腺病毒腫瘤診斷法

2023-11-07 10:46:27 2

腺病毒腫瘤診斷法
【專利摘要】本文提供了使用重組腺病毒檢測受試者中癌症的組合物和方法。更具體地，使用重組腺病毒診斷患者的癌症以及進一步使用重組腺病毒篩選有效治療所述患者癌症的化合物。
【專利說明】腺病毒腫瘤診斷法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求於2012年3月14日提交的美國臨時申請N0.61/610，970的優先權，所述臨時申請為了所有目的全文納入本文。
[0003]對聯邦政府資助研發做出的發明的權利的聲明
[0004]本發明是在美國國家衛生研究院授予的政府支持的基金R01HG004876、R21RR024453和R43RR031424下進行的。政府對本發明擁有某些權利。

【背景技術】
[0005]細胞從實體瘤擴散到身體遠端的被稱為轉移的過程造成了所有腫瘤相關的死亡的90%以上。起源於原發性腫瘤的細胞可進入循環系統並流動以侵入遠離原發性腫瘤的器官和組織並在其中定殖和增殖。因此，這些循環腫瘤細胞(CLC)的檢測為轉移性癌細胞的早期鑑定和治療祀向提供了寶貴的機會(Cristofanilli, 2004 ；de Bono, 2008)。目前用於檢測CTC的技術包括反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、流式細胞術、螢光原位雜交以及最近的微流體技術。遺憾的是，RT-PCR不能區分活的轉移性CTC和源於原發性腫瘤的核酸或細胞片段。
[0006]基於抗體的技術不能用於檢測所有癌症，而僅能檢測那些表達最常見的和被很好地表徵的標記物的癌症。當前系統的CTC計數(enumerat1n)僅提供了一層關於癌症診斷的信息。已經證明CellSearch? (Veridex, Raridan NJ)裝置取得了 CTC分析的商業成功並且其被FDA批准用於乳腺、前列腺和結腸，然而在卵巢、直腸和肺中的使用還有待批准。所述CellSearch?,系統的局限性包括:(a)依賴於EpCAM的表達水平(PunnooseEA,等人，PLoS ONE.2010 ；5(9):el2517), (b)不使用間充質標記物(Punnoose EA,等Λ , PLoS ONE.2010 ；5(9):el2517), (c)依賴於抗體親和力用來捕獲(Nagrath S，等人，Nature, 2007 ；450(7173): 1235-9.18097410)，以及最重要的(d)缺少 CTC 表型特徵。
[0007]沒有任何抗體具有100%的腫瘤或組織特異性，而且抗體既結合活的CTC也可以結合死的CTC。因此需要更敏感的、更加特異的以及可應用更加廣泛的檢測血液中非常少量的CTC的技術。另外，急需開發新的診斷劑和工具，其不僅能檢測和捕獲CTC還能對它們的惡性潛能進行定量以及「預先」確定在切除個體患者的腫瘤中最有效療法。
[0008]儘管癌症在基因組範圍內具有複雜性和可變性，但是共同點是它們都具有生長失調的表型，即所謂的癌症標誌，這是由相對少量的關鍵途徑發生突變而引起的。 申請人:沒有將重心放在檢測大量的且在腫瘤之間高度可變的單個基因損傷上，而是構建了診斷性病毒，所述病毒在其基因組中整合了多個轉錄和分子模塊以感染和檢測患者的腫瘤，報告腫瘤的分子「標誌」以及「預先」報告腫瘤對不同療法的反應。使用這些試劑，任何給定腫瘤的分子損傷和惡性特徵可被快速識別(24小時以內)並可通過標準化自動平臺來評分。另夕卜，這些試劑也能作為報告分子以快速且直接地測定患者的腫瘤是否可能對具體治療產生反應。


【發明內容】

[0009]在一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括給予受試者重組報告性腺病毒。使所述重組報告性腺病毒感染受試者中的癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。從受試者中獲得含有所述報告病毒感染的癌細胞的樣品並檢測所述報告病毒感染的癌細胞，從而檢測了所述受試者中的癌症。
[0010]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。使重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞，檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
[0011]在另一方面，提供了確定測試化合物是否抑制了來自癌症患者的癌細胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。將重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。使所述報告病毒感染的癌細胞生長足夠的時間。測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平並將所述水平與對照水平對比，其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的細胞癌的生長。
[0012]在另一方面，提供了分離來自受試者的樣品中報告病毒感染的癌細胞的方法。所述方法包括將所述報告病毒感染的癌細胞與未感染的細胞分離，其中所述分離至少部分地基於所述報告病毒感染的癌細胞的表達的報告基因表型。
[0013]在另一方面，提供了含有癌細胞報告分子模塊和癌細胞結合模塊的重組報告性腺病毒。
[0014]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括將本文(包括其中的實施方案)中提供的含有重組報告性腺病毒給予受試者。使所述重組報告性腺病毒感染所述受試者中的癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。從含有所述報告病毒感染的癌細胞的受試者中獲得樣品，並檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
[0015]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。將本文(包括其中的實施方案)中提供的重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒感染癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞，檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
[0016]在另一方面，提供了檢測測試化合物是否抑制了來自癌症患者的癌細胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品以及將本文(包括其中的實施方案)中提供的重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒感染癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。使所述報告病毒感染的癌細胞生長足夠的時間並測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平。將所述水平與對照水平對比，其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細胞的生長。
[0017]在另一方面，提供了檢測癌症的試劑盒。所述試劑盒包括本文(包括其中的實施方案)中提供的重組報告性腺病毒。
[0018]在另一方面，提供了用於篩選癌症藥物的試劑盒。所述試劑盒包括癌症抑制性化合物和本文(包括其中的實施方案)中提供的重組報告性腺病毒。
[0019]在另一方面，提供了用於分離癌細胞的試劑盒。所述試劑盒包括用於檢測表達的報告基因表型的裝置和本文(包括其中的實施方案)中提供的重組報告性腺病毒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.癌症的標誌
[0021]圖2.Adsemly在體外反應中快速地從模塊部分裝配Ad基因組。圖2上部分:被分成轉錄和功能模塊並被克隆到質粒上的基因組。圖2中間部分:將E1、E3和E4模塊用腫瘤特異性啟動子驅動的螢光蛋白修飾以突出CTC。圖2下部分:多位點特異性的病毒在體外重新裝配和重建示意圖。
[0022]圖3.P16被沉默時E2F-應答啟動子被激活。
[0023]圖4.將空間濾波器(遮罩)放置在所述器件外觀的放大圖像中。染色細胞的輸入螢光脈衝信號用不同的空間濾波器調節，然後將所述信號用PMT記錄，產生了時間域上的不同的光電流波形，其對應於細胞通過微流體通道時的不同的位置，例如(111)、(1101)或(1011)。這種時空編碼技術通過使用僅僅一個PMT來區分3種或甚至更多種信號，從而降低了系統的大小和成本。
[0024]圖5.圖5(a)裝置結構。將250 μ m寬的主流體通道分成3個亞通道。中間的通道用於收集廢液，同時左邊和右邊的通道用於收集樣品。通過光纖將照明光(488nm雷射)遞送到所述裝置中並由塗有Teflon AF的光流體波導引導。將PZT驅動器整合至裝置中。方塊中是由PDMS製成的裝置的分選接合點。圖5(b)當PZT驅動器垂下時，目的細胞被推到右邊的分選通道，同時非靶細胞直接進入到中間的廢液通道而不會引發PZT。圖5(c)流動豐旲式觀察。左邊:通過置加用聞速CMOS攝像機每0.3ms拍攝的照片對分選到右邊通道的螢光珠進行的追蹤。右邊:不同電壓強度下進入PZT驅動器的微珠的軌跡曲線圖。其有助於設置用於足夠偏轉的闕值電壓。
[0025]圖6.使用NanoSort-UCSD μ FACS系統從未染色細胞中分選出螢光染色的紅白血病細胞(Κ562)的說明。得到230倍的富集因子(40)。
[0026]圖7.操作流程和預期的來自轉導的CTC的螢光讀出。
[0027]圖8.通過病毒載體對CTC進行表型分析。
[0028]圖9.選擇的腫瘤診斷途徑的螢光讀出。該圖列出了一組最初的4種診斷性表達盒(左邊)和它們在細胞中的預期表型(右邊)。CMV-[Foxo3-GFP]盒具有組成型活性，因此GFP能在所有含有有活性的CMV啟動子的細胞類型中表達。在含有低活性PI3K/Akt的細胞中，例如非腫瘤組織，Foxo3-GFP融合蛋白定位到細胞核中。然而，在含有高活性PI3K/Akt的細胞中，例如在腫瘤細胞中，Foxo3-GFP融合蛋白定位到細胞質中。E2F- [mCherry-CRTC2]盒僅僅在具有無活性pRB的細胞(例如在幾乎所有的腫瘤中)中有活性。在這些細胞中，如果腫瘤抑制子Lkbl是完整的,貝U mCherry-CRTC2融合蛋白定位在細胞質中。然而，在缺失了Lkbl功能的腫瘤細胞中，mCherry-CRTC2融合蛋白則定位到細胞核中。所述血清應答元件(SRE)啟動子僅在具有激活的生長因子信號傳導或有絲分裂原刺激的細胞中表達YFPj^示該細胞是快速分裂的細胞例如腫瘤。最後，SMAD-應答啟動子盒驅動含有有活性的TGF3信號傳導的細胞中tdTomato的表達,在某些癌症中,這種現象與轉移表型聯繫在一起。當結合在一起時，該四種表達盒提供了五種不同的癌症相關途徑的信息。
[0029]圖10.對腺病毒Adsembly模塊進行改造以構建腫瘤診斷病毒。使用Adsembly基因組組裝方法構建病毒。在該圖表中，示出了其中放置了起初的四種癌症診斷表達盒中每一種的Adsembly模塊。將兩種盒克隆到El模塊中，因為在之前的實驗中已經證明了 El模塊允許雙表達盒的存在。將E3模塊的E3A/E3B部分刪除並用單個盒子替換。沒有顯示在表I中列出的對尾絲基因的改造，所述尾絲也存在於E3模塊中。最後，將E4區域刪除並用單個的模塊替換。可在材料與方法中找到關於刪除和插入的更具體的信息。對這些Adsembly載體改造以後，將它們用在常規Adsembly反應中以構建含有一種或更多所述腫瘤診斷表達盒的病毒。

【具體實施方式】
[0030]1.定義
[0031]「核酸」是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其
[0032]多聚體，以及它們的互補序列。所述術語包括含有已知的核酸類似物或修飾的主鏈殘基或修飾的連接的核酸，所述核酸可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參照核酸相似的結合特性，並且以與參考核酸類似的方式代謝。這樣的類似物的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
[0033]除非另有說明，特定的核酸序列也暗含其保守性修飾的變體(例如，簡併密碼子置換)和互補序列以及明確指定的序列。具體地，簡併密碼子置換可以通過產生其中一個或多個所選(或所有)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷置換的序列來實現(Batze 等,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ；0htsuka 等人，J.B1l.Chem.260:2605-2608(1985) ；Rossolini 等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98 (1994))。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。
[0034]特定的核酸序列還暗含「剪接變體」。相似地，由核酸編碼的特定的蛋白質暗含由該核酸的剪接變體編碼的任何蛋白。「剪接變體」，顧名思義，是基因可變剪切的產物。轉錄後，可將起始的核酸轉錄物剪接以使不同的(可變的)核酸剪接產物編碼不同的多肽。剪接變體的產生機制不同，但是都包括外顯子的可變剪接。通過通讀轉錄從相同的核酸衍生的不同多肽也包含在此定義中。剪接反應的任何產物(包括所述剪接產物的重組體形式)包括在此定義中。鉀通道剪接變體的實例在Leicher等，J.B1l.Chem.273 (52): 35095-35101 (1998)中論述。
[0035]可採用本領域熟知的常規連接和限制性酶切技術構建含有所需的治療基因的編碼和調控序列的合適的載體(見Maniatis等人，in Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982))。可以對分離的質粒、DNA 序列、或合成的寡核苷酸進行切割、加尾和重新連接以形成所需的形式。
[0036]當將核酸與另一核酸序列置於功能性關係中時，該核酸被「可操作地連接」。例如，如果前序列或分泌性前導序列的DNA被表達為參與多肽分泌過程中的前蛋白，那麼所述前序列或分泌性前導序列的DNA與所述多肽的DNA可操作地連接；或者如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼該啟動子或增強子與所述編碼序列可操作地連接；如果核糖體結合位點位於可促進翻譯的位置，那麼所述核糖體結合位點與所述編碼序列可操作地連接。一般，「可操作地連接」意指連接的DNA序列是相鄰的，並且，在分泌性前導序列的情況下是鄰近的並且處於閱讀相中。然而，增強子不必是鄰接的。通過在適宜的限制酶切位點處連接來實現連接。如果這樣的位點不存在，則依據常規實踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接體。
[0037]在兩條或多條核酸或多肽序列的上下文中，術語「相同」或「同一性」百分數指的是使用以下描述的使用默認參數的BLAST或BLAST2.0序列比對算法或通過手動比對以及視覺觀察(見，例如，NCBI網址等)測定的相同的或者具有特定百分數的相同胺基酸殘基或核苷酸的兩條或多條序列或亞序列(即在比較窗口或指定區域內進行最大相關性的比較和比對時，在指定的區域內大約60%同一性、優選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高的同一性)。然後將這些序列稱為「基本相同的」。該定義也指的是，或者可以應用於測試序列的互補(compliment)序列。所述定義還包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有置換的那些序列。如下所述，所述優選的算法可產生缺口(gap)等。優選地，同一性存在於長度為至少約25個胺基酸或核苷酸的區域內，或更優選地，在長度為至少約50-100個胺基酸或核苷酸的區域內。
[0038]在序列比對時，一般一種序列作為測試序列與之比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入電腦，如果需要的話，指定序列坐標，並指定序列算法程序參數。優選地，使用默認程序參數，或者指定替代參數。然後基於所述程序參數，序列比較算法計算所述測試序列相對於參考序列的序列同一性百分數。
[0039]本文使用的「比較窗口 」包括涉及具有任何一個選自如下鄰接位置數目的區段:20-600、通常約50-約200、更通常約100-約150，其中在將兩個序列以最佳方式進行比對後，可以將一條序列與具有相同數目鄰接位置的參考序列進行比較。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。可通過以下方法進行最佳的用於比較的序列比對，例如，通過Smith&ffaterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同源算法，通過 Needleman&Wunsch, J.Mol.B1l.48:443 (1970)的同源比對算法，通過 Pearson&Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的相似性搜索法，通過這些算法的計算機化工具(Wisconsin Genetics軟體包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575ScienceDr., Madison, WI),或者通過人工比對和視覺觀察(見例如，Current Protocol inMolecular B1logy (Ausubel 等,eds.1995 增刊))。
[0040]適合用於測定序列同一性和序列相似性百分數的算法的優選實例為BLAST和BLAST2.0 算法，所述算法分別記載於在 Altschul 等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.B1l.215:403-410(1990)中。使用具有本文所述參數的BLAST和BLAST2.0來測定本發明的核酸和蛋白的序列同一性百分數。本領域已知,進行BLAST分析的軟體可通過美國國家生物技術信息中心公開獲得。該算法包括首先通過鑑定查詢序列中的具有長度W的短的字串，來鑑定高計分序列對(HSP)，當將所述短字串與資料庫序列中的具有相同長度的字串進行比對時，所述短的字串匹配或者滿足一些陽性值的閾值得分T。T被稱為相鄰字串得分閾值(Altschul等，上文)。這些起始相鄰字串匹配(hit)作為種子用於起始搜索尋找包含它們的更長的HSP。只要累積比對得分可增加，就將所述字串匹配沿著每條序列雙向延伸。對於核酸序列，使用參數M(—對匹配殘基的獎分；通常>0)和N(錯配殘基的罰分；通常〈0)計算累積得分。對於胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。所述字串匹配在每個方向上的延伸在下列情況下會終止:當累積比對得分從其最大獲得值降低了數量X時；由於一個或多個負得分殘基比對的累積，所述累積得分達到零或更低時；或者到達任一序列的末端時。所述BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對於核酸序列)使用字串長度(W)為11、期望值(E)為10、M = 5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認值。對於胺基酸序列，所述BLASTN程序使用字串長度(W)為 3、期望值(E)為 10 以及 BLOSUM62 得分矩陣(見 Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915(1989))比對(B)為 50、期望值(E)為 10、M = 5、N = -4 以及兩條鏈的比較作為默認值。
[0041]術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文可以互換使用，是指胺基酸殘基的多聚體。所述術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是對應的天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸多聚體，以及天然存在的胺基酸多聚體和非天然存在的胺基酸多聚體。
[0042]術語「胺基酸」指的是天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來被修飾的那些胺基酸，例如，羥脯氨酸、Y -羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物指的是具有和天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基團結合的α-碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這類類似物具有修飾的R基團(例如正亮氨酸)或者修飾的肽主鏈，但是保留著和天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物指的是具有與胺基酸通常的化學結構不同，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。
[0043]本文中的胺基酸可被稱為其通常已知的IUPAC-1UB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號。類似地，核苷酸可被稱為其通常接受的單字母密碼。
[0044]「保守性修飾變體」適用於胺基酸和核酸序列。就具體的核酸序列而言，保守性修飾變體指的是編碼相同的或基本相同的胺基酸序列的那些胺基酸，或者當核酸不編碼胺基酸序列時，保守性修飾變體指的是其基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在每一個由一個密碼子指定為丙氨酸的位置上，所述密碼子可改變為任何一個所述的相應密碼子，而不會改變所編碼的多肽。這類核酸改變是「沉默改變」，其是保守性修飾改變的一種。本文中每一條編碼多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每一種可能的沉默改變。技術人員會理解，核酸中的每一個密碼子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)都可被修飾從而產生功能相同的分子。因此，對於表達產物而言，而並未對於實際探針序列而言，編碼多肽的核酸的每一個沉默改變都暗含在每一個所述序列中。
[0045]對於胺基酸序列，技術人員應理解，對核酸、肽、多肽或蛋白序列進行能夠改變、添加或刪除所編碼的序列中的單個胺基酸或小百分比的胺基酸的單個置換、刪除或添加，這類單個置換、刪除或添加產生「保守性修飾變體」，在所述保守性修飾變體中所述改變導致胺基酸被化學上相似的胺基酸所置換。提供了功能相似的胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾變體除了包括上述之外，還包括本發明的多態變體、種間同源序列和等位基因。
[0046]下列八組中每組都含有相互之間為保守性置換的胺基酸。I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E) ；3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(見，例如，Creighton, Proteins(1984))。
[0047]當用於例如細胞、病毒、核酸、蛋白質或載體時，術語「重組的」表示，所述細胞、病毒、核酸、蛋白質或載體已經通過引入異源核酸或蛋白質或者通過改變天然胺基酸或者蛋白質而被修飾或者表示所述細胞源自這樣修飾的細胞。因此，例如，重組的細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中不存在的基因或者表達那些原本異常表達、低水平表達或根本不表達的天然基因。
[0048]短語「嚴格雜交條件」指的是在這種條件下通常在核酸的複雜混合物中，探針與其靶亞序列雜交而不與其它序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的，並且在不同的環境下是不同的。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的廣泛指南見於Tijssen,Techniques in B1chemistry and Molecular B1logy—Hybridizat1n withNucleic Probes, 「Overview of principles of hybridizat1n and the strategy ofnucleic acid assays」(1993)。通常,將嚴格條件選擇為在確定的離子強度和pH下比特定序列的熱熔點(Tm)值低約5-10°C。^是(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)達到平衡後(靶序列過量存在時，在Tm下，平衡時50%的探針被佔用)與靶序列互補的探針的50%與靶序列雜交時的溫度。嚴格條件還可以通過加入去穩定劑(例如甲醯胺)來獲得。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號至少兩倍於背景，優選10倍於背景雜交。示例性的嚴格雜交條件可如下:在50%甲醯胺、5x SSC和1% SDS中，在42°C下孵育，或者，在5x SSCU%SDS中，在65°C下孵育、在65°C下用0.2x SSC和0.1% SDS洗滌。
[0049]在嚴格條件下不與彼此雜交的核酸，如果其編碼的多肽基本相同，則它們仍然是基本相同的。例如，當使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡併性來構建核酸拷貝時，會發生這種情形。在這些情況下，核酸一般在中等嚴格雜交條件下進行雜交。示例性的「中等嚴格雜交條件」包括在40%甲醯胺、I M似(:1、1%505的緩衝液中在371:下雜交，並在451:下用1父SSC洗滌。陽性雜交為至少兩倍於背景。普通技術人員會容易地理解，其他雜交和洗滌條件可用於提供具有相似嚴格性的條件。確定雜交參數的其他指南在大量參考文獻中提供，例如，Current Protocols in Molecular B1logy, ed.Ausubel et al., John Wiley&Sons。
[0050]對於PCR，儘管退火溫度取決於引物長度而可在約32°C -48°C間變化，但是約36°C的溫度一般用於低嚴格性擴增。儘管高嚴格性退火溫度取決於引物長度和特異性而可在約50°C到約65°C範圍內，但是對於高嚴格性PCR擴增，一般溫度為約62°C。高和低嚴格性擴增的一般循環條件包括90°C _95°C變性階段持續30 sec-2min、退火階段持續30sec-2min、以及約72°C延伸階段持續l-2min。低和高嚴格性擴增反應的方案和指南在例如Innis etal.(1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applicat1ns, Academic Press, Inc.N.Y.)中提供。
[0051]術語「轉染作用」、「轉導作用」、「轉染」或「轉導」可互換使用並被定義為將核酸分子或蛋白質引入到細胞的過程。使用非病毒或基於病毒的方法將核酸引入到細胞中。所述核酸分子可以是編碼完整蛋白或者其功能部分的序列。一般，核酸載體包括蛋白表達必需的元件(例如，啟動子、轉錄起始位點等)。轉染的非病毒方法包括不使用病毒DNA或病毒顆粒作為遞送系統而將核酸分子引入到細胞中的任何適當的方法。示例性的非病毒轉染方法包括磷酸鈣轉染、脂質體轉染、核轉染、聲致穿孔、熱擊轉染、磁轉染和電穿孔。對於基於病毒的方法，任何有用的病毒載體都可用於本文描述的方法中。病毒載體的實例包括，但不限於反轉錄病毒、腺病毒、慢病毒和腺-伴隨病毒載體。在一些方面，使用腺病毒載體按照本領域熟知的常規步驟將核酸分子引入至細胞中。術語「轉染作用」或「轉導作用」也指的是將蛋白質從外部環境引入至細胞中。一般，蛋白質的轉導作用或轉染作用依賴於能夠穿過細胞膜的多肽或蛋白質與目的蛋白的結合。參見，例如，Ford等，(2001)Gene Therapy8:1-4and Prochiantz(2007)Nat.Methods 4:119-20。
[0052]轉染基因的表達可在宿主細胞中瞬時或穩定發生。在「瞬時表達」過程中，所述轉染核酸沒有整合到宿主細胞基因組中，並且在細胞分裂過程中未轉移到子代細胞中。因為所述轉染核酸的表達僅限於轉染的細胞，因此所述基因的表達隨著時間而都丟失。相比之下，當轉染基因與另一個賦予轉染細胞選擇優勢的基因共轉染時，所述轉染基因可發生穩定表達。這樣的選擇優勢可以是對給予細胞的某種毒素的抗性。可通過轉座子介導的將轉染基因插入到宿主基因組中來進一步實現所述轉染基因的表達。在轉座子介導的插入過程中，所述基因以可預測的方式放置在兩個轉座子接頭序列之間，所述兩個轉座子接頭序列使得能夠插入至宿主基因組中並隨後被切除。
[0053]當提及細胞培養物本身或培養過程時，術語「培養」、「正在培養」、「生長」、「正在生長」、「維持」、「正在維持」、「擴增」、「正在擴增」等可互換使用，意指在適合存活的條件下在體外(例如，離體)維持細胞。使得培養的細胞能夠存活，並且培養可導致細胞生長、分化或分裂。所述術語並不意味著在培養物中的細胞都能存活、生長或分裂，因為一些細胞可自然衰老等。一般將細胞培養在培養基中，所述培養基可在培養的過程中更換。
[0054]術語「培養基」和「培養液」指的是細胞培養環境。培養基一般為等滲溶液，並且可以為液態的、凝膠狀的、或半固態的，例如，以提供細胞粘附的基質或支持物。本文使用的培養基可包括用於培養細胞所必需的營養支持物、化學支持物和結構支持物的組分。
[0055]「對照」樣品或數值指的是充當參照的樣品，通常為已知的參照，用於與測試樣品進行比較。例如，可從測試條件(例如，存在測試化合物)中獲取測試樣品，並將所述測試樣品與來自已知條件(例如，不存在測試化合物(陰性對照)、或者存在已知化合物(陽性對照))中的樣品進行比較。對照也可表示從很多測試或結果收集而來的平均值。本領域技術人員會理解，可設計對照用於評估任何數量的參數。例如，可設置對照以基於藥理學數據(例如，半衰期)或治療學量度(例如，副作用的比較)來比較治療效果。本領域技術人員應理解哪些對照在給定的情形中有價值，並且應能夠基於與對照數值進行的比較來分析數據。對照還可以對確定數據的顯著性有價值。例如，如果對於給定參數的數值在對照中的變化性很大，則認為測試樣品的變化不顯著。
[0056]在包含「另外的」、「其他的」、或「第二」組分的組合物(例如，癌細胞報告模塊、報告基因表型)中，本文使用的第二組分不同於其他組分或第一組分。「第三」組分不同於其它、第一和第二組分，並且類似地，其他列舉的或另外的組分也不同。
[0057]用於本文時，術語「癌症」指的是哺乳動物中的所有類型的癌症、腫瘤或惡性腫瘤，包括白血病、癌和肉瘤。不例性的癌症包括腦癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、頭&頸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞性肺癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宮癌和髓母細胞瘤。另外的實例包括，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、原發性腦瘤、原發性腦癌、惡性胰島瘤(malignant pancreatic insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡變前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、內分泌和外分泌胰腺腫瘤以及前列腺癌。
[0058]術語「白血病」廣義上指的是造血器官的進行性惡性疾病，並且一般由血液和骨髓中白細胞和它們的前體的異常增殖和發育來表徵。白血病通常在臨床上基於以下幾點進行分類:(1)急性或慢性疾病的持續時間和特性；(2)涉及細胞的類型:骨髓細胞(骨髓內產生的)、淋巴細胞(淋巴生成的)或單核細胞；和(3)白血病或非白血病(亞白血病)血液中異常細胞數量的增加或非增加。P388白血病模型能夠預測體內抗白血病活性而被廣泛接受。認為不管正在進行治療的白血病的類型是什麼，在P388測定中測試為陽性的化合物通常在體內表現出一定水平的抗白血病活性。因此，本發明包括治療白血病的方法，以及，優選地，治療以下類型白血病的方法:急性非淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T-細胞白血病、白細胞不增多性白血病、非白血性白血病(aleukocythemic leukemia)、嗜鹼性粒細胞性白血病、幹細胞性白血病、牛白血病、慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚細胞性白血病、嗜酸性粒細胞性白血病、格羅斯白血病、多毛細胞白血病、成血性白血病、成血細胞性白血病、組織細胞性白血病、幹細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、白細胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、成淋巴性白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細胞性白血病、肥大細胞白血病、巨核細胞白血病、小原粒性白血病、單核細胞性白血病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病、骨髓性粒細胞性白血病、粒單核細胞性白血病、內格利白血病、漿細胞白血病、多發性骨髓瘤、漿細胞性白血病、前髓細胞性白血病、裡德爾細胞性白血病、席林白血病、幹細胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細胞性白血病。
[0059]術語「肉瘤」通常指的是由類似胚性結締組織的物質組成的腫瘤並且通常由嵌入在纖維狀物質或均一物質中的緊密堆積的細胞組成。可以用抗腫瘤的硫醇結合的線粒體氧化劑和抗癌劑的結合來治療的肉瘤包括:軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy' s 肉瘤、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)H泡狀軟組織肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠色瘤肉瘤、絨毛膜癌、胚胎性肉瘤、腎母細胞瘤(Wilms' tumor sarcoma)、子宮內膜肉瘤、間質肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纖維細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、粒細胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特發性多發性色素沉著出血性肉瘤、B細胞免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞免疫母細胞肉瘤、延森肉瘤、卡波西肉瘤、枯氏細胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉肉瘤、骨膜外肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯肉瘤、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛細管擴張性肉瘤。
[0060]術語「黑色素瘤」指的是起源於皮膚和其他器官的黑素細胞系統的腫瘤。可以用抗腫瘤藥硫醇結合的線粒體氧化劑和抗腫瘤劑的結合治療的黑色素瘤包括:例如，肢端雀斑樣黑色素瘤、無黑色素黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克勞德曼黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤、惡性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、指甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和淺表擴張性黑色素瘤。
[0061]術語「癌」指的是由易於浸潤周圍組織並產生轉移的上皮細胞組成的惡性腫瘤(new growth) □可以用抗腫瘤藥硫醇結合的線粒體氧化劑和抗腫瘤劑的結合治療的示例性的癌包括，例如，腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、腺樣囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、腎上腺皮質癌、肺泡癌、肺泡細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、基底細胞癌(carcinomabasocellulare)、基底細胞樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管原癌、腦樣癌、膽管細胞癌、絨毛膜癌、膠體癌、粉剌狀癌、子宮體癌、篩形癌、胸廓癌、皮膚癌、柱狀癌、柱狀細胞癌、導管癌、硬癌、胚胎性癌、髓樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮細胞癌、夕卜植癌、潰痕性癌、硬癌(carcinoma fibrosum)、膠樣癌(gelatiniforni carcinoma)、膠樣癌(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌(giant cell carcinoma)、巨細胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌、顆粒細胞癌、發母質癌、多血癌、肝細胞癌、許特爾細胞癌、粘液癌、hypemephroid carcinoma,幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、克羅姆佩柯赫爾癌(Krompecher' s carcinoma)、庫爾契茨基細胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌、豆狀癌(lenticular carcinoma)、豆狀癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克魯肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳頭狀癌、門脈周癌、浸潤前癌、鱗狀細胞癌(prickle cell carcinoma)、粉剌癌(pultaceous carcinoma)、腎細胞癌、備細胞癌、肉瘤樣癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、硬癌(solanoid carcinoma)、球形細胞癌、梭形細胞癌、髓樣癌(carcinoma spong1sum)、鱗狀癌、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)、繩捆癌、血管擴張性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管擴張性癌(carcinomatelangiectodes)、移行細胞癌、結節性皮癌(carcinoma tuberosum)、結節性皮癌(tuberous carcinoma)、撫狀癌和域毛狀癌。
[0062]本文中的「治療有效劑量或治療有效量」意指能產生給藥目的療效的劑量。準確的劑量和製劑取決於治療的目的，並且可由本領域技術人員使用已知的技術來確定(見，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ;Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy, 20th Edit1n, Gennaroj Editor(2003)，and Pickarj DosageCalculat1ns (1999))。
[0063]術語「可藥用的鹽」或「可藥用的載體」意指包括依據本文所述的化合物中的具體的取代基，使用相對無毒的酸或鹼而製備的活性化合物的鹽。當本發明化合物含有相對酸性的官能度時，可通過在淨相(neat)或在合適的惰性溶劑中將中性形式的這類化合物與足量的所需鹼接觸在適合的惰性溶劑中接觸來獲得鹼加成鹽。可藥用鹼加成鹽的實例包括:鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機胺鹽或鎂鹽、或相似的鹽。當本發明化合物含有相對鹼性的官能度時，可通過在淨相或在合適的惰性溶劑中將中性形式的這類化合物的中性形式與足量的所需酸接觸來獲得酸加成鹽。可藥用酸加成鹽的實例包括:衍生自無機酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫鹽(monohydrogencarbonic acid)、磷酸、磷酸氫鹽(monohydrogenphosphoric acid)、憐酸二氫鹽(dihydrogenphosphoric acid)、硫酸、硫酸氫鹽(monohydrogensulfuric acid)、氫碘酸或亞磷酸等的酸加成鹽；以及衍生自相對無毒的有機酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥拍酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等的鹽。也包括胺基酸的鹽例如精氨酸鹽等和有機酸的鹽例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(見，例如Berge等，Journalof Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977))。本發明某些特定的化合物同時含有使所述化合物轉換成鹼加成鹽或酸加成鹽的鹼性和酸性官能度。本領域技術人員已知的其他可藥用載體適用於本發明。
[0064]I1.方法
[0065]在一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括給予受試者重組報告性腺病毒。使所述重組報告性腺病毒能夠感染受試者中的癌細胞，由此形成報告病毒感染的癌細胞。從所述受試者中獲得含有所述報告病毒感染的癌細胞的樣品並檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。本文提供的重組報告性腺病毒是包含至少一個(例如，一個)編碼報告蛋白質的序列的重組腺病毒。重組報告性腺病毒的非限制性實例在表2和圖9中顯示。根據公開的申請PCT/US2011/048006中記載的方法形成本文(包括實施方案)提供的重組報告性腺病毒，所述申請為了所有目的全文納入本文。所述報告蛋白可以是螢光蛋白(例如綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白)或它可以是能被螢光標記從而易於檢測的蛋白。可通過將螢光標記的抗體與報告蛋白結合來實現螢光標記。在一些實施方案中，所述重組報告性腺病毒包括可操作地與編碼螢光蛋白的核酸連接的巨細胞病毒啟動子。在一些其他實施方案中，所述螢光蛋白為綠色螢光蛋白。在一些實施方案中，所述重組報告性腺病毒包括可操作地與編碼螢光蛋白的核酸連接的E2F啟動子。在一些其他實施方案中，所述突光蛋白為紅色突光蛋白。在一些實施方案中，所述重組報告性腺病毒包括可操作地與編碼螢光蛋白的核酸連接的SRE啟動子。在一些其他實施方案中，所述螢光蛋白為黃色突光蛋白。在一些實施方案中，所述重組報告性腺病毒包括可操作地與編碼突光蛋白的核酸連接的SMAD-應答啟動子。在一些其他實施方案中，所述螢光蛋白為紅色螢光蛋白。
[0066]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。將重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒能夠感染癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞，檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。在一些實施方案中，根據本文提供的方法的檢測包括檢測報告基因的表型。在一些其他實施方案中，所述報告基因表型為螢光報告基因表型。當用本文提供的重組報告性腺病毒感染細胞(例如，癌細胞)時，用足以表達報告表型的量的重組報告性腺病毒感染所述細胞。
[0067]在另一方面，提供了測定測試化合物是否抑制來自癌症患者的癌細胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。將重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒能夠感染癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。使所述報告病毒感染的癌細胞能夠有足夠的時間生長。測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平並將所述水平與對照水平相比，其中和對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細胞的生長。本文提供的對照水平是在沒有所述測試化合物存在的條件下癌細胞的生長水平。
[0068]在一些實施方案中，根據本文提供的方法的癌症是肺癌、皮膚癌或乳腺癌。在其他實施方案中，根據本文提供的方法的癌細胞是循環癌細胞。在一些實施方案中，所述癌細胞是惡變前細胞。在一些實施方案中，根據本文提供的方法的樣品是體液。在一些其他實施方案中，所述體液為血液。在其他實施方案中，所述體液為血清或血漿。在其他實施方案中，所述體液為尿液、唾液、肺組織、支氣管肺泡灌洗樣品或呼出氣冷凝物。
[0069]在另一方面，提供了分離來自受試者的樣品中報告病毒感染的癌細胞的方法。所述方法包括將所述報告病毒感染的癌細胞與未感染細胞分離，其中所述分離至少部分基於所述報告病毒感染的癌細胞的表達的報告基因表型。在一些實施方案中，所述報告基因表型是螢光活性的水平。在其他實施方案中，所述報告基因表型是細胞生長的水平。在其他實施方案中，所述報告基因表型是異常細胞形態的水平。在一些實施方案中，所述方法進一步包括使得所述報告病毒感染的癌細胞能夠有足夠的時間去生長，從而表達所述表達的報告基因表型。在一些實施方案中，所述未感染細胞是非癌細胞。在其他實施方案中，所述樣品為血液樣品。
[0070]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括將本文(包括其實施方案)提供的重組報告性腺病毒給予受試者。使所述重組報告性腺病毒能夠感染所述受試者中的癌細胞，從而形成報告病毒感染的癌細胞。從含有所述報告病毒感染的癌細胞的受試者中獲得樣品，並檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
[0071]在另一方面，提供了檢測受試者中癌症的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品。將本文(包括其實施方案)提供的重組報告性腺病毒與癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒能夠感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞，檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。在一些實施方案中，所述方法進一步包括給予所述受試者癌症治療。
[0072]提供了測定測試化合物是否抑制來自癌症患者的癌細胞的生長的方法。所述方法包括從受試者中獲得含有癌細胞的樣品以及將本文(包括其實施方案)提供的重組報告性腺病毒與癌細胞接觸。使所述重組報告性腺病毒能夠感染癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞。使所述報告病毒感染的癌細胞能夠有足夠的時間去生長並測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平，將所述水平與對照水平相比，其中與對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制了來自所述患者的癌細胞的生長。
[0073]II1.組合物
[0074]本文特別提供了用於癌細胞的診斷和檢測的重組報告性腺病毒。在一方面，提供了含有癌細胞報告模塊和癌細胞結合模塊的重組報告性腺病毒。本文提供的癌細胞報告模塊包括編碼報告蛋白的報告基因。所述報告蛋白可以是螢光蛋白(例如綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白)或它可以是能被螢光標記從而易於檢測的蛋白。可通過將螢光標記的抗體與報告蛋白結合來實現螢光標記。本文提供的癌細胞結合分子是能夠結合由癌細胞表達的分子的分子(例如，細胞受體)。所述細胞結合分子可以是小分子或蛋白。在一些實施方案中，所述癌細胞報告模塊包括可操作地與報告基因連接的癌症應答啟動子。本文提供的癌症應答啟動子是在癌細胞中具有活性的啟動子，其中所述活性是可檢測地不同於非癌細胞中所述啟動子的活性。在一些實施方案中，與所述啟動子在非癌細胞中的活性相比，所述活性降低。在其他實施方案中，與所述所述啟動子在非癌細胞中的活性相比，所述活性增加。在一些其他實施方案中，所述報告基因是螢光報告基因。
[0075]在一些實施方案中，所述重組腺病毒還包含免疫逃避模塊。本文提供的免疫逃避模塊是蛋白質或多肽，如果所述重組報告性腺病毒表達了所述蛋白質或多肽，則其防止所述重組報告性腺病毒被癌症患者的免疫系統檢測。
[0076]在一些實施方案中，所述癌細胞報告模塊是第一癌細胞報告模塊，所述重組報告性腺病毒還包括第二癌細胞報告模塊和第三癌細胞報告模塊。在一些實施方案中，所述第一癌細胞報告模塊能表達第一報告基因表型，所述第二癌細胞報告模塊能表達第二報告基因表型，所述第三癌細胞報告模塊能表達第三報告基因表型。在一些其他實施方案中，所述第一報告基因表型、第二報告基因表型和第三報告基因表型均為可檢測地不同的。在一些實施方案中，所述第一報告基因表型指不第一癌症，第二報告基因表型指不第二癌症，第三報告基因表型指示第三癌症。在一些其他實施方案中，所述第一癌症、所述第二癌症和所述第三癌症各自不同。在一些實施方案中，第一報告基因表型、第二報告基因表型和第三報告基因表型指不單一癌症。
[0077]IV.試劑盒
[0078]在另一方面，提供了用於檢測癌症的試劑盒。所述試劑盒包括本文(包括其實施方案)提供的重組報告性腺病毒。在一些實施方案中，所述試劑盒包括用於從來自受試者的組織或細胞樣品中分離細胞(例如，潛在的癌細胞)的試劑，例如本文描述的那些(例如磁珠或其他基於親和性的分離材料，貯存緩衝液等)。因此，所述試劑盒可包括能夠與至少一種細胞特異性的標記物特異性結合的抗體或其他試劑。所述試劑盒也可包括用於在處理和檢測過程中盛裝樣品的試管或其他容器。所述試劑盒還包括在適於感染細胞和檢測細胞的條件下將所述重組報告性腺病毒給予所述患者的說明書。
[0079]在另一方面，提供了用於篩選癌症藥物的試劑盒。所述試劑盒包括癌症抑制性化合物和本文(包括其實施方案)中提供的重組報告性腺病毒。在一些實施方案中，所述試劑盒包括用於給藥癌症抑制性化合物的試劑(例如貯存緩衝液)和用於檢測報告基因表型的桌面檢測設備。
[0080]在另一方面，提供了用於分離癌細胞的試劑盒。所述試劑盒包括用於檢測表達的報告基因表型的裝置和本文(包括其實施方案)中提供的重組報告性腺病毒。在一些實施方案中，所述試劑盒包括用於從來自受試者的組織或細胞樣品中分離癌細胞的試劑，例如本文描述的那些(例如磁珠或其他基於親和性的分離材料，貯存緩衝液等)。因此，所述試劑盒可包括能夠與至少一種癌細胞特異性標記物特異性結合的抗體或其他試劑。所述試劑盒也可包括用於在處理和檢測過程中盛裝樣品的試管或其他容器。所述試劑盒還包括在適於感染癌細胞和檢測癌細胞的條件下將所述重組報告性腺病毒給予所述患者的說明書。
[0081]V.
【具體實施方式】
[0082] 申請人:意欲開發標準化自動平臺，所述標準化自動平臺能夠在分子混合和預後能力的水平上提供床旁檢測診斷以告知臨床決定，而這一點在任何其它的檢測系統、生物標記物或相關的基因表達譜中是不可能做到的。已經開發了一種從血液中檢測、計數、表徵和分離有活力的CTC的無創性測試。該測試警告臨床醫生源自原發病灶的癌症的存在或進展，同時告知關於根據循環癌細胞的數目性質和由遺傳畸變失調的腫瘤途徑來確定應該用多大的力度來治療患者的臨床決策。此外，使用由技術員操作的快速經濟的自動平臺，基於有力的轉錄報告分子和分子標記，可確定哪條關鍵的癌症途徑失調。可以分離、捕獲所述CTC，並將其直接用於檢測它們對不同的潛在治療方案應答的能力以及它們告知關於哪一種治療選擇最可能獲得最大功效的臨床醫師決策的能力。
[0083]通過螢光蛋白讀出數據來提供關於腫瘤途徑的定量和定性數據的病毒載體
[0084]目前在腫瘤基因組中已經鑑定出100，000種以上的突變(Stratton MR, CampbellPJ, Futreal PA, Nature.2009 ；458(7239):719-24.19360079)其中至少 350 個基因表現為頻發突變(Futreal PA 等人，Nat Rev Cancer,.2004 ；4(3): 177-83.14993899)。儘管這是新的遺傳學知識，癌症患者的診斷、預後和治療仍然主要依賴於主觀組織病理學、轉變的替代性生物標記物、可變的表面標記物或相關的基因表達譜。隨著NDA測序的發展，不久可能會對每一個癌症患者的腫瘤進行測序。然而，即使這種情況有可能，但是這些數據也不會顯示癌症微環境內的決定腫瘤表型的表觀遺傳修飾和關鍵相互作用，或者也不能使人們預測這些因子如何相互作用以測定患者的臨床結果或患者腫瘤對於不同治療的應答。
[0085]儘管癌症具有複雜性和遺傳變異性，但是所有的癌症都具有決定它們惡性潛能的表型，即所謂的「癌症標誌」，這是相對少數關鍵途徑中發生突變的結果。(圖1，(HanahanD, Weinberg RA, Cell, 2000 ; 100 (I): 57-70.10647931))。在各個腫瘤中，儘管使這些途徑失調的突變有所不同，但都聚集在關鍵轉錄元件和效應因子的下遊。例如，RTKs, RAS, PTEN、P1-3K或RAF中的突變可導致腫瘤能夠足以依靠自身來完成生長因子信號傳導，而RB本身的突變、P16的缺失(點突變和表觀遺傳沉默)或細胞周期蛋白的過表達可使RB腫瘤抑制因子途徑失活(Du ff, Searle JS, Curr Drug Targets, 2009 ；10(7):581-9.19601762 ；Sherr CJ, Cel,2004 ；116(2):235-46.14744434；Rossi DJ,Weissman IL,Cell, 2006 ；125(2):229-31.16630811 ；Gazdar AF, Oncogene, 2009 ；28 Suppl 1:S24-31.19680293 ;Yuan TL, Cantley LC, Oncogene,.2008 ;27 (41): 5497-510.18794884)。所述突變的獲得和它們產生的表型特徵的獲得不是同時發生的，但是經常經過進展階段並且發生在很長的一段時間內。可使用基於診斷性的轉錄報告分子和細胞的測定來從功能上測定這些關鍵分子活性的失調程度。例如，Rb或pl6中的突變導致E2F驅動的啟動子的激活(Du ff, SearleJS,Curr Drug Targets, 2009 ; 10 (7):581-9.19601762 ；SherrCJ, Cel，2004 ; 116 (2):235-46.14744434)。類似地，SMAD的細胞核和細胞質的定位指示TGF β途徑的信號傳導和轉移(Shi Y, Massague J.，Cell, 2003 ；113(6):685-700.12809600)。在基礎研究和藥物篩選應用中，將這些基於轉錄和細胞的螢光定位的讀出結果用作腫瘤途徑活性的報告分子。
[0086] 申請人:沒有將重心放在檢測大量且在腫瘤之間高度可變的單個基因損傷上，而是構建了病毒診斷性靶標(drones)，所述病毒診斷性靶標(drones)將多種轉錄模塊和分子模塊整合到其基因組中以檢測患者的腫瘤，報告腫瘤的分子「標記」以及其早期對不同治療的反應。為了實現這一目的， 申請人:開發了變形的新技術平臺，所述技術平臺是 申請人:近期開發的用來構建新一代腫瘤選擇性複製腺病毒(O' Shea CC, Oncogene, 2005 ；24(52):7636-9.16299525 ;0' Shea CC.，Oncogene, 2005 ；24(52):7640-55.16299526)。腺病毒是天然多基因表達載體，其能夠在轉染一小時內到達細胞核(O' Shea CC, Oncogene, 2005 ；
24(52):7636-9.16299525 ；0 ' Shea CC.，Oncogene, 2005 ；24 (52):7640-55.16299526 ；Leopold PL, Crystal RG, Adv Drug Deliv Rev., 2007 ；59(8):810-21.17707546) ? 申請人:的『Adsembly』使得從來自於基因組構建部件(構建於具有與Ad2/5不同趨向性和特性或者已經被遺傳修飾以賦予改變的功能的60個以上的人和動物腺病毒)和外源元件的文庫在體外快速從頭裝配自定義的腺病毒基因組(圖2) (O' Shea CC, Oncogene, 2005 ；24(52):7636-9.16299525)。 申請人:已經使用該技術構建了 60個以上具有多種突變和轉基因表達盒的新病毒，並且已經表明使用該方法構建的病毒能夠進行高效價生長。
[0087]E1、E2和E3區域不是培養中複製所必需的或者其可由可獲得的細胞系補充(Goncalves MA, de Vries AA，Rev Med Virol.，2006 ; 16 (3): 167-86.16710837)。這些區域中的每一個都具有獨立的啟動子元件，所述啟動子元件通過選擇性剪接來驅動多種基因產物(16種基因)的表達。 申請人:將這開發為一個系統，用來改造(engineer)單個的有效診斷劑，所述診斷劑包括對不同癌症樣品中的失調的途徑活性進行多路定量測量(表I)。將所述天然病毒啟動子用在含有關鍵突變/表型的癌症中激活的啟動子替換。這些啟動子驅動4種不同的螢光報告基因融合蛋白的表達，所述螢光報告基因融合蛋白提供關於患者腫瘤中失調的關鍵途徑的額外的信息，例如，細胞核和細胞質的NF-κ B(發炎)、T0RC2 (LKBI 突變和代謝)、F0X0 (PI3-K/AK 突變)或者 SMAD 4 (TGF β 途徑突變)(ShiY, Massague J., Cell,2003 ；113 (6):685-700.12809600 ；0eckinghaus A,Ghosh S., ColdSpring Harb Perspect B1l.,2009 ；1 (4):a000034.20066092 ；ffullschleger S,LoewithR,Hall MN, Cell, 2006 ；124(3):471-84.16469695 ；ffeidinger C et al., Endocr RelatCancer, 2008 ；15(4):917-29.18775975)。使用這些試劑，任何給定腫瘤的分子損傷和惡性特徵可被快速識別(24小時以內)並可通過NanoSortlab-on-a-chip μ FACS來評分。另夕卜，這些試劑也能作為報告分子被用於快速且直接地檢測患者的腫瘤是否可能對具體治療產生反應。 申請人:的技術在幾個重要方面對之前記載的基於病毒的CTC檢測方法(Fong SM等人，Surgery, 2009 ;146 (3):498-505.19715807 ;Kojima T 等人，J Clin Invest., 2009 ；119(10):3172-81.19729837)進行了改進。通過使用「Adsembly」，可構建腫瘤應答螢光元件的文庫。Adsembly可實現多種特製的用於特定類型腫瘤和途徑突變檢測的腺病毒的快速構建。Adsembly還使得能夠簡化腺病毒的重定向，因此使CTC轉導的機會最大。最後，Adsembly使得容易從不同基因組模塊進行多基因表達，所述多基因表達增加了在CTC檢測過程中可獲得的信息量。
[0088]Lab-On-A-Chip 技術
[0089]已經提出了改善CTC計數和捕獲的方法，並且已經證明流式細胞術是成功的(Allan AL, Keeney Μ.，J Oncol.，2010 ；2010:426218.20049168)。流式細胞術可在多種參數下進行快速卻高度特異的定量的逐個細胞分析，以及能夠對CTC進行分選用於進一步的分子表徵。另外，流式細胞術是成熟的、公認的、具有商業可行性的技術。然而，多種障礙使得目前的流式細胞術在CTC的床旁檢測(point-of-care)分析中不實用。首先，必須通過人工將各個抗體移液到細胞樣品中來對細胞進行標記。由於抗體處理、移液不準確、儲存的不一致、抗體批次的差異，該過程可能會導致數據方面產生較大差異。第二，目前的流式細胞儀很昂貴而且具有較大的佔地面積(即，不可移動)。最後，目前的流式細胞儀在進行操作時在技術上和分析上都具有挑戰性。
[0090]為了解決這些技術問題， 申請人:已經開發了將微流體(microfIuidics)、光電子學(photonics)、微聲學(microacoustics)與創新性的分析技術結合在一起的lab-on-a-chip技術。這些由NanoSort.1nc授予獨佔許可的專利技術能通過堅固、便攜的、便宜的裝置使得流式細胞術能進行床旁檢測(point-of-care)，所述技術僅以當前工業翹楚的幾分之一的成本和空間滿足或超出當前工業翹楚的性能(Cho SH, Chen CH, TsaiFS,Godin JM, Lo YH, Lab Chip., 2010 ； 10 (12):1567-73.20379604 ；Cho SH et al., ConfProc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ；2009:1075-8.19965141 ；Chen CH 等人，B1medMicrodevices, 2009 ；11 (6): 1223-31.19649710 ；Chen CH,等人，In:Hawkins AR, editor.Handbook of Optofluidics: CDC Press ；2010.p.664 ；Godin J,Lo YH, B1med OptExpress, 2010 ；1 (5): 1472-9.21258563)。
[0091]基於病毒的檢測器和診斷介導的CTC的螢光顯示
[0092] 申請人:構建了一系列替換病毒E1、E3和E4轉錄單元的腫瘤途徑活性模塊，已將使用另外的修飾將所述模塊重新組裝到病毒骨架中，以賦予新的組織嗜性和其他活性。已經在人腫瘤細胞系(其具有已知的表型/突變)以及原代細胞中驗證了這些病毒診斷試劑，並且已經在培養物和人血液樣品中都得到了證實。
[0093]第一組診斷性腺病毒已經被改造以表達四種不同的螢光生物標記物，所述螢光生物標記物被用來診斷具有在RB/pl6、TGF0、生長因子/P1-3K/Ras/MAPK、LKBl/AMPK途徑中的突變的腫瘤細胞，不僅對所述腫瘤細胞進行標記為了檢測和收集，還確定所述腫瘤細胞的惡化潛能和其對治療的反應。來自Sanger中心和Cosmic資料庫的最新數據顯示EGFR在28% 的腫瘤中增加 / 突變，RB (12% ),pl6(13% ), Ras(17% ), LKBl (9% ), SMAD4(2% )。該方法的可行性已經通過以下證明:使用這類腫瘤特異性啟動子用於開發溶瘤病毒，以選擇性地誘導病毒基因在癌症中的表達，從而確保腫瘤進行選擇性病毒複製(O' SheaCC,Oncogene, 2005 ；24(52):7636-9.16299525:0 ' Shea CC.，Oncogene, 2005 ；24(52):7640-55.16299526 ；Huang TG et al., Gene Ther.，2003 ; 10 (15):1241-7.12858189 ;McCormick F., Cancer B1l Ther., 2003 ；2 (4Suppl I):S157-60.14508094 ；RiesSJ, Brandts CH, Drug Discov Today, 2004 ；9(17):759-68.15450242 ；Ch1cca EA, Nat RevCancer, 2002 ；2(12):938-50.12459732)。
[0094]例如，來自健康女性的乳腺組織含有不同的人乳腺上皮細胞(vHMEC)的亞群，在所述人乳腺上皮細胞亞群中pl6INK4a是表觀遺傳沉默的(Holst CR, Cancer Res., 2003 ；63(7):1596-601.12670910)並且所述人乳腺上皮細胞亞群被認為代表了乳腺癌惡變前的前體(Tlsty TD, J Mammary Gland B1l Neoplasia, 2004 ；9(3):263-74.15557799 ；Crawford YG 等人，Cancer Cell, 2004 ；5 (3):263-73.15050918 ；Romanov SR 等A, Nature, 2001 ；409(6820):633-7.11214324)。在圖 3 中， 申請人:表明，其中天然 El 啟動子被細胞 E2F 啟動子(Johnson L 等人，Cancer Cell, 2002 ；1(4):325-37.12086848)替換的病毒特異性地驅動vHMEC和HMEC中下遊病毒蛋白的表達。 申請人:使用類似的策略檢測和分離CTC，但是使用了不能複製的病毒，其中病毒基因現在被螢光標記物替換，這使得能夠使用整合的lab-on-a-chip μ FACS對CTC進行檢測、定量和分選。
[0095]為了達到此目的，將病毒「E1」模塊啟動子和開放閱讀框用E2F啟動子替換，所述E2F啟動子能夠驅動T0RC2-eYFP融合蛋白。這樣能夠鑑定在pRb/pl6途徑和LKBl中有突變的細胞。用兩種盒子替換病毒「E3」模塊啟動子和開放閱讀框。由血清應答元件(SRE)調控的CMV啟動子能夠驅動mCherry，從而鑑定EGFR/RAS/RAF/MAPK途徑的高度激活，TGF β調控的啟動子能夠驅動mOrange，從而鑑定具有轉移潛能的細胞。病毒「E4」模塊啟動子和開放閱讀框被驅動eGFP-FOXO的CMV主要IE啟動子替換，所述eGFP-FOXO在幾乎所有的細胞中表達並且既可以作為標準化螢光的方法也可以作為鑑定在PTEN/P1-3K/AKT途徑中有突變的細胞的方法。
[0096]為了確保CTC感染， 申請人:還引入了新創新。第一個被發現的Ad5是用於基礎和臨床研究中的最主要的腺病毒。Ad5的細胞受體是和E-鈣黏蛋白一起標記上皮細胞的CAR。然而，CAR的表達經常在正在進行上皮向間質轉化(EMT)的細胞中下調，例如這種現象可能發生在轉移過程中。為了感染和檢測這些細胞， 申請人:已經構建和驗證了幾種結合到不同細胞受體(例如CD46)的尾絲假型病毒，從而使CTC轉導的可能性最大(表2)。
[0097]已經在在原代肺和乳腺上皮細胞以及一組含有已知分子損傷的肺和乳腺癌細胞系中對該最初的一系列五種病毒(每種都祀向一種可選的受體但是都含有相同的表達盒)進行了檢驗(Neve RM 等，Cancer Cell, 2006 ; 10 (6): 515-27.17157791)。在 MOI=30下用所述五種病毒的每一種轉導細胞24小時，接著用FACS和顯微鏡進行螢光檢測。證實了在培養物中腫瘤的選擇性基因表達之後， 申請人:優化了人血液樣品情況中的病毒轉導。之前已經證明能複製的腺病毒載體(Kojima T et al., J Clin Invest., 2009 ；119(10):3172-81.19729837)和複製缺陷型腺病毒載體(Lyons M et al.,MolTher.，2006 ; 14 (I): 118-28.16580883)都能轉導全血樣品中的細胞(包括摻有腫瘤細胞的樣品)。將7.5 ml從血庫中獲得的失效的全血(expired whole blood)用含有氯化銨的紅細胞裂解緩衝液處理。接著以1、10、100或1000個細胞/ml血液的濃度向所述樣品中摻入肺癌細胞或乳腺癌細胞(Punnoose EA等，PLoS ONE.2010 ;5 (9): el2517)。摻入原代肺或乳腺上皮細胞作為副對照。對兩種轉導方案進行檢測。在一種情形中，將細胞沉澱並以每種病毒14UO5和16 PFU的濃度將五種病毒的混合物加入到樣品中。在第二種情形下，不沉澱細胞而將病毒加入到全血中。加入病毒以後，將細胞在37°C下振蕩孵育16或24小時，離心收集，用PBS洗滌2次，並通過μ FACS分選。
[0098]用於CTC 分離的 NanoSort-UCSD 臺式 μ FACS
[0099]NanoSort使用由一些NIH NCRR資助部分支持的來自Yuhwa Lo 』 sUCSD實驗室的技術開發了唯一的全功能lab-on-a-chip微型螢光激活細胞分選器(μ FACS)原型(ChoSH, Chen CH, Tsai FS,Godin JM, Lo YH, Lab Chip.，2010 ; 10 (12):1567-73.20379604 ;Cho SH 等人，Conf Proc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ；2009:1075-8.19965141 ；Chen CH 等人，B1med Microdevices, 2009 ；11(6):1223-31.19649710 ；Chen CH 等A , In:Hawkins AR, editor.Handbook of Optofluidics:CDC Press ;2010.ρ.664)。所述lab-on-a-chip μ FACS使用了用於螢光和散射檢測的晶片光學波導和獨特設計的時空編碼的結構。光學詢問後，所述裝置使用整合的壓電磁碟驅動器通過轉移有限體積(10pL到InL)的流體來分選單個細胞。圖4示出了在檢測點處的來自光倍增管(PMT)的典型的時空編碼的螢光信號(1110)，短時間後接著進行另一個時空編碼的螢光信號(1011)，由此來確認成功的分選(Cho SH 等人，Conf Proc IEEE Eng Med B1l Soc., 2009 ；2009:1075-8.19965141 ；Godin J, J B1photonics., 2008 ; I (5): 355-76.19343660)。該裝置具有以下獨特特徵:確認單獨分選事件的成功以及確保滯留每個CTC。所述檢測信號(編碼為1110)應該記錄而隨後的(1011)信號沒有記錄，該系統立刻檢測到CTC已經離開了分選器。在這種情況下，用戶可以選擇第二次處理樣品以捕獲CTC。
[0100]圖5示意性地示出了所述壓電分選器的原理和該晶片分選器如何有效地轉換(switch)液流。本文所示的液流轉換速度受限於 申請人:的CCD攝像機的速度，因此實際的液流轉換速度從而分選速度在實際中要快幾倍。圖6顯示了細胞分選的結果同時表I總結了 NanoSort-UCSD的μ FACS和BD的Mo-Flow系統之間的比較。使用μ FACS系統， 申請人:完成了 CTC的計數和分離。
[0101]FACS (螢光激活的細胞分選)被用作用於CTC計數和分離的基本模型，所述模型具有修飾和優化的lab-on-chip設計。這些修飾包括所述壓電分選器和微流體流動限制的設計。和目前的優化速度而非特異性的設計不同，優化的分選使用了使收集效率最大化以確保能夠分選每個單個CTC的設計。關於流動限制，目前的設計使用了鞘流(sheath flow)以產生側流限制，還使用了由Naval研究實驗室發明的「人字形式樣」以實現在橫向方向上的流動限制(Howell PB, Jr.，Lab Chip, 2008 ；8(7): 1097-103.18584084)。然而，由於大的懸浮細胞(例如，CTCs)具有較強升力，因此「人字形」設計對其不太有效(Godin J.整合微流體的光學系統.La Jolla:University of California, San Diego ;2010)。 申請人:會研究並優化可選的流動限制設計(例如，利用彎曲通道中的慣性力和偏心力(Bhagat A等人，微流體和納米流體，2009 ；7(2):217-26 ；Bhagat AAS 等人，流體物理，2008 ；20 (10): 101702-4 ；Di Carlo D 等人，Anal Chem, 2008 ;80 (6): 2204-11.18275222 ；Di Carlo D 等人，Proc NatlAcad Sci U S A, 2007 ； 104 (48): 18892-7.18025477))來改善 CTC 限制並聚焦在流動流中。流動流中改善的CTC限制降低了螢光和散射信號的變異係數(CV)，這能夠降低計數誤差。
[0102]使用NanoSort裝置測試樣品。 申請人:接著使用商品流式細胞儀(例如，FACSAria, BD)來測量「收集的樣品」和「廢液」中的細胞濃度。收集的樣品和廢液間的細胞比率顯示了計數準確性和分選效率
[0103]結合使用腫瘤選擇性突光病毒載體和μ FACS以檢測和分離來自臨床血液樣品的CTC
[0104]為了驗證腫瘤特異性螢光病毒載體和μ FACS技術在臨床樣品中的應用， 申請人:從來自於UCSD Moore癌症中心的來自IV期非小細胞肺癌患者中獲取外周血樣品。該特定的腫瘤對 申請人:的病毒很合適，因為該腫瘤是上皮來源的(CD45-、EpCAM+和細胞角蛋白8和18+、和/或細胞角蛋白19+)並且可以使用CellSearch CTC平臺(Veridex)對其進行檢驗。另外，該腫瘤尤其適用於 申請人:的病毒，因為該腫瘤是幾種不同的人腺病毒的天然和主要靶標。將7.5 ml全血收集在肝素化試管中，並用含有氯化銨的紅細胞裂解緩衝液處理。接著將五種病毒的混合物加入到樣品中並在37°C下振蕩孵育24小時。轉導後，將細胞以100xg進行沉澱、用PBS洗滌兩次並通過μ FACS進行分選。收集在背景上發螢光的細胞用於進一步的顯微鏡處理。 申請人:會確定用來診斷癌症標誌的細胞質或細胞核染色(圖7和8)。
[0105]將所述NanoSort實驗方案和最好的用於檢驗的可商購的系統CellSearch (Veridex)進行比較。兩種方法都分析7.5mL血液。將由臨床實驗室(ApoCell、Houston、TX)進行CellSearch。對結果進行分析、由小組進行討論並準備公布在同行評議的出版物中。
[0106]V1.實驗步驟
[0107]所有的載體都是在Ad5 Adsembly載體的基礎上操作而來。
[0108]Δ El {SREp-YFP} - {CMVp- [Foxo3-GFP]}質粒的構建
[0109]通過PCR得到質粒pENTR Ad5 Δ El CMV-GFP的骨架。該片段含有具有驅動eGFP的CMV啟動子的插入片段的Ad5基因組(GenBank登錄號AC_000008/G1:56160529F)的376-3514位的刪除。通過PCR從質粒pSRE_luc上得到SRE啟動子，並通過PCR從質粒P⑶NA3上得到BGH多腺苷酸化信號。使用序列和連接非依賴性克隆(SLIC)將SRE啟動子和BGH多聚A結合到pENTR Ad5AEl CMV-GFP骨架中以構建質粒pENTR Ad5AElSREp-CMV-GFP。這也在SRE啟動子和BGH多聚A信號之間產生了 PacI限制性酶切位點。通過 PCR 從 Ultimate ORF Collect1n (Invitrogen)中的含有 Foxo3 的 cDNA 的質粒上得到Foxo3 cDNA。通過SLIC將其直接融合到通過PCR獲得的質粒pENTR Ad5AEl SREp-CMV-GFP的骨架中GFP的N-末端。這產生質粒pENTR Ad5 Λ El SREp-CMV-[Foxo3_GFP]。最後，通過PCR從質粒pLanYFP-NT上得到Ian-YFP的cDNA，並通過SLIC將其克隆到Pac1-酶切的質粒 pENTR Ad5AEl SREp-CMV-[Foxo3-GFP]上。這產生質粒 pENTR Λ El {SREp-YFP} - {CMVp-[Foxo3-GFP]}。
[0110]Δ Ε3 {SMADrp-tdTomato}質粒系列的構建
[0111]將該五種質粒(pENTRAd5 E3、pENTR Ad5 E3 Ad5/3 尾絲、pENTR Ad5 E3 Ad5/ll尾絲、pENTR Ad5 E3 Ad5/34尾絲、以及pENTR Ad5 E3 Ad5_RGD尾絲)的每個都做下面一系列的改變。首先，通過定點誘變將E3啟動子中的27539-27542位的TATA盒子序列(GenBankAccess1n AC_000008)突變為 CATC。並且，將 27509-27514 位的 ATF 結合位點從 TCGTCA 突變為TAGGCA。這兩種改變降低了 E3啟動子的基本活性以減少假陽性讀出。接著通過PCR得到這些載體的骨架以刪除E3A和E3B區域(28130-30807位)，使用SLIC將PacI限制性酶切位點前的SMAD-應答啟動子(SMADrp)插入到該骨架中。最後，通過PCR得到tdTomato並使用SLIC將其插入到Pac1-消化的載體中。
[0112]Δ E4 {E2Flp- [mCherry-CRTC2]}質粒的構建
[0113]通過PCR得到pENTR Ad5 E4的骨架以刪除Ad5基因組的32927-35815位，並使用SLIC將其與PacI限制性酶切位點前的E2F1啟動子結合。通過PCR從病毒0NYX-411的DNA上得到E2F1啟動子。這產生質粒pENTR Ad5 Δ E4 E2Flp。通過PCR從Ultimate ORFCollect1n中的含有CRTC2 cDNA的質粒上得到CRTC2 cDNA,並且從質粒pmcherry-Cl上得到mCherry cDNA。用SGLRS胺基酸接頭將CRTC2融合到mCherry的C-末端，使用SLIC將其克隆到PacI消化的載體pENTR Ad5 Δ E4 E2Flp上。這構建了質粒pENTRAd5ΔE4{E2Flp-[mCherry-CRTC2]}。
[0114]關於PCR，使用Phus1n酶(NEB)進行所有的PCR。所有的PCR都使用Ix HF緩衝液、200 μ M每種(1見1\0.5 4]\1每種引物和1ng模板進行。PCR條件如下:98°C 30秒——10個循環的98°C 10秒、65°C 30秒(每2個循環溫度降低1°C )、對於每Ikb的PCR產物長度72 0C 30秒——72 0C 5分鐘，4°C保持。
[0115]關於SLIC，將線性片段用外切核酸酶在室溫下在以下20μ I反應體系中處理12分鐘，所述反應體系為:50mM Tris pH8、10mM MgCl2、50 μ g/mL BSA、200mM尿素、5mM DTT和0.5μ I Τ4 DNA聚合酶。通過加入Ιμ? 0.5Μ EDTA將反應終止，接著在75°C下孵育20分鐘。然後在新試管中將等量的T4處理的DNA混合至約20 μ I體積。對於結合兩個片段的SLIC，使用10 μ I的各反應液。對於結合三個片段的SLIC，使用7μ I的各反應液。通過以下方式將片段退火:加熱到65°C 10分鐘，接著緩慢冷卻以每5秒降低溫度0.5°C直至25°C。退火後，轉化5 μ I反應液並篩選克隆。
[0116]關於從改造的入門載體質粒構建病毒，使用Adsembly基因組裝配方法構建這些病毒。將20 fmol的雙向DEST載體與50 fmol的Ad5 El入門載體以及各10 fmol的Ad5 E3和E4入門載體結合。將這些載體在10 μ I的終體積中與2 μ I LR Clonase II(Invitrogen)結合。將該反應在25°C下過夜孵育(12-16小時)。通過加入1μ I蛋白酶K(Invitrogen)並在37°C下孵育10分鐘終止反應。然後將5 μ I反應液轉化到對ccdB基因產物敏感的高效感受態細菌中(>le9 cfu/yg)。隨後分離菌落並篩選完整的基因組。根據生產商的說明書使用FuGENE6 ((Roche)將陽性克隆轉染到293-E4細胞中，五天後回收病毒。
[0117]轉導原代細胞和腫瘤細胞以測定來自病毒的螢光讀出。將正常非腫瘤細胞和各種腫瘤細胞放置在顯微鏡室載玻片上。第二天，去除培養基並加入病毒接種物。病毒接種物的總感染複數等於30。2小時以後，移除所述接種物並加入新鮮培養基。24小時以後，將細胞用PBS洗滌一次，並用4%多聚甲醛固定30分鐘。固定以後，將細胞用PBS洗滌一次並進行螢光成像。
[0118]Vn.表格
[0119]表1.CTC的定量和定性測定
[0120]

【權利要求】
1.檢測受試者中癌症的方法，所述方法包括: (i)給予受試者重組報告性腺病毒； (?)使所述重組報告性腺病毒感染所述受試者中的癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞； (iii)從所述受試者中獲得含有所述報告病毒感染的癌細胞的樣品；以及 (iv)檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
2.檢測受試者中癌症的方法，所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細胞的樣品； (?)將重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸； (iii)使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞；以及 (iv)檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
3.測定測試化合物是否抑制來自癌症患者的癌細胞的生長的方法，所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細胞的樣品； (?)使重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸； (iii)使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞； (iv)使所述報告病毒感染的癌細胞有足夠的時間去生長； (v)測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平；以及 (vi)將所述水平與對照水平相比，其中和所述對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制來自所述患者的癌細胞的生長。
4.權利要求1、2或3中任一項的方法，其中所述癌症為肺癌、皮膚癌或乳腺癌。
5.權利要求1、2或3中任一項的方法，其中所述癌細胞為循環癌細胞。
6.權利要求1、2或3中任一項的方法，其中所述癌細胞為惡變前細胞。
7.權利要求1、2或3中任一項的方法，其中所述樣品為體液或組織樣品。
8.權利要求7的方法，其中所述體液為血液。
9.權利要求1或2中任一項的方法，其中所述檢測包括檢測報告基因表型。
10.權利要求9的方法,其中所述報告基因表型為突光報告基因表型。
11.分離來自受試者的樣品中的報告病毒感染的癌細胞的方法，所述方法包括將所述報告病毒感染的癌細胞與未感染的細胞分離，其中所述分離至少部分地基於所述報告病毒感染的癌細胞的表達的報告基因表型。
12.權利要求11的方法，還包括使所述報告病毒感染的癌細胞有足夠的時間去生長，從而表達所述表達的報告基因表型。
13.權利要求11的方法，其中所述未感染的細胞為非癌細胞。
14.權利要求11的方法，其中所述樣品為血液樣品。
15.含有癌細胞報告模塊和癌細胞結合模塊的重組報告性腺病毒。
16.權利要求15的重組報告性腺病毒，還包括免疫逃避模塊。
17.權利要求15的重組報告性腺病毒,其中所述癌細胞報告模塊包括與報告基因可操作地連接的癌症應答啟動子。
18.權利要求17的重組報告性腺病毒,其中所述報告基因為突光報告基因。
19.權利要求15的重組報告性腺病毒,其中所述癌細胞報告模塊是第一癌細胞報告模塊，並且所述重組報告性腺病毒還包含第二癌細胞報告模塊和第三癌細胞報告模塊。
20.權利要求19的重組報告性腺病毒,其中所述第一癌細胞報告模塊能表達第一報告基因表型，所述第二癌細胞報告模塊能表達第二報告基因表型，並且所述第三癌細胞報告模塊能表達第三報告基因表型。
21.權利要求20的重組報告性腺病毒,其中所述第一報告基因表型、所述第二報告基因表型和所述第三報告基因表型均為可檢測地不同的。
22.權利要求20的重組報告性腺病毒,其中所述第一報告基因表型指不第一癌症,所述第二報告基因表型指示第二癌症，並且所述第三報告基因表型指示第三癌症。
23.權利要求22的重組報告性腺病毒，其中所述第一癌症、所述第二癌症和所述第三癌症均獨立地是不同的。
24.權利要求20的重組報告性腺病毒,其中所述第一報告基因表型、所述第二報告基因表型和所述第三報告基因表型都指示單一癌症。
25.檢測受試者中癌症的方法，所述方法包括: (i)給予受試者權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒； (?)使所述重組報告性腺病毒感染所述受試者中的癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞； (iii)從受試者中獲得含有所述報告病毒感染的癌細胞的樣品；以及 (iv)檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
26.檢測受試者中癌症的方法，所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細胞的樣品； (?)使權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸； (iii)使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞；以及 (iv)檢測所述報告病毒感染的癌細胞從而檢測了所述受試者中的癌症。
27.權利要求25或26中任一項的方法，還包括給予所述受試者癌症治療。
28.測定測試化合物是否抑制來自癌症患者的癌細胞的生長的方法，所述方法包括: (i)從受試者中獲得含有癌細胞的樣品； (?)將權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒與所述癌細胞接觸； (iii)使所述重組報告性腺病毒感染所述癌細胞從而形成報告病毒感染的癌細胞； (iv)使所述報告病毒感染的癌細胞有足夠的時間去生長； (v)測定所述報告病毒感染的癌細胞的生長水平；以及 (vi)將所述水平與對照水平相比，其中和對照水平相比的低水平表明所述測試化合物抑制來自所述患者的癌細胞的生長。
29.檢測癌症的試劑盒，所述試劑盒包括權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒。
30.篩選癌症藥物的試劑盒，所述試劑盒包括抑制癌症的化合物和權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒。
31.分離癌細胞的試劑盒，所述試劑盒包括用於檢測表達的報告基因表型的裝置和權利要求15-24中任一項的重組報告性腺病毒。
【文檔編號】G01N33/569GK104204805SQ201380014047
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月14日 優先權日:2012年3月14日
【發明者】C·奧謝, C·帕沃斯 申請人:薩克生物研究學院