當歸、紅芪超濾膜提取物用於抗輻射的應用的製作方法

2023-06-15 01:25:31

專利名稱：：當歸、紅芪超濾膜提取物用於抗輻射的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種當歸、紅芪超濾膜提取物及其用於抗輻射的應用。
背景技術：
：隨著國民經濟的發展和人民生活水平的提高，輻射與人們的工作和生活越來越密切，由於臨床上對癌症患者進行放療、化療的的廣泛開展，以及由於核能和核技術在農業生產、醫療衛生、科學研究及國防裝備中的大量應用，職業性受照人員的輻射性損害日益得到重視，受輻射的人員越來越多，損害越來越嚴重。然而目前已知的一些具有輻射防護作用的藥物，多數毒性比較大，所以人們從天然的藥物入手以期待開發毒性小、適用於臨床的防治放射損傷的藥物。中國傳統中草藥及一些有效組分已成為研究的熱點，並且取得了較大進展。中藥抗輻射方面的研究目前主要在單味補氣補血藥的層面上，比如人參、黃芪、當歸、枸杞等藥材均有抗輻射作用的研究報導。國外研究報導，在體、離體實驗結果均顯示，人參具有抗輻射作用。中藥複方製劑的研究主要是基於經典複方或自行組方，比如四物湯，六味地黃丸等。我們用於實驗的組方是在傳統組方當歸補血湯的基礎上改良而成，即為當歸、紅芪(15)超濾膜提取物，經動物實驗證明具有抗輻射作用。
發明內容本發明是在研究古方的基礎上，發揮中藥成分豐富、毒性低等優點，經篩選和系統試驗研究，提供一種當歸、紅芪超濾膜提取物。本發明的另一目的在於提供當歸、紅芪超濾膜提取物的方法。本發明的再一目的在於當歸、紅芪超濾膜提取物用於防輻射危害保護的應用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現一種當歸、紅芪超濾膜提取物，其特徵是當歸與紅芪組份比例為1566。當歸、紅芪超濾膜提取物的方法，其步驟是取當歸紅芪飲片按一定比例加水煎煮二次，第一次加當歸和紅芪飲片質量6倍量水煎煮2h，第二次加當歸和紅芪飲片質量4倍量水煎煮lh，合併兩次煎液靜置過夜，過濾煎液，得濾液；濾液再經超濾膜超濾，超濾壓力<0.4Mpa，溫度<40°C，超濾液經噴霧乾燥，製成乾粉。上述的超濾膜為10-2萬分子量超濾膜，膜材料為聚醚碸(PES)，10萬分子量膜孔徑為0.05μm，5萬分子量超濾膜孔徑為0.25μm，2萬分子量超濾膜孔徑為0.01μm。當歸、紅芪超濾膜提取物理化性質1.本品為淡黃色粉末，易溶於水，不溶於乙醇，甲醇。易吸潮，PH值5-6。本品水溶液在365nm紫外燈下顯紫色。2.本品水溶液加入10%的α-萘酚乙醇溶液3滴，搖勻後將試管傾斜，沿試管壁加入濃硫酸出現紫紅色環。本發明的優點和產生的有益效果1、本發明旨在發揮當歸具有補血活血，調經止痛，潤腸通便功能和紅芪補氣固表，利尿託毒，排膿，斂瘡生肌功能及兩味中藥毒性低等優點，並從化學與藥理學指標為切入點來研究當歸補血湯配伍比例及其效用，組成小複方，其功效主要為補血以及提高機體免疫功能，解決機體接受輻照後機體免疫力下降以及血象偏低的問題。2、將該複方採用超濾膜分離技術進行提取分離，最大程度的保留了多糖等有效組分，祛除了其他無用成分，提高了原藥物的生物利用度，最大限度的保留了原方的療效。3、本發明超濾膜提取物在提取有效部位的基礎上，採用現代製劑技術製備成膠囊齊U，為使用者服用提供方便，。4、當歸、紅芪為我省的大宗道地藥材，資源豐富，質量優質，本發明動物實驗研究表明，當歸、紅芪超濾膜提取物對輻射具有確切的保護功能，將該藥製備成對輻射具有保護功能的保健品，能夠促成我省中藥材資源優勢向經濟優勢轉化。具體實施例方式下面結合實施例，對本發明技術方案再作進一步的說明實施例1本發明採用的中藥材來自甘肅省岷縣，當歸購自岷縣生產基地、紅芪均購自岷縣藥材站。取當歸紅芪飲片按15的比例加水煎煮二次，第一次加當歸紅芪飲片質量6倍量水煎煮2h，第二次加當歸紅芪飲片質量4倍量水煎煮lh，合併兩次煎液靜置過夜，過濾煎液，得濾液；濾液再經10萬分子量(截留分子量為10萬)超濾膜——聚醚碸(PES)膜超濾，超濾壓力為0.3Mpa，溫度為35°C，超濾液經噴霧乾燥，製成乾粉。實施例2為了表明本發明對防輻射危害保護的效果，本發明對動物進行了外周血白細胞計數實驗、骨髓細胞DNA含量測定實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性實驗、血清溶血素實驗。1.實驗材料1.1動物KM小鼠，SPF級，雄性，體重20士2g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，質量合格證號SCXK(甘)2004-0006，實驗設施使用證號SYXK(甘)2004-0006。動物分籠飼養，食固體飼料，飼料由北京科澳協力實驗動物飼料有限公司提供，食水自由，室溫2025°C，相對溼度45%52%。1.2藥物及配製當歸紅芪超濾膜提取物分別為當歸紅芪(15)超濾膜提取物組、當歸紅芪(24)超濾膜提取物組、當歸紅芪(33)超濾膜提取物組，每克生藥合提取物乾燥粉0.109g(0.109g/g)，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供，當歸補血湯成人每日用量36g生藥，成人體重按60kg計算，則人的一日用量為0.6g生藥/kg(0.0656g藥粉/kg)。按照人與動物臨床公斤體重劑量倍數直接換算法，取小鼠的等效劑量為人體推薦量的5倍(3g生藥/kg，0.328藥粉/kg)作為小劑量，10倍(6g/kg，0.656藥粉/kg)作為中劑量，20倍(12g/kg,1.312藥粉/kg)作為大劑量，灌胃的給藥的量為0.2ml/10gbwo1.3主要儀器及試劑全自動血球計數儀(美國雅培，型號⑶1200)；醫用直線加速器(北京醫療器械研究所，型號BD-6M)；流式細胞儀(美國Couter，型號EPICSXL)；電子天平(北京Sartorius，型號BL121SS)；雙目光學顯微鏡(日本，Olympus公司)；圖像分析系統(北京偉力新世紀發展有限公司，型號WL-9000)；離心沉澱機(上海醫用分析儀器產品)；紫外分光光度計(日本島京，型號UV-2401PC)。溶血素(美國雅培CD1200，批號6260312)；稀釋液(三和醫療設備有限公司，批號0612001)；甲醇(天津市德恩化學試劑有限公司，批號20070712)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號071005)；Giemsa染液(pH6.8PBS配製，由甘肅中醫學院基礎部生物實驗室提供)；SOD試劑盒；Hank's液(北京鼎國生物技術有限責任公司，批號87P00138)；戊巴比妥鈉(中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號20030816)；EDTA-K2抗凝劑(天津市科密歐化學試劑開發中心，批號20080218)2.實驗方法2.1模型製備採用醫用直線加速器(北京醫療器械研究所，型號BD-6M)低能X射線一次性全身照射小鼠製造模型，皮源距100cm，其中外周血白細胞計數實驗、骨髓細胞DNA含量測定實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗，設定輻射劑量為5.0Gy/min;血中超氧化物歧化酶(SOD)活性實驗設定輻射劑量為8.OGy/min；血清溶血素實驗設定輻射劑量為3.OGy/min。2.2動物分組2.21外周血白細胞計數實驗隨機分為四組，15隻/組，分別為模型組、模型組+當歸紅芪(15)組、模型組+當歸紅芪(24)組、模型組+當歸紅芪(33)組(不設空白組，將每組輻射前的指標作為空白對照)。2.22骨髓細胞DNA含量測定實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性實驗、血清溶血素實驗均隨機分為五組，15隻/組，模型組+當歸紅芪(15)組、模型組+當歸紅芪(24)組、模型組+當歸紅芪(33)組空白組只給生理鹽水，模型組只造模不給藥，藥物組每天灌服相應劑量藥物，具體給藥時間見具體實驗方法。2.3實驗結果統計方法計量資料，採用方差分析，方差分析之前按照方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求後，用轉換後的數據進行統計；若變量轉換後仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。對於計數資料，採用X2檢驗。2.4實驗步驟及結果2.4.1外周白細胞計數(包括體重變化、相關臟器指數及病理學損害)除模型組只造模不給藥外，其它給藥組連續灌胃給藥30天，照射後繼續口服灌胃至第45天。分別於照射前、照射後第3天、第7天及第14天四次採末梢血20μL，加入稀釋液(三和醫療設備有限公司，批號0612001)至40ul，用全自動血球分析儀(美國雅培，型號CD1200)檢測血常規，最後一天稱重後頸椎脫白處死小白鼠，取脾臟、胸腺進行稱重並計算臟器指數，實驗結果見表1和表2。表1對直線加速器低能X射線照射小鼠白細胞的影響G^STOtableseeoriginaldocumentpage6注與模型組比較呼<0.05^籲<0.01錢籲<0.001表2對直線加速器低能χ射線照射小鼠肝臟、胸腺及脾臟指數的影響(士smtableseeoriginaldocumentpage6注與模型組比較^P<0.05^籲<0.01錢籲<0.OOl從表1可以看出照射後第3d、第7d、第14d，輻射模型對照組的白細胞計數與照射前比較，差異均有統計學意義(p<0.001)，說明輻射損傷模型成立。照射後第3d，第7d，第14當歸紅芪各比例組白細胞計數明顯高於輻射模型對照組，其中當歸紅芪(15)組與模型組比較，統計學意義顯著(P<0.001)；第7d,第14d當歸紅芪(24)組與模型組比較也具有顯著向差異；第7d，第14d，33與空白組比較也具有統計學意義(P<0.05)。在輻照後第7天及第14d受試物各比例組小鼠外周血白細胞的數量與輻照後第3d比較有增高趨勢，提示受試物對輻射引發的外周血白細胞減少有防護作用，並能促進其數量恢復。表2結果表明，輻照後小鼠的脾臟和胸腺指數較空白組均下降(P<0.001)，其中當歸紅芪(15)組能夠較為顯著的提高兩臟器的指數，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。2.4.2對骨髓細胞DNA含量的影響除模型組只造模不給藥，空白組給與生理鹽水外，其它給藥組連續灌胃給藥30天，照射後繼續口服灌胃至第33天，在照射後第3天即第33天給藥後約2h，頸椎脫白處死小白鼠，剝離出股骨，用ImL注射器(5號針頭)吸取一定體積的Hank’s液(北京鼎國生物技術有限責任公司，批號87P00138)，衝出股骨中的全部骨髓細胞；最後，讓細胞懸液通過4號針頭的注射器，使細胞在懸液中充分分散。用流式細胞儀(美國Couter，型號EPICSXL)檢測DNA含量(碘化吡啶法)，結果見表3。表3對直線加速器低能X射線照射小鼠骨髓細胞DNA含量的影響(χ±SD)tableseeoriginaldocumentpage7注與模型組比較呼<0.05^籲<0.01錢籲<0.001；從表3得知輻照後小鼠骨髓細胞DNA含量較空白組均下降(P<0.001)，其中當歸紅芪(15)能夠較為顯著的提高其含量，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。2.4.3小鼠骨髓細胞微核數的影響除模型組只造模不給藥，空白組給與生理鹽水外，其它給藥組連續灌胃給藥30天，照射後繼續口服灌胃至第33天，在照射後第3天即第33天給藥後約2h，頸椎脫白處死小白鼠，取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規塗片。或用小牛血清衝洗股骨骨髓腔製成細胞懸液塗片，塗片自然乾燥後，放入甲醇(天津市德恩化學試劑有限公司，批號=20070712)中固定5-lOmin，放入Giemsa應用液中(Giemsa染液，pH6.8PBS配製，由甘肅中醫學院基礎部生物實驗室提供)，染色10-15min，立即用磷酸鹽緩衝液或蒸餾水衝洗，晾乾。鏡檢，每隻動物計數1000個嗜多染紅細胞中微核細胞數，並計算微核率，結果見表4。表4對直線加速器低能X射線照射小鼠骨髓有核細胞計數的影響(n=l5,χ土SD)tableseeoriginaldocumentpage7注與模型組比較^<0.05@Ρ<0.01@籲<0.001；從表4可以看出照射後第3天，小鼠骨髓有核細胞數明顯增加(Ρ<0.001)，其中當歸紅芪(15)組、當歸紅芪(24)組、當歸紅芪(33)組均能對抗該效應，與模型組比較均具有統計學意義((P<0.001，P<0.01，P<0.01)。2.4.4對中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響除模型組只造模不給藥，空白組給與生理鹽水外，其它給藥組連續灌胃給藥30天，照射後繼續口服灌胃至第37天，在照射後第7天，用紫外分光光度計(日本島京，型號UV-2401PC)進行SOD檢測，結果見表5。表5對直線加速器低能X射線照射小鼠血清中SOD的影響(；土Smtableseeoriginaldocumentpage8注與模型組比較^P<0.05^籲<0.01錢籲<0.001；從表5可以看出照射後第7天，小鼠血清中SOD含量明顯下降(P<0.001)，其中當歸紅芪(15)組、當歸紅芪(24)組均能對抗該效應，與模型組比較均具有統計學意義((P<0.01，P<0.05)。2.4.5對血清溶血素的影響(血凝法)除模型組只造模不給藥，空白組給與生理鹽水外，其它給藥組連續灌胃給藥30天，照射後繼續口服灌胃至第45天，在照射後第15天，進行血清溶血素的測定。免疫動物及血清分離取羊血，免疫動物及血清分離取羊血紅細胞(SRBC)，用生理鹽水洗滌3次，每次離心2000r/min共lOmin。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%(ν/ν)的細胞懸液，每隻鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。5天後，摘除眼球取血於離心管內，放置約lh，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心lOmin，收集血清。凝集反應用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置於微量血凝實驗板內，每孔100μL，再加入IOOyL0.5%(ν/ν)的SRBC懸液，混勻，裝入溼潤的平盤內加蓋，於37°C溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度一般分為5級(O-IV)記錄，按下式計算抗體積數，抗體水平=(S1+2S2+3S3......nSn)式中1、2、3……η代表對倍稀釋的指數，S代表凝集程度的級別，抗體積數越大，表示血清抗體越高。O級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成緻密的圓點狀，四周液體清皙。I級紅細胞大部分沉集在孔底成園點狀，四周有少量凝集的紅細胞。II級凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏鬆的紅點。III級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。IV級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。實驗結果見表6.表6對直線加速器低能χ射線照射小鼠血清溶血素的影響(；士smtableseeoriginaldocumentpage9注與模型組比較^P<0.05^籲<0.01錢籲<0.001；與空白組比較0P<0.0500P<0.Ol000P<0.001.從表6可以看出照射後第15天，小鼠血清溶血素抗體水平明顯下降(Ρ<0.01)，其中當歸紅芪(15)組、當歸紅芪(24)組、當歸紅芪(33)組均能對抗該效應，與模型組比較均具有統計學意義((P<0.0001)。綜上所述，機體受到輻射後，射線會直接作用於骨髓造血幹細胞，導致骨髓幼稚造血細胞受損，細胞增殖分裂能力下降，外周血中成熟細胞再生來源中斷。外周血白細胞壽命短，更新快，如果髓造血功能受到抑制，成熟白細胞不能及時得到更新，則白細胞數量迅速下降。因此，白細胞是反映輻射損傷的最直接、最經典的指標。資料表明，輻照後白細胞數的變化有明顯的時相性，表現為初期下降時相和暫時回升時相相等。小鼠輻照後初期下降致最低值的時間是發生在輻照後313d，暫時性回升時相的開始時間是14d。本實驗選定了輻照後第3d、第7天及第14d三個時間點，觀察受試物對輻照後小鼠血液系統的影響。在輻照後第3d觀察到輻射對小鼠外周血白細胞產生了顯著影響，白細胞數量大量地減少，說明輻照對小鼠機體造成了一定的損傷。在輻照後第7天及第14d受試物低、中、高劑量組小鼠外周血白細胞的數量與輻照後第3d比較有增高趨勢，提示受試物對輻射引發的外周血白細胞減少有防護作用，並能促進其數量恢復。電離輻射作用於機體後，可直接作用於DNA、蛋白質及酶類，引起電離和化學鍵斷裂，使分子變性和細胞結構破壞，發生微核變化；輻射誘發大量的自由基，導致全身的過氧化反應。超氧化物歧化酶SOD是防禦機體由於氧代謝接受電子不足形成的超氧自由基損害的主要防禦性酶，與機體的衰老、腫瘤、炎症、免疫性疾病、心血管疾病以及輻射的防護有關。SOD對氧化與抗氧化之間的平衡有非常重要的作用，能清除過氧化陰離子，在輻射傷害中保護細胞。SOD的活力間接影響清除自由基的能力，所以可以作為抗輻射損傷的一個客觀生化指標。本實驗說明了受試物能增強輻射後小鼠機體的超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而也驗證了當歸、紅芪提取物能修復輻射對抗氧化系統的損傷。輻射會使機體發生複雜的反應，從而在體內產生大量的內源性自由基，引起過氧化反應，對機體的免疫系統會造成一定的損傷。體液免疫由B淋巴細胞產生的抗體介導，夕卜來抗原進入機體後，在外周淋巴組織(脾臟、淋巴結等)中與特異性B淋巴細胞上的膜受體(mLg)結合，從而開始B淋巴細胞活化，刺激不同類型的抗體產生。SRBC進入機體後與B細胞表面受體結合，活化的B淋巴細胞進一步分化並分泌抗SRBC抗體，即溶血素。所以血清溶血素的含量反映了B淋巴細胞產生抗體的能力，也可作為綜合反映和評價機體免疫功能的客觀指標，進而成為抗輻射損傷的生化指標。本實驗證明當歸紅芪超濾膜提取物對免疫系統損傷有保護作用。紅芪超濾膜提取物可以通過有效地維持和提高機體免疫器官受到輻射損傷後的功能，從而提高機體抗輻射的能力。所以當歸紅芪超濾膜提取物抗輻射作用機制之一可能與其增強免疫器官功能有關。3.結果判定以上外周血白細胞、脾臟與胸腺指數、股骨骨髓細胞DNA含量、骨髓細胞微核數、血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清溶血素影響的五項實驗中，任何兩項實驗結果為陽性，可判定該提取物對輻射危害具有輔助保護功能。在血液系統、抗氧化系統和免疫系統等幾個方面的實數據均顯示出當歸紅芪(15)超濾膜提取物對輻照後小鼠的輻射損傷有一定防護和恢復作用。權利要求一種當歸、紅芪超濾膜提取物，其特徵是當歸與紅芪重量比為1∶5～6∶6。2.由權利要求1所述的一種當歸、紅芪超濾膜提取物的方法，其步驟是取當歸紅芪飲片按一定比例加水煎煮二次，第一次加當歸和紅芪飲片重量6倍量水煎煮2h，第二次加當歸和紅芪飲片質重量4倍量水煎煮lh，合併兩次煎液靜置過夜，過濾煎液，得濾液；濾液再經超濾膜超濾，超濾壓力≤0.4Mpa，溫度≤40°C，超濾液經噴霧乾燥，製成乾粉。3.根據權利要2所述的一種當歸、紅芪超濾膜提取物的方法，其特徵是上述的超濾膜為10-2萬分子量超濾膜，膜材料為聚醚碸(PES)，10萬分子量膜孔徑為0.05μm，5萬分子量超濾膜孔徑為0.25μm，2萬分子量超濾膜孔徑為0.01μm。4.權利要求1所述的一種當歸、紅芪超濾膜提取物用於防輻射危害保護的應用。全文摘要本發明涉及當歸、紅芪超濾膜提取物用於防輻射危害保護的應用。取當歸紅芪飲片按重量1∶5～6∶6的比例，分別6倍量水煎煮2h，4倍量水煎煮1h，煎煮二次後，合併煎液靜置，過濾，得濾液。濾液再經2～10萬分子量超濾，超濾液經噴霧乾燥，製成乾粉。本發明採用醫用直線加速器低能X射線一次性全身照射小鼠製造模型，並於照射前後分別灌胃給予當歸、紅芪超濾膜提取物水溶液，通過分析外周血白細胞、脾臟與胸腺指數、股骨骨髓細胞DNA含量、骨髓細胞微核數、血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清溶血素等指標的變化，表明當歸、紅芪超濾膜提取物具有對輻射危害的保護功能。文檔編號A61K36/48GK101822709SQ20091002150公開日2010年9月8日申請日期2009年3月6日優先權日2009年3月6日發明者李應東申請人:甘肅中醫學院