蛋白激酶Czeta調控腫瘤細胞趨化運動的用途的製作方法

2023-12-08 19:53:41 1

專利名稱：蛋白激酶Czeta調控腫瘤細胞趨化運動的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白激酶Czeta調控腫瘤細胞趨化運動的用途。
背景技術：
趨化因子及其受體在不同階段腫瘤生存、生長和轉移中起著非常重要的作用，不僅調節腫瘤細胞的生長和轉移，而且趨化不同類型的白細胞，形成利於腫瘤細胞生存、生長、分化的微環境。如Muller及其同事發現，在小鼠模型中，CXCR4和它的配體SDF-1α控制乳腺癌轉移的分布模式，參見文獻(Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokinereceptors in breast cancer metastasis.Nature 2001；41050-56.)因此，阻斷趨化運動可以有效地控制癌細胞的轉移並縮小或消除腫瘤。
曾有研究發現，腫瘤細胞的趨化運動是通過化誘因子及其受體活化G蛋白信號通路介導的，例如，MIP-3β/CCR7、IL-8/CXCR1-2、SDF-1α/CXCR4等。化誘因子的受體屬於七次穿膜受體超家族，它們通過下遊偶聯的G-蛋白傳遞活化信號。近十年來，細胞生物學家對七次穿膜受體和G蛋白調控的趨化運動的分子機理進行了深入研究，認識到趨化因子和特異受體偶聯後，能夠活化一系列細胞內信號轉導過程，包括PI3K活化，Ca2+動員，PKC活化，細胞內肌動蛋白聚集、細胞形態改變，最終導致細胞的定向遷移或者其它的生物學活動(Kimmel AR andParent CA.The Signal to MoveD.discoideum Go Orienteering.Science.3001525-1527，2003.)。
除了G蛋白信號通路以外，實際上其它的信號傳遞通路，酪氨酸蛋白激酶受體，也可以調控趨化運動。例如，表皮生長因子及其受體(EGF/EGFR)也能夠誘導細胞的趨化運動，且與G蛋白的信號傳遞無關(Price JT，Tiganis T，Agarwal A，Djakiew D，and Thompson EW.Epidermal Growth Factor Promotes MDA-MB-231 Breast Cancer Cell Migration through aPhosphatidylinositol 3-Kinase and Phospholipase C-dependent Mechani sm.Cancer Res.595475-5478，1999.)。但是對酪氨酸蛋白激酶受體誘導的趨化運動的分子機制所知甚少。EGF/EGFR在腫瘤的生長和轉移中可能同樣起著非常重要的作用。研究發現在多數乳腺癌細胞中，EGFR表達水平增高，而且往往與臨床預後不良密切相關。以EGFR為靶點設計的特異性抗EGFR的封閉抗體阻斷EGFR的功能後，能夠有效抑制小鼠體內多種EGFR高表達的腫瘤細胞的生長和轉移(Baselga J，Mendelsohn J.The epidermal growth factorreceptor as a target for therapy in breast carcinoma.Breast CancerRes Treat.1994；29127-38.)。
研究還發現，多種趨化因子受體活化後能夠誘導一種人蛋白激酶C(Protein Kinase C，以下簡稱PKC)的活化。而PKC的活化對於白細胞和其它的細胞的趨化運動、趨化因子受體自身的負反饋調節以及不同趨化因子受體之間的功能調節非常重要。不同的趨化因子、不同的受體和不同的細胞類型導致不同的PKC亞型的活化。
但是，PKC亞型在EGFR誘導的腫瘤細胞趨化運動中功能尚屬未知，也未見到以PKC亞型為靶點設計特異抗癌藥物方面的研究。

發明內容
本發明的目的是1.研究EGF/EGFR誘導的細胞趨化運動機制，尋找EGFR和趨化因子授體誘導的趨化運動的信號傳遞途徑中可能分享共同的下遊信號蛋白，並了解此信號蛋白在EGFR誘導的細胞趨化運動中的作用；2.確定在EGF誘導的腫瘤細胞趨化運動中起關鍵作用的PKC亞型。
3.以上述確定的PKC亞型為靶點設計有效抑制腫瘤細胞的轉移和生長的藥物。
本發明發現PKCζ是腫瘤細胞的趨化運動的必需組分，抑制該酶的活化可以有效地抑制EGFR和趨化因子受體誘導的腫瘤細胞的趨化運動。
本發明的技術方案是運用對不同PKC亞型特異的抑制劑分析EGF誘導腫瘤細胞的趨化性定向移動的分子機理。然後分析不同的特異性PKC抑制劑對EGF誘導的腫瘤細胞趨化運動的影響，以便確定起關鍵作用的PKC亞型。運用合成的特異的PKCζ假底物短肽抑制PKCζ的活性和免疫螢光等方法進一步驗證該種PKC分子確實參與EGF誘導的乳腺癌細胞的趨化運動的信號轉導過程。
具體研究方法及結果如下1.利用微孔趨化小室，以乳腺癌細胞株MDA-231為腫瘤細胞模型研究EGF誘導的細胞趨化運動。
細胞趨化是一種有效、直接、簡便的研究體外細胞定向運動的方法。本發明使用不同濃度的人EGF和SDF-1α檢測乳腺癌細胞的趨化運動。結果顯示，EGF以劑量依賴方式誘導MDA-231趨化運動，並且，與趨化因子相比，ECF趨化能力更強。
2.檢測特異的抑制劑對細胞趨化運動能力的影響因為已知PI3K和PKC參與趨化因子誘導的細胞趨化運動，本發明檢測不同濃度的特異的PI3K的抑制劑Ly294002和不同PKC亞型特異的抑制劑對細胞趨化運動能力的影響，以確定PI3K和PKC是否也參與EGF誘導的乳腺癌細胞MDA-231的趨化運動。結果顯示蛋白激酶Czeta(以下簡稱PKCζ)和PI3K特異抑制劑能夠抑制EGF誘導的乳腺癌MDA-231細胞的趨化運動。提示PI3K和PKCζ亞型很可能參與EGF誘導的腫瘤細胞的趨化運動。
3.EGF能夠特異誘導PKCζ亞型的活化細胞內PKC的膜移位是PKC活化的特異標誌。在靜止的細胞中，PKC主要分布於細胞質，細胞受到刺激後，PKC活化並且移位到細胞質膜或者核膜。為了確定PKCζ能夠被EGF特異刺激活化，用免疫螢光染色確定PKC分子在細胞內的分布。結果表明EGF能夠特異誘導PKCζ膜移位。另外，PI3K抑制劑Ly294002能夠完全抑制這一過程。結果表明，與趨化因子誘導的下遊信號途徑一致的是，PI3K也參與EGF誘導的細胞內信號轉導過程，並且PKCζ活化依賴PI3K。
使用抑制劑得到的結果只能給我們提示信號通路中可能起作用的蛋白分子，為了進一步確定PKCζ參與EGF誘導的細胞趨化運動，用合成的特異的PKCζ假底物短肽(Pseudosubstrate)和對照短肽與細胞孵育後檢測細胞的趨化運動能力。結果顯示，與對照短肽相比，特異的PKCζ底物短肽以劑量依賴方式抑制細胞趨化，且在100μM濃度時完全抑制。表明PKCζ參與EGF誘導MDA-231細胞中的趨化運動並且起著非常重要的作用。
本發明從以上工作的結果中得出，PKCζ參與腫瘤細胞的趨化運動，是腫瘤細胞趨化運動的必需組分，抑制該酶的活化可以有效地抑制EGFR和趨化因子受體誘導的癌轉移。因此PKCζ是設計高效、特異的抗癌細胞生長和轉移的藥物的關鍵靶點。


圖1說明特異的PI3K的抑制劑Ly294002和不同PKC亞型特異的抑制劑對EGF誘導的乳腺癌細胞MDA-231的趨化運動的影響。
細胞與不同濃度的抑制劑(見實施例中說明)在37℃共同孵育45-60分鐘後，直接加到趨化小室的上板孔中，檢測抑制劑對細胞的趨化能力的影響。如圖所示，PI3K抑制劑Ly294002和PKCζ抑制劑能夠完全抑制細胞的趨化，而G6850、G6976對細胞的趨化無顯著影響。
圖2表明合成的特異的PKCζ底物短肽(Pseudosubstrate)能夠特異抑制MDA-231細胞趨化運動。與對照短肽相比，特異的PKCζ假底物短肽以劑量依賴方式抑制細胞趨化，並且在10μM濃度時完全抑制特異的PKCζ，假底物短肽和對照短肽對細胞的隨機趨化能力沒有影響。合成短肽對細胞的隨機趨化能力沒有影響。
具體實施例方式本發明用以下實施例進一步清楚說明本發明的技術內容，需要說明的是，儘管在實施例中僅舉出了用人乳腺癌MDA-231細胞進行實驗，但本領域的其它技術人員可以在不脫離本發明實質性內容的範圍內使用其它腫瘤細胞達到類似結果。
名詞解釋蛋白激酶C蛋白激酶C超家族分三個家族classical PKC、novel PKC和atypical PKC。蛋白激酶Czeta(以下簡稱PKCζ)是PKC超家族的ζ亞型，是atypical PKC家族的成員之一，該家族的蛋白激酶可能具有一定的組成性活性，但是與其它家族的蛋白激酶C相同的是，它們也可以被磷脂醯絲氨酸(PS)，磷脂醯肌醇類(PI)以及不飽和脂肪酸激活。激活的PKCζ磷酸化下遊底物分子中的某些絲氨酸和蘇氨酸位點，調節下遊分子的功能，因此PKCζ也屬於絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
實驗材料來源人乳腺癌MDA-231細胞由美國國家癌症研究所Dr.Joost J.Oppenheim贈送；趨化小室購自Neuro Probe公司；EGF購自BD公司；0.01％Fibronectin來自Sigma；Ly294002、G6850、G6976、Chelerythrine Chloride、合成的PKCζ假底物短肽和對照短肽購自Calbiochem公司；Oregon green 514-Phalloidin購自Molecular Probe公司；兔抗人PKCα和抗人PKCζ多克隆抗體購自Santa Cruz公司。
實施例1 EGF能夠誘導MDA-231細胞趨化運動1.實驗方法用趨化小室檢測細胞的趨化運動是一個非常成熟的方法，可使用本領域常規方法具體操作。簡略地說，將不同濃度的化誘因子EGF和SDF-1α加到趨化小室下層板的孔中。用濾膜分隔上下小室，上層小室加MDA-231細胞。孵育後去除膜上層非特異趨化的細胞後，將膜固定、Diff-Quick染色後顯微鏡下計數(400x視野)。每孔計3個視野的平均數作為該孔的趨化細胞數。樣品孔的趨化細胞數，與對照孔的細胞數的比率即為趨化指數。結果用3個孔的平均趨化指數±標準差(Mean±SD)表示。每個實驗至少重複3次。
2.實驗結果趨化因子SDF-1α能夠以劑量依賴方式誘導MDA-231細胞的趨化運動，趨化指數約為4倍左右。同樣，EGF也能夠誘導MDA-231細胞的趨化運動，趨化指數可達到10倍以上。
3.結論人EGF能夠誘導MDA-231趨化運動，且與趨化因子SDF-1α相比，EGF是更強的趨化誘導劑。
實施例2 PKCζ和PI3K特異抑制劑對MDA-231趨化運動的抑制1.實驗方法用特異的PI3K的抑制劑Ly294002(30μM)和不同PKC亞型特異的抑制劑，100nM G6850，50nM G6976，10μM Chelerythrine Chloride在37℃預先處理細胞45-60min，然後直接加到趨化小室上板孔中，檢測細胞對EGF的趨化運動能力。
2.實驗結果見圖1，PI3K特異的抑制劑Ly294002能夠有效抑制EGF誘導的MDA-231趨化運動；與之相同，PKCζ特異的抑制劑Chelerythrine Chloride也能夠完全抑制MDA-231細胞的趨化。然而，G6850和G6976，抑制cPKC和nPKC，對EGF誘導的MDA-231運動沒有明顯的抑制作用。
3.結論Ly294002和Chelerythrine Chloride能夠有效抑制EGF誘導的乳腺癌細胞MDA-231的趨化運動，提示PKCζ，而非其他的PKC亞型，和PI3K參與EGF誘導的乳腺癌MDA-231細胞的趨化運動，並且起著重要的作用。
實施例3 免疫螢光方法確定EGF能否特異誘導PKCζ分子在MDA-231細胞中活化1.實驗方法實驗前48h種植MDA-231細胞，用含0.1％BSA的無血清FPMI 1640繼續培養3h。用含抑制劑(30μM Ly294002)或者不含抑制劑的無血清培養基(FPMI 1640，0.1％BSA)繼續處理細胞60min。用培養基(FPMI 1640，0.1％BSA)或EGF(用FPMI 1640，0.1％BSA稀釋到50ng/ml)刺激特定一段時間後用4％PFA將細胞固定。PBS洗滌兩次後用0.2％Tween 20於4℃穿膜30min。再次洗滌後用兔抗人PKC的特異多抗(分別1∶100稀釋到PBS中)室溫孵育1h後，用PBS充分洗滌3次，然後加FITC-(異硫氰螢光素)標記的羊抗兔二抗室溫避光孵育1h，再次充分洗滌後共聚焦螢光顯微鏡觀察PKC的分布。
2.實驗結果在未受EGF刺激的細胞中，PKCα和PKCζ主要分布於細胞漿。EGF刺激後，PKCζ分布改變移位到細胞內膜，與之形成鮮明對比的是，PKCα的分布在EGF刺激前後沒有變化。說明在MDA-231乳腺癌細胞中，EGF能夠誘導PKCζ的活化，並且，PKCζ的活化是特異的。經過PI3K抑制劑Ly294002預處理後，對未受刺激細胞內的PKCα和PKCζ的分布沒有影響，然而完全抑制了EGF誘導的PKCζ的膜移位，說明PI3K參與EGF誘導的PKCζ的活化過程，PKCζ的活化依賴PI3K。
3.結論EGF能夠特異活化PKCI，PI3K抑制劑Ly294002完全抑制PKCζ活化，提示與趨化因子誘導的下遊信號途徑一致的是，PKCζ參與EGF誘導的細胞內信號轉導，並且PKCζ活化依賴PI3K。使用抑制劑得到的結果只能給我們提示信號通路中可能起作用的蛋白分子。
實施例4 特異的PKCζ假底物短肽抑制細胞趨化實驗1.實驗方法用合成的特異的PKCζ假底物短肽(Pseudosubstrate)和對照短肽與細胞37℃孵育1h後檢測細胞的趨化運動能力。
2.實驗結果結果見圖2。與對照短肽相比，特異的PKCζ假底物短肽以劑量依賴方式抑制細胞趨化，並且在100μM濃度時完全抑制。特異的PKCζ假底物短肽和對照短肽對細胞的隨機趨化能力沒有影響。
3.結論PKCζ參與EGF誘導的MDA-231細胞的趨化運動，抑制PKCζ的功能能夠完全抑制細胞的定向運動。
以上各實驗表明，PKCζ是腫瘤細胞的趨化運動的必需組分，抑制該酶的活化可以有效地抑制EGFR和趨化因子受體誘導的癌轉移，並導致腫瘤的縮減。因此PKCζ是設計高效、特異的抗癌細胞生長和轉移的藥物的關鍵靶點。
權利要求
1.蛋白激酶Czeta調控腫瘤細胞趨化運動的用途。
2.權利要求1所述蛋白激酶Czeta的用途，所述腫瘤細胞趨化運動是腫瘤的生長和轉移的關鍵過程。
3.權利要求1或2所述蛋白激酶Czeta的用途，所述腫瘤細胞是乳腺癌細胞。
4.蛋白激酶Czeta用於設計和製備抗腫瘤藥物的用途。
5.權利要求4所述蛋白激酶Czeta的用途，所述抗腫瘤藥物是抗乳腺癌藥物。
6.蛋白激酶Czeta抑制腫瘤生長和轉移的用途。
全文摘要
本發明涉及蛋白激酶Czeta(Protein Kinase Cζ，PKCζ)在調控腫瘤細胞趨化運動中的用途。本發明發現PKCζ是腫瘤細胞的趨化運動的必需組分，抑制該酶的活化可以有效地抑制EGFR和趨化因子受體誘導的腫瘤細胞的趨化運動。因此PKCζ是設計高效、特異的抗癌細胞生長和轉移的藥物的關鍵靶點。
文檔編號A61K38/48GK1647820SQ20041000114
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月30日 優先權日2004年1月30日
發明者張寧, 孫榮華, 朱斯特J·奧本海姆, 馬大龍 申請人:北京大學