它的腫瘤定位(Kitamura等，Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))，因此，在另一優選實施方式中，用水溶性聚合物通過本發明的方法衍生的肽的體內半衰期相對於未衍生的肽的體內半衰期或AUC有所提高。
肽的體內半衰期或AUC的提高最好表示為這一量的增加的百分比範圍。增加的百分比的下限為大約40％、大約60％、大約80％、大約100％、大約150％或大約200％，範圍的上限為大約60％、大約80％、大約100％、大約150％或高於大約250％。
任何分子量的PEG部分，例如5kD、10kD、20kD和30kD，均可用於本發明的方法。
生物分子在另一優選實施方式中，修飾糖具有生物分子。在進一步的優選實施方式中，該生物分子是功能蛋白、酶、抗原、抗體、肽、核酸(即單核苷酸或核苷、寡核苷酸、多聚核苷酸和單鏈或多鏈核酸)、凝集素、受體或其組合。
優選的生物分子基本上是不發螢光的，或發射很少的螢光而不適於用作分析中的螢光標記。而且通常優選採用非糖的生物分子，這種優選的例外是採用通過與另一實體(例如PEG、生物分子、治療性部分、診斷部分等)共價連接而修飾的天然存在的糖。在一個示例性實施方式中，作為生物分子的糖部分與連接子臂連接，隨後糖-連接子臂盒與肽經由本發明的方法連接。
可用於本發明的實踐的生物分子可以來自任意來源。生物分子可以從天然來源中分離或可以通過合成方法產生，肽可以是天然肽或突變肽。突變可以用化學誘變作用、定點誘變或其它的本領域技術人員已知的誘導突變方式實現。用於本發明的實踐的肽包括例如酶、抗原、抗體和受體。抗體可以是多克隆或單克隆的；完整的或者片段。肽可選地是定向進化程序的產物。
天然存在的和合成的肽和核酸均可用於本發明；這些分子可以通過任意可利用的活性基團與糖殘基組分或交聯劑連接。例如，肽可以通過反應性的胺、羧基、巰基、或羥基連接。活性基團可以位於肽末端或在肽鏈內的位點。核酸可以通過鹼基(例如環外胺(exocyclicamine))上的活性基團或糖部分上的可利用的羥基(例如3′-或5′-羥基)連接。肽和核酸鏈可以進一步在一個或多個位點衍生，使合適的活性基團連接在鏈上。參見Chrisey等，Nucleic Acids Res.243031-3039(1996)。
在進一步的優選方案中，選擇生物分子使通過本發明的方法修飾的肽指向特定組織，從而相對於輸送給該組織的未衍生化肽的數量提高肽向組織中的輸送。在另一優選的方案中，衍生化肽在選定時間內被輸送給特定組織的數量由於衍生化至少提高大約20％、更加優選至少大約40％，更加優選至少大約100％。目前，靶向應用的優選的生物分子包括抗體、激素和細胞表面受體的配基。
在此外的示例性的具體實施方式
中，提供了具有生物素的綴合物。因此，通過連接帶有一個或多個修飾基團的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素部分精心製成選擇性地生物素化的肽。
治療性部分在另一個優選的方案中，修飾糖包括治療性部分。本領域技術人員將理解在治療性部分和生物分子的種類之間有重疊；許多生物分子具有治療性質或潛能。
治療性部分可以是已經接受的臨床使用的試劑，或者它們可以是試驗性使用的藥物，或正在研究其活性或作用機理的藥物。治療性部分在給定的疾病狀態中可以具有驗證的作用，或者在給定的疾病狀態中可以僅僅推測顯示出需要的作用。在一個優選的方案中，治療性部分是化合物，正在篩選它們的與選定的組織的相互作用的能力。在本發明的實踐中應用的治療性部分包括來自大量具有多種藥理學活性的藥物種類的藥物。優選的治療性部分基本上是不發螢光的，或發射小量的螢光而不適於用作分析中的螢光標記。而且，通常優選採用不是糖的治療性部分。一種這種優選的例外情況是利用通過與另一個實體，例如PEG、生物分子、治療性部分、診斷部分等等共價連接而修飾的糖。在另一個示例性的具體實施方式
中，治療性糖部分與連接子臂連接，隨後糖-連接子臂盒與肽經由本發明的方法連接。
把治療性和診斷試劑與各種其它的種類連接的方法為本領域技術人員眾所周知，例如參見，Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；及Dunn等，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在一個示例性的具體實施方式
中，治療性部分與修飾糖經由在選定狀態下裂解的鍵連接。示例性的條件包括但不局限於選擇的pH(例如胃、小腸內、細胞內囊泡)、活化酶的存在(例如酯酶、還原酶、氧化酶)、光、熱等等。本領域已知許多可裂解的基團，例如參見，Jung等，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等，J.Biol.Chem.，26514518-14525(1990)；Zarling等，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)，Park等，J.Biol.Chem.，261205-210(1986)；Browning等，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。
可利用的治療性部分的種類包括例如非甾族的抗炎藥物(NSAIDS)。NSAIDS可以從例如下列的種類中選擇(例如丙酸衍生物、乙酸衍生物、芬那酸(fenamic acid)衍生物、聯苯羧酸衍生物和oxicam)；包括氫化可的松等等的甾族抗炎藥物；抗組胺藥物(例如氯芬胺、曲普利啶)；止咳藥(例如右美沙芬、可待因、咳美芬和噴託維林)；止癢藥物(例如甲地嗪和阿利馬嗪)；抗副交感神經生理作用的藥物(例如東莨菪鹼、阿託品、後馬託品、左旋多巴)；止吐藥和止噁心藥(例如賽克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；減食慾藥(苄非他明、芬特明、對氯苯丁胺、苯氟拉明)；中樞興奮藥(例如安非他明、脫氧麻黃鹼、右苯丙胺和哌甲酯)；抗心律失常藥(例如普萘洛爾、普魯卡因胺、丙吡胺、奎尼丁、恩卡尼)；β-腎上腺素能阻斷劑(例如美託洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾、拉貝洛爾和噻嗎洛爾)；抗心衰藥物(例如米力農、氨力農和多巴酚丁胺)；抗高血壓藥(例如依那普利、可樂定、肼屈嗪、米諾地爾、胍那決爾、胍乙啶)；利尿藥(例如阿米洛利和氫氯噻嗪)；血管擴張劑(例如地爾硫、胺碘酮、異克舒令、布酚寧、妥拉唑林和維拉帕米)；血管收縮劑(例如二氫麥角胺、麥角胺和美西麥角)；抗潰瘍藥物(例如雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉劑(例如利多卡因、布比卡因、氯普魯卡因、地布卡因)；抗抑鬱藥物(例如丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、nortryptiline)；安定藥和鎮靜劑(例如氯氮、貝那替秦、苯喹胺、氯西泮、羥嗪、洛沙平和丙嗪)；抗精神病藥(例如氯普噻噸、氟奮乃靜、氟哌啶醇、嗎茚酮、硫利達嗪和三氟拉嗪)；抗微生物藥(抗細菌、抗真菌、抗原生動物和抗病毒藥物)。
優選的併入本組合物的抗微生物藥包括，例如β-內醯胺藥物、喹諾酮藥物、環丙沙星、諾氟沙星、四環素、紅黴素、阿米卡星、三氯生、多丙環素、捲曲黴素、氯己定、金黴素、土黴素、克林黴素、乙胺丁醇、己脒定異硫代硫酸、甲硝唑、噴他脒、慶大黴素、卡那黴素、lineomycin、美他環素、烏洛託品、二甲胺四環素、新黴素、奈替米星、巴龍黴素、鏈黴素、妥布黴素、咪康唑和金剛烷胺的藥學上可接受的鹽。
其它可用於本發明的實踐中的藥物部分包括抗腫瘤藥(例如抗雄激素(例如亮丙立德或者氟他胺)、殺細胞劑(例如14-羥基柔紅黴素、多柔比星、泰素、環磷醯胺、白消安、順鉑、β-2-幹擾素)抗雌激素(例如他莫昔芬)、抗代謝物(例如氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巰嘌呤、硫鳥嘌呤)。也包括在這些類別內的是診斷和治療的基於放射性同位素的試劑，以及綴合的毒素，例如蓖麻毒蛋白、格爾德黴素、mytansin、CC-1065、duocarmycins、Chlicheamycin和其相關結構以及類似物。
治療性部分還可以是激素(例如甲羥基孕酮、雌二醇、亮丙立德、甲地孕酮、奧曲肽或生長抑素)；肌肉鬆弛藥(例如桂美君、環苯扎林、黃酮哌酯、奧芬那君、罌粟鹼、美貝維林、異達維林、利託君、地芬諾酯、丹曲林以及阿珠莫林)；解痙藥；骨-活化的藥物(例如二磷酸鹽和膦醯基烷基次膦酸藥物複方)；內分泌調節藥物(例如避孕藥(例如炔諾醇、炔雌醇、炔諾酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羥孕酮)、糖尿病調節劑(例如格列本脲或氯磺丙脲)、合成代謝藥，例如睪內脂或司坦唑醇、雄激素(例如甲睪酮、睪酮或氟甲睪酮)、抗利尿劑(例如去氨加壓素)以及降鈣素。
本發明中也可採用雌激素(例如己烯雌酚)、糖皮質類固醇(例如曲安西龍、倍他米松等等)以及孕激素類，如炔諾酮、炔諾醇、炔諾酮、左炔諾孕酮；甲狀腺劑(例如碘塞羅寧或左甲狀腺素)或抗甲狀腺劑(例如甲硫咪唑)；抗高泌乳素釋放素藥物(例如卡麥角林)；激素抑制劑(例如達那唑或戈舍瑞林)、催產劑(例如甲麥角新鹼或縮宮素)以及前列腺素、例如mioprostol、前列地爾或地諾前列酮，也可以採用。
其它可採用的修飾基團包括免疫調節藥(例如抗組胺劑、肥大細胞穩定劑、如洛度沙胺和/或cromolyn、類固醇(例如曲安西龍、丙酸倍氯米松、可的松、地塞米松、潑尼松龍、甲潑尼龍、倍氯米松，或氯倍他索)、組胺h2拮抗劑(例如法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)、免疫抑制劑(例如硫唑嘌呤、環孢菌素)等等。也可以採用具有抗炎活性的基團如舒林酸、依託度酸、酮洛芬和酮洛酸。其它與本發明一同使用的藥物對本領域技術人員是顯而易見的。
修飾糖的製備通常，糖部分和修飾基團通過使用活性基團連接在一起，該活性基團一般通過連接方法轉化成在生理相應的條件下不反應的新的有機功能基團或種類。糖反應功能基團位於糖部分的任意位點上。用於本發明的實踐中的活性基團和反應類別通常在生物綴合化學領域是眾所周知的。目前可利用的優選的反應性糖部分的反應類別是在相對溫和的條件下進行的。這些包括但不局限於親核取代(例如胺和醇與醯基滷、活化酯反應)、親電子取代作用(例如烯胺反應)和添加碳-碳和碳-雜原子多重鍵(例如麥可加成反應、狄爾斯-阿耳德反應)。這些及其他可利用的方應在下列文獻中討論，例如，March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances inChemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
從糖核或修飾基團向外延伸的有效的反應性功能基團包括但不限於(a)羧基和其不同的衍生物，包括但不限於，N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基苯並三唑酯、滷化醯基、醯基咪唑、硫酯、對硝基苯酯、烷基、鏈烯基、炔基和芳香族酯；(b)羥基，其可以變為，例如酯、醚、醛等等。
(c)滷代烷基基團，其中滷化物可以後來用親核基團如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、碳負離子或醇鹽離子代替，從而導致新的基團在滷素原子的功能基團上共價連接；(d)親二烯體基團，能夠參與狄爾斯-阿爾德反應，例如，馬來醯亞胺基基團；(e)醛或酮基，因此隨後的衍生可能經由羰基衍生物的形成而實現，例如，亞胺、腙、縮氨基脲或肟，或經由如格利亞加成或烷基鋰加成的機制；(f)磺醯滷化物基團，進行隨後與胺的反應，例如，形成氨磺醯；(g)硫醇基，可以例如變為二硫化物或與醯基滷反應；(h)胺或硫氫基，例如可以是醯化、烷基化或氧化的；
(i)鏈烯，例如可以進行環加成作用、醯化作用、麥可加成等等；以及(J)環氧化物，可以與例如胺以及羥基化合物反應。
可以選擇反應性功能基團使它們不參與或不幹涉組裝反應性糖核或修飾基團所必需的反應。另外，可以通過保護基的存在使反應性的功能基團被保護而不參與反應。本領域技術人員了解怎樣保護特定的功能基團，使它不與選擇的反應條件牴觸。有效的保護基的實例，例如參見Greene等，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，JohnWiley Sons，New York，1991。
在隨後的討論中，將闡述一些用於本發明的實踐中的特定的修飾糖的實例。在示例性的具體實施方式
中，使用唾液酸衍生物作為糖核，修飾基團與之連接。專注於對唾液酸衍生物進行討論僅是為了說明的清晰，而不應解釋為對本發明範圍的限制。本領域技術人員將理解多種其它糖部分也可以使用唾液酸舉例闡述的類似的方式進行活化和衍生。例如，可以獲得許多修飾半乳糖、葡萄糖、N-乙醯半乳糖胺和巖藻糖的方法，僅舉幾個糖底物的例子，可以容易地由現有技術公認的方法修飾。例如參見，Elhalabi等Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等，J.Org.Chem.6524(2000))。
在一種示例性的具體實施方式
中，由本發明的方法修飾的肽是在原核細胞(例如大腸桿菌)、真核細胞，包括酵母和哺乳動物細胞(例如CHO細胞)或在轉基因的動物中產生的糖肽，因此含有不完全地唾液酸化的N-和/或O-連接寡糖鏈。缺乏唾液酸並含有末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈，可以被PEG化、PPG化或用修飾的唾液酸改變。
示例性的PEG-唾液酸包括 其中L是一個取代的或未被取代的烷基或取代的或未被取代的雜烷基連接子部分，其把唾液酸部分和PEG部分連接起來，「n」是1或更大的數字；以及 其中標誌「s」代表從0到20的整數，「n」是1或更大的數字。
在方案4中，用保護的胺基酸(例如甘氨酸)衍生物的活化酯處理氨基糖苷1，把糖胺殘基轉變為相應的保護的胺基酸醯胺加合物。用醛縮酶處理加合物形成α-羥基羧酸2，在CMP-SA合成酶的作用下，化合物2變為相應的CMP衍生物，然後通過催化氫化CMP衍生物產生化合物3。採用經由甘氨酸加合物的形成引入的胺作為用活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝苯基)與化合物3反應進行PEG連接的位點，分別產生如4或5的種類。
方案4 表1列出了用PEG或PPG部分衍生的糖單磷酸的典型實例。人生長激素突變體可以通過方案1的方法修飾，其它的衍生物通過現有技術公認的方法製備。例如參見，Keppler等，Glycobiology 1111R(2001)；以及Charter等，Glycobiology 101049(2000)。其它的胺反應性PEG和PPG類似物可以從市場上購買得到，或可以通過本領域技術人員易得的方法製備。

用於本發明的實踐的修飾的糖磷酸可以在其它的位點以及上述的位點被取代。目前優選的唾液酸的取代在式I中闡明 其中X是一個連接基團，優選選自-O-、-N(H)-、-S、CH2-、和-N(R)2，其中每個R是獨立地選自R1-R5的成員，符號Y、Z、A和B各代表選自上述的與X相同的基團。各自獨立地挑選X、Y、Z、A和B，因此它們可以是相同的或不同的。符號R1、R2、R3、R4和R5代表H、水溶性聚合物、治療性部分、生物分子或其它部分。另外，這些符號代表與水溶性聚合物、治療性部分、生物分子或其它部分結合的連接子。
此處公開的示例性的與綴合物連接的部分包括但不限於PEG衍生物(例如烷基-PEG、醯基-PEG、醯基-烷基-PEG、烷基-醯基-PEG、氨甲醯基-PEG、芳香基-PEG)、PPG衍生物(例如烷基-PPG、醯基-PPG、醯基-烷基-PPG、烷基-醯基-PPG氨甲醯基-PPG、芳基-PPG)、治療性部分、診斷部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙醯肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基Lewis X、FGF、VFGF、蛋白、軟骨素、角質素、皮膚素、白蛋白、整合素、有觸角的寡糖、肽等等。各種修飾基團與糖部分的連接方法對本領域技術人員是易得的(POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICALAPPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，AmericanChemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Dunn等，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
交聯基團用於本發明的方法的修飾糖的製備包括把修飾基團與糖殘基連接以及形成穩定的加合物，該加合物是糖基轉移酶的底物。糖和修飾基團可以通過零級或高級交聯劑連接。示例性的能被用於連接修飾基團和碳水化合物部分的雙功能的化合物包括但不限於雙功能的聚(乙二醇)、聚醯胺、聚醚、聚酯等等。連接碳水化合物和其它分子的通用的方法在文獻中是已知的。例如參見，Lee等，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)以及Bednarski等，WO92/18135。在隨後的討論中，活性基團在初期的修飾糖的糖部分上進行溫和處理。本討論的焦點是為了說明的清晰，本領域技術人員將理解該討論也與修飾基團上的活性基團有關。
一種示例性的策略涉及使用異雙功能交聯劑SPDP(n-琥珀醯亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)把保護的巰基加入糖上，然後使巰基去保護以與修飾基團上的另一個巰基形成二硫鍵。
如果SPDP不利地影響修飾糖作為糖基轉移酶底物的能力，也可用其它的一系列交聯劑中的一個，如2-iminothiolane或N-琥珀醯亞胺S-乙醯硫代乙酸(SATA)形成二硫鍵。2-iminothiolane與伯胺反應，立即在含有胺的分子上整合不受保護的巰基。SATA也與伯胺反應，但整合保護的巰基，以後使用羥胺去乙醯化，產生自由巰基。在所有情況下，整合的巰基自由地與其它巰基或保護的巰基反應，如SPDP，形成需要的二硫鍵。
上述的策略是示例性的，但並不限於本發明中採用的連接子。還可獲得可被用於使修飾基團與肽交聯的不同的策略的其它交聯劑。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶)-L-半胱氨酸醯肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶)巰基-丙醯基醯肼)與預先由溫和的高碘酸處理氧化的碳水化合物部分反應，因此在交聯劑的醯肼部分和高碘酸產生的乙醛之間形成腙鍵。TPCH和TPMPH向糖上引入2-吡啶基硫酮保護的硫氫基，其可以用DTT去保護，隨後用來綴合，如在組分之間形成二硫鍵。
如果發現二硫鍵不適於生產穩定的修飾糖，可以採用其它的交聯劑在組分之間組成更加穩定的鍵。異雙功能交聯劑GMBS(N-γ-馬來醯亞氨丁醯氧基)琥珀醯亞胺)和SMCC(琥珀醯亞氨基4-(N-馬來醯亞氨-甲基)環己烷)與伯胺反應，因而向組分上引入馬來醯亞胺基團。馬來醯亞胺基團可以隨後與另一組分上的巰基反應，所述巰基可以通過先前提到的交聯劑導入，由此在組分之間形成穩定的硫醚鍵。如果組分之間的位阻影響了組分的活性或者修飾糖作為糖基轉移酶底物的能力，可以使用在組分之間引入長間隔臂的交聯劑，包括一些前面提到的交聯劑的衍生物(即SPDP)。因此有足夠的合適的可利用的交聯劑，其中每個的選擇都取決於它對最優的肽綴合物和修飾糖生產的效果而選擇。
許多試劑可用於修飾具有分子內部的化學交聯的修飾糖組分(交聯試劑和交聯過程的綜述參見Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.，以及Cooney，D.A.，InENZYMESAS DRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，NewYork，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，所有文獻都在此處作為參考引入)。優選的交聯劑源自於各種零-長度、同雙功能的和異雙功能的交聯劑。零-長度交聯劑包括二個內在的化學基團直接結合，而不導入外來的材料。催化二硫鍵形成的試劑屬於這一種類。另一個實例是誘導羧基和伯氨基形成醯胺鍵的試劑，如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s試劑K(2-乙基-5-苯基異唑-3′-磺酸)以及羰二咪唑。除這些化學試劑外，轉穀氨醯胺酶(穀氨醯基-肽-γ-穀氨醯轉移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度交聯劑。這些酶在蛋白結合穀氨醯胺殘基的醯氨基團上催化醯基轉移反應，通常用伯氨基作為底物。優選的同型和異型雙功能的試劑分別含有二個相同或二個不同的位點，其可以與氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性的基團反應。
氨基反應性基團在一個優選的方案中，交聯劑上的位點是氨基反應性基團。可利用的氨基反應性基團的非限制性的實例包括碳酸鹽酯、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯、亞氨酸酯、異氰酸酯、醯基滷化物、芳香基疊氮化物、對硝基苯基酯、醛、和磺醯氯。
NHS酯與修飾糖組分的伯(包括芳香族)氨基優先反應。組氨酸的咪唑基已知與伯胺競爭反應，但反應產物不穩定，容易發生水解。該反應涉及胺對NHS酯的酸性羧基的親核攻擊，形成醯胺，釋放N-羥基琥珀醯亞胺。因而，丟失了原始氨基的正電荷。
亞氨酸酯是與修飾糖組分的胺基反應的最特異性的醯化試劑。在pH7和10之間，亞氨酸酯僅與伯胺反應。伯胺親核性地攻擊亞氨酸，產生在高pH分解為脒的中間物或在低pH下新的亞氨酸，新亞氨酸可以與另一個伯胺反應，因而交聯二個氨基團，一種推定的具有雙功能反應性的單功能亞氨酸。與伯胺反應的主要產物是比起始的胺鹼性更強的脒，因而保持了起始氨基的正電荷。
異氰酸酯(和異硫氰酸酯)與修飾糖組分的伯胺反應，形成穩定的鍵。它們與巰基、咪唑和酪氨醯基團的反應產生相對不穩定的產物。
醯基疊氮化物也用作氨基特異性試劑，其中親合組分的親核胺在弱鹼性情況下攻擊酸性羧基，例如在pH8.5。
例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的芳香基滷化物優先與修飾糖組分的氨基團和酪氨酸苯酚基反應，也與巰基和咪唑基反應。
單和二羧酸的對硝基苯酯也是有效的氨基反應性基團。儘管試劑特異性不很高，α-和ε-氨基團看起來反應最迅速。
如戊二醛的醛與修飾糖的伯胺反應。儘管氨基團與醛的醛基反應形成不穩定的席夫鹼，戊二醛能夠用穩定的交聯來改變修飾糖。在pH6-8，即典型的交聯pH條件下，環狀聚合物經歷脫水而形成α-β非飽和的醛聚合物。然而當與另一個雙鍵連接時，席夫鹼是穩定的。兩個雙鍵的共振相互作用防止了Schiff鍵的水解，而且，高局部濃度的胺可以攻擊烯雙鍵形成穩定的Michael加成產物。
芳香族磺醯氯與修飾糖組分的許多位點反應，但與氨基團的反應是最重要的，結果形成穩定的氨磺醯鍵。
巰基反應性基團在另一個優選的方案中，位點是巰基反應性基團。有效的、非限制性的巰基反應性基團的實例包括馬來醯亞胺、烷基滷化物、吡啶基二硫化物和硫代鄰苯二甲醯亞胺。
馬來醯亞胺與修飾糖組分的硫氫基優先反應，形成穩定的硫醚鍵。它們也以大大變慢的速度與伯氨基團和組氨酸的咪唑基反應。然而，在pH7，馬來醯亞胺基團可以認為是硫氫特異性基團，因為在該pH下，單純的硫醇的反應速率比相應的胺的反應速率大1000倍。
烷基滷化物與硫氫基、硫化物、咪唑和氨基團反應。然而，在中性到弱鹼性pH下，烷基滷化物主要與硫氫基反應形成穩定的硫醚鍵。在較高的pH，傾向於與氨基團的反應。
吡啶基二硫化物經由二硫化物交換與自由巰基反應，產生混合的二硫化物。結果，吡啶基二硫化物是最特異性的巰基反應性基團。
硫代鄰苯二甲醯亞胺與自由硫氫基反應形成二硫化物。
羧基反應性殘基在另一個具體實施方式
中，溶於水和有機溶劑的碳二亞胺被用作羧基反應性試劑。這些化合物與自由羧基反應形成假尿素，假尿素可以與可利用的胺偶聯，產生醯胺鍵，教導如何用碳二亞胺修飾羧基(Yamada等，Biochemistry 204836-4842，1981)。
除利用位點特異性的反應部分外，本發明設計通過利用非特異性活性基團把糖與修飾基團連接起來。示例性的非特異性交聯劑包括光活化基團，其在黑暗中完全沒有活性，在吸收合適能量的光子後變為活性反應組分。在一個優選的方案中，光活化基團選自在加熱或光解疊氮化物後產生的nitrene的前體。無電子nitrene非常活潑，可以與許多化學鍵包括N-H、O-H、C-H、和C＝C反應。儘管可以採用三個類型的疊氮化物(芳基的、烷基和醯基衍生物)，目前最優選芳香基疊氮化物。在光解作用下的芳香基疊氮化物的反應性對N-H和O-H比對C-H鍵更強。無電子的arylnitrenes迅速地環擴大形成脫氫氮雜，趨向與親核試劑反應，而不是形成C-H插入產物。芳香基疊氮化物的反應性可以由吸電子取代基如環中的硝基或羥基的存在而提高，這樣的取代基推動芳香基疊氮化物的最大吸收偏向更長的波長。未被取代的芳香基疊氮化物具有在260-280nm範圍內的最大吸收，而羥基和硝基芳香基疊氮化物顯著吸收超過305nm的光。因此，最優選羥基和硝基芳香基疊氮化物，因為它們對親合組分採用比未被取代的芳香基疊氮化物較少傷害的光解作用的條件。
在另一個優選的方案中，光活化基團選自氟化的芳香基疊氮化物。氟化芳香基疊氮化物的光解作用產物是芳香性胺亞遊基(nitrene)，所有的這些芳香性胺亞遊基都經歷這些基團高效率的特徵性反應，包括C-H鍵插入(Keana等，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一個具體實施方式
中，光活化基團選自二苯甲酮殘基。二苯甲酮試劑通常比芳香基疊氮化物試劑產生較高的交聯產量。
在另一個具體實施方式
中，光活化基團選自重氮化合物，其在光解作用下形成無電子卡賓。這些卡賓進行許多反應，包括插入C-H鍵、添加至雙鍵(包括芳香族系統)、吸引氫和與親核中心配位產生碳離子。
在另一個具體實施方式
中，光活化基團選自重氮丙酮酸，例如，對硝基苯重氮丙酮酸的對硝基苯酯與脂肪胺反應，產生重氮丙酮酸醯胺，經紫外線光解作用後形成醛。光分解的重氮丙酮酸修飾的親合組分將如同甲醛或戊二醛一樣反應形成交聯。
與伯胺反應的同型雙功能交聯劑胺-反應性交聯劑的合成、性質和應用在文獻中商業化地描述(對交聯過程和試劑的綜述，參見上文)。可以獲得許多試劑(例如PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同雙功能NHS酯的優選的非限制性的實例包括二琥珀醯亞胺戊二酸(DSG)、辛二酸二琥珀醯亞胺(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺)辛二酸(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺(磺基-DST)、二[2-(琥珀醯亞胺基氧羰基氧)-乙基]-碸(BSOCOES)、雙-2-(磺基琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基碸(磺基BSOCOES)、乙二醇二(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇二(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(磺基EGS)、二硫代二(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)和二硫代二(磺基琥珀醯亞胺丙酸)(磺基DSP)。優選的非限制性的同雙功能亞氨酸酯的實例包括二甲基馬來醯亞胺酸酯(DMM)、二甲基琥珀醯亞胺酸酯(DMSC)、二甲基己二醯亞胺酸酯(DMA)、二甲基庚二醯亞胺酸酯(DMP)、二甲基辛二醯亞胺酸酯(DMS)、二甲基-3，3′-氧二丙醯亞胺酸酯(DODP)、二甲基-3，3′-(亞甲基雙氧基)二丙醯亞胺酸酯(DMDP)、二甲基-3′-(雙亞甲基雙氧基)二丙醯亞胺酸酯(DDDP)、二甲基-3，3′-(四亞甲基雙氧基)二丙醯亞胺酸酯(DTDP)，和二甲基-3，3′-二硫代雙丙醯亞胺酸酯(DTBP)。
優選的非限制性的同型雙功能異硫氰酸酯的實例包括對苯二異硫氰酸酯(DITC)和4，4′-雙異硫氰基-2，2′-二磺酸茋(DIDS)。
優選的非限制性的同型雙功能異氰酸酯的實例包括二甲苯-二異氰酸酯、甲苯-2，4-二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯、2，2′-雙羧基-4，4′-苯偶氮基二異氰酸酯和六亞甲基二異氰酸酯。
優選的非限制性的同型雙功能芳基滷化物的實例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-碸。
優選的非限制性的同型雙功能脂肪基醛試劑的實例包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
優選的非限制性的同型雙功能醯化試劑的實例包括二羧酸的硝基苯酯。
優選的非限制性的同型雙功能芳香族磺醯氯的實例包括苯酚-2、4-二磺醯氯，和α-萘酚-2，4-二磺醯氯。
優選的非限制性的另外的氨基反應性同型雙功能試劑的實例包括與胺反應產生雙氨基甲酸的赤藻糖醇雙碳酸。
與自由硫氫基反應的同型雙功能交聯劑這樣的試劑的合成、性質和應用在文獻中描述(交聯過程和試劑的綜述，參見上文)。許多試劑可以在市場上購買得到(例如PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
優選的非限制性的同型雙功能馬來醯亞胺的實例包括雙馬來醯亞胺己烷(BMH)、N，N′-(1、3-苯撐)雙馬來醯亞胺、N，N′-(1、2-苯撐)雙馬來醯亞胺、苯偶氮基雙馬來醯亞胺，和雙(N-馬來醯亞胺甲基)醚。
優選的非限制性的同型雙功能吡啶二硫化物的實例包括1，4-雙-3′-(2′-吡啶基雙硫)丙醯氨基丁烷(DPDPB)。
優選的非限制性的同型雙功能烷基滷化物的實例包括2，2′-雙羧基-4，4′-雙碘乙醯氨偶氮苯、α，α』-二碘-對二甲苯磺酸、α，α』-二溴-對二甲苯磺酸、N，N′-雙(b-溴乙基)苯甲基胺、N，N′-雙(溴乙醯)苯肼和1，2-雙(溴乙醯)氨基3-苯丙烷。
同型雙功能光活化交聯劑這樣的試劑的合成、性質和應用在文獻中描述(交聯過程和試劑的綜述參見上文)。一些試劑是市場上可買到的(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
優選的非限制性的同型雙功能光活化交聯劑的實例包括雙-β-(4-疊氮水楊酸醯氨)乙基二硫化物(BASED)、雙-N-(2-硝基-4-疊氮苯)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)，和4，4′-雙硫雙苯基疊氮。
具有吡啶基二硫化物部分的氨基反應性異型雙功能試劑這樣的試劑的合成、性質和應用在文獻中描述(交聯過程和試劑的綜述參見上文)。許多試劑可以在市場上購買得到(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
優選的非限制性的具有吡啶二硫化物部分和氨基反應性NHS酯的異雙功能試劑的實例包括N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺6-3-(2-吡啶二硫)丙醯胺己酸(LC-SPDP)、硫代琥珀醯亞胺6-3-(2-吡啶二硫)丙醯胺己酸(硫代LCSPDP)、4-琥珀醯亞胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯(SMPT)，和硫代琥珀醯亞胺6-α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯甲醯胺己酸(硫代-LC-SMPT)。
具有馬來醯亞胺部分的氨基反應性異型雙功能試劑這樣的試劑的合成、性質和應用在文獻中描述。優選的非限制性的具有馬來醯亞胺部分和氨基反應性NHS酯的異雙功能試劑的實例包括琥珀醯亞胺馬來醯亞胺醋酸(AMAS)、琥珀醯亞胺3-馬來醯亞胺丙酸(BMPS)、N-γ-馬來醯亞胺丁醯氧琥珀醯亞胺酯(GMBS)、N-γ-馬來醯亞胺丁醯氧硫琥珀醯亞胺酯(硫代GMBS)、琥珀醯亞胺6-馬來醯亞胺己酸(EMCS)、琥珀醯亞胺3-馬來醯苯甲酸(SMB)、m-馬來醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、m-馬來醯亞胺苯甲醯-N-羥基硫代琥珀醯亞胺酯(硫代MBS)、琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸(SMCC)、硫代琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸(硫代SMCC)、琥珀醯亞胺4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸(SMPB)，和硫代琥珀醯亞胺4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸(硫代SMPB)。
具有滷代烷部分的氨基反應性異型雙功能試劑這樣的試劑的合成、性質和應用在文獻中描述。優選的非限制性的具有滷代烷部分和氨基反應性NHS酯的異雙功能試劑的實例包括N-琥珀醯亞胺-(4-碘乙醯基)氨基安息香酸(SIAB)、硫代琥珀醯亞胺-(4-碘乙醯)氨基苯甲酸(硫代SIAB)、琥珀醯亞胺-6-(碘乙醯)氨基己酸(SIAX)、琥珀醯亞胺-6-(6-((碘乙醯基)-氨基)己醯氨)己酸(SIAXX)、琥珀醯亞胺-6-(((4-(碘乙醯基)-氨基)-甲基)-環己烷-1-羰基)氨基己酸(SIACX)、和琥珀醯亞胺-4((碘乙醯基)-氨基甲基環己烷-1-羧酸(SIAC)。
優選的具有氨基反應性NHS酯和烷基二滷化物部分的異雙功能試劑的實例是N-羥基琥珀醯亞胺2，3-二溴丙酸(SDBP)。SDBP通過連接它的氨基團向親合組分引入分子內部的交聯。二溴丙醯部分對伯胺基團的反應是通過反應溫度控制的(McKenzie等，Protein Chem.7581-592(1988))。
優選的非限制性的具有滷代烷部分和氨基反應性對硝基苯酯部分的異型雙功能試劑的實例包括對硝基苯碘醋酸(NPIA)。
本領域技術人員已知其它的交聯劑，例如參見，Pomato等，U.S.專利號5,965,106。選擇一種特定應用的合適的交聯劑在本領域技術人員的能力範圍內。
可裂解的連接子基團在此外的具體實施方式
中，由可以被裂解以從糖殘基釋放修飾基團的基團提供連接子基團。本領域已知許多可裂解的基團，例如參見，Jung等，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等，J.Immunol.1431859-1867(1989)。而且大量的可裂解的雙功能的(同型和異型雙功能的)連接子基團可以從如Pierce等的供應商購買獲得。
示例性的可裂解的部分可以使用光、熱或如硫醇、羥胺、鹼、高碘酸等等的試劑裂解。而且，某些優選的基團在體內隨內吞而被裂解(例如，順式-烏頭基；參見Shen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優選的可裂解基團包括可裂解的部分，是選自由二硫化物、酯、亞胺、碳酸、硝基苄基、苯醯基和苯偶姻基團構成的組的成員。
修飾糖與肽的結合使用合適的酶介導修飾糖與糖基化的或非糖基化的肽連接。優選地，選擇修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度使得糖基化繼續進行直到受體耗盡。下文論述的事項雖然在唾液酸轉移酶的情形下闡明，通常也可適用於其它的糖基轉移酶反應。
一些使用糖基轉移酶人工合成需要的寡糖結構的方法是已知的，且通常可適用於本發明。例如WO 96/32491，Ito等，Pure Appl.Chem.65753(1993)和U.S.專利號5,352,670、5,374,541和5,545,553描述了示例性的方法。
本發明使用單一糖基轉移酶或糖基轉移酶的組合進行。例如，可以使用唾液酸轉移酶和半乳糖基轉移酶的組合。在使用一種以上的酶的具體實施方式
中，酶和底物優選在初始反應混合物中組合，或一旦第一酶促反應完成或幾乎完成就加入進行第二酶促反應的酶和試劑。通過在一個容器中順次實施兩個酶促反應，比其中分離中間體種類的方法提高了總產率。而且，降低了額外的溶劑和副產品的清除和處理。
在一個優選方案中，第一和第二酶都是糖基轉移酶。在另一個優選方案中，一種酶是內切糖苷酶。在另外的優選方案中，採用兩種以上酶裝配本發明的修飾的糖蛋白，酶用來在向肽添加修飾糖之前或之後在肽的任何位點改變糖結構。
在另一個具體實施方式
中，本方法利用一種或多種外切糖苷酶或內切糖苷酶。通常糖苷酶是突變體，被改造形成糖基鍵而不是將其裂解。突變體聚糖酶通常包括一個胺基酸殘基對一個活性酸性胺基酸殘基位點的取代。例如，當內切聚糖酶是endo-H時，取代的活性部位殘基通常是位點130的Asp、位點132的Glu或其組合。通常胺基酸替換為絲氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、或穀氨醯胺。
突變體酶催化反應，通常通過與內切聚糖酶水解步驟的逆反應相似的合成步驟來進行。在這些具體實施方式
中，糖基供體分子(例如，需要的寡或單糖結構)含有離去基團，反應向蛋白上的GlcNAc殘基添加供體分子。例如，離去基團可以是滷素，如氟化物。在其它具體實施方式
中，離去基團是Asn、或Asn-肽部分。在此外的具體實施方式
中，糖基供體分子上的GlcNAc殘基被修飾。例如，GlcNAc殘基可以包括1，2唑啉部分。
在一個優選方案中，使用的生產本發明的綴合物的每一種酶以催化劑量存在。特定的酶的催化量根據酶的底物的濃度以及反應條件如溫度、時間和pH值而變化。確定在預選的底物濃度和反應條件下的給定的酶的催化量為本領域技術人員眾所周知。
進行上述步驟的溫度可以從僅僅零度以上到最敏感的酶變性的溫度的範圍。優選溫度的範圍大約為0℃到大約55℃，更優選大約20℃到大約30℃。在另一個示例性的具體實施方式
中，在提高的溫度下使用嗜熱酶實施本方法的一種或多種步驟。
反應混合物維持一段足以使受體糖基化的時間，從而形成需要的綴合物。一些綴合物常常在幾小時後就可以檢出，通常24小時或更短的時間內就能獲得可回收的量。本領域技術人員理解反應速率取決於一些可變因素(例如酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)，這些因素對一個選定的系統進行優化。
本發明也提供了工業規模的修飾的肽的生產。如此處使用的，工業規模通常生產至少大約250mg，優選至少大約500mg，更優選至少大約1克的最終的純化綴合物，優選在單個反應周期後，即綴合物不是來自同樣的、連續重複的合成周期的反應產物的組合。
在隨後的討論中，本發明通過修飾唾液酸部分與糖基化的肽的綴合來舉例說明。示例性的修飾的唾液酸用m-PEG標記。下列主要討論PEG修飾的唾液酸和糖基化的肽是為了說明的清楚，而不意味著暗示本發明被限制於這二個組分的綴合。技術人員理解該討論通常可適用於添加除了唾液酸外的修飾糖基部分。而且，討論同樣地可適用於用除了m-PEG的其它試劑修飾糖基單位，包括其它的水溶性聚合物、治療性部分和生物分子。
可以使用酶促方法把m-PEG化或m-PPG化的碳水化合物選擇性地導入肽或糖肽上。該方法採用含有PEG、PPG或屏蔽的反應性功能基團的修飾糖，並與合適的糖基轉移酶或糖合酶組合。通過選擇產生需要的碳水化合物鍵的糖基轉移酶和利用修飾糖作為供體底物，可以把PEG或PPG直接導入肽骨架上、存在的糖肽的糖殘基或已經加到肽上的糖殘基上。
唾液酸轉移酶的受體存在於要用本發明方法修飾的肽上，該受體是天然存在的結構或重組地、酶學地或者化學地添加的。合適的受體包括，例如半乳糖基受體，如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、GalNAc、Galβ1，3GalNAc、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)及其他本領域技術人員已知的受體(例如參見，Paulson等，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
在一個
具體實施例方式
中，唾液酸轉移酶受體在糖肽體內合成後即存在於待修飾的糖肽上。這樣的糖肽可以使用本發明方法不進行糖肽的糖基化模式的預先修飾而被唾液酸化。另外，本發明的方法可用於唾液酸化不包括適當的受體的肽；首先通過本領域技術人員已知的方法修飾肽使其包括受體。在一種示例性的具體實施方式
中，在GalNAc轉移酶的作用下添加GalNAc殘基。
在一個示例性的具體實施方式
中，通過向與肽連接的合適的受體附加半乳糖殘基合成半乳糖受體，例如GalNAc。該方法包括將待修飾的肽與含有適量的半乳糖基轉移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和適當的半乳糖供體(例如UDP-半乳糖)的反應混合物孵育。使反應充分地完成，或加入了預定量的半乳糖殘基時終止反應。合成選擇的糖受體的其它的方法對本領域技術人員是顯而易見的。
在另一
具體實施例方式
中，首先全部或部分地「修剪」糖肽連接的寡糖，以暴露唾液酸轉移酶的受體，或暴露可以添加一個或多個合適的殘基以獲得適當的受體的部分。如糖基轉移酶和內切糖苷酶的酶(例如參見U.S.專利號5,716,812)可用於連接反應和修剪反應。
在隨後的討論中，通過利用具有連接的水溶性聚合物的修飾糖對本發明的方法進行舉例說明。本討論是為了說明的清晰，技術人員將理解該討論同樣適用於修飾糖具有治療性部分、生物分子等等的具體實施方式
。
在一個示例性的具體實施方式
中，在添加修飾糖之前「修剪」O-連接的碳水化合物殘基。例如把GalNAc-Gal殘基削減為GalNAc。具有水溶性聚合物的修飾糖與一個或多個通過「修剪」暴露的糖殘基連接。在一個實施例中，「修剪」了糖肽，經由糖基部分向得到的O-側鏈胺基酸或糖肽聚糖加入水溶性聚合物，例如與水溶性聚合物連接的Sia、Gal、或GalNAc部分。修飾糖部分與「修剪的」糖肽上的受體位點連接。另外，未改變的糖部分例如Gal可以加到O-連接聚糖的末端。
在另一個示例性的具體實施方式
中，經由具有半乳糖殘基的修飾糖把水溶性聚合物加到GalNAc殘基上。另外，可以把未改變的Gal加到末端GalNAc殘基上。
然而在另一個例子中，使用修飾的唾液酸把水溶性聚合物加到Gal殘基上。
在另一個示例性的具體實施方式
中，把O-連接糖基殘基「削減」為與胺基酸連接的GalNAc。在一個實施例中，經由用聚合物修飾的Gal添加水溶性聚合物。也可以把未改變的Gal加到GalNAc上，後面是具有結合的水溶性聚合物的Gal。在又一個具體實施方式
中，把一個或多個未改變的Gal殘基加到GalNAc上，後面是用水溶性聚合物修飾的唾液酸部分。
使用本發明的方法，基本上可能削減和建立任意的需要結構的碳水化合物殘基。如上所述，可以把修飾糖加到碳水化物部分的末端，或可以在肽核心和碳水化合物末端之間。
在一個示例性的例子中，使用聚合物修飾的唾液酸把水溶性聚合物加到末端Gal殘基上。採用合適的唾液酸轉移酶添加修飾的唾液酸。該方法概括於方案5。

在另外的方法中，屏蔽的反應性官能團存在於唾液酸上，概括為方案6。屏蔽的反應基團優選不受用於連接修飾的唾液酸與肽的條件的影響。在修飾的唾液酸與肽共價連接後，除去屏蔽，如PEG、PPG、治療性部分、生物分子或其它的試劑把肽連接。通過與修飾糖殘基上的無屏蔽的活性基團反應，該試劑與肽以特異性的方式連接起來方案6 任意修飾糖均可與其合適的糖基轉移酶使用，取決於糖肽的寡糖側鏈的末端糖(表2)。正如以上的討論，導入PEG化或PPG化結構需要的糖肽的末端糖可以在表達期間天然地引入，或可以使用合適的糖苷酶、糖基轉移酶或糖苷酶和糖基轉移酶的混合物在表達後產生。
表2


在另一示例性的具體實施方式
中，UDP-半乳糖-PEG與牛乳β1，4-半乳糖基轉移酶反應，從而把修飾半乳糖轉移到合適的末端N-乙醯葡糖胺結構。糖肽上的末端GlcNAc殘基可以在表達期間產生，如可以在如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌這樣的表達體系中產生，而且可以根據需要通過唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉移酶處理糖肽而產生。
在另一個示例性的具體實施方式
中，使用GlcNAc轉移酶如GNT1-5把PEG化的GlcN轉移到糖肽上的末端甘露糖殘基上。在另一示例性的具體實施方式
中，用酶學方法把N-和/或O-連接聚糖結構從糖肽上除去，暴露胺基酸或末端糖基殘基，隨後與修飾糖連接。例如，用內切聚糖酶除去糖肽的N-連接的結構以暴露糖肽上GlcNAc-連接-Asn的末端GlcNAc。用UDP-Gal-PEG和合適的半乳糖基轉移酶把PEG-或PPG-半乳糖官能團導入暴露的GlcNAc上。
在另一
具體實施例方式
中，利用能把糖殘基轉移到肽骨架上的已知的糖基轉移酶把修飾糖直接加到肽骨架上。這個示例性的具體實施方式
在方案7中闡明。示例性的用於本發明的實踐的糖基轉移酶包括但不限於，GalNAc轉移酶(GalNAcT1-20)、GlcNAc轉移酶、巖藻糖轉移酶、葡糖轉移酶、木糖轉移酶、甘露糖轉移酶等等。這個方法的使用允許修飾糖直接加到沒有任何碳水化合物的肽上，或加到存在的糖肽上。在兩種情況下，修飾糖的添加都發生在肽骨架上的由糖基轉移酶的底物特異性限定的特定位點，而不是如用化學方法對蛋白質的肽骨架進行修飾那樣的隨機添加。通過用生物工程技術把合適的胺基酸序列導入多肽鏈，可以把一系列的試劑導入缺乏糖基轉移酶底物肽序列的蛋白或糖肽中。
方案7 在上述的每一示例性的具體實施方式
中，修飾糖與肽結合後，可以使用一種或多種另外的化學或酶促修飾步驟。在一種示例性的具體實施方式
中，採用一種酶(例如巖藻糖基轉移酶)向連接於肽的修飾糖末端添加糖基單位(例如巖藻糖)。在另一個實例中，使用酶促反應對修飾糖沒能連接的位點「加帽」(例如唾液酸化)。另外，使用化學反應改變連接的修飾糖的結構。例如，連接的修飾糖與使它和修飾糖連接的肽元件的鍵穩定或使其不穩定的試劑反應。在另一個實例中，修飾糖的元件在和肽結合後去保護。技術人員將理解在修飾糖與肽連接後，有一系列的酶促和化學方法可用於本發明的方法。此外修飾糖-肽綴合物的精修也在本發明的範圍內。
酶糖基轉移酶糖基轉移酶催化活化糖(供體NDP-糖)以逐步方式加入蛋白、糖肽、脂質或糖脂或增長的寡糖的非還原末端。N-連接糖肽經由轉移酶和脂質連接寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Man9以整體轉移人工合成，然後修剪核心。在這種情況下，「核心」糖的性質與隨後的連接物不同。現有技術中已知許多糖基轉移酶。
本發明中採用的糖基轉移酶可以任意選擇，只要它可以利用修飾糖作為糖供體。這種酶的實例包括Leloir通路糖基轉移酶，例如半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶、N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖轉移酶、木糖轉移酶、葡糖醛酸基轉移酶等等。
對於涉及糖基轉移酶反應的酶促糖合成，糖基轉移酶可以從任意的來源克隆或分離。許多克隆糖基轉移酶以及它們的多核苷酸序列是已知的。例如參見，「網際網路克隆糖基轉移酶相關網址」(http://www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)。糖基轉移酶胺基酸序列和可以推導出胺基酸序列的編碼糖基轉移酶的核苷酸序列也可以在許多公共資料庫中找到，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等。
本發明的方法可以採用的糖基轉移酶包括但是不限於半乳糖基轉移酶、巖藻糖轉移酶、葡糖基轉移酶、N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺轉移酶、葡糖醛酸基轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖轉移酶、葡糖醛酸轉移酶、半乳糖醛酸轉移酶和寡糖轉移酶。適當的糖基轉移酶包括從真核生物以及原核生物中獲得的糖基轉移酶。
編碼糖基轉移酶的DNA可以通過化學合成、通過從合適的細胞或細胞系培養物篩查反轉錄mRNA、通過篩查來自合適的細胞的基因組文庫、或通過這些方法的組合而獲得。篩查mRNA或基因組DNA可以用來自糖基轉移酶基因序列的寡聚核苷酸探針進行。探針可以根據已知的並用於常規雜交分析的方法用可檢測的基團如螢光基團、放射性原子或化學發光的基團標記，。另外，可以通過利用聚合酶鏈式反應(PCR)，用由糖基轉移酶基因序列產生的PCR寡聚核苷酸引物獲得糖基轉移酶基因序列。參見Mullis等的U.S.專利號4,683,195、Mullis的U.S.專利號4,683,202。
糖基轉移酶可以在用含有編碼糖基轉移酶的DNA的載體轉化的宿主細胞中合成。載體是可複製的DNA構建體。載體用於擴增編碼糖基轉移酶的DNA和/或表達編碼糖基轉移酶的DNA。表達載體是可複製的DNA構建體，其中編碼糖基轉移酶的DNA序列與適當的調控序列可操作性連接，該調控序列能夠影響糖基轉移酶在適當的宿主中表達。這種調控序列的需要根據選擇的宿主和選擇的轉化方法而變化。通常，調控序列包括轉錄啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結合部位的序列，以及調節轉錄和翻譯終止的序列。擴增載體不需要表達控制域，所需要的只是在宿主中複製的能力(這通常由複製起點給與)以及促進轉化體的識別的選擇基因。
巖藻糖轉移酶在一些具體實施方式
中，用於本發明的方法的糖基轉移酶是巖藻糖基轉移酶。本領域技術人員已知巖藻糖轉移酶。示例性的巖藻糖轉移酶包括把L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉移到受體糖的羥基位點的酶。轉移非核苷酸糖到受體上的巖藻糖轉移酶也可用於本發明中。
在一些
具體實施例方式
中，受體糖是例如寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團中的GlcNAc。這個反應的適宜的巖藻糖轉移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)，其首先從人乳中被鑑定(參見Palcic等，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels，等，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；以及Nunez等，Can.J.Chem.592086-2095(1981))，也包括在人血清中發現的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖轉移酶(FTIV、FTV、FTVI)。也鑑定了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，一種唾液酸α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉移酶。也鑑定了重組形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖轉移酶(參見Dumas，等，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)以及Kukowska-Latallo等，Genes and Development 41288-1303(1990))。其它的示例性的巖藻糖轉移酶包括例如α1，2巖藻糖轉移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促巖藻糖化可以通過Mollicone等Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或U.S.專利號5,374,655描述的方法進行。用於生產巖藻糖基轉移酶的細胞也包括合成GDP-巖藻糖的酶促系統。
半乳糖基轉移酶在另一組具體方案中，糖基轉移酶是半乳糖基轉移酶。示例性的半乳糖基轉移酶包括α(1，3)半乳糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如參見Dabkowski等，Transplant Proc.252921(1993)以及Yamamoto等Nature 345229-233(1990)，牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA868227-8231(1989))，豬(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一合適的α1，3半乳糖基轉移酶是參與血液B組抗原合成的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人))。
另外適於本發明的方法的是β(1，4)半乳糖基轉移酶，包括例如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104165-168(1988))以及E.C.2.4.1.38和神經醯胺半乳糖基轉移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它合適的半乳糖基轉移酶包括例如，α1，2半乳糖基轉移酶(來自例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell5519-528(1994))。
從克隆的基因中通過遺傳工程生產如酶GalNAc TI-XIV的蛋白質是眾所周知的。例如參見，U.S.專利號4,761,371。一個方法涉及收集足夠的樣品，然後通過N末端測序確定胺基酸序列，然後把該信息用於分離編碼全長的(膜結合)轉移酶的cDNA克隆，該cDNA克隆在昆蟲細胞系Sf9的表達導致充分活性的酶的合成。然後對在16種不同的蛋白質中已知的糖基化位點周圍的胺基酸使用半定量分析確定該酶的受體特異性，然後是合成肽的體外糖基化研究。該工作已經證明一定的胺基酸殘基在糖基化的肽片段過量存在，而且糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍的特定位點的殘基對受體效力也許具有比其它胺基酸部分更顯著的影響。
唾液酸轉移酶唾液酸轉移酶是另一種類型的用於本發明的重組細胞和反應混合物的糖基轉移酶。產生重組體唾液酸轉移酶的細胞也產生CMP-唾液酸，其是唾液酸轉移酶的唾液酸供體。適合用於本發明的唾液酸轉移酶的實例包括ST3Gal III(例如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalII、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAcIII(這裡採用的唾液酸轉移酶命名法按照Tsuji等，Glycobiology 6v-xiv(1996)的描述)。一種示例性的稱為α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)的α(2，3)唾液酸轉移酶把唾液酸轉移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal，參見Van denEijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一示例性的2，3-唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.4)把唾液酸轉移到二糖或糖苷的非還原末端Gal上，參見Rearick等，J.Biol.Chem.2544444(1979)以及Gillespie等，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其它示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸轉移酶(參見Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優選地，為了糖肽碳水化合物的糖基化，唾液酸轉移酶將能把唾液酸轉移到序列Galβ1，4GlcNAc-上，其是在充分地唾液酸化的碳水化合物結構上的末端唾液酸下的最常見的倒數第二序列(參見表3)。
表3採用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸轉移酶

1)Goochee等，Bio/Technology 91347-1355(1991)2)Yamamoto等，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)一種用於本發明方法中的示例性的唾液酸轉移酶是ST3Gal III，也稱為α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)。該酶催化唾液酸向Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的轉移(例如參見Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1991))，負責糖肽中天冬醯胺連接的寡糖的唾液酸化。唾液酸與Gal連接，在兩個糖之間形成α連接。兩個糖之間的鍵(連接)位於NeuAc的位點2和Gal的位點3之間。這種特別的酶可以從鼠肝臟中分離(Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等，(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，有助於通過重組表達生產這種酶。在一個優選實施方式中，本發明的唾液酸化方法採用大鼠ST3Gal III。
其它示例性的用於本發明的唾液酸轉移酶包括那些從空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)分離的酶，包括α(2，3)，例如參見WO99/49051。
除了表3中所列的酶以外的唾液酸轉移酶也可用於商業上重要的糖肽的唾液酸化的經濟和高效的大規模工藝。作為發現這些其它酶的應用的簡單測試，使各酶的不同的量(1-100mU/mg蛋白)與脫唾液酸-α1AGP(在1-10mg/ml)反應，比較目的唾液酸轉移酶相對於牛ST6Gal I、ST3Gal III或者這兩個唾液酸轉移酶的唾液酸化糖肽的能力。另外，其它從肽主鏈酶促釋放的糖肽或N-連接寡糖可替代脫唾液酸-α1AGP用於這種估價。比ST6Gal I能更有效地唾液酸化糖肽的N-連接寡糖的唾液酸轉移酶可以用於肽唾液酸化的實用的大規模工藝(如在此公開中所舉例說明的ST3Gal III)。
其它糖基轉移酶本領域技術人員將理解其它糖基轉移酶可以替代入類似的轉移酶周期，如已經詳細描寫的唾液酸轉移酶。尤其是糖基轉移酶還可以是葡糖基轉移酶等，例如Alg8(Stagljov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA915977(1994))或Alg5(Heesen等，Eur.J.Biochem.22471(1994))。
N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶也用於本發明的實踐中。適宜的N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶包括但是不限於α(1，3)N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶、β(1，4)N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等，J.Biol Chem.26915162(1994))以及多肽N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶(Homa等，J.Biol.Chem.26812609(1993))。合適的N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hull等，BBRC 176608(1991))，GnTII，GnTIII(Ihara等，J.Biochem.113692(1993))，GnTIV和GnTV(Shoreiban等，J.Biol.Chem.26815381(1993))，O-連接的N-乙醯氨基葡糖基轉移酶(Bierhuizen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899326(1992))，N-乙醯氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶(Rajput等，Bichem J.285985(1992))以及透明質酸合酶。
甘露糖轉移酶可用於轉移修飾的甘露糖部分。合適的甘露糖轉移酶包括α(1，2)甘露糖轉移酶、α(1，3)甘露糖轉移酶、α(1，6)甘露糖轉移酶、β(1，4)甘露糖轉移酶、Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1(參見Kornfeld等，Annu.Rev.Biochem.54631-664(1985))。
木糖轉移酶也可用於本發明，例如參見，Rodgers等，Biochem.J.，288817-822(1992)以及Elbain等，U.S.專利號6,168,937。其它合適的糖基轉移酶循環在下列文獻中描述Ichikawa等，JACS1149283(1992)，Wong等，J.Org.Chem.574343(1992)以及Ichikawa等，CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS.Yaltami，ed.(ATL Press，1993)。
原核糖基轉移酶也用於本發明的實踐中，這種糖基轉移酶包括涉及脂寡糖(LOS)合成的酶，其由許多革蘭氏陰性細菌產生。LOS通常具有末端聚糖序列，該聚糖序列模擬人上皮細胞表面或宿主分泌物中發現的多糖綴合物(Preston等，Critical Reviews in Microbiology23(3)139-180(1996))。這種酶包括但並不限於，如大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的物種的rfa操縱子的蛋白，包括β1，6半乳糖基轉移酶和β1，3半乳糖基轉移酶(例如參見，EMBL登錄號M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL登錄號S56361(鼠傷寒沙門氏菌))，葡糖基轉移酶(Swiss-Prot登錄號P25740(大腸桿菌)，β1，2葡糖基轉移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登錄號P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登錄號P19817(鼠傷寒沙門氏菌))，以及β(1，2)-N-乙醯氨基葡糖基轉移酶(rfaK)(EMBL登錄號U00039(大腸桿菌)。其它的胺基酸序列已知的糖基轉移酶包括由例如rfaB的操縱子編碼的酶，其已經在例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸沙門氏菌(Salmonella enterica)，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)，Mycobacteriumleprosum，以及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子。
涉及產生含有lacto-N-neotetraose，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙醯基-D-葡萄糖氨基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖以及pk血基團三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖以及Pk血液類別三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的結構的糖基轉移酶也適用於本發明，該結構在黏膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌中的LOS中被識別(Scholten等，J.Med.Microbiol.41263-243(1994))。來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的編碼涉及這些結構的生物合成的糖基轉移酶的基因已經從腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18729-740(1995))以及淋病奈瑟氏球菌突變株F62中識別(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由lgtA、lgtB和lgE三個基因組成的位點編碼在lacto-N-neotetraose鏈中加入最後三個糖時所需要的糖基轉移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。最近證明了lgtB和lgtA基因產物的酶活性，提供了它們的糖基轉移酶功能的第一個直接證據(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，有兩個另外的基因，即lgtD把β-D-GalNAc加到lacto-N-neotetraose結構的末端半乳糖的位點3以及lgtC把末端α-D-Gal加到縮短的LOS的乳糖元件，從而產生pk血型抗原結構(Gotshlich(1994)，見上文)。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，另外的免疫型L1也表達pk血型抗原，且已經顯示攜帶lgtC基因(Jennings等(1995)，見上文)。奈瑟氏球菌屬糖基轉移酶和相關的基因也在USPN 5,545,553(Gotschlich)中描述。來自幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的α1，2-巖藻糖基轉移酶和α1，3-巖藻糖基轉移酶基因也已經被鑑定(Martin等，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。空腸彎曲桿菌糖基轉移酶也用於本發明(例如參見，http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf 42.html)。
磺基轉移酶本發明也提供了產生包括硫酸化分子，例如包括硫酸化聚糖如肝素、硫酸乙醯肝素、carragenen和相關的化合物的肽的方法。適宜的磺基轉移酶包括例如軟骨素-6-磺基轉移酶(Fukuta等描述的雞cDNA，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)；GenBank登錄號D49915)。糖基氨基聚糖N-乙醯葡糖胺N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶1(Dixon等，Genomics 26239-241(1995)；UL18918)，以及糖基氨基聚糖N-乙醯葡糖胺N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶2(Orellana等描述的鼠科cDNA，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)以及Eriksson等，J.Biol.Chem.26910438-10443，(1994)；GenBank登錄號U2304中描述的人cDNA)。
細胞結合的糖基轉移酶在另一個具體實施方式
中，本發明的方法中使用的酶是細胞結合的糖基轉移酶。儘管已知許多可溶糖基轉移酶(例如參見，U.S.專利號5,032,519)，當與細胞相關聯時，糖基轉移酶通常是膜結合形式。迄今研究的許多膜結合酶被認為是內在蛋白質，也就是說由超聲處理它們不從膜釋放，而需要去垢劑溶解。已經在脊椎動物和無脊椎動物的細胞表面識別了表面糖基轉移酶，也已經認識到這些表面轉移酶在生理條件下維持催化活性。然而，更多識別的細胞表面糖基轉移酶的功能是支持細胞間的識別(Roth，MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA，1990)。
已經建立了改變細胞表達的糖基轉移酶的方法，例如Larsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)報導了一種分離克隆的cDNA序列的遺傳方法，以確定細胞表面寡糖結構和它們的相關糖基轉移酶的表達。用從已知的表達UDP-半乳糖β-D-半乳糖-1，4-N-乙醯-D-葡糖醯氨α-1，3-半乳糖基轉移酶的鼠科動物細胞系中分離的mRNA生成的cDNA文庫轉染COS-1細胞，然後培養轉染的細胞，並分析α1-3半乳糖基轉移酶的活性。
Francisco等Proc.Natl.Acad.Sci.USA892713-2717(1992)公開了一種把β-內醯胺酶錨定到大腸桿菌的外表面的方法。由(i)外膜蛋白的信號序列，(ii)外膜蛋白的跨膜片段，以及(iii)完整的成熟的β-內醯胺酶序列組成的三重融合體被產生，導致表面結合的活性內醯胺酶分子。然而，Francisco方法僅限於原核細胞系統，如作者承認的，完成適當的功能需要完全的三重融合體。
融合蛋白質在另外的示例性的具體實施方式
中，本發明的方法利用具有一個以上涉及需要的糖肽綴合物的合成的酶活性的融合蛋白質。融合多肽可以由例如與輔助酶的催化有效域結合的糖基轉移酶的催化活性域組成。輔助酶催化結構域可以催化作為糖基轉移酶供體的核苷酸糖形成的步驟，或催化涉及糖基轉移酶周期的反應。例如，編碼糖基轉移酶的多核苷酸可以與編碼涉及核苷酸糖合成的酶的多核苷酸按讀碼框連接。因此產生的融合蛋白不僅能夠催化核苷酸糖的合成，而且能夠催化糖部分向受體分子的轉移。融合蛋白可以是與一個可表達的核苷酸序列連接的兩個或更多的循環酶。在另外的具體實施方式
中，融合蛋白包括兩個或更多糖基轉移酶的催化活性域。例如參見，5,641,668。利用不同的適當的融合蛋白質可以容易地設計和生產本發明的修飾糖肽(例如，參見，PCT專利申請PCT/CA98/01180，1999年6月24日公開為WO 99/31224)。
固定的酶除細胞結合的酶外，本發明也提供了固定在固體和/或可溶性支持物上的酶的應用。在一種示例性的具體實施方式
中，提供了一種根據本發明的方法經由完整的糖基連接子與PEG連接的糖基轉移酶。PEG-連接子-酶綴合物可選擇地與固體載體連接。本發明的方法的固相載體化酶的應用使反應混合物的逐步建立(work up)和反應產物的提純簡單化，以及使酶能夠容易地回收。本發明的方法中使用了糖基轉移酶綴合物。其它的酶和支持物的組合對本領域技術人員是顯而易見的。
通過重組體方法糖基化突變體人生長激素的糖基化可以通過重組方式在細胞內完成。編碼突變體人生長激素(包括至少一個新導入的N-或O-連接糖基化位點)的多核苷酸序列，可以轉染適當的宿主細胞系，例如來源於酵母、昆蟲、或哺乳動物的真核細胞系。由這樣的細胞系重組產生的突變體人生長激素通過宿主細胞的糖基化機製糖基化。
糖基化的突變體hGH的純化通過上述工序生產的糖基化的人生長激素優選在使用以前純化。可以使用標準的、眾所周知的技術，例如薄層或厚層層析法、柱層析、離子交換層析或膜濾法。優選使用膜濾法，更優選利用反向滲透膜，或一個或多個柱色譜技術進行回收，如以下論述的和這裡引用的文獻中討論的。
如果糖基化的突變體人生長激素是細胞內產生的，作為第一步，通過例如離心法或超濾法除去宿主細胞或細胞溶解片段的微粒碎片；可選地，可以用市場上可買到的蛋白濃縮膜濃縮蛋白，然後通過一個或多個選自下列的方法從其它的雜質中分離多肽變體免疫吸附層析法、離子交換柱分離法(例如在二乙氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基基團的基質上)、在Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-瓊脂糖凝膠、WGA-瓊脂糖凝膠、Con A-瓊脂糖凝膠、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、PhenylToyopearl、SP-瓊脂糖凝膠或蛋白A瓊脂糖凝膠上的層析分離法、SDS-PAGE層析分離法、二氧化矽層析分離法、層析聚焦、反相HPLC(例如具有附加的脂肪基的矽膠)、凝膠過濾，例如使用葡聚糖凝膠分子篩或大小排阻色譜法、選擇性地結合多肽的柱上的層析分離法以及乙醇或硫酸銨沉澱。
在培養中產生的糖基化的突變體人生長激素通常首先通過從細胞、細胞溶解產物、培養基等等中提取，然後進行一次或多次濃縮、鹽析、含水離子交換或大小排阻色譜步驟而分離。另外，可以通過親合層析純化糖蛋白。最後，可以採用HPLC進行最後的純化步驟。
蛋白酶抑制劑，例如甲磺醯氟(PMSF)可以包括在任何上述的步驟中，以抑制蛋白水解，也可以包括抗生素以防止意外汙染物的生長。
有時候，首先使用市場上可買到的蛋白濃縮膜濃縮來自生產本發明的糖基化人生長激素的體系的上清液，例如使用一種Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置。濃縮步驟後，可以把濃縮物施加到適當的純化基質。例如，適當的親合基質可以包括結合在適當的支持物上的肽的配體、凝集素或抗體分子。另外，可以採用陰離子交換樹脂，例如具有側掛DEAE基團的基質或基層。適當的基質包括丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或其它的通常用於蛋白純化的類型。也可以採用陽離子交換步驟，適當的陽離子交換劑包括各種含有磺丙基或羧甲基基團的不溶基質，特別優選磺丙基基團。
最後，可以採用一個或多個RP-HPLC步驟進一步純化糖基化的突變體人生長激素，所述RP-HPLC使用疏水性RP-HPLC介質例如具有側掛甲基或其它脂肪基的矽膠。還可以採用某些或所有的上述純化步驟的不同組合提供糖蛋白。
由大規模的發酵生產的本發明的糖基化的突變體人生長激素可以通過類似於Urdal等J.Chromatog.296171(1984)公開的方法純化。該參考文獻描述了二個相繼的在製備級HPLC柱上進行的重組體人IL-2純化的RP-HPLC步驟。另外，可以使用例如親合層析的技術純化糖蛋白。
突變體hGH的功能分析糖基化的突變體人生長激素的生產後，優選純化後，使用一些現有技術中已知的方法測試糖蛋白的生物學功能。功能性分析以人生長激素的不同的特徵為基礎，例如它與人生長激素受體結合的特異性、hGH受體的活化和在促進細胞生長中的活性。在各個分析中，野生型人生長激素作為陽性對照包括在內。
可以進行放射性受體結合分析檢測放射性標記的hGH受體和本發明的突變體人生長激素之間的結合。這樣的分析的詳細說明可以在文獻中找到，例如Tsushima等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，37334-337(1973)；Chin等，Endocr.Meta.37334(1973)；以及U.S.專利號4,871,835、5,079,230.
通過例如脛骨測試的方法評定突變體人生長激素促進細胞生長的能力(Parlow等，Endocrinology 771126(1965)；U.S.專利號4,871,835)。簡要地說，切除28-30天齡的小鼠的垂體，維持10-14天不予治療。然後通過每日皮下注射給與大鼠重組來源的人生長激素突變體。第六天宰殺動物，取出前腿膝蓋骨，並測量骺板的寬度。在試驗開始時和宰殺前也監測這些大鼠的重量，並對每日接受注射不同濃度的突變體人生長激素的不同的組進行比較。
而且，可以表明突變體人生長激素在來自人成淋巴細胞瘤克隆並在細胞表面表達人生長激素受體的IM-9細胞中引起hGH依賴性酪氨酸磷酸化的能力的生物活性。如MB-2細胞的其它細胞類型也可以適於hGH功能分析。通過針對磷酸化酪氨酸的單克隆抗體顯示暴露於突變體人生長激素的細胞蛋白的酪氨酸磷酸化水平，如Silva等描述的，Endocrinology，132101(1993)和U.S.專利號6,238,915。
藥物組合物和給藥具有上述的所需的寡糖決定簇的糖基化突變體人生長激素可以用作治療許多與生長激素缺陷相關的疾病和病症的治療劑。可以用本發明的突變體人生長激素治療的生長相關病症包括侏儒症、兒童和成年人身高不足、惡病質/肌肉損耗、全身肌肉萎縮、和性染色體異常(例如特納症候群)。其它的可以使用本發明的突變體hGH治療的病症包括短腸綜合症、脂肪營養障礙、骨質疏鬆症、尿毒症、燒傷、女性不育、骨質再生、普通糖尿病、II型糖尿病、骨關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和失眠症。本發明的突變體hGH也可以用於促進各種癒合過程，例如全身組織再生、骨再生和傷口癒合或作為疫苗佐劑。因而本發明也提供了一種藥物組合物，包括有效量的糖基化突變體人生長激素，其根據如上所述的方法生產。
本發明的藥物組合物適於在許多藥物輸送系統中使用。用於本發明的適宜的配方可在Remington′s Pharmaceutical Science，MackPublishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中找到。對藥物輸送方法的簡述參見Langer，Science 2491527-1533(1990)。
藥物組合物計劃通過腸胃外、鼻內、局部、口服、或表面(local)給藥，如通過皮下注射、噴霧吸入或透皮吸收進行預防和/或治療。通常該藥物組合物通過腸胃外給藥，例如皮下或靜脈內。因此，本發明提供了腸胃外給藥的組合物，包括溶解或懸浮在可接受的載體中的糖基化突變體人生長激素，優選水載體，如水、緩衝水、鹽水、PBS等等。該組合物也可以含有如吐溫20和吐溫80的去垢劑；如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖的穩定劑；以及如EDTA和間甲酚的防腐劑。該組合物可以含有藥學上可接受的模擬生理條件所需要的輔助物質，如pH校準和緩衝劑、張力調節劑、潤溼劑、去垢劑等等。
這些組合物可以通過傳統的滅菌技術消毒或可以濾過消毒，獲得的水溶液可以直接包裝使用或凍幹，凍幹製劑在給藥之前與無菌含水載體結合。製劑的pH通常在3和11之間，更加優選從5到9，最優選從7到8。
可以給與含有糖基化的突變體人生長激素的組合物進行預防和/或治療。在治療性應用中，把組合物給予已經遭受與生長激素缺乏相關的疾病或病症的患者，其量足夠治療或至少部分阻止疾病和它的併發症的症狀。足夠完成這些的量被稱為「治療有效量」。對該應用有效的量取決於疾病或病症的嚴重性和患者的體重和一般狀況，但對70kg的患者，通常每日從大約0.1mg到大約2,000mg的糖基化的突變體人生長激素，更多採用每日從大約5mg到大約200mg化合物的劑量。
在預防應用中，把含有本發明的糖基化的突變體人生長激素的組合物給予容易患某一疾病或具有患病風險的患者。這種量被稱為「預防有效量」。在這種情況下，精確的量也取決於患者的健康狀況和體重，對於70kg體重的患者，通常每日從大約0.1mg到大約1,000mg，更多採用從大約5mg到大約200mg每70kg體重。
組合物的單一或多重給藥可以以治療醫師選擇的劑量水平和模式進行。無論如何，藥物製劑應該提供一定量的有效治療患者的本發明的糖基化突變體人生長激素。
提供下列實施例僅作為舉例說明，而不是對本發明的限制。本領域技術人員將容易地識別可以變化或修改而產生實質上類似的結果的許多非關鍵參數。
實施例1人生長激素以許多不同的亞型和不同的胺基酸序列存在。兩種最好地鑑定的形式包括胎盤來源的hGH，亦稱GH-V(PDB P01242)，以及垂體來源的hGH，亦稱促生長素或GH-N(P01241)；參見圖1。垂體來源的hGH不是糖基化的，並且在大腸桿菌中作為治療劑產生。胎盤來源的hGH(GH-V)在胺基酸140位點具有一個N-糖基化位點(參見表4和圖1，如箭頭所示)。
表4.人生長激素(GH-V)，來源於胎盤；P01242(SEQ ID NO2)fptiplsrlfdnamlrarrlyqlaydtyqefeeayilkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnrvktqqksnlellrisllliqswlepvqllrsvfanslvygasdsnvyrhlkdleegiqtlmwrledgsprtgqifnqsyskfdtkshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf ↑垂體來源的hGH(GH-N)可以在胺基酸位點140修飾，通過使編碼多肽的核苷酸序列突變而導入N-連接糖基化位點，因此不編碼野生型賴氨酸(在表5和圖1中的GH-N多肽序列上的胺基酸140縮寫為「k」，如箭頭所示)，核苷酸序列將在GH-N的胺基酸位點140編碼天冬醯胺(縮寫「n」)(參見圖2)。
表5.人生長激素(GH-N)，來源於垂體；P01242(SEQ ID NO1)fptiplsrlfdnamlrahrlhqlafdtyqefeeayipkeqkysflqnpqtslcfsesiptpsnreetqqksnlellrisllliqswlepvqflrsvfanslvygasdsnvydllkdleegiqtlmgrledgsprtgqifkqtyskfdtnshnddallknygllycfrkdmdkvetflrivqcrsvegscgf ↑
這個突變的垂體來源的hGH，不考慮用於生產該多肽的表達體系，可以被糖基化或糖基綴合化(參見WO 03/31464，此處引入作為參考)。這個突變的垂體來源的hGH優選被糖聚乙二醇化，其中聚乙二醇(PEG)部分與突變的垂體來源的hGH多肽經由糖基鍵連接(參見WO03/31464，此處引入作為參考)。圖3描述了在Sf9昆蟲細胞或哺乳動物細胞中產生的hGH N-連接聚糖突變體的糖聚乙二醇化。突變的垂體來源的hGH的糖聚乙二醇化期望導致改善的生物物理學性質，包括但不限於改善的半衰期，改善的曲線下面積(AUC)值，降低的清除率和降低的免疫原性。
實施例2另外的方法是在垂體來源的hGH多肽中建立O-連接糖基化位點。該O-連接糖基化位點可以用作使用GalNAcT2酶等使突變的hGH多肽糖聚乙二醇化的位點。一個或多個另外的轉移酶可以用於向該位點加入聚糖或糖綴合物。突變的垂體來源的hGH多肽優選被糖聚乙二醇化。圖4描述了在大腸桿菌中產生的hGH O-連接聚糖突變體的糖聚乙二醇化。
實施例3如通過hGH和它的受體的晶體結構所識別的，垂體來源的hGH的蛋白環區域最適於導入糖基化位點的突變(圖5)。具體地，可以向編碼野生型垂體來源的hGH胺基酸序列的胺基酸1-6(FPTIPL；SEQ IDNO10)，胺基酸48-52(PQTSL；SEQ ID NO11)，胺基酸59-64(PTPSNR；SEQ ID NO12)，胺基酸133-139(PRTGQIF；SEQ ID NO13)，胺基酸133-145(PRTGQIFKQTYSK；SEQ ID NO14)，或胺基酸139-142(FKQT；SEQ ID NO15)的核苷酸序列(參見表5和圖1)引入突變，從而向獲得的突變的垂體來源的hGH多肽引入N-連接或O-連接的糖基化位點。
圖6說明了6個導入的O-連接糖基化位點，圖6中的箭頭各自代表在GH-N O-連接聚糖hGH突變體中發生O-連接糖基化的蘇氨酸殘基。
圖7和圖8各自說明二個另外的GH-N O-連接聚糖hGH突變體。
實施例4本實施例描述了向優選含有脯氨酸位點的野生型人生長激素序列或其任何修飾型中導入O-連接糖基化位點的胺基酸序列突變，即絲氨酸或蘇氨酸殘基。
1.氨基末端突變在氨基末端突變體中，野生型hGH的N末端即FP2TIP5LS；SEQ IDNO16被替換為MXnTP2TIP5LS或MAPTSSXnP2TIP5LS。優選的實例包括
MVTPTIPLS；SEQ ID NO17MQTPTIPLS；SEQ ID NO18MAPTSSPTIPLS；SEQ ID NO19MAPTSSSPTIPLS(IL-2N-末端)；SEQ ID NO20MPTTFPTIPLS；SEQ ID NO21MPTSSPTIPLS；SEQ ID NO22MPTSSSPTIPLS；SEQ ID NO232.內部突變位點1在這類突變體中，野生型hGH的N末端即FP2TIP5LS；SEQ ID NO24被替換為ZmP2T XnBoP5LS。優選的突變包括MFPTQIPLS；SEQ ID NO25MFPTSIPLS；SEQ ID NO26MFPTSSPLS；SEQ ID NO27MTPTQIPLS；SEQ ID NO28MFPTTTPLS；SEQ ID NO293.內部突變位點2在這種類型的突變中，用AZmJqP37OrXnBoΔpY替代P37周圍的胺基酸序列，即AYIP37KEQKY；SEQ ID NO30，其中Z，J，O，X和B中的至少一個獨立的選自Thr或Ser，Δ可以包括Lys(K)，而X可以是Asp(D)，優選的實例包括AYIP37TQGAY；SEQ ID NO31AYIP37TSSSY；SEQ ID NO32AQITP37TEQKY；SEQ ID NO33AYIP37TEQSY；SEQ ID NO34
4.內部突變位點3在這種類型的突變中，用LZmJqP48OrXnBoLC替代P48周圍的胺基酸序列，即LQNP48QTSLC；SEQ ID NO35，其中Z，J，O，和X的至少一個獨立的選自Thr或Ser，優選的實例包括LQTP48QTSLC；SEQ ID NO36LQNP48TTSLC；SEQ ID NO375.內部突變位點4在這種類型的突變中，用SZmUsJqP59TPOrXnBoΔrT替代P59周圍的胺基酸序列，即SESIP59TPNREET；SEQ ID NO38，其中Z，J，O，B，Δ，U和X中的至少一個獨立地選自Thr或Ser，B、Δ和Z可以包括帶電荷的胺基酸，優選的實例包括SESTP59TPNREET；SEQ ID NO39SSSTP59TPNREET；SEQ ID NO40SESIP59TPNTEET；SEQ ID NO41SESIP59TPNTQET；SEQ ID NO42SESIP59TPTQGAT；SEQ ID NO43SESIP59TPTESST；SEQ ID NO44SQSTP59TPNREET；SEQ ID NO45SQSTP59TPNQEET；SEQ ID NO46SESTP59TPTSSST；SEQ ID NO476.內部突變位點5在這種類型的突變中，用SZmUsJqP89OrXnBoΔrλtS替代P89周圍的胺基酸序列，即SWLEP89VQFLRS；SEQ ID NO48，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一個獨立地選自Thr或Ser，J和λ可以包括帶電荷的胺基酸，優選的實例包括
SWLEP89TQGLRS；SEQ ID NO49SWLEP89TQGATS；SEQ ID NO50SSQTP89VQFLRS；SEQ ID NO51SWLEP89TSSLSS；SEQ ID NO52SMVTP89VQFLRS；SEQ ID NO537.內部突變位點6在這種類型的突變中，用EZmUsJqP133OrXnBoΔrλtF替代P133周圍的胺基酸序列，即EDGSP133RTGQIF；SEQ ID NO54，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一個獨立地選自Thr或Ser，優選的實例包括EDGSP133TTGQIF；SEQ ID NO55EDGSP133NTGQIF；SEQ ID NO56EDGSP133TQGQIF；SEQ ID NO57EDGSP133TVGQIF；SEQ ID NO58EDGSP133TTTQIF；SEQ ID NO59EDGSP133TSSQIF；SEQ ID NO60EDGSP133TTQGIF；SEQ ID NO61EDGSP133QTGQIF；SEQ ID NO62EDGTP133NTGQIF；SEQ ID NO63EDQTP133NTGQIF；SEQ ID NO648.內部突變位點7在這種類型的突變中，用GZmUsJqΔr140OrXnBoS替代P140周圍的胺基酸序列，即GQIFK140QTYS；SEQ ID NO65，其中Z，U，J，O，B和X中的至少一個獨立地選自Thr或Ser，優選的實例包括GQIFN140QTYS；SEQ ID NO66GQIFN140ITYS；SEQ ID NO67GQIFP140QTSS；SEQ ID NO68GQIFP140TTTS；SEQ ID NO69
GQITP140QTYS；SEQ ID NO70GQIFT140QTYS；SEQ ID NO71GQIST140QTYS；SEQ ID NO72GQIPT140TTYS；SEQ ID NO739.C端突變在這種類型的突變中，用VEGSCG190PXnBoZmUsP替代野生型hGH的C-端胺基酸序列VEGSCG190F；SEQ ID NO74，其中Z，U，B和X中的至少一個獨立地選自Thr或Ser，優選的實例包括VEGSCGPTTTP；SEQ ID NO75VEGSCGPTSSP；SEQ ID NO76VEGSCGPTQGAMP；SEQ ID NO77VEGSCGPTTIP；SEQ ID NO78VEGSCGPMVTP；SEQ ID NO79在上述所有情況下，X、Z、B、Δ、J、U、O和λ獨立地選自E(穀氨酸鹽)，任意的無電荷胺基酸或二肽組合(包括M、F、MF)等等；m、n、o、p、q、r、s和t獨立地選自0到3的整數。在所有的情況下，任意的hGH突變體都可以有或沒有N-末端Met。胺基酸殘基根據起始未改變序列進行編號，其中最左端的殘基編號為1。修飾後未改變的胺基酸的編號保持不變。在本發明的hGH突變體中可以存在多於一個的上述序列修飾。
儘管本發明參考特定的實施方式公開，顯而易見本領域技術人員可以設計出本發明的其它實施方式和變化，而不背離本發明真正的實質和範圍。
本申請引用的所有專利、專利申請和其它公開出版物均整體引入作為參考。
序列表110Neose Technologies，Inc.
DeFrees，Shawn120人生長激素糖基化突變體的製備方法和組合物130040853-01-5101WO150US 60/469,1141512003-05-09150US 60/494,7511512003-08-13150US 60/495,0761512003-08-14150US 60/535,2901512004-01-0816079170PatentIn version 3.22101211191212PRT213智人220
221MISC FEATURE223成熟人生長激素(GH-N)4001Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys PheArg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 1902102211191212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223成熟人生長激素(GH-V)4002Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala Arg Arg Leu Tyr Gln Leu Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Leu Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Val Lys Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Leu Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Arg100 105 110His Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Trp Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Asn Gln Ser Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Lys Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 1902103211191212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體14003Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 1902104211194212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體2(O-連接的N-末端)4004Pro Thr Thr Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala
1 5 10 15Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln20 25 30Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu35 40 45Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro50 55 60Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg65 70 75 80Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu85 90 95Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn100 105 110Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met115 120 125Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln130 135 140Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu145 150 155 160Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val165 170 175Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys180 185 190Gly Phe2105211191212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體34005Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 1902106211193212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體4(O-連接的N-末端)4006Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met1 5 10 15Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln35 40 45Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser50 55 60Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg85 90 95Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val100 105 110Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly
115 120 125Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr130 135 140Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu165 170 175Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly180 185 190Phe2107211193212PRT213智人220
221MISC FEATURE223人生長激素突變體54007Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met1 5 10 15Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln35 40 45Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser50 55 60Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg85 90 95Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val100 105 110Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly115 120 125Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr130 135 140Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys145 150 155 160Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu
165 170 175Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly180 185 190Phe2108211192212PRT213智人220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體64008Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe20 25 30Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn35 40 45Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn50 55 60Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser65 70 75 80Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser85 90 95Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr100 105 110Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg115 120 125Leu Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr130 135 140Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn145 150 155 160Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr165 170 175Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 1902109211192212PRT213智人
220
221MISC_FEATURE223人生長激素突變體74009Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe20 25 30Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn35 40 45Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn50 55 60Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser65 70 75 80Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser85 90 95Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr100 105 110Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg115 120 125Leu Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr130 135 140Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn145 150 155 160Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr165 170 175Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190210102116212PRT213智人40010Phe Pro Thr Ile Pro Leu1 5210112115212PRT213智人40011Pro Gln Thr Ser Leu
1 5210122116212PRT213智人40012Pro Thr Pro Ser Asn Arg1 5210132117212PRT213智人40013Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe1 52101421113212PRT213智人40014Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys1 5 10210152114212PRT213智人40015Phe Lys Gln Thr1210162117212PRT213智人40016Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5210172119212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40017Met Val Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5
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223N-末端突變體40018Met Gln Thr Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 52101921112212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40019Met Ala Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 102102021113212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40020Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 102102121111212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40021Met Pro Thr Thr Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 102102221111212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40022Met Pro Thr Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 1021023
21112212PRT213人工序列220
223N-末端突變體40023Met Pro Thr Ser Ser Ser Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10210242117212PRT213智人40024Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser1 5210252119212PRT213人工序列220
223突變體40025Met Phe Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser1 5210262119212PRT213人工序列220
223突變體40026Met Phe Pro Thr Ser Ile Pro Leu Ser1 5210272119212PRT213人工序列220
223突變體40027Met Phe Pro Thr Ser Ser Pro Leu Ser1 5210282119212PRT213人工序列220
223突變體
40028Met Thr Pro Thr Gln Ile Pro Leu Ser1 5210292119212PRT213人工序列220
223突變體40029Met Phe Pro Thr Thr Thr Pro Leu Ser1 5210302119212PRT213智人40030Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr1 5210312119212PRT213人工序列220
223突變體40031Ala Tyr Ile Pro Thr Gln Gly Ala Tyr1 5210322119212PRT213人工序列220
223突變體40032Ala Tyr Ile Pro Thr Ser Ser Ser Tyr1 52103321110212PRT213人工序列220
223突變體40033Ala Gln Ile Thr Pro Thr Glu Gln Lys Tyr1 5 10
210342119212PRT213人工序列220
223突變體40034Ala Tyr Ile Pro Thr Glu Gln Ser Tyr1 5210352119212PRT213智人40035Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys1 5210362119212PRT213人工序列220
223突變體40036Leu Gln Thr Pro Gln Thr Ser Leu Cys1 5210372119212PRT213人工序列220
223突變體40037Leu Gln Asn Pro Thr Thr Ser Leu Cys1 52103821112212PRT213智人40038Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 102103921112212PRT213人工序列220
223突變體40039Ser Glu Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 102104021112212PRT213人工序列220
223突變體40040Ser Ser Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 102104121112212PRT213人工序列220
223突變體40041Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Thr Glu Glu Thr1 5 102104221112212PRT213人工序列220
223突變體40042Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Asn Thr Gln Glu Thr1 5 102104321112212PRT213人工序列220
223突變體40043Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Thr Gln Gly Ala Thr1 5 102104421112212PRT213人工序列220
223突變體40044
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Thr Glu Ser Ser Thr1 5 102104521112212PRT213人工序列220
223突變體40045Ser Gln Ser Thr Pro Thr Pro Asn Arg Glu Glu Thr1 5 102104621112212PRT213人工序列220
223突變體40046Ser Gln Ser Thr Pro Thr Pro Asn Gln Glu Glu Thr1 5 102104721112212PRT213人工序列220
223突變體40047Ser Glu Ser Thr Pro Thr Pro Thr Ser Ser Ser Thr1 5 102104821111212PRT213智人40048Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 102104921111212PRT213人工序列220
223突變體40049Ser Trp Leu Glu Pro Thr Gln Gly Leu Arg Ser1 5 10
2105021111212PRT213人工序列220
223突變體40050Ser Trp Leu Glu Pro Thr Gln Gly Ala Thr Ser1 5 102105121111212PRT213人工序列220
223突變體40051Ser Ser Gln Thr Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 102105221111212PRT213人工序列220
223突變體40052Ser Trp Leu Glu Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser1 5 102105321111212PRT213人工序列220
223突變體40053Ser Met Val Thr Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser1 5 102105421111212PRT213智人40054Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe1 5 102105521111212PRT213人工序列
220
223突變體40055Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gly Gln Ile Phe1 5 102105621111212PRT213人工序列220
223突變體40056Glu Asp Gly Ser Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 102105721111212PRT213人工序列220
223突變體40057Glu Asp Gly Ser Pro Thr Gln Gly Gln Ile Phe1 5 102105821111212PRT213人工序列220
223突變體40058Glu Asp Gly Ser Pro Thr Val Gly Gln Ile Phe1 5 102105921111212PRT213人工序列220
223突變體40059Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ile Phe1 5 102106021111212PRT213人工序列220
223突變體
40060Glu Asp Gly Ser Pro Thr Ser Ser Gln Ile Phe1 5 102106121111212PRT213人工序列220
223突變體40061Glu Asp Gly Ser Pro Thr Thr Gln Gly Ile Phe1 5 102106221111212PRT213人工序列220
223突變體40062Glu Asp Gly Ser Pro Gln Thr Gly Gln Ile Phe1 5 102106321111212PRT213人工序列220
223突變體40063Glu Asp Gly Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 102106421111212PRT213人工序列220
223突變體40064Glu Asp Gln Thr Pro Asn Thr Gly Gln Ile Phe1 5 10210652119212PRT213智人40065Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser1 5
210662119212PRT213人工序列220
223突變體40066Gly Gln Ile Phe Asn Gln Thr Tyr Ser1 5210672119212PRT213人工序列220
223突變體40067Gly Gln Ile Phe Asn Ile Thr Tyr Ser1 5210682119212PRT213人工序列220
223突變體40068Gly Gln Ile Phe Pro Gln Thr Ser Ser1 5210692119212PRT213人工序列220
223突變體40069Gly Gln Ile Phe Pro Thr Thr Thr Ser1 5210702119212PRT213人工序列220
223突變體40070Gly Gln Ile Thr Pro Gln Thr Tyr Ser1 521071
2119212PRT213人工序列220
223突變體40071Gly Gln Ile Phe Thr Gln Thr Tyr Ser1 5210722119212PRT213人工序列220
223突變體40072Gly Gln Ile Ser Thr Gln Thr Tyr Ser1 5210732119212PRT213人工序列220
223突變體40073Gly Gln Ile Pro Thr Thr Thr Tyr Ser1 5210742117212PRT213智人40074Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 52107521111212PRT213人工序列220
223突變體40075Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Thr Pro1 5 102107621111212PRT213人工序列220
223突變體40076Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Ser Ser Pro1 5 102107721113212PRT213人工序列220
223突變體40077Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro1 5 102107821111212PRT213人工序列220
223突變體40078Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Thr Thr Ile Pro1 5 102107921111212PRT213人工序列220
223突變體40079Val Glu Gly Ser Cys Gly Pro Met Val Thr Pro1 5 10
權利要求
1.一種分離的核酸，含有編碼突變體人生長激素的多核苷酸序列，其中突變體人生長激素包括相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化位點。
2.權利要求1的核酸，其中相應的野生型人生長激素具有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
3.權利要求1的核酸，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
4.權利要求3的核酸，其中脯氨酸殘基位於SEQ ID NO1或SEQID NO2的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
5.權利要求1的核酸，其中突變體人生長激素含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
6.權利要求1的核酸，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
7.含有權利要求1的核酸的表達盒。
8.含有權利要求1的核酸的細胞。
9.一種突變體人生長激素，含有在相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化化位點。
10.權利要求9的突變體人生長激素，其中相應的野生型人生長激素具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
11.權利要求9的突變體人生長激素，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
12.權利要求11的突變體人生長激素，其中脯氨酸殘基位於SEQID NO1或SEQ ID NO2的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
13.權利要求9的突變體人生長激素，含有SEQ ID NO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
14.權利要求9的突變體人生長激素，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
15.權利要求9的突變體人生長激素，含有通過糖基連接子與糖基化位點連接的水溶性聚合物。
16.權利要求15的突變體人生長激素，其中所述的糖基連接子是完整的糖基連接子。
17.權利要求15的突變體人生長激素，其中糖基化位點是突變糖基化位點。
18.一種生產突變體人生長激素的方法，該突變體人生長激素含有在相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化，該方法包括下列步驟(a)重組生產突變體人生長激素；和(b)使該突變體人生長激素在新導入的糖基化位點糖基化。
19.權利要求18的方法，其中相應的野生型人生長激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
20.權利要求18的方法，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
21.權利要求20的方法，其中脯氨酸殘基位於SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
22.權利要求18的方法，其中突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
23.權利要求18的方法，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
24.一種藥物組合物，含有有效量的突變體人生長激素，該突變體人生長激素含有在相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化。
25.權利要求24的組合物，其中相應的野生型人生長激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
26.權利要求24的組合物，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
27.權利要求26的組合物，其中脯氨酸殘基位於SEQ ID NO1或SEQ ID N02的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
28.權利要求24的組合物，其中突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
29.權利要求24的組合物，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
30.一種治療患者中人生長激素缺乏的方法，包括給與患者有效量的突變體人生長激素的步驟，其中該突變體人生長激素包含相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化。
31.權利要求30的方法，其中相應的野生型人生長激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
32.權利要求30的方法，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
33.權利要求32的方法，其中脯氨酸殘基位於SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
34.權利要求30的方法，其中突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
35.權利要求30的方法，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
36.一種生產突變體人生長激素糖綴合物的方法，該突變體人生長激素含有在相應的野生型人生長激素中不存在的新導入的N-連接或O-連接糖基化，該方法包括下列步驟(a)重組生產突變體人生長激素，和(b)用修飾的糖在新導入的糖基化位點使該突變體人生長激素酶促糖基化。
37.權利要求36的方法，其中修飾的糖用選自聚(乙二醇)和m-聚(乙二醇)的成員進行修飾。
38.權利要求36的方法，其中相應的野生型人生長激素具有SEQID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸序列。
39.權利要求36的方法，其中新導入的糖基化位點靠近脯氨酸殘基。
40.權利要求36的方法，其中脯氨酸殘基位於SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的位點2、5、37、48、59、89、113、140或190。
41.權利要求36的方法，其中突變體人生長激素含有SEQ IDNO3、4、5、6、7、8或9的胺基酸序列。
42.權利要求36的方法，其中該突變體人生長激素含有多於一個的新導入的糖基化位點。
全文摘要
本發明涉及一種人生長激素的突變體，該突變體包括新導入的N－連接的或O－連接的糖基化位點，因此這些重組產生的多肽具有與天然存在的人生長激素顯著不同的糖基化模式。另外公開了該突變體的多核苷酸編碼序列、包括該編碼序列的表達盒、表達該突變體的細胞和生產該突變體的方法。此外公開了包括該突變體的藥物組合物和應用該突變體的方法。
文檔編號C12N5/10GK101080238SQ200480016847
公開日2007年11月28日 申請日期2004年5月7日 優先權日2003年5月9日
發明者S·德弗裡斯, H·克勞森 申請人:尼奧斯技術有限公司