一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒應用的製作方法

2023-12-03 13:50:56 1

專利名稱：一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說涉及一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的應用。
背景技術：
植物對環境變遷及不良環境有足夠的適應性和抗抵能力，這種抗逆性既受系統發育的遺傳基因所控制，又受個體發育中生理生態所制約。植物抗寒機理的闡明，不僅有著重要的科學理論意義，而且具有重要的應用價值。全球每年因低溫寒害造成農作物的損失高達數千億美元。因此，長期以來，已有多種學科，如植物生理學、形態學、遺傳育種學、生物化學、生物物理學、細胞生物學及分子生物學等，從多方面對植物抗寒機理進行了廣泛的研究。
Weiser認為植物在適應低溫過程中基因表達發生改變。Guy等研究發現冷馴化能誘導和增加一些基因的表達，使多種基因表達發生改變。這些冷誘導基因表達的產物可分為兩類，一是調控蛋白，調控寒冷信號傳導、抗寒基因表達和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，與植物抗寒性的提高直接相關。隨著科學技術的不斷發展，人們已成功利用轉基因技術將已獲得的冷調節基因轉入到不抗寒植株中，研究結果證明，冷調節基因確實具有提高植物抗寒力的功能。但同時也存在一些轉基因植株抗寒力提高不明顯的例子。Claudia等利用農桿菌介導法將菠菜中的CAP160、CAP85基因轉入菸草中，結果發現轉基因植株的LT50與野生型無明顯差別，說明兩蛋白對植物抗寒力的提高影響不大。這同時也證明植物抗寒力是由多組基因調控的累積性狀，利用單一基因轉移技術來提高植物抗寒力，其效果非常有限，只有多個冷調節基因共同協作才能達到增強植物抗寒力的目的。就目前基因轉化技術來看，利用多基因轉化提高植物抗寒力，仍需待以時日。
人們在研究極地魚類和昆蟲時，發現它們體內有一種抗凍蛋白(AFP)。這種蛋白能夠導致熱滯並能抑止重結晶，從而提高這些生物對寒冷的耐性。但人們在植物中一直沒有找到抗凍蛋白。1998年，Worrall等在胡蘿蔔中發現抗凍蛋白，它能抑止重結晶，並與多聚半乳糖醛酸酶抑止蛋白(PGIPs)的序列高度同源。PGIPs屬於一個蛋白家族——富含亮氨酸的重複結構(Leu-rich repeat，LRR)蛋白家族。LRR的特點是保守序列GxIPxxLGxLxxLxxLxLxxNxLx，它參與激素受體反應、酶的抑制、細胞粘附、細胞運輸和哺乳動物細胞早期發育。PGIPs可特異的抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶活性，但不抑制植物的或細菌的，從而引起植物對真菌的防禦反應。研究人員致力於尋找能夠提高植物抗寒能力的基因，這具有深遠的經濟價值。

發明內容
本發明的目的在於提供一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1在提高植物抗寒性方面的應用。
本發明的技術方案如下本發明所述抗寒功能的AtPGIP1基因是用BLAST的方法，通過與胡蘿蔔PGIP序列的比對，從擬南芥信息資源TAIR資料庫中得到的；在乾旱、冷和鹽誘導處理的擬南芥cDNA文庫中篩選發現的，其在GenBank中的編號是AT3G55530，該基因的CDS長993bp，5』UTR長23bp，3』UTR長153bp，編碼330aa的蛋白。
用SMART程序分析預測AtPGIP1蛋白，該蛋白含有四個LRR結構域和一段信號肽。
AtPGIP1基因序列是用BLAST的方法，通過與胡蘿蔔PGIP序列的比對，從擬南芥信息資源TAIR資料庫中得到的。AtPGIP1基因用如下引物從我們自己構建的擬南芥(生態型Landsberg eracta)的cDNA文庫中通過PCR擴增出來5』-CGGGATCCATGGATAAGACAG-3』和5』-CGGGATCCTAGAGAT AAGCTT-3』，然後通過BamHI酶切連入pBluescript構建重組載體pBS-PGIP1，並轉入大腸桿菌進行擴增。重組載體pBS-PGIP1經XbaI和SalI酶切，載體pBA002經XbaI和XhoI酶切，SalI和XhoI是同尾酶，酶切後可產生相同的粘性末端，片段和載體連接轉入大腸桿菌進行擴增，得到重組載體pBA002-PGIP1。將pBA002-PGIP1轉入根癌農桿菌，進行擴大培養，用真空法轉化擬南芥。收穫的種子經過篩選，並用葉片PCR進行鑑定，得到高表達AtPGIP1的轉基因植物。
本發明的有益效果本發明破譯了擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的功能，證實了該基因能夠提高植物的抗寒能力。該基因的應用可降低全球每年因低溫寒害而造成的農作物的損失，有著巨大的經濟價值和應用前景。


圖1為AtPGIP1和AtPGIP2在基因組上的位置和推測的AtPGIP1的結構域；圖2為0℃處理後AtPGIP1和AtPGIP2表達量的northern結果；圖3為AtPGIP1轉基因植物表達量的Nothern blot結果；圖4為低溫處理wt、轉P35S-PGIP1植物和突變體pgip1植物的結果。
其中，圖1中A為AtPGIP1和AtPGIP2在基因組上的位置，箭頭部分表示開放讀碼框，兩個基因中間都有內含子；B為推測的AtPGIP1的結構域；AtPGIP1含有四個LRR結構域和一段信號肽。圖3中，7.2，8.1，16.2，21.4為轉Pubiquitin-PGIP1植物，1，4，5，6，13，17為轉P35s-PGIP1植物。
具體實施例方式
用來做野生型(wt)、突變體(mutant)和轉基因的擬南芥的生態型是Columbia。種子滅菌後在MS的平板上萌發，4℃春化3天，然後生長在22℃的溫室中，每天16小時的光周期。兩星期後移入土中，在同樣的條件下生長。
實施例1將野生型的植物在0℃處理不同時間，然後進行Northern分析，結果如圖2所示，發現AtPGIP1和AtPGIP2的表達量變化有所不同。這說明AtPGIP1可被冷誘導，而AtPGIP2不能被冷誘導，所以AtPGIP1基因是與冷誘導相關的。
實施例2將AtPGIP1基因分別克隆到含有單子葉植物的啟動子ubiquitin和雙子葉植物的啟動子35S的表達載體中，農桿菌介導轉入野生型擬南芥，得到轉基因的植株。我們總共選了9棵來做Nothern blot分析，結果如圖3所示，發現不同植株的AtPGIP1表達量不同，野生型植株中有少量表達，而突變體植株中沒有表達。而轉Pubiquitin-PGIP1植物的總體表達水平比轉P35s-PGIP1植株要高。
實施例3寒冷試驗本發明在低溫條件下處理wt、轉P35S-PGIP1植物和突變體pgip1植物。三種植物在4℃處理兩個月，10℃處理半個月，之後在15℃處理兩個月。結果如圖4所示，轉基因植物AtPGIP1的植株最大，而突變體pgip1的植株最小，冷處理對轉P35S-PGIP1植物的生長影響最小。該實驗說明，PGIP1基因的表達能提高植物對寒冷的耐受性。
實施例4 RNA提取和Northern blot分析用熱酚法分別提取約兩周大的wt、轉P35S-PGIP1植物和pgip1突變體植物的總RNA，進行Northern blot分析。Northern blot的探針用Redi-prime的試劑盒進行製備。Nothern blot結果表明與野生型植株比較，轉P35S-PGIP1植株中AtPGIP1的表達量有所增高，而突變體中則沒有表達。
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權利要求
1.一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1在提高植物抗寒能力上的應用，其特徵在於所述基因AtPGIP1來源於擬南芥cDNA文庫，其在GenBank中的編號是AT3G55530，核苷酸序列如序列表所示，編碼330個胺基酸，胺基酸序列如序列表所示。
全文摘要
本發明公開了一種擬南芥多聚糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1的抗寒應用。本發明所述抗寒功能的AtPGIP1基因是用BLAST的方法，通過與胡蘿蔔PGIP序列的比對，從擬南芥信息資源TAIR資料庫中得到的；在乾旱、冷和鹽誘導處理的擬南芥cDNA文庫中篩選發現的，其在GenBank中的編號是AT3G55530，該AtPGIP1基因的CDS長993bp，5′UTR長23bp，3′UTR長153bp，編碼330aa的蛋白。本發明證實了該基因能夠提高植物的抗寒能力，對該基因的應用可降低全球每年因低溫寒害而造成的農作物的損失，有著巨大的經濟價值和應用前景。
文檔編號C12N15/29GK1609218SQ20041005229
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月19日 優先權日2004年11月19日
發明者謝旗, 劉媛媛 申請人:中山大學