一種重組腫瘤疫苗及其生產方法
2023-12-09 02:12:21
專利名稱：一種重組腫瘤疫苗及其生產方法
一種重組腫瘤疫苗及其生產方法
背景技術：
抗原提呈是適應性免疫應答中的一個過程，期間抗原提呈細胞捕獲抗原並將抗原提呈至其表面以供T細胞識別。抗原和主要組織相容性複合物(MHC)分子位於抗原提呈細胞表面，其能夠被T細胞受體識別和結合，藉此促進抗原提呈。一旦T細胞識別了細胞表面的抗原，其活化並產生針對抗原的免疫應答。通過抗原提呈，T細胞能夠產生針對外源性抗原和內源性抗原的免疫應答。細胞因子在免疫應答調控中發揮著重要作用。細胞因子是由免疫系統中的細胞分泌的低分子量蛋白，其具有發送調節免疫系統信號的功能。不同細胞因子能夠傳送不同信號。例如，某些細胞因子能夠刺激免疫細胞的增殖或成熟；某些細胞因子能夠引導免疫細胞的遷移；以及某些細胞因子能夠增強基於細胞的免疫應答。 據信，癌症或腫瘤至少部分地與人體內對癌變的免疫應答減弱或缺乏相關。多種療法已被用於治療癌症，包括基因療法。用於癌症治療的基因療法可以涉及到輸送能夠殺傷或抑制癌細胞的基因、能夠增強針對癌細胞免疫應答的基因、能夠修復或代替基因突變或改變的基因、或能夠使癌細胞對化療或放療更為敏感的基因。發明概述本發明涉及用於預防或治療腫瘤和癌症的重組腫瘤疫苗。該腫瘤疫苗可以包含編碼用於預防和治療腫瘤以及癌症的抗原提呈肽、細胞因子和其它因子的核酸，和/或含有此類核酸的表達載體，和/或含有此類核酸和/或表達載體的宿主細胞。本發明還涉及包含腫瘤疫苗的藥物組合物以及使用腫瘤疫苗預防和治療腫瘤和癌症的方法。一方面，本發明提供了一種重組腫瘤疫苗，其包含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸、編碼細胞因子的第二多核苷酸、和至少一個啟動子的組合物，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一個。另一方面，本發明提供了一種重組腫瘤疫苗，其包含具有編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、編碼細胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一個啟動子的表達載體，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一個。另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，包含藥學上可接受的載體以及含有編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸、編碼細胞因子的第二多核苷酸、和至少一個啟動子的腫瘤疫苗，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一個。另一方面，本發明提供了一種治療腫瘤的方法，包括向對象給予藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體以及含有編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸、編碼細胞因子的第二多核苷酸、和至少一個啟動子的腫瘤疫苗，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一個。另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，包含藥學上可接受的載體以及含有編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、編碼細胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一個啟動子的腫瘤疫苗，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一個。另一方面，本發明提供了一種治療腫瘤的方法，包括向對象給予藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體以及含有編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段、編碼細胞因子的第二多核苷酸片段、和至少一個啟動子的腫瘤疫苗，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段中的至少一個。前述發明概述僅僅是示例性的，而非旨在以任何方式進行限定。另外除上文所述示例性的方面、實施方式和特徵外，更多方面、實施方式和特徵將通過引用附圖和下文的詳細說明給出。附圖的簡要說明圖I為表達載體pAd-HSP-hGM-CSF的示意圖。圖2為腺病毒基因組Ad-HSP-hGM-CSF的示意圖。圖3為腺病毒基因組Ad-HSP-mGM-CSF的示意圖。圖4顯示了在B16細胞(a)、Ifep3B細胞(b)、和Hela細胞(C)中通過ELISA測定的mGM-CSF的表達水平，其分別在10、100和1000的感染複數(MOI)下被Ad-HSP-mGM-CSF感染。圖5顯示了在B16細胞(a)、Ifep3B細胞(b)、和Hela細胞(C)中通過ELISA測定的hHSP70的表達水平，其分別在10、100和1000的MOI下被Ad-HSP-mGM-CSF感染。圖6顯示了在感染複數為300時Ad-HSP-hGM-CSF對不同腫瘤細胞的細胞毒性作用。圖7顯示了在感染複數為100時Ad-HSP-hGM-CSF對不同腫瘤細胞的細胞毒性作用。圖8顯示了在感染複數為30時Ad-HSP-hGM-CSF對不同腫瘤細胞的細胞毒性作用。圖9顯示了 Ad-HSP-mGM-CSF對7種不同類型細胞的細胞毒性作用。
圖10顯示了給予小鼠Ad-HSP-mGM-CSF後腫瘤尺寸的改變。發明詳述在以下詳細說明中，引用附圖作為參考，這些附圖也為本發明的其中一部分。附圖中，除非上下文另有說明，否則類似符號一般表示類似的組分。在詳細說明、附圖和權利要求中描述的示例性實施方式不具有限定作用。在不脫離本發明主旨和範圍的前提下，可以利用其它實施方式並可以進行其它改變。核酸組合物本發明涉及一種重組腫瘤疫苗，其具有含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸、編碼細胞因子的第二多核苷酸、和至少一個啟動子的組合物，其中至少一個啟動子操作性地連接至第一多核苷酸和第二多核苷酸中的至少一個。本文使用的術語「重組」指使用一種或多種分子生物學技術對一種或多種生物分子如多核苷酸或多肽分子進行人工處理，以使得此類生物分子處於不同於其自然狀態。本文使用的術語「多核苷酸」或「核酸」指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、或核糖核酸_脫氧核糖核酸的混合物如DNA-RNA雜交物。多核苷酸或核酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA或DNA-RNA雜交物。多核苷酸或核酸可以是線性的或環狀的。
本文使用的術語「編碼」或「為……編碼」指能夠轉錄為mRNA和/或翻譯為肽或蛋白。「編碼序列」或「基因」指編碼mRNA、肽或蛋白的多核苷酸序列。在本發明中這兩個術語可以互換使用。本文使用的術語「mRNA」指與模版DNA序列互補並且能夠作為蛋白合成模版的RNA分子。本文使用的術語「抗原提呈多肽」指能夠結合抗原、提呈抗原至抗原提呈細胞並且促進抗原提呈細胞識別抗原的多肽或蛋白。本文使用的術語「抗原提呈細胞」指能夠在其表面呈現抗原和其主要組織相容性複合物(MHC)的細胞，這樣T細胞能夠識別所呈現的抗原。呈現的抗原能夠被免疫細胞如T細胞識別，藉此產生針對抗原的免疫應答。在某些實施方式中，抗原提呈細胞是樹突狀細胞、巨噬細胞、B-細胞或上皮細胞。在某些示例性實施方式中，抗原提呈細胞是樹突狀細胞。
本文使用的術語「操作性地連接」指所述編碼序列以允許其表達的方式直接或間接地連接或關聯至一個或多個調控序列本文使用的術語「表達」指編碼序列轉錄為mRNA和/或編碼序列翻譯為肽或蛋白。本文使用的術語「轉錄」指RNA的合成過程，通過RNA聚合酶讀取DNA序列以生成與DNA序列互補的RNA鏈。本文使用的術語「翻譯」指肽或蛋白的合成過程，通過核糖體讀取mRNA序列以根據mRNA序列中含有的胺基酸密碼子產生胺基酸鏈。本文使用的術語「調控序列」指對編碼序列表達所必須的或有益的任意核苷酸序列。調控序列可以包括，但不限於，一個或多個啟動子、增強子、轉錄終止子、多聚腺苷酸化序列和內在核糖體插入位點。本文使用的術語「啟動子」指能夠控制編碼序列轉錄的多核苷酸序列。啟動子序列包括足以供RNA聚合酶識別、結合和啟動轉錄的特定序列。此外，啟動子序列可以包括調節RNA聚合酶的識別、結合和啟動轉錄活性的序列。啟動子可以影響與其定位於相同核酸分子的基因或與其定位於不同核酸分子的基因的轉錄。啟動子序列的功能，依據其調控的性質，可以是組成型的或誘導型的。「組成型」啟動子指在宿主細胞中具有持續性活化基因表達功能的啟動子。「誘導型」啟動子指當存在特定刺激物或刺激時在宿主細胞中啟動基因表達的啟動子。本文使用的術語「增強子」指使編碼序列轉錄和/或翻譯增強的核苷酸序列。增強子可以操作性地連接至編碼序列的5』末端或3』末端。在本文中可以使用在真核細胞中可起作用的任意增強子。增強子的實例包括，但不限於，猴病毒40 (SV40)早期基因增強子、來自勞氏肉瘤病毒長末端重複(LTR)序列的增強子、以及來自人巨細胞病毒(CMV)的增強子。本文使用的術語「轉錄終止子」指可被真核細胞RNA聚合酶識別以終止轉錄的核苷酸序列。終止子序列可以操作性地連接至編碼序列的3』末端。在某些實施方式中，終止子可以包含裂解RNA的信號，這樣能夠暴露RNA上的多聚腺苷酸化位點。在本文中可以使用在真核細胞中有功能的任意終止子序列。終止子序列的實例包括，但不限於，來自病毒的終止序列如SV40終止子，和來自已知基因的終止序列如牛生長激素終止子序列。本文使用的術語「多聚腺苷酸化序列」指能夠被真核細胞識別為當其轉錄後，在轉錄的mRNA上添加多聚腺苷酸殘基的信號的核苷酸序列。多聚腺苷酸化序列可以操作性地連接至編碼序列的3』末端。在本文中可以使用在真核細胞中可起作用的任意多聚腺苷酸化序列。多聚腺苷酸化序列的實例包括，但不限於，AAUAAA，和SV40多聚腺苷酸化信號。
本文使用的術語「內在核糖體插入位點」(IRES)指允許從mRNA序列的中部起始轉錄的核苷酸序列。IRES可以用於在一個多核苷酸分子中將兩個或多個編碼序列分隔開來，以使得兩個或多個編碼產物分別翻譯形成。IRES可以操作性地連接至第一編碼序列的3』末端之後和第二編碼序列5』末端之前。在本文中可以使用在真核細胞中可起作用的任意IRES序列。IRES的實例包括，但不限於，小核糖核酸病毒IRES、瘟病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、A肝病毒IRES和C肝病毒IRES。本發明提供了一種組合物，其包含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸和編碼細胞因子的第二多核苷酸。在某些實施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在不同的核酸分子上。在某些實施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在相同的核酸分子上。在某些實施方式中，由單一的啟動子控制第一多核苷酸和第二多核苷酸的表達。在某些實施方式中，由不同啟動子控制第一多核苷酸和第二多核苷酸的表達。在某些實施方式中，第一多核苷酸和第二多核苷酸操作性地連接至一個啟動子，其控制第一和第二多核苷酸的表達，並且其中第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段由IRES序列分隔。在某些實施方式中，第一多核苷酸操作性地連接至控制第一多核苷酸表達的第一啟動子，第二多核苷酸操作性地連接至控制第二多核苷酸表達的第二啟動子。第一啟動子和第二啟動子可以是相同的或不同的。在某些實施方式中，本發明的啟動子是真核啟動子如來自CMV的啟動子(例如CMV立即早期啟動子(CMV啟動子))、愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)啟動子、人類免疫缺陷病毒(HIV)啟動子(例如HIV長末端重複序列(LTR)啟動子)、莫洛尼病毒啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、SV40早期啟動子、來自人基因的啟動子如人肌球蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、人肌肉肌酸啟動子、人金屬硫蛋白￠-肌動蛋白啟動子、人泛素C啟動子(UBC)、小鼠磷酸甘油酸激酶I啟動子(PGK)、人胸腺嘧啶激酶啟動子(TK)、人延伸因子Ia啟動子(EFlA)、花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、E2F-1啟動子(E2F1轉錄因子I啟動子)、a-甲胎蛋白啟動子、縮膽囊肽啟動子、癌胚抗原啟動子、C-erbB2/neu癌基因啟動子、環氧合酶啟動子、CXC-趨化因子受體4 (CXCR4)啟動子、人附睪蛋白4(HE4)啟動子、II型己糖激酶啟動子、L-網素啟動子、粘蛋白樣糖蛋白(MUCl)啟動子、前列腺特異性抗原(PSA)啟動子、存活素啟動子、酪氨酸酶相關蛋白(TRPl)啟動子、和酪氨酸激酶啟動子。在某些實施方式中，本發明的啟動子可以是腫瘤特異性啟動子。本文使用的術語「腫瘤特異性啟動子」指優選地或特異性地在腫瘤細胞中具有啟動基因表達的功能且在非腫瘤細胞或非癌細胞中無活性或具有降低活性的啟動子。腫瘤特異性啟動子的實例包括，但不限於，E2F-1啟動子、a -甲胎蛋白啟動子、縮膽囊肽啟動子、癌胚抗原啟動子、C-erbB2/neu癌基因啟動子、環氧合酶啟動子、CXCR4啟動子、HE4啟動子、II型己糖激酶啟動子、L-網素啟動子、MUCl啟動子、PSA啟動子、存活素啟動子、TRPl啟動子、和酪氨酸酶啟動子。在某些實施方式中，本發明的啟動子是E2F-1啟動子。在某些實施方式中，E2F-1啟動子具有SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列。上文所述的第一啟動子和/或第二啟動子可以是組成型啟動子。在某些實施方式中，組成型啟動子可以是管家基因啟動子，其為基本細胞功能所必須的。實例包括，但不限於，￠-肌動蛋白啟動子、UBC啟動子、PGK啟動子、TK啟動子和EFlA啟動子。在某些實施方式中，組成型啟動子可以是病毒啟動子。實例包括，但不限於，CMV啟動子、SV40啟動子和CaMV 35S啟動子。在某些實施方式中，本發明的重組核酸組合物包含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸，其由組成型啟動子如CMV啟動子調控，以及編碼細胞因子的第二多核苷酸，其由腫瘤特異性啟動子如E2F-1啟動子調控。 在某些實施方式中，抗原提呈多肽是熱休克蛋白。熱休克蛋白是當細胞暴露於升高的溫度或其它應激狀況時表達增加的蛋白家族。已知熱休克蛋白在將蛋白摺疊成適宜構 象中起重要作用。此外，發現熱休克蛋白可提呈蛋白片段至免疫系統。任意熱休克蛋白均可作為本發明中的抗原提呈多肽。熱休克蛋白的實例包括，但不限於，HsplO, Hsp20、Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hspl04、HspllO、a -B-晶體蛋白和葡萄糖調節蛋白。在某些實施方式中，抗原提呈多肽是Hsp70。Hsp70蛋白包括，但不限於，Hsp70_l、Hsp70-2、Hsp70-4、Hsp70_5、Hsp70_6、Hsp70_7、Hsp70_8、Hsp70_9、Hsp70_12 和 Hsp70_14。在某些實施方式中，抗原提呈多肽是Hsp70-1。Hsp70-1蛋白包括，但不限於，Hsp 70-1A和Hsp 70-1B。在某些實施方式中，抗原提呈多肽是Hsp90。Hsp90蛋白包括，但不限於，Hsp90- a p Hsp90- a 2、Hsp90_ ^、內源性纖溶酶和TNF受體相關蛋白I。在某些實施方式中，抗原提呈多肽是葡萄糖調節蛋白。葡萄糖調節蛋白包括，但不限於，葡萄糖調節蛋白75(Grp75，也稱為Hsp70_9)、Grp78(也稱為Hsp70_5)、Grp94(也稱為內源性纖溶酶)和Grp 170。熱休克蛋白的示例性例子及其GenBank登錄號列於表I。表I熱休克蛋白的例子
權利要求
1.一種組合物，所述組合物包含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸，編碼細胞因子的第二多核苷酸，和至少一個啟動子，其中所述至少一個啟動子操作性地連接至所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸中的至少一個。
2.一種表達載體，所述表達載體包含編碼抗原提呈多肽的第一多核苷酸片段，編碼細胞因子的第二多核苷酸片段，和至少一個啟動子，其中所述至少一個啟動子操作性地連接至所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段中的至少一個。
3.根據權利要求I所述的組合物或根據權利要求2所述的表達載體，其中所述抗原提呈多肽是熱休克蛋白。
4.根據權利要求I所述的組合物或根據權利要求2所述的表達載體，其中所述熱休克蛋白選自 Hsp 10、Hsp20、Hsp27、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Hsp90、Hsp 104、Hsp 110、 a -B-晶狀體蛋白和葡萄糖調節蛋白。
5.根據權利要求4所述的組合物或表達載體，其中所述熱休克蛋白是Hsp70。
6.根據權利要求I所述的組合物或根據權利要求2所述的表達載體，其中所述抗原提呈多肽與Hsp70具有至少70%的序列同一性。
7.根據權利要求I所述的組合物或根據權利要求2所述的表達載體，其中所述細胞因子選自巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞/粒細胞集落刺激因子、幹細胞因子和紅細胞生成素。
8.根據權利要求I所述的組合物或權利要求2所述的表達載體，其進一步包括操作性地連接至啟動子的編碼細胞因子的第三多核苷酸。
9.根據權利要求I所述的組合物或權利要求2所述的表達載體，其中所述第一多核苷酸操作性地連接至組成型啟動子和所述第二多核苷酸操作性地連接至腫瘤特異性啟動子。
10.根據權利要求I所述的組合物或權利要求2所述的表達載體，其中所述至少一個啟動子是真核啟動子。
11.根據權利要求I所述的組合物或權利要求2所述的表達載體，其中所述至少一個啟動子是腫瘤特異性啟動子。
12.根據權利要求2所述的表達載體，其中所述表達載體選自質粒、病毒、噬菌體和粘粒。
13.根據權利要求12所述的表達載體，其中所述表達載體是病毒載體。
14.根據權利要求13所述的表達載體,其中所述病毒載體是衍生自一種或多種病毒的載體，所述病毒選自腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、泡性口炎病毒、 麻疹病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒和仙臺病毒。
15.根據權利要求13所述的表達載體，其中所述病毒載體是複製型載體。
16.根據權利要求15所述的表達載體,其中所述病毒載體是含有Ela基因的腺病毒載體。
17.根據權利要求16所述的表達載體，其中所述Ela基因操作性地連接至腫瘤特異性啟動子。
18.分離的宿主細胞，所述細胞包含如權利要求I所述的組合物或如權利要求2所述的表達載體。
19.藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載體，以及如權利要求I所述的組合物、如權利要求2所述的表達載體和如權利要求18所述的分離的宿主細胞中的任意一種。
20.治療癌症的方法，所述方法包含向對象給予如權利要求19所述的藥物組合物。
全文摘要
本申請涉及用於預防和治療腫瘤以及癌症的腫瘤疫苗。腫瘤疫苗可以含有編碼用於預防和治療腫瘤以及癌症的抗原提呈肽、細胞因子和其它因子的核酸，或含有此類核酸的表達載體或病毒，或含有此類核酸或表達載體的宿主細胞。
文檔編號A61K31/7088GK102985094SQ201180031875
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者梁旻 申請人:東源生物醫藥科技(上海)有限公司