用於診斷前列腺癌的新型RNA‑生物標誌物標籤的製作方法

2023-11-30 10:40:06 2

本發明屬於生物化學領域。特別地，本發明屬於分子生物學領域。更特別地，本發明涉及rna轉錄物的分析。最特別地，本發明屬於前列腺癌診斷領域。
背景技術：
：前列腺癌是男性中最常見的癌症。2012年，新診斷的前列腺癌病例數量在美國約為24萬例，歐盟約為36萬例，其中德國為68,000例。在美國，目前估計前列腺癌診出和前列腺癌死亡的終身風險分別為15.9％和2.8％。儘管對前列腺癌進行了廣泛的篩查，並在治療轉移性疾病方面取得了重大進展，但在西方世界前列腺癌仍然是每年25萬男性患癌死亡的第二大常見原因。目前，前列腺特異性抗原(psa)血清水平的檢測和直腸指檢是兩種主要的篩查方法。通常建議結果異常的患者進行前列腺活檢。然而，這會有嚴重的後果。產生大量假陽性結果的psa篩查因缺乏特異性導致全世界每年有數百萬男性進行不必要的前列腺活檢(過度診斷)。此外，進行活檢帶來感染性併發症的重大風險。因此，對於早期前列腺癌診斷迫切需要一種更靈敏和特異性更高的診斷試驗以改善前列腺癌篩查並避免大量不必要的前列腺活檢。本發明通過提供一系列用於篩查和診斷前列腺癌的生物標誌物來解決這個問題。發明概述通過對前列腺癌患者和對照的64個樣本進行二代測序鑑定了在腫瘤組織和對照組織中差異表達的轉錄物，並通過微陣列和qrt-pcr分析對256個樣本和56個樣本分別進行驗證。本發明描述了rna生物標誌物，其迄今尚未被發現適用於前列腺癌的診斷。本發明涉及一種用於診斷前列腺癌症的方法，其包括分析患者樣本中至少兩種核酸的表達水平的步驟，其中所述至少兩種核酸選自至少兩組核酸，其中所述組由以下構成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38其中，如果所述至少兩種核酸的表達水平高於閾值，則所述樣本被認定為前列腺癌陽性。本發明還涉及在嚴格條件下與上述組中的核酸雜交的一系列核酸。本發明進一步涉及該方法用於診斷前列腺癌的用途。本發明還涉及用於診斷前列腺癌的試劑盒，其包括至少兩個引物或者探針，所述引物或者探針在嚴格條件下與至少兩種核酸雜交，其中所述至少兩種核酸選自至少兩組核酸，其中所述組具有下列組成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38定義為用於本申請文中的特定術語提供以下定義。如本發明所用，「核酸」或者「核酸分子」通常指可以是未經修飾或者修飾的任何核糖核酸或者脫氧核糖核酸。「核酸」包括但不限於單鏈和雙鏈核酸。如本發明所用，術語「核酸」還包括如上所述的包括一個或者多個修飾鹼基的dna。因此，具有因穩定性或其他原因經過修飾的主鏈的dna是「核酸」。本發明所用的術語「核酸」包括化學、酶學或代謝修飾形式的核酸，以及病毒和細胞dna特徵的化學形式，包括例如簡單和複雜的細胞。本發明上下文中的術語「水平」或者「表達水平」指的是生物標誌物存在於患者樣本中的水平。通常，通過將生物標誌物的表達水平與用於標準化的樣本中的一個或者幾個管家基因進行比較來測量生物標誌物的表達水平。如果生物標誌物的表達水平超過合適的對照(例如健康的組織)的相同生物標誌物的表達水平設定的閾值，則來自患者的樣本被認定為前列腺癌陽性。本發明所用的術語「分析樣本中核酸的存在和/或水平」或者「具體估計核酸的水平」涉及用於評估和定量核酸水平的方式和方法。一種有用的方法是，例如，定量逆轉錄pcr。同樣地，也可以通過例如northern印跡法、二代測序或者包括測量擴增後在260和280nm處吸光度的光譜技術來分析rna水平。如本發明所用的術語「擴增」，當其應用於核酸序列時，指的是從一個核酸模板序列產生特定核酸序列的一個或者多個拷貝的過程，優選通過聚合酶鏈式反應的過程。其他的擴增方法包括，但不限於，連接酶鏈式反應(lcr)、基於特異性多核苷酸的擴增(nsba)或者本領域公知的任何其他方法。如本發明所用，關於診斷標誌物或者預後標誌物使用的術語「關聯」將來自病人的樣本中標誌物的存在或者量與來自一個已知具有某種症狀或者存在具有該症狀風險的人的樣本的標誌物的存在或者表達水平相比較。患者樣本中標誌物的表達水平可以與已知與特定診斷相關聯的水平進行比較。如本發明所用，術語「診斷」涉及鑑定任何發展階段的疾病，在本發明中指的是前列腺癌，並且還包括確定受試者發展該疾病的傾向。術語「ensembl基因idensg00000245750.3」涉及ensembl的基因id序列注釋。屬於相同基因id的轉錄物可能具有不同的剪接事件、外顯子，並且可能產生差別極大的蛋白質。這些蛋白質是因選擇性剪接而產生的異構體。所述ensembl基因id在其他的注釋系統例如，rp11-279f6.1,或者基因座(hg19)chr15:69,755,365-69,863,775(+)具有等同物。在本發明中，任何ensembl注釋的等同物均可以使用。術語「ensembl基因idensg00000255545.3」涉及ensembl的基因id序列注釋。屬於相同基因id的轉錄物可能具有不同的剪接事件、外顯子，並且可能產生差別極大的蛋白質。這些蛋白質是因選擇性剪接而產生的異構體。所述ensembl基因id在其他的注釋系統例如，rp11-627g23.1或者基因座(hg19)chr11:134,306,367-134,375,555(+)具有等同物。在本發明中，任何ensembl注釋的等同物均可以使用。如本發明所用，術語「螢光染料」指的是吸收特定波長的光能並以不同波長重新發光的任何化學物質。適用於標記核酸的螢光染料包括例如：fam(5-或6-羧基螢光素)、vic、ned、螢光素、fitc、ird-700/800、cy3、cy5、cy3.5、cy5.5、hex、tet、tamra、joe、rox、bodipytmr、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅、亞基馬黃(yakimayellow)、阿利克夏染料(alexafluor)以及pet等等。如本發明所用，當術語「分離的」用於提及核酸時，其意指天然存在的序列從其所在的正常細胞(例如染色體)環境中去除，或者在非天然環境中合成(例如人工合成)。因此，所述「分離的」序列可以在無細胞的溶液中，或者被置於不同的細胞環境中。如本發明所用，「試劑盒」指的是一個封裝的組合；該組合可選擇地包括該組合的使用說明和/或使用該組合需要的其他反應物和組件。如果所述試劑盒包括核酸，所述試劑盒還可以包括所述核酸的合成或者非天然突變體。合成的或者非天然的核酸應被理解為包含任何化學、生物化學或者生物學修飾的核酸，這樣的核酸並非以此形式出現於自然界中。這些修飾包括但不限於：帶有螢光染料或者淬滅劑標記、生物素標籤以及核酸骨架的修飾，或者將上述核酸區別於其天然對應物的任何其他修飾。上述說明同樣適用於其他天然化合物例如蛋白、脂質等。本發明所用術語「患者」指的是因為疾病或者懷疑患有疾病而正在接受醫療護理或者應該接受醫療護理的活著的人或者非人生物。這包括正在被調查病理徵兆的尚未確定疾病的人。因此本發明所述的方法和試驗適用於人類和獸類疾病。本發明所用屬於「引物」，指的是核酸——無論其是純化的限制性消化中自然出現或者以合成方式產生的，當將該核酸置於引物延伸產物合成的條件下，其可以作為合成的起始點；其與一條核酸鏈互補，並在核苷酸、誘導劑例如dna聚合酶的存在下，及合適的溫度和ph時被誘導。所述引物可以為單鏈或者雙鏈，其必須足夠長以引導所需延伸產物在誘導劑存在下合成。引物的確切長度取決於眾多因素：包括溫度、引物的來源以及所用方法。優選地，引物的長度為大約15-100個鹼基；更優選地為大約20-50個鹼基；最優選的為大約20-40個鹼基。關於確定引物合適長度的因素對本領域普通技術人員而言是容易獲知的。可選擇地，上述引物可以是合成的元件，即其包含化學、生物化學或生物學修飾。這些修飾包括但不限於：帶有螢光染料或者淬滅劑標記，或者核酸骨架中的修飾，或者將上述引物區別於其天然對應物的任何其他修飾。術語「探針」指的是任何可用於特異性檢測生物實體的元件，例如核酸、蛋白或者脂質。除了可以特異性結合生物實體的部分以外，探針上還包括允許其在試驗中被檢測到的至少一個修飾。該修飾包括但不限於：標記，例如螢光染料；特別引入的放射性元素；或者生物素標籤。所述探針還包括其結構上的修飾，例如鎖定的核酸。本發明所用術語「樣本」指的是為了診斷、預後或者評估感興趣的受試者，例如患者的目的而獲得的體液或者組織的樣本。優選的測試樣本包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔積液。此外，本領域技術人員能夠認識到，在分餾或純化程序之後，一些測試樣本將更容易被分析，例如將全血分離成血清或血漿組分。因此，在本發明一優選實施例中，所述樣本選自組，該組包括：血液樣本、血清樣本、血漿樣本、腦脊液樣本、唾液樣本、尿液樣本或者任何上述樣本的提取物，以及血液或者淋巴中的循環腫瘤細胞、任何疑似含有轉移的組織以及任何可能包含前列腺癌細胞或者其部分的來源，包括囊泡，例如外來體、微泡等，以及來自前列腺腫瘤細胞的游離的或與蛋白質結合的rna分子。優選地，所述樣本為血液樣本，最優選地為血清樣本或者血漿樣本。重要的是，尿液(特別是直腸指診後)和精液屬於最優選的樣本。組織樣本也可以是在手術過程獲得的活檢標本或組織樣本。本發明所用術語「曲線下面積(auc)」描述了接收器操作特性(roc)曲線或者roc曲線下的面積。auc涉及生物標誌物的特異性和靈敏度。一個完美的標記(auc＝1.0)在roc空間的左上角產生一個點或者坐標為(0，1)的點，這表示靈敏度為100％(無假陰性)且特異性為100％(無假陽性)。術語「p值」涉及當零假設實際為真，即不同組的平均值之間沒有差異時獲得觀察到的樣本結果(或更極端的結果)的可能性。p值越小，替代假設相比於比零假設能更好地解釋觀察結果的可能性越高。術語「調整後的p值」指的是因多種比較(被測試基因/探針的數量)而調整後的p值。應用的方法在實驗部分詳細描述。本發明的詳細描述本發明描述了前列腺癌診斷的方法。所述方法包括分析取自患者的樣本並具體確定所述患者樣本中生物標誌物組合的水平。然後，將每個生物標誌物的結果與閾值相關聯，並且當結果超過該閾值時，所述患者樣本被認定為前列腺癌陽性。本發明涉及包含seqidnos.1～42的幾組序列。所述序列如下所示。限於篇幅，僅列出前100個核苷酸。序列的其他部分可以在序列表中找到。特別地，本發明涉及8組不同的序列：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38序列seqidno3和11對應於來自該基因座(hg19)：chr2：1,550,437-1,629,191(-)的剪接的轉錄物。轉錄物seqidno.36和38的長度分別為38342個核苷酸和346832個核苷酸。發明者驚奇地發現，這兩個核酸對應的是單個的、長的轉錄物。因此，這些長轉錄物任意部分表達水平的檢測適用於本發明的方法。有兩種類型的序列。第一種，一些轉錄物是已經在相關資料庫中注釋的已知序列。它們通過各自的注釋被識別。第二種，還沒有被注釋的新的轉錄物。本發明中它們被設定為：xloc_後跟一個數字。這些名稱提供了關於轉錄物的基因組起源的信息，但可能不會代表給定轉錄物的整個序列。檢測到的序列在一些情況下可能更長或者更短。在xloc轉錄物的情況中，如果檢測到片段，則這些片段可以短至1000個、500個、400個、300個、200個、150個、100個、50個、40個、30個、20個、10個、9個、8個、7個、6個或者5個核苷酸。表1：seqidno列表。同時列出序列seqidnos1～42及其相應的轉錄物和基因注釋。表中顯示每條seqidno的前100個核苷酸。生物標誌物pca3通常用於前列腺癌(pca)的診斷。正如所預期的，本發明人通過二代測序發現：pca3的表達水平是測試的受試者中pca疾病的象徵(圖2)。然而，發現生物標誌物在非常低風險的腫瘤(v)中具有最高的表達水平，並且隨著腫瘤的危險因素的增加而降低。這一發現使pca3成為中高危腫瘤的不可信標誌物，這也表明需要更好的前列腺癌生物標誌物。就特異性和靈敏度來說，發明人發現了許多顯著優於pca3的新的生物標誌物。例如，相比於pca3的值為0.851，retro-rpl7(seqidno.1)在roc曲線下的面積(auc)的值為0.935(圖3)。seqidno.1和seqidno.12所示序列與生物標記的組合產生的auc值為0.985(見表7)。已經發現以下組的生物標誌物的組合對前列腺癌具有高度指示性：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38選自所有上述8組的生物標誌物的組合產成的auc值為1.0(見圖6)。因此，本發明涉及一種診斷前列腺癌症的方法，其包括分析患者樣本中至少兩種核酸的表達水平的步驟，其中所述至少兩種核酸選自至少兩組核酸，其中，所述組由以下構成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38其中，如果所述至少兩種核酸的表達水平高於閾值，則認定所述樣本為前列腺癌陽性。本發明進一步涉及一種診斷和/或治療前列腺癌的方法，其包括分析患者樣本中至少兩種核酸的表達水平的步驟，其中所述至少兩種核酸選自至少兩組核酸，其中所述組由以下構成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38其中，如果所述至少兩種核酸的表達水平高於閾值，則認定所述樣本為前列腺癌陽性；並且給患者施用一種或多種前列腺癌治療劑。優選的前列腺癌治療藥物包括：多西他賽卡巴他賽米託蒽醌雌莫司汀多柔比星依託泊苷(vp-16)、長春花鹼紫杉醇卡鉑醋酸阿比特龍、比卡魯胺、康士得、地加瑞克、恩雜魯胺、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、潑尼松、西普魯塞-t(sipuleucel-t)、二氯化鐳223和/或長春瑞濱在一優選的實施例中，本發明涉及一種診斷前列腺癌症的方法，其包括分析至少兩種核酸的表達水平的步驟，其中所述至少兩種核酸中的至少一種選自第2組中的seqidno.4、5、6、7、8、9和10，和/或第1組中的seqidno.1。在本發明的另一個實施例當中，分析至少3種核酸的表達水平，其中所述核酸選自至少3個不同的組。在本發明的可選實施例中，分析至少4種核酸的表達水平，其中所述核酸選自至少4個不同的組。在本發明的可選實施例中，分析至少5種核酸的表達水平，其中所述核酸選自至少5個不同的組。在本發明的可選實施例中，分析至少6種核酸的表達水平，其中所述核酸選自至少6個不同的組。在本發明的可選實施例中，分析至少7種核酸的表達水平，其中所述核酸選自至少7個不同的組。在本發明的最優選的實施例中，分析每一組中的至少1種核酸的表達水平。所述樣本可以選自以下組，所述組包括：前列腺組織、活檢材料、淋巴結、尿液、精液、血液、血清、血漿、血液或淋巴中的循環腫瘤細胞、疑似含有轉移的任何組織以及可能含有前列腺腫瘤細胞或其部分，例如外來體、微泡、以及來自前列腺腫瘤細胞的游離的或與蛋白質結合的rna分子。更優選地，所述樣本為尿液，最優選地，所述樣本為患者經過直腸指檢(dre)後的尿液。用於定量核酸的任何合適的方法可用於分析核酸的表達水平。在一個實施例中，使用基於螢光的試驗進行核酸定量。在一優選的實施例中，通過測量標記的引物、標記的探針或螢光檢測劑的螢光來進行表達水平的分析。在本發明的另一個實施例中，使用基於核酸擴增的試驗進行核酸定量。在一優選實施例中，使用pcr或測序方法進行核酸定量。在最優選的實施例中，使用qrt-pcr進行核酸定量。在一可選的實施例中，對由核酸或其反向互補序列編碼的蛋白質進行分析和定量。本發明還涉及用於診斷前列腺癌的試劑盒，其包括至少兩個引物或者探針，所述引物或者探針在嚴格條件下與至少兩種核酸雜交，其中所述至少兩種核酸選自至少兩組核酸，其中所述組由以下構成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38所述試劑盒可能包括兩種以上的核酸。在一優選的實施例中，所述試劑盒還包含用於分析表達水平的試劑。在一優選的實施例中，所述試劑盒還包括用於核酸擴增和/或核酸定量和/或核酸檢測的試劑。在另一實施例中，所述試劑盒包括對照樣本。實驗結果表明新型生物標誌物組合對pca檢測具有高度特異性和靈敏度。理想地，將組中核酸的轉錄物的表達水平與樣本中一個或幾個其他基因(例如管家基因)的轉錄物的表達水平進行比較。合適的管家基因的實例如下表2所示：表2：閾值為測試樣本和被指定為癌陽性的對照樣本之間的最小表達差異。理想地，測試樣本與對照樣本之間生物標誌物的表達水平差異為1.5倍(±20％)、2倍(±20％)、3倍(±20％)、4倍(±20％)以及最優選地為5倍(±20％)或者更多。p值(t檢驗)為﹤2×10-5。fdr優選為﹤5×10-4。對於所選擇的基因的組，閾值優選為腫瘤樣本的表達相比於對照樣本的表達增加2倍(±20％)。本發明涉及rna生物標誌物的水平分析。該分析可以通過多種方法完成，例如基於pcr的方法，如定量逆轉錄pcr。本發明涉及一種特異性確定生物標誌物水平的擴增方法。在本發明中，將樣本與對核酸特異的正向引物以及反向引物混合，所述核酸的序列至少選自以下序列組：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38然後進行擴增循環。設計探針或引物使得它們在嚴格條件下能夠與所述靶序列雜交。所述至少兩個擴增反應可以同時進行或以多重擴增的形式進行。在一個實施例中，通過測量標記的引物、標記的探針或螢光檢測劑的螢光來進行該方法中的分析。更優選地，通過qrt-pcr進行表達水平的分析。在進一步的實施例中，通過測序的方法進行至少兩種核酸的表達水平的分析。本發明還涉及組合中包括的生物標誌物的表達水平的定量。擴增後，直接定量並且定量可以通過多種方法完成。在使用其中至少一個引物具有螢光染料時，可以使用來自染料的螢光信號進行定量。可以使用各種引物系統和染料，如sybrgreen、多重探針、taqman探針、分子信標和蠍形引物。其他可行的定量方法是，例如northern印跡法、二代測序或260和280nm處的吸光度測量。從下面的實施例清楚地得出，本發明公開了用於檢測前列腺癌的生物標誌物組合，其比目前的生物標誌物可以更準確和靈敏地診斷疾病。實施例臨床隊列在德勒斯登大學醫院接受根治性前列腺切除術(rpe)或手術以去除良性前列腺增生(bph)的前列腺癌(pca)患者被納入旨在鑑定pca新生物標誌物的回顧性臨床隊列。根據法律規定，獲得當地道德委員會的批准和患者知情同意書。對於pca患者，收集至少五年的臨床隨訪數據。來自40名pca患者和8名bph患者的前列腺組織樣本用於通過全基因組rna測序鑑定診斷相關的生物標誌物。根據gleason(theveteran’sadministrationcooperativeurologicresearchgroup:histologicgradingandclinicalstagingofprostaticcarcinoma；intannenbaum,m.urologicpathology:theprostate,philadelphia:leaandfebiger.pp.171-198)及rpe中相鄰淋巴結轉移的存在(參見表3)的階段劃分，基於分期定義了四個pca組。表3：用於全基因組rna測序的pca隊列：對照組(c)由bph樣本組成。非常低風險(v)和低風險(l)組包括分別具有gleason評分(gs)<7和＝7的患者的樣本，全部無淋巴結轉移(pn0)。中風險(m)組包括gs7的組織組成。對於後者，分析了從相同患者獲得的成對的腫瘤和無腫瘤的組織樣本。通過定製的微陣列和定量逆轉錄實時pcr(qrt-pcr)，進一步對包含256個(40個對照bph、216個腫瘤樣本)和56個患者(16個對照bph、40個腫瘤樣本)的隊列分別驗證選擇的生物標誌物候選物。前列腺組織樣本前列腺組織樣本獲得自德勒斯登大學醫院泌尿外科手術，並儲存在德勒斯登大學綜合癌症中心的液氮中。對前列腺癌(pca)患者進行的前列腺切除術(rpe)獲得的前列腺組織樣本分為腫瘤樣本和無腫瘤樣本。使用良性前列腺增生(bph)患者的前列腺組織樣本作為非腫瘤對照。上述均具備患者知情同意書。為了驗證樣本的狀態及其腫瘤細胞含量，將所有樣本分為一系列冷凍切片。為此，將冷凍組織樣本包埋在tissue-tekoct化合物(sakurafinetekgmbh)中，並通過冷凍固定在金屬壓頭上。使用裝有冷卻至-28℃的切片機刀片c35(feather)的冷凍切片機(leica)製備冷凍切片。將每個樣本切成總共208個冷凍切片，其中4個進行he染色，並由病理學家對其腫瘤細胞含量進行評估(圖1)。由此產生3堆連續的冷凍切片，其中每堆冷凍切片兩個側邊為he染色部分。僅將任一側邊包含至少60％或最多5％腫瘤細胞部分的堆分別用作腫瘤樣本或無腫瘤樣本。然後對所選擇堆的50個冷凍切片進行rna製備。rna分離使用qiazol和qiacube上的mirneasyminikit(均來自qiagen)，隨後手動進行dna酶i消化，從冷凍保存的組織中分離總rna。使用nanodrop1000(peqlab)測定rna濃度。使用agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies，paloalto，ca)驗證rna完整性，並且僅對rna完整性數值(rin)至少為6的rna樣本進行進一步處理。全基因組長rna二代測序使用包含來自良性前列腺增生(bph)8個前列腺組織樣本作為對照和56個腫瘤組織樣本(包括來自具有gleason評分的樣本的腫瘤和無腫瘤組織對)的回顧性pca隊列的子集進行全基因組的rna測序。使用ribo-zerorrnaremovalkit(epicenter)從1μg總rna中去除核糖體rna。使用scriptseqv2rna-seq文庫製備試劑盒(epicenter)從50ng不含rrna的rna製備測序文庫。使用agencourtampurexp系統試劑盒(beckmancoulter)純化雙標記的cdna。pcr進行10個循環以摻入用於樣本多重化的索引條形碼並擴增cdna文庫。在agilentbioanalyzer(agilenttechnologies)中，使用dnahighsensitivitykit測定擴增文庫的質量和濃度。8個樣本中每個取4ng混為一個庫，並用瓊脂糖凝膠電泳在2％瓊脂糖凝膠中選擇大小。根據製造商的說明書，用minelutegelextraction(qiagen)將150～600bp範圍之間的樣本進行割膠和純化。在agilentbioanalyzer中，使用dnahighsensitivitychip(agilenttechnologies)對純化的文庫進行定量。然後將每個純化的、經過大小選擇的庫加載到illuminahiseq2000的流動池，並將其分配到所有通道中。根據製造商的方案，在illuminacbot儀器中，使用truseqpeclusterkitsv3(illuminainc.)進行簇生成。使用illuminahiseq2000測序儀(illuminainc.)進行測序。測序運行的細節如下：雙末端測序策略；read1為101個循環，索引序列為7個循環，read2為101個循環。測序數據的分析：原始數據的準備使用casavav1.8.1(illumina)對包含鹼基響應文件(bcl文件)的原始測序數據進行處理，從而產生fastq文件。fastq文件包含每個臨床樣本所有測序的rna片段，以下稱為「讀數」。通過使用cutadapt(http://code.google.com/p/cutadapt/)刪除特定的轉座序列。測序數據的分析：基因圖譜繪製以及轉錄物組裝使用segemehlv0.1.4-382和tophatv2.0.9將讀數映射至人類基因組(集合hg19)。使用cufflinksv2.1.1和cuffmergev2.1.1將新的轉錄物，即在gencodev17中未注釋的轉錄物組裝起來。將所有新的轉錄物單和所有已知的gencodev17中的轉錄物合併成一個綜合注釋集。測序數據的分析：統計分析通過htseq-countv0.5.4p1(http://www-huber.embl.de/users/anders/htseq/doc/count.html)計算具有新的和已知的轉錄物的綜合注釋集中包含的每個轉錄物和基因的讀數。使用r和bioconductorlibrariesedger鑑定差異表達的轉錄物和基因。通過縮放每個樣本的文庫大小(tmm方法)調整臨床樣本的不同rna組成。將負二項對數線性模型擬合到每個轉錄物或基因的讀數計數，並且通過似然比檢驗識別不為零的係數。錯誤發現率由benjanimi-hochberg調整控制。定製微陣列的驗證基於測序結果，定製了具有180000個探針(agilentsureprintg3customexonarray，4x180k，design-id058029)的微陣列，其包含mrna、長非編碼rna(gencodev15)、新轉錄物和所有差異表達的轉錄物。使用包含作為對照的來自良性前列腺增生的40個前列腺組織樣本，以及在根治性前列腺切除術後的pca患者的164個腫瘤組織樣本和52個無腫瘤組織樣本回顧性pca隊列進行微陣列篩選。使用quickamplabelingkit(agilent)，用200ng總rna合成crna，並將1650ngcrna在陣列(agilentgeneexpressionhybridizationkit)上雜交。通過實時定量pcr進行驗證為了驗證通過二代測序和微陣列篩選獲得的結果，使用實時定量pcr篩選總共56個組織樣本(16個無腫瘤樣本和40個腫瘤樣本)。根據製造商的說明書，使用high-capacityreversetranscriptionkit(appliedbiosystems)和隨機引物，從100ng總rna合成cdna。隨後使用4μl稀釋的cdna進行pcr試驗。使用定製和預設計的taqmangeneexpressionassays(appliedbiosystems)在appliedbiosystems7900htreal-timepcr系統上進行管家基因和目標轉錄物的實時定量pcr。所有樣本均一式三份測量，並將這些測量的方法用於進一步的計算。表4：用於前列腺組織樣本中qrt-pcr驗證的appliedbiosystemstaqman基因表達試驗的id。rt-qpcr結果的統計分析對未調節的管家基因gapdh(seqidno.1)和hprt1(seqidno.3和seqidno.9)分別進行數據歸一化。對於相對定量，分析相對於對照樣本的中值表達的每個樣本基因表達的變化。所有統計學分析均採用r統計軟體進行。使用學生t-檢驗(student'st-test)，比較腫瘤樣本和對照樣本之間生物標誌物的log2轉化的相對表達水平。使用proc包計算接收器操作特性(roc)曲線，其通過曲線下面積(auc)表示每個標記物的的診斷能力的量度。所有樣本均一式三份測量，並將這些測量的方法用於進一步的計算。dre尿液樣本的驗證dre尿液樣本的收集以及rna分離在前列腺直腸指診(dre)後收集尿樣(dre尿液)。這種常規進行的檢查方法允許使尿液樣本包括一定量的前列腺細胞。將dre尿液樣本離心並用pbs洗滌兩次。將所得細胞沉澱重新懸浮於700μlqiazol中。隨後使用手動操作dna酶i消化，使用qiacube上的mirneasyminikit(均來自qiagen)分離總rna。使用nanodrop1000(peqlab)測定rna濃度。在agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies，paloalto，ca)上驗證rna完整性。實時定量pcr篩選dre尿液樣本根據製造商的說明書，從2×50ng的總rna中，使用superscriptiii逆轉錄酶(appliedbiosystems)以及隨機引物合成cdna。隨後使用4μlcdna進行pcr試驗。在appliedbiosystems的7900htreal-timepcr系統中使用定製和預設計的taqmangeneexpressionassays(appliedbiosystems)進行管家基因(psa)和靶轉錄物的實時定量pcr。所有樣本均一式兩份測量，並將這些測量的方法用於進一步的計算。dre尿液樣本的全基因組長rna二代測序對於全基因組長rna測序，使用乙醇將7個dre尿液樣本中的全部rna析出，以濃縮rna的量並重懸於10μl不含rna酶的水中。使用lowinputribo-zerorrnaremovalkit(epicentre，經clontech修飾)從4ngrna中去除rrna，得到10μl不含rrna的rna。利用8μl不含有rrna的rna，使用smarterstrandedrnaseqkit(clontech)來準備測序文庫。使用agencourtampurexpsystemkit(beckmancoulter)純化雙標記的cdna。pcr進行18個循環，以摻入用於多重樣本的索引條形碼並擴增cdna文庫。在agilentbioanalyzer(agilenttechnologies)上使用dnahighsensitivitykit測定擴增的文庫的質量和濃度。樣本被合併為庫，並且根據製造商的說明書在illuminacbot儀器上使用15pmol/l的合併文庫以及truseqpeclusterkitv4(illuminainc.)來生成簇。在illuminahiseq2500測序儀(illuminainc.)上，使用hiseqsbsv4測序試劑(250個循環)進行測序。測序運行的細節如下：雙末端測序策略；read1為126個循環，索引序列為7個循環，read2為126個循環。dre尿液qrt-pcr結果的統計分析針對前列腺特異性抗原(psa)進行數據歸一化，以分析來自dre尿液樣本的qrt-pcr結果。對於相對定量，分析相對於對照樣本的中值表達的每個樣本基因表達的變化。所有統計學分析均採用r統計軟體進行。表5：用於qrt-pcr驗證的appliedbiosystemstaqman基因表達試驗的id。結果將rpe和8個bph前列腺組織樣本作為良性、非腫瘤對照，使用鏈特異性、雙末端長rna二代測序(ngs)分析40個pca腫瘤樣本和16個無腫瘤樣本的轉錄組。為了優化數據質量和分析的穩定性，製備了至少3個部分、每個樣本約150個的冷凍切片。病理評估後，僅保留在腫瘤樣本和無腫瘤樣本中分別滿足最大腫瘤細胞數為60％和最小腫瘤細胞數為5％的部分進行進一步分析。轉錄組測序(rnaseq)方法旨在全面鑑定和定量在正常或癌前列腺組織中表達的rna。將獨立於多聚腺苷酸化狀態的所有類別的編碼和長的非編碼轉錄物進行測序。使用大輸入量的rna來確保文庫的高複雜性。此外，對每個文庫平均200m的雙末端讀數2×100nt進行測序，使得低表達的轉錄物能夠基於高覆蓋率進行組裝。該方法勝過大多數分析大量樣本的同類公開研究。總共約組裝了3000個沒有顯示與gencodev17中注釋的轉錄物有外顯子重疊的新的轉錄物。在錯誤發現率為0.01時，在所有對比中觀察到有6442個差異表達的基因。表4給出了特定對比時差異表達基因的數量。表6：不同對比以及gencode生物型的差異表達基因的數量。結果成功地重現了先前報導在前列腺腫瘤和正常組織之間差異表達的大部分轉錄物。此外，已經鑑定了許多新的pca相關轉錄物，其可用於開發用於診斷pca的試驗。選出的最有希望的轉錄物通過qrt-pcr在pca腫瘤和bph對照樣本的測試隊列中得到驗證。這些新型生物標誌物候選物中的幾種，其特異性和靈敏度已經顯著超過已經用於pca診斷的生物標誌物pca3的特異性和靈敏度。在測序隊列中，pca3被證明與pca明顯相關，但高危組有較強的下降傾向(圖2)。在測試隊列中，相比於pca3在roc曲線(auc)下的面積值為0.851，新的生物標誌物retro-rpl7(seqidno.1)產生的面積值為0.935(圖3)。本發明的新的生物標誌物retro-rpl7和xloc133897的組合產生的auc值為0.975(圖6)。實驗結果表明，新型生物標誌物對pca的檢測具有較高的特異性和靈敏度。因此，可以在可能含有前列腺腫瘤細胞或其部分(包括囊泡如外來體、微泡等，以及來自前列腺腫瘤細胞的游離或與蛋白質結合的rna分子)的所有來源中，單獨或者組合測量這些新發現的生物標誌物(或者與已知的生物標誌物組合)的基礎上來進行pca診斷。這些來源包括(但不限於)前列腺組織、活檢材料、淋巴結、尿液、精液、血液、血清、血漿、血液或淋巴中的循環腫瘤細胞，以及疑似含有pca轉移的任何組織。本發明rna生物標誌物的測量可以通過適合特異性估計rna水平的任何方法進行，例如基於pcr的方法，如qrt-pcr。該試驗可用於pca的早期診斷(篩選)、預測腫瘤的侵襲性(預後)和/或幫助選擇治療。因此，基於這些生物標誌物的診斷試驗可以顯著降低當前測定的高假陽性率，從而有助於避免不必要的侵入性前列腺活組織檢查。生物標誌物的組合選自組，所述組由以下構成：第1組：seqidno.1第2組：ensembl基因id為ensg00000245750.3的剪接變體，其選自由seqidno.4、5、6、7、8、9、和10構成的組第3組：ensembl基因id為ensg00000255545.3的剪接變體，其選自由seqidno.26、27、28和29構成的組第4組：seqidno.3和11第5組：seqidno.12第6組：seqidno.24第7組：seqidno.36第8組：seqidno.38也對其組合的診斷價值進行了分析。本發明人發現當如下表和圖7所示對所述組的組合進行分析時，診斷值和auc大大增加。這表明不僅單獨的新型生物標誌物優於先前已知的生物標誌物，令人驚奇的是它們的組合也使pca診斷有進一步的顯著改善。表7：包含第5組序列的標誌物組合的auc值相比於第5組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。seqaseqbauc值seqid120.817seqid12+seqid10.985seqid12+seqid30.959seqid12+seqid110.96seqid12+seqid4_100.989seqid12+seqid380.896seqid12+seqid360.944表8：包含第2組序列的標誌物組合的auc值相比於第2組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。seqaseqbauc試驗seqid4_100.959seqid4_10+seqid26_290.981seqid4_10+seqid120.989seqid4_10+seqid380.98seqid4_10+seqid360.988表9：包含第3組序列的標誌物組合的auc值相比於第3組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。表10：包含第4組序列的標誌物組合的auc值相比於第4組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。seqaseqbauc試驗seqid30.935seqid3+seqid10.984seqid3+seqid4_100.981seqid3+seqid110.946seqid3+seqid120.959seqid3+seqid26_290.962seqid3+seqid360.974seqid3+seqid380.958表11：包含第1組序列的標誌物組合的auc值相比於第1組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。seqaseqbauc試驗seqid10.935seqid1+seqid30.984seqid1+seqid4_100.986seqid1+seqid110.983seqid1+seqid120.985seqid1+seqid26_290.985seqid1+seqid360.986seqid1+seqid380.983表12：包含第6組序列的標誌物組合的auc值相比於第6組單獨使用產生的auc值。數據來自64個前列腺組織樣本的rna二代測序分析。seqaseqbauc測序seqid240.919seqid24+seqid11seqid24+seqid30.984seqid24+seqid110.975seqid24+seqid121seqid24+seqid4_100.988seqid24+seqid26_290.962seqid24+seqid360.959seqid24+seqid380.966表13：包含第7組和第8組序列的標誌物組合的auc值相比於第7組或者第8組單獨使用產生的auc值。數據來自256個前列腺組織樣本的定製微陣列分析。seqaseqbauc值seqid380.806seqid360.88seqid38+seqid360.958seqid24+seqid30.984seqid24+seqid110.975seqid24+seqid121seqid24+seqid4_100.988seqid24+seqid26_290.962seqid24+seqid360.959seqid24+seqid380.966本發明人還發現，可以在患者的尿樣中檢測到所有組的表達，然而在健康患者的尿樣中所有組不表達或者低表達(圖8)。這個結果是令人驚奇的，因為fontenete等人(int.brazjurol.vol.37no.6riodejaneironov./dec.2011)曾顯示：由於其在健康患者中比在pca患者即本發明樣本中更頻繁地過表達，因此psa的mrna不是尿樣中前列腺癌的合適的生物標誌物。因此，分析尿樣中生物標誌物表達水平可以用於可靠地診斷前列腺癌並非先驗的結果。基於這些生物標誌物組合的診斷測定的優點使得其相比於現有的試驗具有顯著降低的假陽性率，並且測量其在尿樣中的表達水平避免了進行不必要的侵入性前列腺活檢。附圖說明圖1：組織樣本質量的驗證：為了確定組織樣本的腫瘤細胞含量，如圖所示，從冷凍樣本製備冷凍切片。he：蘇木精/伊紅；ihc：免疫組化。組織樣品質量的驗證：從冷凍樣品製備4μm的冷凍切片以用於he染色(以確保組織樣品的腫瘤細胞含量)、rna和dna分離以及ihc。he：蘇木精/伊紅；ihc：免疫組化。圖2：轉錄物pca3的rna測序結果箱型圖。回顧性pca隊列的rna測序結果包含來自良性前列腺增生的8個前列腺組織樣本的作為對照(c)，v(非常低風險；gleason＜7，pn0)、l(低風險；gleason評分＝7，pn0)以及m(中等風險；gleason評分＜＝7，pn+)組，其中每個組都有8個pca腫瘤樣本，以及高危組h(高危；gleason評分＞7)中的16對腫瘤組織和無腫瘤組織樣本。圖3：通過56個前列腺組織樣本的qrt-pcr分析得出的retro-rpl7(seqidno.1)以及pca3的roc曲線。圖4：seqidno.12的定製微陣列數據的箱線圖。使用包含來自作為對照的良性前列腺增生的40個前列腺組織樣本作為對照，以及在根治性前列腺切除術(rpe)後的pca患者的164個腫瘤組織樣本和52個無腫瘤組織樣本的回顧性pca隊列進行的定製微陣列篩選結果。圖5：通過對如圖4所描述的256個前列腺組織樣本進行定製微陣列分析得出的關於seqidno.12的roc曲線。圖6：基於雙轉錄標記的logit模型(logitmodel)。顯示了包含retro-rpl7(seqidno.1)和xloc133897(seqidno.2)(auc＝0.975)的多變量logit模型的roc曲線。圖7：生物標誌物標籤：a)將通過對8個對照組織樣本(良性前列腺增生，bph)和40個前列腺癌組織樣本中如序列seqidno.1、3、4-10、11、12、24、26-29、36和38所示的轉錄物進行rna二代測序得到的數據結合為一個標記以產生更高的特異性和靈敏度。數據通過箱線圖(左側)和roc曲線(右)顯示。產生的auc值為1.0。b)將通過對40個對照組織樣本(良性前列腺增生，bph)和164個前列腺癌組織樣本中如序列seqidno.1、3、4-10、11、12、24、26-29、36和38所示的轉錄物進行定製微陣列分析得到的數據結合為一個標記以產生更高的特異性和靈敏度。數據通過箱線圖(左側)和roc曲線(右)顯示。產生的auc值為1.0。圖8：通過rna二代測序檢測尿液樣本中的生物標誌物：在泌尿科醫師對患者進行直腸指檢後獲得尿樣。使用illuminahiseq2500二測序儀對從這些樣本分離的rna進行轉錄組全rna測序。通過標準算法將讀數映射至基因組，並對映射至本發明序列號(seqidno.)的基因座位點的讀數進行計數，並將其歸一化為從前列腺特異性抗原(psa)的基因位點得出的讀數，其作為尿液中前列腺上皮細胞存在的量度。比較了患有和不患有前列腺癌的患者的樣本。sequencelisting弗勞恩霍夫應用研究促進協會用於診斷前列腺癌的新型rna-生物標誌物標籤p1710728wpep14195709.22014-01-1242patentinversion3.51825dnahomosapiens1ttttccggctggaaccatggagggtgttgaagagaagaagaaggttcctgctgtgccaga60aacccttaagaaaaagtgaaggaatttcacagagctgaagatcaagcgcctgagaaataa120gtttgcccaaaagatgcttctaaaggcaaggaggaagcttatctatgaaaaagcaaagca180ctatcacaaggaatatatgcagatgtacagaactgaaattcaaatatcgaggatggcaag240aaaagctggcaacttctatgtatctgcagaacccaaattggcgtttgtcatcaggatcgg300aggttatcaattgggtgagcccaaaggtctgaaaggtgttgcaacttctttgccttcatc360aaatcttcaatagaaactttgtgaagctcagcagggcttcaataatgtgctgaggtttgt420agaaccatatattgcatgggcatacccaaatctgaagtcagtaaataaactaatctacaa480atgtggttatagcaaaatgaataagaagctacttgctccaacagataatactttgattgc540tcgatctcttggtaaatatggcctcatctgcatggaggatctgattcatgagatctatac600tgttggaaaatgcttaaagaagcaaataacttcctgtggcccttcaaattatcctctcga660caagttagaatgaagaaaaagaccaccaattttgtagaaggtggagatgctgacaacagg720gaagaccagatcaacaggcttattagaagaataaacatgcctaccacaattattttttgt780aatctagccagttaataaacagtacctgctctcaaattgaaaaaa82523120dnahomosapiens2gcccgcttctgtgactccaccccttacggaaagtctatgggactctctgaaatgtatgag60tgatactgttagaaagcggcaagaaaatgaaaagaaaacgtggatgttttccatatttga120gttgatgcaggctggagacaacagctgccagagctgcaaggcagaacaccctgagaagtg180gaaccggaggatccaggcgcctgttgaagggataaatgagagccgtggcgtgtggatggg240actctttctgtcttccgtttggctgaagctccaaacgccaggagtaacccagtgggtagc300aagcacccttccctccacctctgcaggaattgcaaaaagcaatggtaaaaaaattggttt360gtgatccttaccccagtgctcaaggaggttggagaagctgaaag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