喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體及其應用的製作方法
2023-06-29 12:42:21
專利名稱：喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種喜樹鹼及其衍生物的自 乳化藥物前體及其應用。
背景技術：
喜樹鹼(筒稱CPT)及其衍生物作用於拓樸異構酶，是一種潛在的抗 癌藥物。目前，託泊替康和鹽酸伊立替康(7-乙基-10-哌啶子基羰氧基喜 樹鹼，CPT-ll)已經通過FDA批准，同時一些其它衍生物也進入了臨床 前試驗和臨床試驗階段(Hausheer Frederick H, Haridas Kochat. 11 ，7-Substituted camptothecin derivatives and formulations of 11,7-substituted camptothecin derivatives and methods for uses thereof; US5633260 )。但是, 由於CPT及其衍生物在水中的溶解性差，而且其內酯環在血液中易水解， 臨床應用受到糹艮大限制。
藥物緩釋技術是解決CPT及其衍生物水溶性差、在血液中易水解這 些問題的方法之一。通過將CPT及其衍生物包埋在疏水的脂質雙分子層 或高分子微膠嚢中，或將其20-羥基酯化，可以提高其內酯環的穩定性。 申請號為200410022041.7的中國專利中公開了 一種提高喜樹鹼或其衍生 物的脂質體包封率的方法，申請號為200410024795.6的中國專利中公開了 一種羥基喜樹鹼脂質體及其製備方法，均表明製備具有高包埋率的喜樹 鹼或其衍生物的脂質體，能使羥基喜樹鹼不發生在鹼性條件下內酯的開環 反應，從而降低羥基喜樹鹼的毒性，也能使抗癌活性成分結構穩定。
同時，藥物緩釋載體還能增加CPT及其衍生物的水溶性，延長其血 液半衰期，並能通過腫瘤組織的EPR效應提高其在腫瘤部位的聚集，最 終導致更高的藥物療效和更低的機體毒性。 一些藥物緩釋載體已經進入了 臨床試驗，如聚乙二醇喜樹鹼治療局部晚期和轉移性胃癌和胃食管交界處 腺癌已進入臨床二期(Scott LC， Yao JC, III ABB, W A phase-II study of pegylated-camptothecin (pegamotecan) in the treatment of locally advanced and metastatic gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinoma;CancerChemother Pharmacol 2009;63:363-70 )。
但是，現有的這些CPT及其衍生物藥物傳輸體系的載藥能力太低， 在納米載體或脂質體內，CPT及其衍生物的載藥量不超過10。/。，而且載藥 體系不穩定，CPT及其衍生物在血液中的釋放速度太快，導致非靶向藥物 釋放，使得它們的藥物效率低且生物毒性高。在聚合物-CPT及其衍生物 的鍵合物中，只有當CPT及其衍生物量很少時才能保證藥物的水溶性。 例如，分子量為40千道爾頓(Kda)的PEG能攜帶CPT的量僅為0.86% (即一個CPT分子)或者1,76% (即兩個CPT分子)(Greenwald RB， Choe YH， McGuire J, Conover CD; Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates; Adv Drug Delivery Rev 2003;55(2):217-50 )。為了達到一定的 CPT及其衍生物所需要的劑量，現有的CPT及其衍生物的藥物傳輸體系 需要使用大量的載體，但是，反覆使用大劑量的載體給藥會使系統毒性大 大增加。因此，亟需一種載藥量高且系統毒性小的藥物傳輸體系。
發明內容
本發明提供了一種基於喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體，以喜樹 鹼及其衍生物作為疏水部分來合成自乳化藥物前體，即一個或者多個喜樹 鹼或其衍生物分子共價結合到一個或者多個親水的基團或者聚合物短鏈 上，形成含有親水部分和疏水部分的類脂質體(即與脂質體的結構相似) 或類表面活性劑(即與表面活性劑的結構相似)自乳化藥物前體。
一種喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體，是由喜樹鹼分子或喜樹鹼
衍生物分子與親水基團共價結合而成的。
所述的自乳化藥物前體可以由一個喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子 通過其20位的羥基與一個或者多個親水基團共價結合而成；也可以由多 個喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子通過其20位的羥基與一個或者多個親 水基團共價結合而成的。
具體地講，喜樹鹼或者其衍生物通過其20位的羥基與羧酸或酸酐反 應形成羧酸酯，或與取代磷^應形成磷酸酯，或者與引入水溶性的鏈段 或聚合物短鏈段的親水基團反應，來製備得到喜樹鹼及其衍生物的自乳化 藥物前體。
作為優選，所述的自乳化藥物前體可以具有如下結構式其中，R為親水基團，可選用磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2(N,N,N-三甲基乙基磷酸酯基)、磷脂醯絲氨酸基、單糖殘基、多糖殘基、聚乙二 醇鏈段、聚(曱基)丙烯酸鏈段、聚曱基丙烯酸p羥丙酯鏈段、聚乙烯醇 鏈段等中的一種；為了使藥物前體能形成穩定的自乳化納米結構， 一般優 選聚合物短鏈段。上述親水基團具有良好的生物相容性、無毒或低毒，適 於引入到藥物前體中。
Ri為氫、羥基或幾基的衍生物，羥基的衍生物為本領域常用的羥基衍 生物基團，如酯基、醚基等。
喜樹鹼或者其衍生物通過其20位的羥基與引入水溶性的鏈段或聚合 物短鏈段的親水基團反應時，所述的自乳化藥物前體可以具有如下結構 式其中，Ri為氫、羥基或羥基的衍生物；n=3~30。
所述的自乳化藥物前體也可以具有如下結構式:
其中，&為氫、羥基或輕基的衍生物。
所述的自乳化藥物前體在水中能形成納米尺寸膠束或者嚢泡，利用本 領域常用的透析等方法即可得到納米尺寸膠束或者嚢泡。
所述的納米尺寸膠束或者嚢泡可以作為藥物載體，用於負載其它抗癌 藥物如CPT衍生物(7-乙基-10-羥基喜樹鹼，SN-38)、紫杉醇、薑黃素、 甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦參鹼、阿黴素(DOX)等中的一種或多 種，形成攜帶多種藥物的納米藥物。負載藥物的方法可以是通過疏水相互 作用，也可以是本領域常用的其他相互作用，如靜電作用等。
本發明的自乳化藥物前體選用本領域常規的化學合成方法合成即可。
本發明具有如下有益效果
本發明通過在疏水藥物中引入親水基團或在親水藥物中引入疏水基 團製備以藥物分子為結構單元的自乳化藥物前體，該藥物前體具有雙親類 脂質體或類表面活性劑結構，親水部分和疏水部分之間通過特定條件下可 斷裂的化學鍵連接，從而可在特定條件下釋放藥物分子。例如，酯鍵可在 細胞內溶酶體的酸性pH下水解，也可在細胞中被酯分解酶降解。
本發明的自乳化藥物前體同時具有兩種功能 一、自乳化藥物前體自 身可作為一種前體藥物， 一旦進入癌細胞，在細胞內酶的作用下導致CPT及其衍生物的快速釋放，且載藥量高(CPT的負載量一般可超過50%(重 量百分比))、藥物輸送能力好、血液半衰期較長、生物相容性和生物可降 解性較好、生物利用度高、毒性低，可以明顯提高藥物的藥學作用。二、 該自乳化藥物前體能在水溶液中通過自乳化形成納米尺寸的膠束或者嚢 泡(見圖1)，這種納米尺寸的膠束或者嚢泡可通過腫瘤組織的超通透和蓄 積作用(EPR effect)而有效地在腫瘤組織中積累，而使藥物耙向腫瘤組 織。三、該納米膠束或者嚢泡可以作為其他抗癌藥物如CPT衍生物(7-乙基-10-羥基喜樹鹼，SN-38)、紫杉醇、薑黃素、曱氨蝶呤、伊立替康、 丹酚酸、苦參^ 鹹、阿黴素等的載體，從而達到兩種或兩種以上抗癌藥物協 同治療的目的。
本發明的自乳化藥物前體的製備方法操作簡單，採用本領域常規的合 成方法即可。
圖1為本發明自乳化藥物前體形成納米膠束或嚢泡的示意圖2為應用例1中製備的PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒的動態光散射
圖3為實施例1製備的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子 CPT對SKOV-3卵巢癌細胞的毒性效果圖4為實施例1製備的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子 CPT對MCF-7乳腺癌細胞的毒性效果圖5為沒有經過治療的SKOV-3卵巢癌細胞分布圖6為經濃度為0.5ng/ml實施例1製備的PEG-diCPT治療的SKOV-3 卵巢癌細胞凋亡的實驗結果；
圖7為經濃度為2fig/ml實施例1製備的PEG-diCPT治療的SKOV-3 卵巢癌細胞凋亡的實驗結果；
圖8為實施例1製備的PEG-diCPT負載抗癌藥物DOX後對MCF乳 腺癌細胞的毒性效果圖9為實施例1製備的PEG-diCPT對SKOV-3人卵巢癌細胞荷瘤棵 鼠腫瘤的抑制作用效果圖。
具體實施例方式
實施例1 一個PEG連接兩個CPT的自乳化藥物前體(PEG-diCPT)的合 成
(1) PEG-SH的合成
將4.54g( 10mmol)聚(乙二醇)曱醚丙烯酸酯(PEGMEA)溶解於20mL 乾燥的二氯甲烷中，加入1.92g (2mmo1)質量百分濃度為98%的1，2-巰基 乙醇，以O.lmL (0.72mmo1)三乙胺作為催化劑，室溫下攪4半反應24h。 反應結束後將反應物用水透析除去小分子和有機溶劑，水相用二氯曱烷洗 滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥後真空乾燥，得到4.61g產物PEG-SH,產 率為83.64%。 PEG-SH的結構式如下
其中，n=3~30。 (2 )末端帶二酸的PEG的合成
將2.2g ( 4mmo1) PEG-SH和0.52g (4.5mmol)富馬酸溶於5mL乾燥 的N,N-二曱基曱醯胺(DMF)中，以O.OlmL ( 0.36mmol)三乙胺作為催 化劑，7(TC反應12h後，將反應物透析除去未反應的富馬酸、三乙胺和 DMF，經真空乾燥得到2.1g末端帶二酸的PEG,產率為77%。末端帶二 酸的PEG的結構式如下
其中，n=3~30。
(3 )末端帶二醯氯的PEG的合成 取1.32g ( 2mmo1)末端帶二酸的PEG溶於5mL乾燥的二氯甲烷中， 加入0.47g (4mmo1)亞碌u醯二氯和一滴DMF作為催4t劑，室溫下反應過 夜，真空除去溶劑和亞闢b醯二氯，得到1.27 g末端帶二醯氯的PEG,產率 91%。末端帶二醯氯的PEG的結構式如下
9formula see original document page 10
其中，n=3~30。 (4) PEG-diCPT的合成
將87mg ( 0.25mmol) CPT懸浮於5mL乾燥的氯仿並冷卻到0°C 。將 70mg (O.lmmol)末端帶二醯氯的PEG和16mg ( 0.2mmol)吡咬溶於2mL 乾燥的氯仿中並逐滴加入到含CPT的氯仿溶液中，混合溶液於室溫下攪 拌反應24h。將反應物過濾除去未反應的CPT，再用無水乙醚沉澱，經真 空乾燥得到產物PEG-diCPT 98mg，產率71%，該類脂質體自乳化藥物前 體PEG-diCPT中CPT的攜帶量為50% (重量百分比)。PEG-diCPT的結 構式如下
其中，n=3~30。
實施例2 基於聚丙烯酸短鏈的自乳化藥物前體的合成
(1 )取1 g (2.87 mmol)CPT和0.34 g(3.44 mmol)丁二酸酐溶於5 mL DMSO中，加熱至60°C,反應6小時，反應結束後，將反應溶液倒入50 mL 丙酮中沉澱，通過過濾收集固體產物，乾燥後4尋到1.09 g產物I ，產率為 85%。
產物I的結構式如下formula see original document page 11
(2)將0.5g ( l.llmmol)上述產物I和0,154 g ( 1.34 mmol) N-羥 基琥珀醯亞胺溶於在DMSO中，加入0.276 g ( 1.34 mmol) N，N' -二環己 基碳二亞胺(DCC )和0.163 g (1.34 mmol)4-二曱氨基必定(DMAP，反應 過夜，過濾除去副產物。濾液在乙醚中沉澱，得到0.56g產物I1，產率為 89%。產物II的結構式如下
formula see original document page 11
(3)將0.5g(0.89 mmol)上述產物II和與氨基封端的聚丙烯酸0.5 g(0.89mmol)在DMSO中室溫下反應3小時，然後將反應液倒入丙酮中沉 澱，得到0.9g基於聚丙烯酸短鏈的自乳化藥物前體(即產物III ),產率為 90%。產物III的結構式如下formula see original document page 11
其中，n=2~20。 上述反應的合成路線如下所示其中，n=2~20。
實施例3葡萄糖CPT自乳化藥物前體的合成。
(1) 取lg (5.12mrno1)葡萄酸和3.7g (61.6mmol)乙二胺溶於 10 mL水中，加入0.99 g ( 5.12 mmol) l-乙基-(3-二曱基氨基丙基)-碳二 亞胺(EDC)催化反應12小時，反應結束後，將反應溶液倒入100 mL丙 酮中沉澱，通過過濾收集固體產物，乾燥後，得到1.11 g產物IV，產率為 85%。
(2 )將0.3 g ( 1.17 mmol)上述產物IV、 0.66 g ( 1.17 mmol)實施例 2第二步中的產物II與10mlDMSO混合，反應3 h，反應結束後將反應液 倒入丙酮中沉澱，過濾收集固體產物V。
12Ol OH
ohonh 0
產物v
應用例1PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒的製備
將5mg實施例1製備的PEG-diCPT溶解於lmL 二曱基亞碸 (DMSO),並在室溫下攪拌lh製成溶液，在攪拌狀態下將上述溶液逐 滴加入到5mL pH7.4的PBS緩衝液或水中，透析除去DMSO，得到 PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒。
應用例2PEG-diCPT脂質體載藥體系的製備
將0.5mg DOX和2.5mg實施例1製備的PEG-diCPT溶於lmL DMSO
中，並於黑暗條件下攪拌2h製成溶液，再將該溶液逐滴加入到5mL去離 子水中，黑暗條件下攪拌過夜，用去離子水透析除去DMSO和過量的 DOX，即製得PEG-diCPT脂質體載藥體系。
以實施例1製備的自乳化藥物前體PEG-diCPT為例進行檢測，檢測 方法均採用本領域的常規方法。
自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT在水中形成平均尺寸為132 nm的納 米顆粒，其動態光散射圖如圖2所示。
將自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子CPT進4亍體外抗肺瘤效果的對比實驗，其體外抗腫瘤效果分別如圖3和圖4所示。從圖3和圖4 中可以看出，PEG-diCPT與CPT具有相同的細胞毒性，PEG-diCPT對 SKOV-3卵巢癌細胞的半致死量為0.1微克/毫升，對MCF-7乳腺癌細胞的 半致死量為0.8微克/毫升，這一結果表明，自乳化CPT前體藥物 PEG-diCPT可以用來做為抗癌藥物。
考察不同劑量的自乳化CPT前體藥物PEG-diCPT引起SKOV-3卵 巢癌細胞凋亡的情況，並採用未經過任何治療的SKOV-3卵巢癌細胞作為 對照組，實驗結果如圖5、圖6和圖7所示。經過72h的治療，SKOV-3卵 巢癌細胞細胞核的形狀發現明顯的變化，如圖6和圖7所示；另外，與未 使用藥物治療的對照組相比(圖5),經PEG-diCPT治療後的SKOV-3卵 巢癌細胞的數量大大減少，表明自乳化CPT前體藥物PEG-diCPT能引起 癌細胞的明顯凋亡。
負載抗癌藥物DOX的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對MCF乳腺 癌細胞的細胞毒性實驗結果(如圖8所示)表明負載抗癌藥物DOX的 自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對MCF乳腺癌細胞，具有比單純的CPT 和DOX更高的細月包毒性。
考察自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對SKOV-3人卵巢癌細胞荷瘤 棵鼠腫瘤的抑制作用，BALB/c-nu/nu棵鼠腹腔移植腫瘤細胞4星期後尾 靜脈注射O.lmL含PEG-diCPT的磷酸鹽緩沖溶液(PBS ),其等同CPT-劑量為lmg/mL溶液，並用尾靜脈注射O.lmL磷酸鹽緩衝溶液的 BALB/c-nu/nu棵鼠作為對照；48小時後處死棵鼠，分離所有的腫瘤後得 到每隻棵鼠的平均腫瘤的總溼重，實驗結果如圖9所示。
權利要求
1、一種喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體，是由喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子與親水基團共價結合而成的。
2、 如權利要求1所述的自乳化藥物前體，其特徵在於所述的自乳 化藥物前體是由一個喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子通過其20位的羥基 與一個或多個親水基團共價結合而成的。
3、 如權利要求1所述的自乳化藥物前體，其特徵在於所述的自乳 化藥物前體是由多個喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子通過其20位的羥基 與一個或者多個親水基團共價結合而成的。
4、 如權利要求1所述的自乳化藥物前體，其特徵在於具有如下結 構式0— .其中，R為親水基團；R,為氫、羥基或羥基的衍生物。
5、 如權利要求2所述的自乳化藥物前體，其特徵在於所述的R為 磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2 (N,N,N-三曱基乙基磷酸酯基)、磷脂醯 絲氨酸基、單糖殘基、多糖殘基、聚乙二醇鏈段、聚丙烯酸鏈段、聚曱基 丙烯酸鏈段、聚曱基丙烯酸p羥丙酯鏈段或聚乙烯醇鏈段。
6、 如權利要求1所述的自乳化藥物前體，其特徵在於具有如下結構式:formula see original document page 3其中，&為氫、羥基或羥基的衍生物；n=3~30。
7、如權利要求1所述的自乳化藥物前體，其特徵在於具有如下結 構式
8.其中，R!為氫、羥基或羥基的衍生物。
9、 一種用如權利要求1 ~ 8任一所述的自乳化藥物前體製備的納米尺 寸膠束或者嚢泡。
10、 如權利要求9所述的納米尺寸膠束或者嚢泡在作為藥物載體中的 應用。
全文摘要
本發明公開了一種喜樹鹼及其衍生物的自乳化藥物前體，其是由藥物分子與親水基團共價結合而成的；其中，所述的藥物分子為喜樹鹼分子或喜樹鹼衍生物分子，該前體的攜藥量可高達50％以上。本發明還公開了該自乳化藥物前體的應用，其在水中能形成納米尺寸膠束或者囊泡，可以作為藥物載體，用於負載其它抗癌藥物如CPT衍生物、紫杉醇、薑黃素、甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦參鹼、阿黴素等中的一種或多種，形成攜帶多種藥物的納米藥物，實現了藥物的協同治療。
文檔編號C07F9/00GK101628919SQ20091010214
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月20日 優先權日2009年8月20日
發明者唐建斌, 徐春紅, 申有青, 隋梅花 申請人:浙江大學