一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因tnhx1及其抗鹽應用的製作方法

2023-05-20 16:22:21 1

專利名稱：一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因tnhx1及其抗鹽應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說涉及一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因及其應用。
背景技術：
土壤鹽漬化是當今全世界普遍關注的熱點之一。全球大約有1/3的土地存在著不同程度的鹽漬化，我國鹽漬地大約有250多萬公頃。隨著社會發展和人類不斷繁衍，對糧食作物的需求越來越多；如何合理使用這些鹽漬地，將它們變廢為寶，在它們上面種上各種糧食作物來滿足人們的生存需要，這是一個造福人類的重大研究。
土壤中的鹽分含量過高時會對植物產生鹽脅迫，危害植物的正常生長和發育，主要表現在二個方面其一，土壤中較高的溶質濃度導致的水分虧缺；其二，植物吸收水分的同時吸收了過多的鹽離子所帶來的離子毒害，特別是Na+毒害。鹽生植物雖然能適應高鹽環境，但是其胞質內的酶並不能適應高Na+水平，而表現出與甜土植物酶同樣的Na+敏感性，因此，外界Na+濃度升高時，植物反應的最終結果就是保持胞質內較低的Na+濃度。
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區隔化。Na+吸收是一個複雜的過程。Na+的外排和區隔化是間接的主動運輸過程，主要由鈉氫泵蛋白(Na+/H+antiporter)來調節。雖然鈉氫泵蛋白是在生物界普遍存在的負責Na+/H+交換的一種跨膜運輸蛋白，但在植物中扮演著重要的角色細胞內過多的Na+從質膜向細胞外排放和Na+在液泡中的區域化分別是由位於質膜和液泡膜上的鈉氫泵蛋白完成的，來保持植物細胞內的低Na+水平，是植物耐鹽的關鍵因子。
高等植物的排Na+機制主要與質膜鈉氫泵蛋白有關，質膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+從細胞質中泵出細胞，產生跨質膜的H+電化學勢梯度，提供能量，驅動質膜上的鈉氫泵蛋白，使H+順其電化學勢進入細胞，同時Na+逆其電化學勢排出細胞。現在，鈉氫泵蛋白活性已在許多高等植物和藻類中檢測到。質膜上的鈉氫泵蛋白基因最初由酵母克隆得到。啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，質膜Na+-ATPase主要在鹼性條件下起作用，可直接利用水解ATP的能量把Na+泵到細胞外。而在酸性條件下S.cerevisiae則利用質膜鈉氫泵蛋白把Na+排出細胞外，在篩選NaCl耐性菌株時鑑定到該蛋白是由NHA1基因編碼的。在植物中，Shi等從擬南芥中克隆到SOS1基因(SaltOverly Sensitive1)，它編碼的蛋白與細菌和真菌的質膜鈉氫泵蛋白具有非常高的同源性，擬南芥sos1突變體對鹽超敏感，表明sos1在植物耐鹽機制中起重要作用。
鈉氫泵蛋白是位於膜上的逆向轉運蛋白，用SMART程序預測到有12個跨膜區域。在對已發現的所有鈉氫泵蛋白序列進行分析，發現其跨膜區高度保守，對鈉氫泵蛋白擔負Na+/H+轉運的功能非常重要。
近年來在研究鹽生植物種類中發現生長在華東地區海灘鹽土生長的本土植物種類小鹽芥(Thellungiella halophila)，它符合作為遺傳研究模式系統的各種標準，是一種不可忽視的非常有價值的自然資源。以小鹽芥作為模式耐鹽植物來研究抗鹽的分子機理還剛剛起步。

發明內容
本發明的目的在於針對植物的耐鹽能力提供一種能夠提高植物抗鹽能力的蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，也包括與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有70％～100％的同源性，也包括在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸生成的功能相似的衍生物本發明的另一個目的在於提供一種編碼上述蛋白質的小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1。
本發明的另一個目的在於提供含有上述小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1的重組質粒。
本發明的另一個目的在於提供含有上述重組質粒的宿主細胞。
本發明的另一個目的在於提供上述蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白在提高植物的耐鹽能力上的應用。
本發明的技術方案如下本發明所述的TNHX1基因是通過構建經鹽處理後的小鹽芥cDNA文庫，然後對文庫進行耐鹽性篩選後所得到的一個抗鹽克隆。具體實驗步驟用熱酚法分別提取經400mM的NaCl處理0，0.5，1，3，6，12小時後的小鹽芥的總RNA，再進一步分離出總mRNA，構建鹽處理後的小鹽芥cDNA文庫。將cDNA片段克隆到大腸桿菌與酵母的pGAD-GH的穿梭載體中後先在大腸桿菌中擴增後再轉化到對鹽敏感的酵母菌株G19中，在含有不同濃度NaCl的培養基上篩選抗鹽的cDNA克隆。通過首次篩選及重複篩選後，確認第39號克隆攜帶抗鹽基因。將該攜帶抗鹽基因的cDNA從酵母中分離出來，經過測序，結果發現該cDNA是擬南芥NHX1基因的同源體，故我們將其命名為TNHX1。
該基因的全長2461bp，CDS長1638bp，5』UTR長476bp，3』UTR長347bp，編碼546aa的蛋白。用SMART程序分析預測，該蛋白含有12個跨膜區。用農桿菌介導的真空法進行轉基因實驗，實驗結果證明TNHX1基因可以提高不耐鹽植物的抗鹽性能。
本發明的有益效果本發明首次從小鹽芥中克隆到鈉氫泵蛋白基因，並通過轉基因實驗證實了該基因能夠提高植物的抗鹽能力。利用分子生物學手段來研究該基因，將其轉移到非抗鹽的農作物中，以培育出抗鹽的轉基因作物新品種，使其能夠正常生長在鹽漬土地上，這對於擁有5億多畝鹽荒地的我國來說，有著巨大的經濟價值和應用前景。


圖1為SMART程序預測的TNHX1蛋白的結構域，該蛋白含有12個跨膜區；圖2為500mM NaCl處理5天前後野生型擬南芥和小鹽芥的生長情況；圖3為350mM NaCl處理5天後野生型擬南芥和轉P35S-TNHX1的擬南芥生長情況。
具體實施例方式
植物培養及生長條件用來做野生型(wt)、和轉TNHX1基因實驗的擬南芥(Arabdopsisthaliana)的生態型是Columbia(Col.T)，用來鹽處理和建庫的是小鹽芥(Thellungiella halophila，T.halo)。
小鹽芥和擬南芥的種子採用表面滅菌法，70％酒精表面殺菌3-5分鐘後，用10％Bleach浸泡滅菌10-15分鐘後，用無菌水洗3-4次，鋪在1/2 MS的平板上，擬南芥在4℃春化3天，而小鹽芥在4℃春化21天，然後在22℃的溫室中培養，每天16小時的光周期。兩星期後移入土中，在同樣的條件下生長。
實施例1 野生型擬南芥、小鹽芥的耐鹽能力比較將在22℃培養相同天數的野生型擬南芥、小鹽芥同時從1/2 MS平板上轉移到含有500mM NaCl的1/2 MS平板上，繼續培養5天後觀察，結果發現野生型擬南芥全部白化、死亡，而野生型小鹽芥的只有少數葉片白化，且正常生長，如圖2所示。這說明小鹽芥的耐鹽能力比擬南芥好。
實施例2 鹽處理的小鹽芥cDNA文庫的構建和篩選當野生型小鹽芥植物在土裡生長到8～10片葉子時，用400mM的NaCl進行處理，分別在處理後的0，0.5，1，3，6，12小時後取樣，用熱酚法法提取總RNA，再用poly(T)結合的纖維素柱進一步分離出總mRNA，用cDNA文庫構建試劑盒(購自Stratagene公司)來構建經過鹽處理後的小鹽芥cDNA文庫。將cDNA片段克隆到大腸桿菌與酵母的pGAD-GH的穿梭載體中後先在大腸桿菌中擴增後再轉化到對鹽敏感的酵母菌株G19中篩選抗鹽的cDNA克隆。通過首次篩選及重複篩選確認第39號克隆攜帶抗鹽基因。將該攜帶抗鹽基因的cDNA從酵母中分離出來，經過測序後得到該片段的序列。
實施例3 轉TNHX1基因植物的耐鹽性能將TNHX1基因克隆到雙子葉植物的啟動子35S驅動的的表達載體中，用農桿菌介導的真空法轉化不耐鹽的野生型擬南芥，得到轉基因的植株。將轉P35S-TNHX1的擬南芥種子在MS平板上生長到6片葉子的幼苗和野生型的擬南芥幼苗一起轉移到含有350mM NaCl的MS培養基上繼續生長5天。結果如圖3所示，發現作為對照的野生型擬南芥植物的葉片發白，甚至死亡；而轉P35S-TNHX1的植物的生長沒有受到明顯的影響。這說明小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1跟植物的耐鹽能力有重要關係。
UN3204~1.TXTSEQUENCE LISTING110中山大學120一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1及其抗鹽應用130
1602170PatentIn version 3.221012112461212DNA213小鹽芥Thellungiella halophila220
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1.一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1編碼的蛋白質，或其在小鹽芥中的功能類似蛋白，其胺基酸序列與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有70％～100％的同源性。
2.如權利要求1所述的蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.如權利要求1所述的蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白，其特徵在於所述蛋白質的胺基酸序列還包括在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個胺基酸生成的功能相似的衍生物。
4.一種編碼權利要求1、2或3所述蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白的基因。
5.如權利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
6.如權利要求4所述的基因，其核苷酸序列還包括在SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的功能相同的突變體、等位基因或衍生物。
7.一種含有權利要求5或6所述基因的重組質粒。
8.一種含有權利要求7所述重組質粒的宿主細胞。
9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特徵在於所述宿主細胞為大腸桿菌、農桿菌、酵母或植物細胞。
10.權利要求1或2或3所述蛋白質或其在小鹽芥中的功能類似蛋白在提高植物的耐鹽能力上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種小鹽芥鈉氫泵蛋白基因TNHX1及其抗鹽應用。本發明所述的TNHX1基因是通過構建經鹽處理後的小鹽芥cDNA文庫，然後對文庫進行耐鹽性篩選後所得到的一個抗鹽克隆基因。該基因的全長2461bp，CDS長1638bp，5′UTR長476bp，3′UTR長347bp，編碼546aa的蛋白。用SMART程序分析預測，該蛋白含有12個跨膜區。用農桿菌介導的真空法進行轉基因實驗，實驗結果證明TNHX1基因可以提高植物的抗鹽能力，有著巨大的經濟價值和應用前景。
文檔編號C07K14/415GK1651459SQ20041005246
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月1日 優先權日2004年12月1日
發明者謝旗, 張譯月, 楊翠平, 嚴紅豔, 陽成偉 申請人:中山大學