一種新的11個x染色體str基因位點及其分型方法
2023-10-17 19:43:29 1
專利名稱：：一種新的11個x染色體str基因位點及其分型方法
技術領域：
：本發明涉及一種核酸檢測方法，特別涉及11個新的X染色體STR基因位點及其分型方法。
背景技術：
：短串聯重複序列(shorttandemr印eats，簡稱STR)是由2-7個鹼基對作為核心單位，串聯重複形成的一類微衛星DNA序列，其片段可採用PCR技術擴增。STR主要由於核心重複單位數目的變化形成了STR基因位點的遺傳多態性，其等位基因可用銀染、螢光標記和放射自顯影等技術分型。人類基因組中，平均每6-10kb就存在有一個STR基因位點，為法醫個人識別和親子鑑定提供了高信息基因位點的豐富來源。STR在研究與應用中具有以下顯著的優點良好的重複性，分型結果穩定可靠，操作簡單快速；片段長度一般在100400bp，容易通過PCR擴增、電泳分型，適用於各種檢材及高度降解檢材的檢測；三核苷酸、四核苷酸重複的STR位點PCR擴增結果穩定，產生的附加帶、影子帶少，容易分型；是繪製人類遺傳圖、疾病基因連鎖分析、遺傳病診斷、個體識別等分析工作的重要工具。STR的分型，目前最常用的是應用PCR擴增STR，將擴增產物進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，根據片段的大小決定基因型並計算等位基因頻率及遺傳距離並構建系統發育樹。對於PCR產物的檢測可用自顯影技術，PAGE結合銀染，以及螢光標記序列儀自動分析系統。X染色體STR位點廣泛存在真核細胞基因組中，高度穩定且具有較高的遺傳多態性，但與常染色體和Y染色體STR相比，迄今發現和應用的X—STR位點數量非常少，群體分布、突變率、連鎖平衡、基因結構等方面的信息尚不夠豐富，在法醫學、醫學等領域的應用受限，遠不及其他DNA遺傳標記廣泛。但X染色體STR對於親子鑑定、個體識別、性別鑑定、X連鎖遺傳致病基因定位、易感基因的檢出，多基因遺傳病致病基因的定位、發病的分子遺傳機理研究、藥物的設計及使用等方面有獨特的優勢。故X染色體的有關研究有重要的意義。X染色體遺傳標記的研究在國內還處於初期，目前國際上商品化檢測試劑盒僅有德國BiotypeArgusX-8，該類試劑盒在法醫學應用實踐中存在以下問題1)採用這類試劑盒需要增加遺傳標記時遇到困難；2)這些X-STR基因位點都是基於中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發的，其中有些基因位點，在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低。3)國外商品化試劑盒價格昂貴。這些缺點限制了X染色體遺傳標記在國內的應用，不利於進一步在基層推廣。
發明內容本發明所要解決的技術問題就是尋找更多的能應用於法醫學等領域的X染色體STR位點並進行群體遺傳學研究。本發明提供了一種新的11個X染色體STR基因位點及其分型方法，其特徵在於，選用的11個X-STR位點覆蓋了X染色體全長，在短臂的位點有DXS7130(4.15Mb)，DXS8378(8.78Mb);其餘都位於長臂上DXS7132(60.8Mb)、DXS7424(99.39Mb)、DXS6789(91.95Mb)、DXS6799(92.95Mb)、DXS7133(107.8Mb)、DXS101(100.08Mb)、DXS6804(110.8Mb)、HPRTB(123.8Mb)、DXS7423(148.35Mb)。(表l)本發明所選的11個X-STR位點，擴增片段最小的是DXS7133位點，102-126bp;擴增片段最大的位點是DXS6799和HPRTB，271-299bp。所有位點片段大小適中，均適宜PCR擴增。表ltableseeoriginaldocumentpage6ll個X染色體STR等位基因分型方法，其特徵在於，包括下列步驟:1.採用PCR分別擴增11個X染色體STR基因位點的DNA，並設計位點的上下遊引物序列，將上下遊引物稀釋成100uM0L/L，作為母液，取出10lii稀釋到5uM0L/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20uL，含IX反應緩衝液，1.5mM0L/LMgc:U，0.5UTaq酶，0.25PMOL/L引物，200uM0L/LdNTP，DNA20200ng。2.PCR擴增基礎參數為94。C預變性3min，94"C變性lmin，根據位點的不同復性溫度進行30秒、72t:延伸lmin，共計28-32個循環，最後72°C延伸15min;(具體參數見表3)3.擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，採用銀染顯色方法，結合等位基因分型標準物進行標準化分型。上述等位基因分型標準物的製備包括下列步驟-1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與載體pGEM—T進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a;3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板上，過夜培養；4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用；5)以質粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑑定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小；6)確定片段大小後大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。本發明的ll個X染色體STR基因位點已在申請人的實驗室應用於中華民族群體遺傳資料調查，並獲得了多個民族群體的分型結果，經統計學處理證明，該11個X-STR位點完全可以應用在法醫學、人類學、遺傳學和疾病等領域的個體識別、親子鑑定以及基因診斷等方面，結果顯示我國人群與國外人群X-STR遺傳學特點有顯著性差異，具有中國特色。本發明的ll個X染色體STR位點用聚丙烯醯胺凝膠電泳，銀染顯色方法篩選出，可應用於法醫學等領域，並製備了各位點等位基因分型標準參照物(Ladder),對X染色體STR位點的PCR引物和擴增條件進行了優化，其中PCR引物和擴增條件的優化和分型標準參照物的製作使本發明可以做到標準化和簡單化並適合基層單位普及。本發明帶來的技術優點是，擴增產物使用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，用銀染檢測分型，所需儀器和設備簡單，操作方便，適合在基層單位普及，對於中國目前的情況可以得到良好的效果。本發明可以填補國內沒有實用化的X-STR檢測技術和方案的空白，並在中國多個民族中獲得滿意的結果，利用這種技術製備的X染色體段串聯重複序列分型試劑盒，可進行商業化生產並推廣為國內各個實驗室使用該技術克服了使用國外試劑盒無法反映中國多民族遺傳特點的缺陷，可以應用於親子鑑定、個體識別、性別鑑定、X連鎖遺傳致病基因定位、易感基因的檢出，多基因遺傳病致病基因的定位、發病的分子遺傳機理研究、藥物的設計及使用等方面，具有廣泛的應用前景。一種複合化合物的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種複合化合物的製備方法，具體來說是一種可用作發光材料前驅物用途的具有特定比表面積和分散指數的複合化合物的製備方法。
背景技術：
：Eu、Tb、Dy、Gd、Ce、Mn元素所具有的特定電子結構使得通過調整基質材料和合成條件，可以得到多種功能材料。尤其是作為發光材料激活劑離子時，發射光譜可覆蓋從紫外到近紅外的廣闊範圍，同時由於相應的發光材料具有高的發光強度、高的顯色性等優點，目前己經在照明和顯示等領域得到廣泛的應用,，與之相應的電視、節能燈成為人們日常生活中不可或缺的組成部分。隨著科學技術的不斷發展，人們對電視、節能燈等器件的要求不斷提高，尤其在電視方面，大屏幕、高解析度、長壽命、高亮度電視已經逐漸成為市場需求的主流。為了適應顯示及照明領域的迅速發展，技術方面對發光材料的要求也不斷提高，高亮度、高穩定性、粒度分布集中、形貌規則的新型發光材料已經成為市場所趨。為了製備高性能的新型發光材料，科學家們從製備方法、製備原料等方面進行著不懈的努力，尤其近十年內，包括共沉澱法、溶膠凝膠法、燃燒法、噴霧熱解法等新型的軟化學製備方法層出不窮，逐步在為取代傳統的高溫固相法奠定了一定的基礎，通過前驅物的高溫處理來製備發光材料正在成為一個業界共知的趨勢。在製備發光材料前驅物的軟化學方法中，目前最為常用的是共沉澱法。該過程主要是通過在溶液體系中加入一定量的沉澱劑來生成沉澱，然後過濾、烘乾沉澱物，在高溫條件下焙燒沉澱物即可得到前驅物。這種方法的優點在於容易大規模生產，並且產物成份的均一性較好，目前在丫203:Eu螢光粉的製備中己經得到大規模的應用。但是，沉澱法的一些缺點卻一定程度上限制了其大規模應用，尤其在稀土激活的發光材料方面應用並不廣泛。具體如下1)中重稀土離子的沉澱過程容易出現膠狀，條件難以控制。Eu、Tb、Dy、Y、Gd等中重稀土離子的氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽的Ksp值都很小，調節pH值或者與相應的酸根反應容易生成沉澱，但是，除草酸鹽外，中重稀土的大部分反應沉澱物呈膠狀，只有精確控制其pH值、溫度、濃度等綜合條件才能夠生成易於過濾的沉澱物。在實際的操作中，這些條件非常苛刻並且難以掌握，一旦任何一個條件發生tableseeoriginaldocumentpage93.變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離擴增產物聚丙烯醯胺凝膠的製備(6%):1)用250ml的小燒杯稱取42克超純的尿素，依次加入54ml的1XTBE溶液、12ml40%丙烯醯胺和亞甲基雙丙烯醯胺膠液(19:1)，放在磁力加熱攪拌器上，7(TC左右加熱攪拌促進尿素完全溶解。2)尿素完全溶解後，冷卻至室溫，加350ul的10XAPS和35tU的TEMED搖勻後開始灌膠。3)將膠液快速倒在方平的長玻璃板上，短玻璃板置長玻璃板上水平推動，灌好膠後，將鯊魚齒梳反向插入膠板之間封口，注意封膠梳插入的深度。用八個燕尾夾將兩塊玻璃板一起固定住。灌好的膠室溫聚合約2小時待用。預電泳、上樣和電泳:1)凝膠聚合後將梳子取出，用水衝洗膠板去除多餘的凝膠碎片，用純水將加樣槽衝洗乾淨。將膠板固定到電泳槽上，短板向裡，向下壓緊海綿墊，將四個螺旋鈕扭緊固定住膠板，關閉上槽電極液排放開關。在上槽倒入適量電極液(1XTBE)沒過短板，在下電泳槽中倒入適量電極液，將梳子用純水衝洗乾淨插入加樣槽中(梳子尖插入凝膠約12mm)，關閉上下電泳槽蓋，接通電流，預電泳約1小時，使凝膠溫度達到3CTC以上。在預電泳前，可將電極緩衝液放在56'C搖床上預熱，可以縮短預電泳時間。預電泳條件電壓1000V左右，電流30-40rnA，功率約38W。2)將PCR管做好標記，每管加入3.On1的2X上樣緩衝液(2Xloadingsolution),然後分別加入1.03.0ul擴增好的樣品(包括待檢樣本和己知的GM9947樣本)及等位基因標準品(Ladder),混勻後放入擴增儀中95'C變性310分鐘，取出後立即放入冰浴中，準備上樣。PCR產物上樣量應注意調整。3)結束預電泳後，用吸管吹打加樣槽，去除氣泡。然後取3.0yl製備好的樣品加到鯊魚齒梳子中，加樣過程應避免產生氣泡並儘可能減少加樣時間。注意加樣次序及對照、AL位置。4)樣品加完後，立即接通電流，40W恆功率進行電泳。電泳時間根據不同擴增產物大小而定，時間大約為2小時到4小時；4.凝膠的銀染及顯色1)電泳結束後，取出膠板，將梳子取出，用適當的工具將兩玻璃板分開，將粘有膠的長板放入水平搖床上的染色盤中。2)向染色盤中加入1000ml固定液(10%乙酸)，沒過凝膠，室溫搖動20分鐘。將固定液倒出並回收，然後加入純水，沒過凝膠，洗三次，每次25分鐘。3)加入1000ml染色液，室溫下避光搖動30分鐘。將染色液倒出，加入純水洗10秒鐘後將膠板取出，用純水衝洗膠板的背面，倒掉純水，將膠板重新放入染色盤中。加入1000ml顯色液(預冷至4'C1(TC)，用肉眼進行觀察，直到電泳條帶清晰後，倒去顯色液，加入1000ml停顯液(10%乙酸)，10分鐘後取出膠板，用蒸餾水衝洗一會兒，晾乾，用掃描儀將結果保存到計算機中。5.等位基因分型標準物系統建立1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與載體pGEM—T進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a;3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板上，過夜培養；4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用；5)以質粒DNA為模板，作PCR擴增，對各等位基因分型標準物進行鑑定；注意同時用25bpDNA標準參照物、測序樣本及標準細胞株GM9947A作對照，以確定標準片段大小；6)確定片段大小後大量擴增，將不同大小片段的等位基因混合即成等位基因分型標準物。權利要求1.一種新的11個X染色體STR基因位點，其特徵在於，該11個X染色體STR位點覆蓋了X染色體全長，在短臂的位點有DXS7130，DXS8378；其餘都位於長臂上，它們是DXS7132，DXS7424，DXS6789，DXS6799，DXS7133，DXS101，DXS6804，HPRTB，DXS7423；所有位點片段大小適中，均適宜PCR擴增。2.權利要求1所述的11個X染色體STR等位基因分型方法，其特徵在於，包括下列步驟採用PCR分別擴增11個X染色體STR基因位點的DNA，並設計位點的上下遊引物序列，將上下遊引物稀釋成100uMOL/L，作為母液，取出10"l稀釋到5uMOL/L，作為工作液；PCR擴增體系的體積為20uL，含1X反應緩衝液，1.5mM0L/LMgcl"0.5UTaq酶，0.25PMOL/L引物，200uMOL/LdNTP，DNA20200ng。PCR擴增基礎參數為94'C預變性3min,94'C變性lmin，根據位點的不同復性溫度進行30秒、72'C延伸lmin，共計28-32個循環，最後72'C延伸15min;擴增產物使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，採用銀染顯色方法，結合等位基因分型標準物進行標準化分型。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的等位基因分型標準物的製備包括下列步驟1)將具有不同基因型的純合子PCR產物分別與載體pGEM—T進行連接反應。2)連接反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a;3)塗布在氨苄青黴素瓊脂平板上，過夜培養；4)挑菌，大搖，提取質粒DNA，備用；4.摩擦凸輪及其齒輪還是與各自的擺動件動配合，各自的擺動件的擺動軸與各自軸承座動配合，各自擺動件帶有各自配重件，各自的擺動件摩擦輪的齒輪與對應半環摩擦凸輪的齒輪相互嚙合。這樣的共軸可以做為輸入軸或其中一個齒輪可以同傳動機構傳動連接。擺動件優選曲軸。機架的驅動傳動機構帶動多組的摩擦輪共同輸入轉動，並通過各組嚙合的齒輪同步傳動，帶動各組的摩擦輪和半環摩擦凸輪同步轉動；半環摩擦凸輪凸起部分轉到搗固錘杆側面時，各組摩擦輪和半環摩擦凸輪就夾持搗固錘杆提起；半環摩擦凸輪凸起部分轉離搗固錘杆側面時，各組摩擦輪和半環摩擦凸輪就不能夾持搗固錘杆，搗固錘在重力的作用下下落夯實煤餅。擺動件的配重體利用重力迫使擺動件帶動半環摩擦凸輪趨向搗固錘杆，自動補償因磨損造成的偏差。每組搗固錘只有一個半環摩擦凸輪，半環摩擦凸輪外緣周一部分為凸起的半圓環形，靠凸起部分轉到與搗固錘杆相對的位置，與搗固錘杆接觸，靠摩擦力提起搗固錘。半環摩擦凸輪對搗固錘杆的摩擦壓力的保持，是靠配重件的重力通過擺動件(如半環摩擦凸輪的偏心軸套或半環摩擦凸輪動配合的曲軸)，使半環摩擦凸輪總是保持壓力，並補償磨損造成的誤差。這樣不但可以利用配重件使半環摩擦凸輪對搗固錘杆自動產生比較恆定的夾持壓力及摩擦壓力，特別是半環摩擦凸輪磨及搗固錘杆的摩擦板損後，配重件帶動擺動件自動補償，使半環摩擦凸輪壓向搗固錘杆的壓力幾乎不變，而且結構大大簡化，更便於各組搗固錘;^f擦輪、半環摩擦凸輪定位裝配。可以單獨頂起某組配重體，使相應半環摩擦凸輪偏離搗固錘杆，搗固錘不進行工作而單獨進行修理更換。本發明的調心式夾板錘搗固機，夾錘可實現機械調整(工作過程中可隨時調整)，安裝過程可調整到理想工作點，生產一段時間後，還可以通過配重件進行偏心調整來彌補因摩擦產生的誤差，工作過程的波動也可通過自動調心來完成。附圖表示了本發明的一種調心式夾板搗固機結構示意圖，其中圖l調心式夾板搗固機單組機構部分的工作原理結構圖，圖2為調心式夾全文摘要本發明公開了一種新的11個X染色體STR基因位點及其分型方法，選用的11個X-STR位點覆蓋了X染色體全長，在短臂的位點有DXS7130，DXS8378；其餘都位於長臂上，它們是DXS7132、DXS7424、DXS6789、DXS6799、DXS7133、DXS101、DXS6804、HPRTB、DXS7423。所有位點片段大小適中，均適宜PCR擴增。本發明的11個X染色體STR基因位點已在申請人的實驗室應用於中華民族群體遺傳資料調查，並獲得了多個民族群體的分型結果，經統計學處理證明，該11個X-STR位點完全可以應用在法醫學、人類學、遺傳學和疾病等領域的個體識別、親子鑑定以及基因診斷等方面，結果顯示我國人群與國外人群X-STR遺傳學特點有顯著性差異，具有中國特色。文檔編號C12N15/12GK101225387SQ20081001740公開日2008年7月23日申請日期2008年1月25日優先權日2008年1月25日發明者兵餘,劉清波,張洪波,李生斌申請人:西安交通大學