一種與前列腺癌易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用的製作方法

2023-12-09 06:34:21

專利名稱：：一種與前列腺癌易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用的製作方法一種與前列腺癌易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用
技術領域：
本發明屬於生物技術的基因領域，具體涉及一個與前列腺癌易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用。
背景技術：
：前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性中第二大常見腫瘤，在癌症相關死因中位於第六位，全球每年預計新發病例91.4萬人，病死例數約25.8萬人(JemalA,BrayF，CenterMMjFerlayJ，WardE，FormanD.Globalcancerstatistics.CACancerJClin2011;61,69-90.)。前列腺癌的病因大多不是很清楚，目前的研究結果表明，除了年齡和種族，家族史是前列腺癌發病另一主要的高危險因素(GronbergH.Prostatecancerepidemiology.Lancet.2003;361(9360):859-64.)。這種家族聚集性在很大程度上提示了遺傳因素對前列腺癌發生風險的影響。在一項雙胞胎研究中發現，遺傳因素能解釋42%前列腺癌的發病風險(LichtensteinP,HolmNV,VerkasaloPK,IliadouA,KaprioJ,KoskenvuoMetal.Environmentalandheritablefactorsinthecausationofcancer—analysesofcohortsoftwinsfromSweden,Denmark,andFinland.NEnglJMed.2000;343,78-85.)。造成差異的遺傳物質基礎之一就包括SNP(單核苷酸多態性XSNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。佔所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個鹼基對中就有I個，估計其總數可達300萬個甚至更多(CollinsF.S.,BrooksL.D.,ChakravartiA.ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes.1998,8(12)，1229-31.)。目前，SNP是研究人類常見疾病遺傳變異的重要依據。而全基因組關聯研究是系統找出疾病SNP遺傳變異的、具有良好前景的分子遺傳學研究方法。本發明通過全基因組關聯研究，選擇9q31.2區域作為所研究的基因，同時選擇9q31.2區域上的SNP位點作為所研究的方向。經對國內外文獻檢索，至今未見有9q31.2遺傳區域與前列腺癌相關聯的報導，也沒有9q31.2區域上多態性位點與前列腺癌的相關性報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2部分基因序列，通過rs817826單核苷酸多態性位點的遺傳研究，提出一個可作為判定前列腺癌高危人群的易感SNP位點，以利於前列腺癌高危人群的篩查，以利於預防和治療。本發明研究表明，遺傳區域9q31.2與前列腺癌的易感性相關。本發明首先提供與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上的部分基因序列，該基因序列的核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位為T/C。本發明還提供與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上的一單核苷多態性位點，rs817826:rs817826位於RAD23B和KLF4基因之間；rs817826鹼基為T/C；rs817826的SNP序列通過http://genome,uses,edu/資料庫獲得，其序列如SEQ.1D.NO.2所不。本發明還提供檢測一單核苷酸多態性位點的特異性核酸引物SEQ.1D.NO.3、SEQ.1D.NO.4、SEQ.1D.NO.5，且特異性地擴增出單核苷酸多態性位點的擴增產物。本發明關於與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2基因序列，其獲得rs817826序列的具體步驟如下通過http://genome,uses,edu/資料庫，在遺傳區域9q31.2上選擇單核苷酸多態性位點rs817826;依據相應的鹼基序列合成引物ACGTTGGATGCACTTTATCCTCCTAGTGAA(SEQ.1D.NO.3),ACGTTGGATGACCGTTGAGACTTAGTGTAG(SEQ.1D.NO.4)以及UEP引物cccctCTACAGAGGCCCTAGTAAA(SEQ.1D.NO.5);進行PCR擴增，獲取SNPrs817826分型數據。PCR擴增中，PCR反應體系5ul:0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，O.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20補足5ul；PCR反應條件95°C2min；95°C0.5min,96°C0.5min,72°Clmin，45個循環；72°C5min,25°C⑴min;SAP純化反應體系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20補足2ul;SAP純化反應條件37°C40min,85°C5min，25°C^min;單鹼基延伸反應體系2ul:0.2IOXiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM終止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20補足2ul;單喊基延伸反應條件94°C30s；94°C5s,92°C5s-80°C5s，內部循環5次，外部循環40次；72°C180s；25°C^s;將反應產物共15nL，經樹脂純化後，SpectroCHIP晶片上樣；通過MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry進行質譜檢測，並獲取SNPrs817826分型數據。本發明還提供所述的與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2的應用，通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性位點rs817826的基因分型，其中rs817826鹼基為C的個體為前列腺癌易感人群。rs817826鹼基為T的個體為前列腺癌非易感人群。具體實施方式以下結合具體實施例，以進一步說明本發明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性rs817826的基因分型，其中rs817826鹼基為C的個體為前列腺癌的易感人群。具體做法是1.基因組DNA的提取受試者均由外周靜脈血抽取2-3ml，採用QIAampBloodMiniKit250(QIAGEN，德國)試劑盒提取基因組DNA，-20°C保存。2.SNP基因分型根據SNP的序列信息,運用Sequenom公司的引物設計軟體MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.，SanDiego,CA)設計PCR反應和單鹼基擴展引物，並在生物工程(上海)有限公司合成。合成後的引物與樣品DNA進行PCR反應，混合後的反應產物在SequenomiPLEX儀器上進行SNP基因分型。具體實驗流程如下(1)引物設計運用Sequenom公司的引物設計軟體MassARRAYAssayDesign3.1(Sequenom,Inc.,SanDiego,CA)為多重反應自動設計PCR引物(SEQ.1D.NO.3;SEQ.1D.NO.4)和iPLEXGold單鹼基延伸引物(SEQ.1D.NO.5)；(2)PCR反應(A)PCR反應液(Mix):按照下表中的順序從上到下依次加入，單位ul權利要求1.一種與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上的基因序列，其特徵在於，核苷酸序列如SEQ.1D.NO.1所示，其第501位為T/C。2.根據權利要求1所述的與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上的基因序列，其特徵在於，所述的與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上具有一單核苷多態性位點rs817826,rs817826位於RAD23B和KLF4基因之間；rs817826鹼基為T/C；rs817826的SNP序列如SEQ.1D.NO.2所示。3.—種檢測一單核苷酸多態性位點rs817826的特異性核酸引物，其特徵在於序列為SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4，SEQ.1D.NO.5，其特異性地擴增出單核苷酸多態性位點的擴增產物。4.從權利要求2所述的與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2基因序列，獲得rs817826序列的方法,其特徵在於具體步驟如下在遺傳區域9q31.2上選擇單核苷酸多態性位點rs817826;依據相應的鹼基序列合成引物SEQ.1D.NO.3，SEQ.1D.NO.4以及UEP引物SEQ.1D.NO.5;進行PCR擴增，獲取SNPrs817826分型數據。5.從權利要求4所述的方法，其特徵在於PCR反應體系5ul0.625ul10XTaqBuffer,O.125mMdNTP,O.12ulIOnMPCR引物Mix，0.32525nMMgCl2,0.1ul5U/MLHotstar酶，用ddH20補足5ul；PCR反應條件95°C2min；95°CO.5min,96°CO.5min,72°Clmin，45個循環；72°C5min，25°C⑴min;SAP純化反應體系2ul:0.17ul10XSAPBuffer,0.3lU/ulSAP酶，用ddH20補足2ul；SAP純化反應條件37°C40min,85°C5min,25°C00min;單喊基延伸反應體系2ul:0.210XiPlexBuffer,0.2iPlexTermination,0.33IOOuM終止引物Mix,0.041iPlexEnzyme,用ddH20補足2ul;單喊基延伸反應條件94°C30s-MV5s,92°C5s-80°C5s，內部循環5次，外部循環40次；72°C180s；25°C①s;將反應產物共15nL，經樹脂純化後，SpectroCHIP晶片上樣；通過MassARRAYMALD1-TOFMassSpectrometry進行質譜檢測，並獲取SNPrs817826分型數據。6.一種權利要求1所述的與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2基因序列的應用，其特徵在於，通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性位點rs817826的基因分型，其中rs817826鹼基為C的個體為前列腺癌易感人群，rs817826鹼基為T的個體為前列腺癌非易感人群。全文摘要本發明屬於生物技術的基因領域，具體涉及一種與前列腺癌易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用。本發明提供與前列腺癌易感性相關的遺傳區域9q31.2上的部分基因序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；還提供遺傳區域9q31.2上的單核苷多態性位點rs817826；rs817826鹼基為C的個體為前列腺癌易感人群，rs817826鹼基為Ｔ的個體為非易感人群；rs817826的SNP序列如SEQ.ID.NO.2所示。還提供檢測單核苷酸多態性位點的特異性核酸引物SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5，其特異性地擴增出單核苷酸多態性位點的擴增產物。文檔編號C12Q1/68GK102994495SQ20121043261公開日2013年3月27日申請日期2012年11月2日優先權日2012年11月2日發明者孫穎浩,徐劍鋒,莫曾南,許傳亮,任善成,高旭申請人:上海長海醫院,復旦大學