編碼菸草β-1,2-木糖基轉移酶的新核苷酸序列的製作方法

2023-10-05 18:41:39

專利名稱：編碼菸草β-1,2-木糖基轉移酶的新核苷酸序列的製作方法
編碼菸草p-l,2-木糖基轉移酶的新核苷酸序列以下的發明涉及來自菸草屬(7V/cW/""a)物種和栽培種、尤其是來自本 氏菸草(A7cori"wor 6ewf/ifl附/flrtW和菸草栽培種Petite Havana SRl(A7coftVma to6"c"附cv. Petite Havana SR1)的、編碼卩-l，2-木糖基轉移酶(XylT)的新核 苷酸序列，及其生產下述經修飾的菸草植物、尤其是本氏菸草和菸草栽培 種Petite Havana SR1植物的用途，所述植物與對應的未經修飾的菸草植物 相比具有更低水平或改變模式的免疫原性蛋白質結合的N-聚糖、尤其是與 蛋白質結合的N-聚糖上更低水平的p-l，2-木糖殘基。可以如下獲得這類煙 草植物例如通過修飾內源XylT基因的活性來降低內源菸草XylT基因的 表達；通過將內源菸草XylT基因交換為XylT基因的另一等位基因，所述 等位基因提供與蛋白質結合的N-聚糖上更低水平的p-l，2-木糖殘基；或通 過其任何組合。相關領域描述描述了轉基因植物用於生產增值的重組蛋白質如抗體、疫苗、人血制 品、激素、生長調劑劑等等的用途，以提供許多與更常規系統如動物和昆 蟲細胞培養物、酵母、絲狀真菌和細胞相比實際的、經濟和安全的優點(由 Stoger " W" 2002 ， Twyman " W" 2003'， Fischer " 2004綜迷)。儘管蛋白質合成途徑在植物和動物中大致是相同的，但是在翻譯後修 飾中、尤其是關於聚糖鏈結構而言存在許多差異。因此，來自植物的重組 人蛋白質傾向於具有動物中不存在的碳水化合物基團P (1~ 2)-木糖和 a(l—3)-果糖，但是缺乏存在於許多天然人糖蛋白中的末端半乳糖和唾液酸 殘基(Twyman " a/" 2003)。催化木糖從UDP-木糖轉移至蛋白質結合的N-聚糖的核心P-連接的甘露糖中的酶是p-l,2-木糖基轉移酶(XylT)。 XylT是植物和一些非脊推動物 物種如血吸蟲屬(ScA/stoM附flJ種(Khoo"tf/.，1997)和蝸牛(例如Mulder W"/.，1995)中特有的酶，並且不存在於人類或其它脊推動物中。Tezuka "a/. (1992)表徵了美國梧桐04cer;wem/o^/atow附L.)的XylT。 Zeng W a/. (1997)描述了從大豆微粒體中純化XylT。僅分離了部分大 豆XylT cDNA(W099/29835 Al)。Strasser W (2000)和WO01/64卯l描述了擬南芥(Arabidopsis)XylT 基因的分離、編碼的XylT蛋白質的預測氨基^列及其體外和體內酶活 性。可以鑑定以下的資料庫條目，其鑑定了經實驗驗證的和推定的XylT cDNA和基因序列、其部分或同源序列AJ627182，AJ627183 (菸草栽培種 Xanthi (^V,cW朋fi融acw附cv. Xanthi) )、 AM179855 (馬鈴薯(Solan腿 tuberosum)) 、 AM 179856 (葡萄(K,他v/",/em)) 、 AJ891042 (屍o/m/"s ff/6cf x屍印"/附/^附"/tf)、 AY302251 (紫苜蓿(Medicago sativa)) 、 AJ864704 (甘 蔗(Saccharum officinarum)) 、 AM179857(玉蜀黍(Zea mays)) 、 AM179853(大麥(Hordeum vulgare) ) 、 AM179854 (兩色蜀黍(S(^g/iM附6/co/or))、 BD434535 、 AJ277603 、 AJ272121 、 AF272852 、 AX236965 (擬南芥(Arabidopsis thaliana ) ) 、 AJ621918 (稻(Oryza sativa)) 、 AR359783、 AR359782、 AR123000 、 AR123001 (大豆)、AJ618933 (展葉劍葉蘚 (Physcomitrdla patens))。Strasser W"/. (2004a)對植物中N-糖基化調控的兩種途徑作了報導首 先，使用轉錄後基因沉默降低卩-l，2-N-乙醯葡糖胺轉移酶I(GnTI)的表達， 來評價GnTI的表達對本氏菸草中複雜N-聚糖形成的影響，所述p-l，2-N-乙醯葡糖胺轉移酶I涉及高等真核生物中將寡聚甘露糖苷殘基加工為雜合 的和複雜的N-聚糖。N-聚糖圖譜顯示總N-聚糖模式沒有顯著改變，表明 甚至小量殘餘的GnTI活性也允許在本氏菸草中生物合成複雜的N-聚糖。 他們還報導了降低XylT表達導致(3-l，2-木糖基化的N-聚糖顯著減少的類 似途徑。其次，為了達到卩-l，2-木糖和ot-l，3-果糖殘基從N-聚糖中完全消除，使用插入突變林系產生三重敲除的擬南芥植物。這些植物顯示完全缺失活性|3-1，2-木糖基轉移酶和核心a-l，3-巖藻糖基轉移酶，缺乏與免疫原性 蛋白質結合的N-聚糖，並主要合成具有末端p-N-乙醯葡糖胺殘基的人源化 的結構(Strasser W fl/.， 2004b)。闊葉農作物如菸草被認為是商業生產重組蛋白質的有力候選者(參閱 例如Twyman " / ， 2003 )。本發明的目標是提供來自菸草屬物種和栽培種、尤其是來自本氏菸草 和菸草栽培種Petite Havana SR1的備選的XylT cDNA和基因序列，其更 適合於修飾XylT的表達，尤其是在菸草屬物種或栽培種中的表達。發明概述本發明一方面提供了用於生產下述菸草屬植物細胞或植物的方法，所 述菸草屬植物細胞或植物的與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平的p-l，2-木糖殘基，所述方法包括下述步驟向菸草屬物種或栽培種的植物細胞中 引入下述嵌合基因以產生轉基因植物細胞，所述嵌合基因包含有效連接的 可在植物中表達的啟動子、可轉錄的DNA區、和包含在植物中有功能的 轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區，所述可轉錄的DNA區包含第一 有義DNA區(其包含下述核苷酸序列的20個連續核苷酸中至少19個的 核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或 其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自菸草屬物種或栽培種，其中20 個連續核苷酸中的至少19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的 XylT胺基酸；或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核普酸序列或其互補序列，所述核普酸序列優選地可得自菸草屬 物種或栽培種，其中20個連續核苷酸中的至少19個包含至少一個菸草屬 物種特異的XylT核苷酸)、第二反義DNA區(其包含至少19個連續核 苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸與第一DNA區的互補序列具有至少95% 的序列同一性)，其中由可轉錄的DNA區轉錄得到的RNA分子至少能夠 在由第一有義DNA區轉錄的RNA區和由第二反義DNA區轉錄的RNA區之間形成雙鏈RNA區；任選地鑑定轉基因的菸草屬植物細胞，所述煙 草屬植物細胞與未轉化的菸草屬植物細胞相比在與蛋白質結合的N-聚糖 上具有更低的P-l，2-木糖殘基水平；任選地再生轉基因菸草屬植物細胞以 獲得轉基因的菸草屬植物；和任選地鑑定轉基因菸草屬植物，所述轉基因 菸草屬植物與未轉化的菸草屬植物相比在與蛋白質結合的N-聚糖上具有 更低的卩-l，2-木糖殘基水平。菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸或核 苷酸可以是本氏菸草特異的或菸草栽培種Petite Havana SR1特異的XylT 胺基酸或核苷酸，且菸草屬物種或栽培種可優選地分別是本氏菸草或菸草 栽培種Petite Havana SR1。編碼菸草屬XylT蛋白質的核苷酸序列可包含 編碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基醋列或SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的氨基餅列的核苷紗 列，且菸草屬XylT基因的核苷酸序列可包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷,列，或SEQ ID No,: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17的核苷酸序列。本發明的另 一個目的是提供生產下述菸草屬植物細胞或植物的方法， 所述植物細胞或植物在與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平的p-l，2-木糖 殘基，所述方法包括下述步驟對菸草屬物種或栽培種的植物細胞或植物 提供一個或多個雙鏈的RNA分子，其中所述雙鏈的RNA分子包含兩條 RNA鏈， 一條RNA鏈基本由20到21個連續核苷酸中19個的RNA核苷 酸序列組成(所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或 其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自菸草屬物種或栽培種，其中20 到21個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的 XylT胺基酸；或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自菸草屬 物種或栽培種，其中20到21個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬 物種特異的XylT核苷酸)；和鑑定包含所述雙鏈RNA分子的菸草屬植物 細胞或植物，所述植物細胞或植物與不包含該雙鏈RNA分子的相同菸草 屬植物細胞或植物相比，在與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低水平的p-l，2-木糖殘基。可以通過將嵌合基因整合進菸草屬物種或栽培種植物細胞 的基因組中對植物細胞或植物提供雙鏈的RNA，從而產生轉基因植物細 胞，並任選地再生植物細胞以獲得轉基因植物，嵌合基因包含DNA區(所中的至少19個，所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列 或其互補序列，所述核苷酸序列優選地得自菸草屬物種或栽培種，其中20個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨 基酸；或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核 苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自菸草屬物種或栽培 種，其中20個連續核苷酸中的至少19個包含至少一個菸草屬物種特異的 XylT核苷酸)；有效連接的可在植物中表達的啟動子和包含在植物中有功 能的轉錄終止信號和多聚腺苷酸化信號的DNA區。菸草屬物種或栽培種 特異的XylT胺基酸或核苷酸可以是本氏菸草特異的或菸草栽培種Petite Havana SR1特異的XylT胺基酸或核苷酸，且菸草屬物種或栽培種可優選 地分別是本氏菸草或菸草栽培種Petite Havana SR1。編碼菸草屬XylT蛋 白質的核苷酸序列可包含編碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No,:14的胺基酸 序列或SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:lO 的胺基酸序列的核苷酸序列，且菸草屬XylT基因的核苷酸序列可包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷餅列，或SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.: 10或SEQ ID No.: 17的 核苷酸序列。本發明的又一個目的是提供鑑定菸草屬XylTDNA片段的方法，所述 方法包括下述步驟提供可得自菸草屬物種或栽培種的基因組DNA或 cDNA，從以下組中選擇工具，和通過使用基因組DNA或cDNA和引物進 行PCR、或通過使用基因組DNA或cDNA和探針進行雜交來使用所述工 具鑑定來自菸草屬物種或栽培種的XylTDNA片段；所述工具為用作探 針的DNA片段，其包含編碼SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQIDNo.:lO、 SEQ ID No.: 12、或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核21苷瞎列；用作探針的DNA片段，其包含SEQIDNo.: 3、 SEQIDNo.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一的核苷酸序列；用作探針的DNA片段或寡 核苷酸，其包含由20到1513個連續核苷酸組成的核苷酸序列，所述連續 核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基^列的核普^ 列；用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核苷 酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷酸序列； 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核苷酸組 成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一的核苷酸序列；用作PCR反應中引物的 寡核苷酸序列，其具有包含20到200個連續核苷酸的核苷酸序列，所述連 續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的胺基酸序列的核苷酸 序列；用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個連 續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷^列； 用作PCR反應中引物的寡核苷酸，其包含20到200個連續核苷酸的核苷 酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或 SEQ ID No.: 21之任一的核苷酸序列；或用作PCR反應中引物的寡核苷酸， 其具有SEQ ID No.: 1、 SEQ ID No.: 2、 SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、 SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20之任一的核苷酸序列。隨後可分離經鑑定 的片段並用於獲得在與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平P-l，2-木糖殘基 的菸草屬植物細胞或植物。本發明還提供了鑑定與蛋白質結合的N-聚糖上低水平p-l,2-木糖殘基 相關的菸草屬XylT等位基因的方法，所迷方法包括以下步驟提供菸草 屬物種或栽培種不同植物抹系的種群，任選地為經誘變的種群；根據上述方法在種群的各植物林系中鑑定菸草屬XylT等位基因；分析種群各植物 抹系中與蛋白質結合的N-聚糖上p-l，2-木糖殘基水平，並鑑定與其它植物 林系相比與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低p-l，2-木糖殘基水平的植物林 系；和將植物林系中與蛋白質結合的N-聚糖上低水平的p-l，2-木糖殘基與 特定的菸草屬XylT等位基因的存在相關聯。可以向選定的菸草屬植物細 胞或植物中引入菸草屬XylT等位基因，以獲得在與蛋白質結合的N-聚糖 上具有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草屬植物細胞或植物。本發明的又一目的是提供經分離的DNA片段，其編碼包含SEQID No.: 12或SEQIDNo.:14的氨基^列的蛋白質，或該片段的任何部分， 所述部分編碼至少一個本氏菸草特異的XylT胺基酸;經分離的DNA片段， 其包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13或SEQ ID No.: 21的核苷紗列， 或該片段的任何部分，所述部分包含至少一個本氏菸草特異的XylT核苷 酸；經分離的DNA片段，其編碼包含SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6、SEQ ID No.: 8、 SEQIDNo.:10的氨基紗列的蛋白質，或該片段的任何部分， 所述部分編碼至少一個菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT氨基 酸；經分離的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3或SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQIDNo.:9或SEQIDNo.: 17的核苷,列，或該片段的任何 部分，所述部分包含至少一個菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT 核苷酸。本發明還提供了包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因植物可 表達的啟動子、可轉錄的DNA區、和包含在植物中有功能的轉錄終止和 多聚腺苷酸化信號的DNA區，所述可轉錄的DNA區包含反義方向的第一 DNA區(其包含20個連續核苷酸中至少19個，所述連續核苷酸選自編碼 菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，其中20個連續核苷酸中的 至少19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸；或所述 連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其 互補序列，其中20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種特異 的XylT核苷酸)、有義方向的第二DNA區(其包含20個連續核苷酸中至少19個，所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其 互補序列，其中20個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽 培種特異的XylT胺基酸；或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草 屬XylTcDNA的核苷酸序列或其互補序列，其中20個連續核苷酸中的19 個包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸)，其中由可轉錄的DNA 區轉錄得到的RNA分子至少能夠在對應於第一 DNA區的RNA區和對應 於第二 DNA區的RNA區之間通過鹼基配對形成雙鏈的RNA區。嵌合基 因也可以包含植物可表達的啟動子、有義或反義方向的DNA區、和包含 在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區，所述有義或 反義方向的DNA區包含下述20個連續核苷酸中至少19個，所述連續核 苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，其中20個連 續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨基 酸；或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷 酸序列或其互補序列，其中20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草 屬物種特異的XylT核苷酸。本發明提供了包含這類嵌合基因的菸草屬植物細胞和基本由這類菸草 屬植物細胞組成的菸草屬植物及其種子。蛋白質結合的N-聚糖上卩-l，2-木糖殘基水平的用途，所述蛋白質包含SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10、 SEQ ID No.: 12 或SEQ ID No.:14的胺基酸序列或其任何部分，所述任何部分包含編碼至 少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸的20個連續核苷酸中的至 少19個；或下述核苷酸序列用於降低菸草屬植物中與蛋白質結合的N-聚 糖上卩-l，2-木糖殘基水平、在菸草屬物種或栽培種中鑑定XylT基因或XylT cDNA、鑑定與菸草屬物種或栽培種中與蛋白質結合的N-聚糖上低水平 卩-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的等位基因、或向菸草屬物種或栽培種中 引入與蛋白質結合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的 等位基因的用途，所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQID No.: 7、 SEQIDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任何部分，所述任何部分包含含有 至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸的20個連續核苷酸中的 至少19個。根據之前的目的和其它目的，在下文中將闡述本發明的優點和特徵， 通過參考以下的本發明不同實施方案的詳細描述、附帶的權利要求書和附 圖，可更清除地理解本發明的本質。附圖概述

圖1是編碼推定的XylT蛋白的菸草栽培種Xanthi的cDNA序列(登 錄號AJ627182; SEQ ID NO:23 )和分離自菸草栽培種Petite Havana SRI 的兩種不同的XylT cDNA序列(SEQ ID NO: 3和5)之間的全局DNA比對 (以具有以下參數的標準線性評分矩陣為基礎錯配罰分=2，開口罰分- 4, 延伸缺口罰分=1)。點代表菸草栽培種Petite Havana SRI cDNA序列中與 菸草栽培種Xanthi cDNA序列中相應的核苷酸同一的核苷酸；破折號代表 菸草栽培種Petite Havana SRI cDNA序列中對應於菸草栽培種Xanthi cDNA序列中核苷酸的核苷酸缺失。圖2是由來自菸草栽培種Xanthi的cDNA序列編碼的推定的XylT蛋 白(檢索號AJ627182; SEQ ID NO:24 )和由分離自菸草栽培種Petite Havana SRI的兩種不同的XylT cDNA序列編碼的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 4和6 )之間的全局蛋白質比對(以blossum 62評分矩陣為基礎)。 點代表菸草栽培種Petite Havana SRI蛋白質序列中與菸草栽培種Xanthi 蛋白質序列中相應的胺基酸同一的胺基酸；破折號代表菸草栽培種Petite Havana SRI蛋白質序列中對應於菸草栽培種Xanthi蛋白質序列中胺基酸 的胺基酸缺失。圖3是編碼推定的XylT蛋白的來自菸草栽培種Xanthi基因組DNA 序列(檢索號AJ627183; SEQ ID NO:25 )和分離自菸草栽培種Petite Havana SRI的兩種不同的XylT基因組DNA序列(SEQ ID NO:7和9 )之間的全局DNA比對(以具有以下參數的標準線性評分矩陣為基礎錯 配罰分=2，開口罰分-4，延伸缺口罰分=1)。點代表菸草栽培種Petite Havana SR1基因組DNA序列中與菸草栽培種Xanthi基因組DNA序列中 相應的核苷酸同一的核苷酸；破折號代表菸草栽培種Petite Havana SRI 基因組DNA序列中對應於菸草栽培種Xanthi基因組DNA序列中核苷酸 的核苷酸缺失。圖4是由來自菸草栽培種Xanthi的基因組DNA序列編碼的推定的 XylT蛋白(檢索號AJ627183; SEQ ID NO:26 )和由分離自菸草栽培種 Petite Havana SRI的兩種不同的XylT基因組DNA序列編碼的推定的 XyIT蛋白(SEQ IDNO: 8和IO)和由分離自本氏菸草的兩種不同的XylT 基因組DNA序列編碼的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 12和14 )之間的 全局蛋白質比對(以blossum 62評分矩陣為基礎)。點代表菸草栽培種 Petite Havana SRI蛋白質序列中與菸草栽培種Xanthi蛋白質序列中相應 的胺基酸同一的胺基酸；破折號代表菸草栽培種Petite Havana SRI蛋白質 序列中對應於菸草栽培種Xanthi蛋白質序列中胺基酸的胺基酸缺失。發明不同實施方案的詳述本發明以下述發現為基礎來自菸草屬物種和栽培種、尤其是本氏煙 草和菸草栽培種Petite Havana SRI的XylT基因和XylT cDNA，是通過下 述方法獲得與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平卩-l，2-木糖殘基的菸草屬 物種和栽培種、尤其是本氏菸草和菸草栽培種Petite Havana SRI植物的良 好來源核苷酸序列，所述方法例如通過修飾內源菸草XylT基因的活性， 通過將內源菸草XylT基因變更為菸草XylT基因的另 一等位基因，所述等 位基因提供與蛋白質結合的N-聚糖上低水平的j5-l，2-木糖殘基，或通過其 任何組合完成。在一個實施方案中，本發明涉及通過對菸草屬物種或栽培種的植物細 胞或植物提供一種或多種沉默RNA分子獲得在與蛋白質結合的N-聚糖上 具有低水平P-l，2-木糖殘基的菸草屬植物細胞或植物的方法，其中沉默RNA分子包含優選地得自所述菸草屬物種或栽培種的、編碼菸草屬XylT 蛋白的核苷酸序列部分，其中所述部分編碼至少一個菸草屬物種或栽培種 特異的XylT胺基酸；或其中沉默RNA分子包含優選地得自所述菸草屬物 種或栽培種的菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核普酸序列部分， 其中所述部分含有至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。如本文使用的"沉默RNA"或沉默"RNA分子"是指被引入植物細 胞後降低靶基因表達的任何RNA分子。這類沉默RNA可以例如是所謂的 "反義RNA"，其中該RNA分子包含至少20個連續核苷酸的序列，該序 列與靶核酸序列(優選靶基因的編碼序列)的互補序列有95%的序列同一 性。然而，反義RNA也可以針對靶基因的調節序列，包括啟動子序列和 轉錄終止和多聚腺苷酸化信號。沉默RNA還包括所謂的"有義RNA", 其中RNA分子包含至少20個連續核苷酸的序列，該序列與革S核酸的序列 具有95%的序列同一性。其它沉默RNA可以是包含至少20個連續核苷酸 的"未多聚腺苷酸化的RNA",所述連續核苷酸與靶核酸序列的互補序 列具有95 %的同 一性，如WO01/12824或US6423885中所述(兩個文件均 併入本文作為參考)。又一種類型的沉默RNA是如WO03/076619 (引入 本文作為參考)中所述的RNA分子，其包含至少20個連續的核苷酸，所 述連續核苷酸與靶核酸或互補序列具有95%的序列同一性，並還包含如 WO03/076619所述的大部分為雙鏈的區域(包括下述大部分為雙鏈的區 域，該區域包含來自馬鈴薯紡錘塊莖類病毒型的類病毒的核定位信號，或 包含CUG三核苷酸重複)。沉默RNA也可以是包含本文定義的有義和反 義鏈的雙鏈RNA，其中所述有義和反義鏈能夠彼此鹼基配對形成雙鏈的 RNA區(優選有義和反義鏈的所述至少20個連續核苷酸彼此互補)。有 義和反義區也可以存在於一個RNA分子中，從而當有義和反義區形成雙 鏈的RNA區時能夠形成髮夾RNA(hpRNA)。 hpRNA是本領域公知的(參 閱例如WO99/53050,引入本文作為參考)。hpRNA可以被歸類為具有長 的、有義和反義區的長hpRNA，所述有義和反義區可以是大部分互補的， 但不需要完全互補(一般大於約200bp，在200-1000bp之間的範圍內)。hpRNA也可以相當小，尺寸範圍從約30到約42bp變化，但是不比94bp 長太多(見WO04/073390,引入本文作為參考)。沉默RNA也可以是例 如WO2005/052170、 WO2005/047505或US 2005/0144667 (所有的文件引 入本文作為參考)中所迷的人工的微-RNA分子。在另 一個實施方案中，通過生產包含嵌合基因的菸草屬物種或栽培種默RNA分子，所述嵌合基因能夠產生沉默RNA分子、尤其是雙鏈 RNA("dsRNA")分子，其中這類dsRNA分子的互補RNA鏈編碼菸草屬 XylT蛋白的核苷酸序列的部分，所述核苷酸序列優選地得自所述菸草屬物 種或栽培種，其中所述部分編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT 胺基酸，或其中這類dsRNA分子的互補RNA鏈包含菸草屬XylT基因或 菸草屬XyIT cDNA的核普酸序列的部分，所述核苷酸序列優選地得自所述 菸草屬物種或栽培種，其中所述部分包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。本文使用"菸草屬"包括所有已知的菸草屬物種，例如但不限於 Nicotiana acaulis、 N. acuminata、 N. africana、花菸草(N. alata) 、 N. amplexicaulis、 N. arentsii、 N. a"enuata、 N. benavidesii、 N. benthamiana、 N. bigelovii、 N. bonariensis、 N. cavicola、 N. clevelandii、 N. cordifolia、 N, corymbosa、 N. debneyi、 N. excdsior、 N. forgetiana、 N. fragrans、 光 菸草(N. glauca) 、 N. glutinosa、 N. goodspeedii、 N. gossei、 N. hybrid、 N. ingulba、 N. kawakamii、 N. knightiana、 N. langsdorffii、 N. linearis 、 N. longiflora、 N. maritima、 N. megalosiphon、 N. miersii、 N. noctiflora、 N. nudicaulis、 N. obtusifolia、 N. occidentalis、 N. otophora、 N. paniculata、 N. pauciflora、 N. petunioides、百花丹葉菸草(N. plumbaginifolia) 、 N. quadrivalvis、 N. raimondii、 N. repanda、 N. rosulata、 N. rotundifolia、黃 花菸草(N. rustica )、N. setchellii、N. simulans、N. solanifolia、N. spegazzinii、 N. stocktonii、 N. suaveolens、 N. sylvestris、 N. tabacum、 N. thyrsiflora、 N. tomentosa、 N. tomentosiformis、 N. trigonophylla、 N. umbratica、 N.undulata、 N. velutina、 N. wigandioides和Nicotiana x sandera， 和所有已 知的菸草屬栽培種，例如但不限於菸草(Nicotianatabacum)的栽培種如ev. Burley21、 cv. Delgold、 cv. Petit Havana、 cv. Petit Havana SR1、 cv. Samsun 和cv, Xanthi。通常的菸草(Nicotiana tabacum)是一種四倍體雜種物種，其來源於二 倍體物種Nicotiana sylvestris和Nicotiana tomentosiformis。菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA是指在菸草屬物種或栽培種中 天然存在的XylT基因的核苷酸序列，或表示對應於菸草屬物種或栽培種 中天然存在的XylT基因的mRNA的cDNA。類似地，菸草屬XylT蛋白 是指在菸草屬物種或栽培種中天然存在的蛋白質。編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列的實例包括得自本氏菸草的編 碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.: 14中公開的胺基酸序列的核苷酸序列， 或得自菸草栽培種Petite Havana SR1、編碼SEQ ID No.: 4、SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10中公開的氨基餅列的核苷斷列。菸草屬XylT基因的核苷酸序列的實例包括得自本氏菸草、包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13或SEQ ID No.: 21中公開的核苷紗列的核苷 酸序列，或得自菸草栽培種Petite Havana SR1、包含SEQ ID No.: 7或SEQ ID No,: 9中公開的核苷^列的核苷*列。菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列的實例包括得自菸草栽培種Petite Havana SR1、包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5或SEQ ID No.: 17中公 開的核苷酸序列的核苷酸序列。然而，本領域技術人員應當立即明確所示範的核苷^列或其部分可 以被用於鑑定菸草屬物種或栽培種中菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的其它核苷酸序列，並且這類核苷酸序列或其部分也可以被用於例 如在菸草屬植物中降低與蛋白質結合的N-聚糖上P-l，2-木糖殘基的水平。 示範的核香酸序列可被用於選擇i)用作探針的DNA片段，其包含編碼SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的^J^酸序列的核苷^列；ii) 用作探針的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一個的核苷酸序列；iii) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基^列的核苷酸序列；iv) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No，:14的胺基酸序列的核苷酸序列；v) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一個的核苷酸序列；vi) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的胺基酸序列的核苷酸序列；vii) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基斷列的核苷財列；viii) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其包含20到200個連續 核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.:17或SEQIDNo.:21之任一個的核苷酸序列；或ix) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.: 1、 SEQ ID No.: 2、 SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、 SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20 之任一個的核苷酸序列。通過使用來自菸草屬物種或栽培種的基因組DNA或cDNA和上述寡核苷酸作為引物進行PCR，或通過在來自菸草屬物種或栽培種的基因組或 cDNA與上述探針之間優選地在嚴格條件下進行雜交，可以鑑定和/或分離 這類其它菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA或其片段。本文使用"嚴格雜交條件"表示如果探針和耙序列之間存在至少95% 和優選地至少97%的序列同一性，則一般應發生雜交。嚴格雜交條件的實 例是在包含50%曱醯胺、5 x SSC (150 mM NaCl、 15 mM檸檬酸鈉)、 50 mM磷酸鈉(pH7.6)、 5x Denhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖和20照/ml 變性的、經剪切的運載體DNA如鮭精DNA的溶液中過夜溫育，然後將雜 交支持物在0.1 x SSC中於約65'C下洗滌例如約10分鐘(兩次)。其它雜 交和洗滌條件是公知的，並在Sambrook et al， Molecular Cloning: A Laboratory Ma隨I， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)中例 證，尤其是在第11章中。"菸草屬物種特異的XylT核苷酸，，或"菸草屬栽培種特異的XylT核 苷酸"分別是指來自菸草屬物種或栽培種的XylT基因或XylT cDNA的核 苷酸序列的核苷酸，其與SEQ ID NO: 25表示的來自菸草栽培種Xanthi 的XylT基因的相應核苷酸序列或SEQ ID NO: 23表示的來自菸草栽培種 Xanthi的XylT cDNA的相應核苷酸序列不同或不存在於其中。"菸草屬物種特異的XylT胺基酸"或"菸草屬栽培種特異的XylT氨 基酸"分別是指來自菸草屬物種或栽培種的由XylT基因或XylT cDNA編 碼的XylT蛋白的胺基酸序列的胺基酸，其與SEQ ID NO: 26表示的由來 自菸草栽培種Xanthi的XylT基因編碼的XylT蛋白的相應胺基酸序列或 SEQ ID NO: 24表示的由來自菸草栽培種Xanthi的XylT cDNA編碼的 XylT蛋白的相應胺基酸序列不同或不存在於其中。就本發明的目的而言，為了確定來自菸草屬物種或栽培種的XylT基 因或XylT cDNA的核苷酸序列中或由來自菸草屬物種或栽培種的XylT基 因或XylT cDNA編碼的XylT蛋白的胺基酸序列中菸草屬物種或栽培種特 異的核苷酸或胺基酸的存在，通過使用全局比對步驟將來自菸草屬物種或 栽培種的XylT核苷酸或胺基酸序列與來自菸草栽培種Xanthi的相應XylT核苷酸或胺基酸序列進行比較(對核苷酸序列而言，使用的默認的評分矩陣為具有錯配罰分=2、開口罰分=4、延伸缺口罰分=1的"標準線性"。 對於蛋白質序列而言，默認的評分矩陣為"blosum 62"; Henikoff和 Henikoff， 1992.)。為了進行比對，可以使用Align Plus程序(由Scientific & Educational Software, USA提供)。這類全局DNA比對的一個實例是圖1中SEQ ID NO:23表示的來自 菸草栽培種Xanthi的XylT cDNA序列與SEQ ID NO:3和5表示的來自煙 草栽培種Petite Havana SRI的XylT cDNA序列的全局DNA比對。基於 該全局DNA比對確定的菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT核苷 酸的實例包括SEQIDNO:3第1041、 1323、 1332或1421位上的核苷酸， SEQIDNO:5第62、 76、 87、 104、 117、 122、 139、 140、 148、 155、 169、 190、 199、 202、 212、 213、 216、 265、 287、 294、 316、 373、 385、 388、 430、 554、 607、 628、 643、 838、 892、 897、 898、 941、 1005、 1021、 1039或1495位上的核苷酸。這類全局DNA比對的另一個實例是圖3中SEQ ID NO:25表示的來草栽培種Petite Havana SRI的XylT基因序列與SEQ ID NO:ll和13表 示的來自本氏菸草的XylT基因序列的全局DNA比對。基於該全局DNA 比對確定的菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT核苷酸的實例包 括SEQIDNO:7第61、 75、 86、 100-120、 124、 137、 142、 159、 160、 168、 175、 189、 210、 219、 222、 232、 233、 236、 285、 307、 314、 336、 393、 405、 408、 450、 574、 627、 648、 663、 692、 698、 702、 721、 754、 802、 821、 842、 852、 856、卯l、 903、 906、卯7、 908、 917、 927、 928、 930、 931、 960、 961、 965、 974、 977、 981、 983、 986、 1001、 1019、 1027、 1029、 1034、 1068、 1073、 1099、 1120、 1129、 1144、 1154、 1158、 1181、 1193、 1208、 1212、 1228、 1230、 1239、 1275、 1313-1316、 1348、 1353、1357、 1384、 1386、 1496、 1531、 1571、 1601、 1629、 1681、 1696、 1698、 1730、 1754、 1761、 1772、 1789、 1800、 1802、 1811、 1814、 1815、 1855-1861、 1929、 2172、 2190、 2322、 2324、 2328、 2353、 2354、 2391、 2404、 2419、 2428、 2429、 2433、 2434、 2459、 2464、 2478、 2479、 2481、 2484、 2512、 2540-2590、 2595、 2604、 2606、 2630、 2633、 2638、 2670、 2673、 2680、 2695、 2698、 2710、 2711、 2752、 2806、 2811、 2812、 2855、 2919、 2953、 2966、 3217、 3226、 3229或3232位上的核苷酸，SEQIDNO:9第553、 606、 627、 642、 671、 677、 681、 700、 733、 781、 800、 821、 831、 835、 880、 882、 885、 886、 887、 896、 906、卯7、 909、 910、 939、 940、 944、 953、 956、 960、 962、 965、 980、 998、 1006、1008、1013、1047、1052、1078、1099、1108、1123、1133、1137、1160、1172、1187、1191、1207、1209、1218、1254、1292、1293、1294、1295、1327、1332、1336、1363、1365、1475、1510、1550、1580、1608、1660、1675、1677、1709、1733、1740、1751、1768、1779、1781、1790、1793、1794、1834-1840、l卯8、2151、2169、2301、2303、2307、2332、2333、2370、2383、2398、2407、2408、2412、2413、2438、2443、2457、2458、2460、2463、2491、2519-2569、2574、2583、2585、2609、2612、2617、2649、2652、2659、2674、2677、2689、26卯、2731、2785、2790、2791、2834、 2898、 2932、 2945、 3196或3205位上的核苷酸。基於該全局DNA比對確定的本氏菸草特異的XylT核苷酸的實例包括-SEQIDNO:ll第71、 72、 75、 77、 86、 90、 104、 116、 147、 158、 212、 222、 246、 264、 286、 317、 321、 345、 402、 472、 479、 488、 526、 552、 612、 637、 668、 669、 670、 701、 726、 734、 742、 747、 773、 785、 795、 796、 802、 831、 871、 872、 874、 888、 897、 898、 899、 901、 902、 927、 931、 932、 1039、 1044、 1047、 1080、 1091、 1103、 1104、 1113、 1118、 1131、 1134、 1145、 1152、 1164、 1179、 1183、 1199、 1201、 1206、 1227、 1286、 1287、 1288、 1289、 1296、 1301、 1317、 1328、 1332、 1347、 1376、1388、1424、1429、1458、1464、1510、1517、1534、1559、1672、1675、1676、1677、1693、1705、1719、1750、1757、1761、1765、1832、1838、1862、1872、1877、1978、2010、2074、2111、2115、2227、2251、2259、2271、2283、2296、2297、2341、2348、2361、2370、2371、2375、2384、2401、2404、2楊、2495、2497、2521、2529、2561、2607、2701、2777、2822、2843、2856、2867、3020、3052、3053、3116、3143或3227位上的核苷酸，SEQIDNO:13第77、 107、 203、 297、 312、 399、 449、 469、 489、 492、 496、 529、 538、 566、 573、 633、 661、 662、 666、 671、 683、 690、 699、 723、 763、 774、 784、 785、 791、 861、 877、 886、 887、 888、 890、 891、 920、 921、 943、 996、 1015、 1034、 1116、 1190、 1226、 1277-1280、 1282、 1287、 1331、 1343、 1360、 1386-1651、 1672、 1689、 1738、 1770、 1791、 1813、 1820、 1822、 1831、 1832、 1862、 1869、 1874、 1882、 1893、 1906、 1935、 1945、 1956、 1988、 2007、 2033、 2034、 2045、 2049、 2050、 2167、 2198、 2280、 2299、 2315、 2355、 2392、 2413、 2428、 2442、 2464、 2468、 2477、 2493、 2522、 2544、 2548、 2573、 2574、 2639、 2648、 2649、 2653、 2655、 2659、 2679、 2684、 2740、 2773、 2775、 2781、 2796、 2799、 2807、 2816、 2839、 2857、 2975、 2977、 2990、 3053、 3071、 3083、 3119、 3132、 3265、 3311或3392位上的核苷酸。這類全局蛋白質比對的一個實例是圖2中由SEQIDNO:24表示的來 自菸草栽培種Xanthi的XylT cDNA序列編碼的XylT蛋白序列與由SEQ ID NO:4和6表示的來自菸草栽培種Petite Havana SR1的XylT cDNA編 碼的XylT蛋白序列的全局蛋白質比對。基於該全局蛋白質比對確定的煙 草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT胺基酸的實例包括-SEQ ID NO:4第472或502位的胺基酸，-SEQIDNO:6第20、 28、 38、 40、 46、 51、 70、 71、 95、 97、 184、 213、 298、 313、 334或497位的胺基酸。這類全局蛋白質比對的另一實例是圖4中由SEQ ID NO:26表示的來自菸草栽培種Xanthi的XylT基因序列編碼的XylT蛋白序列與由SEQ ID NO:8和10表示的來自菸草栽培種Petite Havana SRI的XylT基因序列編 碼的XylT蛋白序列和與由SEQ ID NO:12和14表示的來自本氏菸草的 XylT基因序列編碼的XylT蛋白序列的全局蛋白質比對。基於該全局蛋白 質比對確定的菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT胺基酸的實例包 括-SEQIDNO:8第19、 27、 32-38、 44、 46、 52、 57、 76、 77、 101、 103、 l卯、219、 304、 319、 340或356位的胺基酸，國SEQIDNO:IO第183、 212、 297、 312、 333或349位的胺基酸。 基於該全局蛋白質比對確定的本氏菸草特異的XylT胺基酸的實例包括-SEQIDNO:12第22、 24、 27、 33、 37、 51、 69、 94、 104、 156、 158、 161、 174、 182、 211、 238、 297、 349或414位的胺基酸，-SEQ ID NO:"第1、 26、 36、 68、 99、 133、 150、 157、 166、 180、 189、 211、 218、 245、 257、 296、 327、 348或392位的胺基酸。沉默RNA分子中、尤其是雙鏈RNA分子的一條鏈中包含的編碼菸草 屬XylT蛋白的核苷酸序列的部分和菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA 的核苷酸序列的部分應當為至少19個核苷酸長，但是可從約19個核苷酸 (nt)變化至多達等於菸草屬XylT蛋白編碼序列或菸草屬XylT基因或 cDNA序列長度的長度(按核苷酸計)。因此有義或反義核苷酸序列的總 長度可以為至少25nt，或至少約50nt、或至少約100 nt、或至少約150 nt、 或至少約200nt、或至少約500nt。預期不存在有義或反義核苷酸序列總 長度的上限。然而由於實踐原因(例如嵌合基因的穩定性)，預期有義或 反義核苷酸序列的長度不應超過5000 nt，尤其是不應超過2500 nt並可以 ,皮限制至約1000 nt。應當明白編碼菸草屬XylT蛋白的核苷^列的部分或菸草屬XylT基 因或菸草屬XylT cDNA的部分(有義或反義區)總長度越長，這些區域和 來自菸草屬物種或栽培種的內源XylT基因中與其互補的相應序列之間需要的序列同一性越不嚴格。優選地，目的核酸應當與相應的靼序列具有至少約75%、尤其是至少約80%、更尤其是至少約85%、非常尤其是約卯 %、特別是約95%、更特別是約100%的序列同一性，非常特別是與耙序 列或其互補序列的相應部分相同。然而，優選目的核酸始終包含約19個連 續核苷酸、尤其是約25nt、更尤其是約50nt、特別是約100nt、非常特 別是約150 nt的序歹'J,所述序列與靶XylT核酸的相應部分具有100%的序 列同一性，其中所述約19個連續核苷酸、尤其是約25nt、更尤其是約50 nt、特別是約100nt、非常特別是約150nt編碼至少一個菸草屬物種或栽 培種特異的XylT胺基酸或包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT 核苷酸。就本發明的目的而言，以百分數表達的兩條相關的核苷酸或氨基^ 列的"序列同一性，，是指兩條最適比對的序列中具有同一殘基的位置數 (xlOO)除以比較的位置數。缺口被認為是不相同的殘基，所述缺口即比對 中一條序列中存在殘基但是另一條中不存在殘基的位置。優選地，為了計 算序列同一性並設計相應的有義或反義序列，缺口數應當被最小化，尤其 是對於較短的有義序列而言。應當明確只要RNA分子的核苷酸序列通過參考相應DNA分子的核苷 ,列被定義時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應當被替換為尿嘧啶(U)。 是提及RNA還是DNA分子在本申請的上下文中將是清楚的。已經證明用於沉默具體靶基因的最小需求是沉默嵌合基因核苷酸序列 中存在對應於靶基因序列的約20-21個連續核苷酸長的核苷酸序列，其中 20-21個連續核苷酸的至少19個與相應的靶基因序列同一。本文使用的"20 個連續核苷酸中的19個"是指選自靶基因的20個連續核苷酸的核苷, 列，該序列具有一個錯配的核苷酸。為了沉默來自菸草屬物種或栽培種的內源XylT基因，沉默嵌合基因 核苷酸序列優選包含20-21個連續核苷酸中至少19個，所述連續核苷酸來 自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列，其中所述20-21個連續核苷酸的至 少19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XyIT胺基酸；或沉默嵌合基因核苷酸序列包含20-21個連續核苷酸中至少19個，所述連續核苷酸 來自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列，其中所述20-21 個連續核苷酸的至少19個包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT 核苷酸。本文使用的"與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平ji-l，2-木糖殘基的煙 草屬植物"是一種植物(尤其是根據本發明的方法獲得的菸草屬植物)， 其中XylT活性;陂降低或廢除，導致與未根據本發明的方法處理的對照煙 草屬植物中與蛋白質結合的N-聚糖上的p-l，2-木糖殘基水平相比，與蛋白 質結合的N-聚糖上有更低水平的p-l,2-木糖殘基，或導致與蛋白質結合的 N-聚糖上不存在P-l，2-木糖殘基。可以通過將來自才艮據本發明的方法獲得 的菸草屬植物的蛋白質聚糖上存在的卩-l，2-木糖殘基水平與來自未根據本 發明方法處理的對照菸草屬植物的蛋白質的聚糖上存在的p-l，2-木糖殘基 水平比較，獲得XylT水平的指示。可以通過以下方法測量植物的與蛋白 質結合的N-聚糖上p-l，2-木糖殘基的水平例如通過如Faye et al. (Analytical Biochemistry, 1993， 209: 104-108)所述的使用木糖特異抗體進 行蛋白質印跡分析，或通過對分離自植物糖蛋白的聚糖進行質傳，所述質 i普使用例如Kolarich和Altmann (2000, Anal. Biochem. 285: 64-75)所述的 基質輔助雷射解吸/離子化飛行時間質鐠法(MALDI-TOF-MS)或使用例如 Henriksson et al. (2003， Biochem. J. 375: 61—73)所述的液相層析串聯質 鐠法(LC/MS/MS)。根據本發明的dsDNA編碼菸草屬XylT表達降低嵌合基因可含有內含 子，如異源內含子，其位於例如根據WO 99/53050 (引入本文作為參考) 公開內容的有義和反義RNA區之間的間隔序列中。已經開始明白雙鏈RNA分子(如上文所述的那些)在植物細胞中被 切割成約20-21個核苷酸的小RNA片段，其作為相應的mRNA變性中的 指導序列(由Baulcombe， 2004綜述)。因此在另一個實施方案中，本發 明涉及用於生產與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草 屬植物細胞或植物的方法，所述方法包括步驟a) 對菸草屬物種或栽培種的植物細胞提供一個或多個雙鏈RNA分 子，其中雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈， 一條RNA鏈基本由20到21 個連續核苷酸的RNA核苷酸序列組成，所述連續核苷酸選自編碼菸草屬 XylT蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列優選地得自所述菸草屬物種或栽 培種，其中所述20到21個連續核苷酸編碼至少一個菸草屬物種或栽培種 特異的XylT胺基酸，或一條RNA鏈基本由20到21個連續核苷酸的RNA 核苷酸序列組成，所述連續核苷酸來自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列優選地得自所述菸草屬物種或栽培 種，其中所述20到21個連續核苷酸包含至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT核苷酸；和b) 鑑定包含這些雙鏈RNA分子的菸草屬植物，所述菸草屬植物與不 包含所述雙鏈RNA分子的相同菸草屬植物相比在與蛋白質結合的N-聚糖 上具有較低水平的P-l，2-木糖殘基。所述20-21 nt長的dsRNA序列也在常規的反義RNA介導的沉默或有 義RNA介導的沉默過程中產生。因此，在本發明的另一個實施方案中， 提供用於生產與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草屬 植物細胞或植物的方法，所述方法包括對菸草屬物種或栽培種的植物細胞 提供嵌合基因，所述嵌合基因包含有效連接的以下DNA片段a) 植物可表達的啟動子，b) 反義或正義方向的DNA區，其包含至少20個連續核苷酸，所述連 續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列優選 地得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述至少20個連續核苷酸編碼至少 一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸，或所述DNA區包含來自煙 草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列的至少20個連續核苷 酸，所述核苷酸序列優選地得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述至少 20個連續核苷酸包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸，(c)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。 因此，所述反義或有義核苷酸區可以從約21nt到約5000nt長，例如長度為21nt、 40 nt、 50 nt、 100nt、 200 nt、 300nt、 500nt、 1000 nt或甚至 約2000nt或更長。另外，就本發明的目的而言，使用的抑制性XylT基因 分子的核苷M列或嵌合基因的編碼區不必與內源菸草屬XylT基因完全 同一或互補，在菸草屬植物細胞中期望所述內源菸草屬XylT基因的表達 被降低。序列越長，整體序列同一性的要求越不嚴格。因此，有義或反義 區與內源菸草屬基因的核苷酸序列或其互補序列可具有約40%或50%或 60 %或70 %或80 %或90 %或100 %的整體序列同一性。然而，如所提到的， 反義或有義區應優選地包含19-20個連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續 核苷酸與XylT基因的核苷酸序列具有約100%的序列同一性，其中所述 19-20個連續核苷酸編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨基 酸，或包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。約100%序 列同一性的那段序列可以是約50、 75或100 nt。可以通過包含DNA元件進一步增強上述嵌合基因的效率，所述嵌合 基因被轉錄時產生反義或有義的沉默RNA，所述DNA元件導致異常的、 未多聚腺苷酸化的XylT抑制性RNA分子的表達。適用於該目的的一個這 類DNA元件是編碼自剪接核酶的DNA區，如WO 00/01133中所述。還 可以通過對產生的RNA分子提供如WO 03/076619中所述的核定位或存留 信號增強效率。來自本氏菸草和來自菸草的例證的XylT核苷酸序列也可以被用於在 菸草屬物種或栽培種的種群中鑑定XyiT等位基因，所述等位基因與蛋白 質結合的N-聚糖上低水平的卩-1，2-木糖殘基相關。這類菸草屬物種或栽培 種的植物種群可以是先前已被誘變的種群。然後可以使用常規育種技術將轉化菸草屬植物的方法也是本領域已知的。農桿菌介導的菸草屬轉化 已經在例3口 Zambryski et al. (1983， EMBO J. 2: 2143-2150)、 De Block et al. (1984， EMBO J. 3(8):1681畫1689)或Horsch et al. (Science (1985) 227: 1229-1231)中描迷。根據本發明獲得的經轉化的菸草屬植物，或獲得的與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草屬植物(其中內源XylT基因已經 被替換為XylT等位基因，所述等位基因與原始XylT等位基因相比，與蛋 白質結合的N-聚糖上更低水平的卩-l，2-木糖殘基相關)可以在常規育種流 程中被用於生產具有相同特性的更多植物，或被用於在相同或相關植物物 種的其它栽培種或雜種植物中引入根據本發明的嵌合基因。得自經轉化的 植物的種子含有本發明的嵌合基因作為穩定的基因組插入物，其可以被本 發明包括。另外，已知反義、有義或雙鏈RNA或編碼嵌合基因的引入可導致表 型的分布在從幾乎沒有或非常少的靶基因表達抑制到非常強或甚至100% 的靶基因表達抑制的範圍內變化。然而，本領域技術人員能夠選擇導致期 望的沉默程度和期望表型的這些植物細胞、植物、事件或植物林系。如本文使用的"包含"旨在被解釋為指出涉及的所述特徵、整數、步 驟或組分的存在，但是不排除一種或多種特徵、整數、步驟或組分或其組 的存在或添加。因此，例如包含核苷酸或胺基酸序列的核酸或蛋白質除了 實際引用的核苷酸或胺基酸之外可包含更多的核苷酸或胺基酸，即被嵌入 更大的核酸或蛋白質中。包含按照功能或結構定義的DNA區的嵌合基因 可包含額外的DNA區等。以下的非限制性實施例描述了下述嵌合基因及其用途，所述嵌合基因 改變菸草屬物種、尤其是本氏菸草和菸草屬栽培種、尤其是菸草栽培種 Petite Havana SR1中與蛋白質結合的N-聚糖上的卩-l，2-木糖殘基水平。除 非在實施例中另有說明，所有的重組DNA技術根據Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY和Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA的第1和第2巻中所述的標準 方案進行。用於植物分子工作的標準材料和方法描述於R.D.D. Croy的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和Blackwell Scientific Publications, UK共同出版。在說明書和實施例全文各處，參照序列表中列出的以下序列SEQ ID NO: 1:適用於擴增一部分菸草屬XylT基因或cDNA的寡核 苷酸XylF4的核苦酸序列。SEQ ID NO: 2:適用於擴增一部分菸草屬XylT基因或cDNA的寡核 苷酸XylR4的核苷酸序列。SEQ ID NO: 3:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基因變體1的部 分cDNA序列。SEQ ID NO 分胺基酸序列。SEQ ID NO 分cDNA序列。SEQ ID NO 分氨基,列。SEQ ID NO 分核苷酸序列。SEQ ID NO 分氨基,列。SEQ ID NO 分核苷酸序列。SEQ ID NO 分氨基^列。 SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO4:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT蛋白變體1的部菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基因變體2的部6:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT蛋白變體2的部7:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基因變體1的部8:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT蛋白變體1的部9:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基因變體2的部10:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT蛋白變體2的部11: 12: 13: 14:本氏菸草XylT基因變體l的部分核苷,列。 本氏菸草XylT蛋白變體1的部分氨基,列。 本氏菸草XylT基因變體2的部分核苷酸序列。 本氏菸草XylT蛋白變體2的部分胺基酸序列。 SEQ ID NO: 15:適用於擴增菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基 因或cDNA的部分的寡核苷酸XylF8的核苷^列。SEQ ID NO: 16:適用於擴增菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基 因或cDNA的部分的寡核苷酸XylR8的核苷^列。SEQ ID NO: 17:菸草栽培種Petite Havana SRI XylT基因變體1的部 分cDNA序列。SEQ ID NO: 18:載體pTKW20的T-DNA區的核苷酸序列。SEQ ID NO: 19:適用於擴增本氏菸草XylT基因或cDNA部分的寡核苷酸XylF9的核苷酸序列。SEQ ID NO: 20:適用於擴增本氏菸草XylT基因或cDNA部分的寡核苷酸XylR9的核苷酸序列。SEQ ID NO: 21:本氏菸草XylT基因變體1的部分序列。SEQ ID NO: 22:載體pTKW29的T-DNA區的核苷酸序列。SEQ ID NO: 23:針對推定的P-(l，2)-木糖基轉移酶的菸草栽培種Xanthi mRNA (檢索號AJ627182 )SEQ ID NO: 24:由SEQ ID NO:23編碼的推定的卩-(l，2)-木糖基轉移酶SEQ ID NO: 25:針對推定的(5-(1，2)-木糖基轉移酶的菸草栽培種 Xanthi xylt基因(檢索號AJ627183 )SEQ ID NO: 26:由SEQ ID NO:25編碼的推定的卩-(l，2)-木糖基轉移酶實施例實施例1:設計用於從菸草栽培種Petite Havana SRI和本氏菸草中分 離XylT cDNA和基因序列的筒並引物將在來自菸草栽培種Petite Havana SRI和本氏菸草的XylT cDNA和 基因組DNA的PCR擴增中被用作簡併引物的寡核苷^列以來自菸草栽 培種Xanthi的基因組DNA序列的外顯子序列為基礎設計，所述外顯子序 列編碼推定的XylT蛋白(檢索號AJ627183)。正向引物(SEQ ID NO:l) 在其5'端械z沒計為CACC用於克隆的目的。以此種方式產生以下的簡併引 物XylF4:5'-CACCTTGTTTCTCTCTTCGCTCTCAACTCAATCACTC畫3' (SEQ ID NO: 1)XylR4: 5，-TCGATCACAACTGGAGGATCCGCATAA -3， (SEQ ID NO: 2)實施例2:從菸草栽培種Petite Havana SRI中分離XylT cDNA序列使用實施例l中所述的簡併引物從菸草栽培種Petite Havana SRI中分 離XylT cDNA序列使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)根據製造商方案從菸草栽培種 Petite Havana SRI的葉中提取RNA並用於cDNA合成，所述cDNA合成 使用用於RT-PCR的Superscript 第 一鏈合成體系(Invitrogen Life Technologies)根據製造商說明進行。使用作為模板的cDNA和引物對XylF4 / XylR4，在以下條件下進行 PCR擴增94。C 15秒(變性)和68X: 3分鐘40個循環(退火和延伸)。擴增了約1500鹼基對的DNA片段，將其克隆進pENTRTM/D-TOPO 載體(Iiwitrogen),並對若干個克隆(包含SEQ ID NO: 3 - XylTc2Nt -和 SEQ ID NO: 5 - XylTc7Nt的序歹'J )測序。來自菸草栽培種Xanthi的編碼推定的XylT蛋白的mRNA序列(檢 索號AJ627182; SEQ ID NO:23 )和從菸草栽培種Petite Havana SRI中分 離的XylTcDNA序列(SEQIDNO:3和5)之間的比對在圖1中展示。由來自菸草栽培種Xanthi的mRNA序列編碼的推定的XylT蛋白(檢 索號AJ627182; SEQ ID NO:24 )和由分離自菸草栽培種Petite Havana SRI 的cDNA序列編碼的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 4和6 )之間的比對 在圖2中展示。實施例3:菸草栽培種Petite Havana SRI和本氏菸草的XylT基因序 列的分離使用實施例1中所述的簡併引物從菸草栽培種Petite Havana SRI和本氏菸草中分離XylT基因序列以Bernatzky和Tanksley (1986)所述的方案為基礎從菸草栽培種 Petite Havana SR1和本氏菸草的葉中提取DNA。使用基因組DNA作為模板和引物對XylF4 / XylR4 ，在以下條件下進 行PCR擴增94°C 15秒(變性)和68°C 4分鐘30秒40個循環(退火 和延伸)。使用來自菸草栽培種Petite Havana SRI的基因組DNA作為PCR擴 增的模板，擴增了約3400鹼基對的DNA片段，將其克隆進 pENTRTM/D-TOPO 載體(lnvitrogen)中，並對若干個克隆(包含SEQ ID NO: 7 - XylTglNt 一和SEQ ID NO: 9 — XylTg3Nt)測序。XylT基因組DNA序列XylTglNt和XylTg3Nt包含兩條推定的內含子 序列和三條推定的外顯子序列。內含子序列的位置為-對XylTglNt而言從SEQ ID NO: 7的位置679處的核苷酸 到位置1974處的核苷酸，和從位置2125處的核苷酸到位置2722處 的核苷酸，和-對XylTg3Nt而言從SEQ ID NO: 9的位置658處的核苷酸 到位置1953處的核苷酸，和從位置2104處的核苷酸到位置2701處 的核苷酸。使用來自本氏菸草的基因組DNA作為PCR擴增的模板，擴增了約 3300到約3600鹼基對的DNA片段，將其克隆進pENTRTM/D-TOPO 載 體(Invitrogen)中，並對若干個克隆(包含SEQ ID NO: 11 - XylTgl4Nb — 和SEQ ID NO:13 - XylTgl9Nb的序列)測序。XylT基因組DNA序列XylTgl4Nb和XylTgl9Nb包含兩條推定的內 含子序列和三條推定的外顯子序列。內含子序列的位置為-XylTgl4Nb:從SEQ ID NO: 11的位置658處的核苷酸到位置 1917處的核苷酸，和從位置2068處的核苷酸到位置2612處的核苷 酸，和-XylTgl9Nb:從SEQ ID NO: 13的位置649處的核苷酸到位置2194處的核苷酸，和從位置2345處的核苷酸到位置2888處的核苷酸。來自菸草栽培種Xanthi的編碼推定的XylT蛋白的基因組DNA序列 (檢索號AJ627183; SEQ ID NO:25 )和從菸草栽培種Petite Havana SRI 中分離的XylT基因組DNA序列(SEQ ID NO: 7和9)和從和本氏菸草中分 離的XylT基因組DNA序列(SEQ ID NO: 11和13 )之間的比對在圖3 中展示。由來自菸草栽培種Xanthi的基因組DNA序列編碼的推定的XylT蛋 白(檢索號AJ627183; SEQ ID NO:26 )和由分離自菸草栽培種Petite Havana SRI的基因組DNA序列編碼的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 8 和10)和由分離自本氏菸草的基因組DNA序列編碼的推定的XylT蛋白 (SEQ ID NO: 12和14 )之間的比對在圖4中展示。實施例4:含菸草屬XylT沉默基因的T-DNA載體的構建 使用實施例2和3中所述從菸草屬XylT序列擴增的DNA片段構建含 有嵌合基因的T-DNA載體，所述嵌合基因轉錄時產生RNA分子，所述 RNA分子包含來自被擴增的DNA片段的有義和反義DNA序列，所迷有 義和反義DNA序列可以鹼基配對形成雙鏈的RNA分子。這類嵌合基因可 以被用於在菸草屬、尤其是菸草栽培種Petite Havana SRI和本氏菸草中降 寸氐XylT基因的表達。4.1.用從菸草栽培種Petite Havana SRI的XylT基因序列擴增的DNA 片段構建含有XylT沉默基因的T-DNA載體以實施例2中分離的、來自菸草栽培種Petite Havana SRI的cDNA 序列為基礎設計寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列將要在從菸草栽培種 Petite Havana SRI中PCR擴增XylT cDNA時被用作非簡併引物。正向引 物(SEQ ID NO:15)在其5'端被設計為具有CACC用於克隆的目的。以此種 方式產生以下的非簡併引物XylF8: 5，-CACCTCTCGCCTTTGGGATATGAAACT -3， (SEQ IDNO: 15)XylR8: 5，-ACAGCTTTGGTGCTGCAGAAACT-3， (SEQ ID NO:16)使用如實施例2所述包含從菸草栽培種Petite Havana SRI的XylT cDNA序列中擴增的DNA片段(SEQIDNO:3-XylTc2Nt)的載體作為模板 和引物對XylF8/XylR8，在以下的條件下進行PCR擴增94°C 15秒(變 性)、56。C30秒(退火)和68'C 45秒(延伸)25個循環。擴增了約470 bp的DNA片段(XylTi4Nt; SEQ ID NO: 17),並將其克 隆進pENTRTM/D-TOPO 載體(Invitrogen)中，得到質粒pKW19。使用 Gateway LR ClonaseTM II (Invitrogen)將質粒pKW19與pHellsgate12 (Helliwell和Waterhouse, Methods (2003) 30: 289-295)重組，得到質粒 pTKW20。因此，pTKW20的T-DNA序列(SEQ ID NO: 18)包含 嵌合的XylT沉羅植因，其包含。包含花椰菜花葉病毒35S轉錄物啟動子區的片段(Odell et al.， 1985)(SEQ ID NO:18從核苷酸969到核苷酸2314) 。包含以有義方向克隆的菸草栽培種Petite Havana SRI XylT cDNA 序列的片段(SEQ ID NO: 18從核苷酸2365到核苷酸2834) 。包含來自蓖麻子的catase-l基因內含子的片段 (SEQ ID NO:18從核苷酸2893到核苷酸3088) 。包含如Rosche和Westhoff (1995)所述的、反向的、來自Flaveria trinervia的丙酮酸正磷酸雙激酶基因第二個內含子的片段 (SEQ ID NO:18從核苷酸3130到核苷酸3871) 。包含以反義方向克隆的菸草栽培種Petite Havana SRI XylT cDNA 序列部分的片段(SEQ ID NO:18從核苷酸3957到核苷酸4426). 。包含如De Greve et al. (1982)所述的根癌農桿菌章魚鹼合酶基因3，非翻譯區的片段(SEQ ID NO:18從核苷酸4479到核苷酸5244). 編碼可選擇標記物的嵌合基因，其包含 。包含根癌農桿菌T-DNA章魚鹼合酶基因啟動子區的片段(SEQ ID NO:18從核苷酸5512到核苷酸5744). 。包含nptll抗生素抗性基因的片段(SEQ ID NO:18從核苷酸5745到核苷酸66卯) 。包含根癌農桿菌T-DNA章魚鹼合酶基因3'非翻譯區的片段。(SEQ ID NO:18從核苷酸6691到核苷酸7396)。 T-DNA載體被引入包含輔助Ti-質粒的根癌農桿菌中。4.2.用從本氏菸草的XylT序列擴增的DNA片段構建包含XylT沉默 基因的T-DNA栽體以實施例3中分離的來自本氏菸草的基因序列為1^出，設計寡核苷酸 序列，所述寡核苷,列要在從本氏菸草中PCR擴增XylT基因時被用作 非簡併引物。正向引物(SEQ ID NO:19)在其5，端^f皮設計為具有 GGCCGGATCCTCG用於克隆的目的，反向引物(SEQ ID NO:20)在其5， 端被設計為具有GGCCATCGATGGTACC。以此種方式產生以下的非簡 並引物XylF9:5，-GGCCGGATCCTCGAGACACAATTGGAGGAAACATGGAAA GC-3"(SEQ ID NO: 19) XylR9:5，-GGCCATCGATGGTACCGGCCCAGCTCTTTATGGAATCAAA -3' (SEQ ID NO: 20)使用包含如實施例3所述從本氏菸草的XylT基因序列中擴增的DNA 片段(SEQ ID NO:ll - XylTgl4Nb)的載體作為模板和引物對XylF9 /XylR9，在以下的條件下進行PCR擴增94。C 15秒(變性)、58'C30秒 (退火)和68t: 30秒(延伸)25個循環。擴增了約430 bp (XylTiNb; SEQ ID NO: 21)的DNA片段，並分別用 Xhol與Kpnl和用BamHI與Clal消化。將Xhol / Kpnl和BamHI / Clal 消化的片段克隆進用Xhol / Kpnl和BamHI / Clal消化的pHANNIBAL (HelHwell和Waterhouse， 2003)中，得到pKW28。因此，質粒pKW28包含嵌合的XylT沉默基因，該沉默基因在限制性 位點Mscl和Pstl之間包含。包含花椰菜花葉病毒35S轉錄物啟動子區的片段(OdelI et al.， 1985)(SEQ ID NO:22從核苷酸3779到核苷酸2434) 。包含以有義方向克隆的本氏菸草XylT基因序列部分的片段(SEQ ID NO:22從核苷酸2427到核苷酸2023) 。包含如Rosche和Westhoff (1995)所述的來自Flaveria trinervia的 丙酮酸正磷酸二激酶基因第二個內含子的片段(SEQ ID NO:22從核苷酸1991到核苷酸1250) 。包含以反義方向克隆的本氏菸草XylT基因部分的片段(SEQ ID NO:22從核苷酸1211到核苷酸807) 。包含如De Greve et al. (1982)所述的根癌農桿菌章魚鹼合酶基因3， 非翻譯區的片段(SEQ ID NO:22從核苷酸786到核苷酸76)。 用Mscl和Pstl消化質粒pKW28,並將嵌合基因與編碼可逸擇標i己物 的嵌合基因 一起引入用Pstl和Smal切割的T-DNA載體的T-DNA邊界之 間，得到pTKW29( pTKW29的T-DNA的序列在SEQ ID NO: 22中表示)， 所迷編碼可選擇標記物的嵌合基因包含。包含根癌農桿菌T-DNA章魚鹼合酶基因啟動子區的片段(SEQ ID NO:22從核苷酸3854到核苷酸4140) 。包含bar膦絲菌素抗性基因的片段(De Block et al.， 1987) (SEQ ID NO:22從核苷酸4161到核苷酸4712)。包含根癌農桿菌T-DNA章魚鹼合酶基因3，非翻譯區的片段 (SEQ ID NO:22從核苷酸4731到核苷酸4991)。載體pTKW29來自pGSC1700 (Cornelissen和Vandewide， 1989)。載 體主鏈含有以下的遺傳元件 質粒核心和限制性片段，所述質粒核心包含用於在大腸桿菌 (Escherichia coli)中複製的來自質粒pBR322 (BolWar et al.， 1977)的複製起 點(ORI ColEl)，所述限制性片段包含用於在根癌農桿菌中複製的來自假單 胞菌(Pseudomonas)質粒pVSl (Itoh et al.， 1984)的複製起點(ORI pVSl)。 賦予對鏈黴素和大觀黴素抗性用於在大腸桿菌和根癌農桿菌中繁殖 和選擇的可選擇標記物基因(aadA) 由來自轉座子Tn903 (Oka et al.， 1981)的nptl基因的新黴素磷酸轉 移酶編碼序列的片段組成的DNA區。將T-DNA栽體引入包含輔助Ti-質粒的根癌農桿菌中。實施例5:分析含有XylT沉f植因的轉基因菸草屬植物。 使用實施例4中所述的根癌農桿菌菌林轉化菸草屬植物5.1.分析含有XylT沉默基因的轉基因菸草栽培種Petite Havana SRI植物使用實施例4.1中描述的根癌農桿菌菌抹根據如Zambryski et al. (1983)中所述的方案轉化菸草栽培種Petite Havana SRI植物。獲得了包含 如實施例4.1中所述的嵌合基因的52個轉基因菸草林系。使用DNA印跡分析在分子水平上分析轉基因植物林系。類似地，使 用RNA印跡分析對植物林系進行XylT RNA表達分析。可以將來自轉基因林系的蛋白質聚糖上存在的P-l，2-木糖殘基水平與 未轉化的植物相比較，可以獲得XylT活性的指示。可以通過以下方法測 量植物的與蛋白質結合的N-聚糖上|3-1，2-木糖殘基的水平例如通過如 Faye et al. (1993)所述的使用木糖特異抗體的蛋白質印跡分析，或通過對分離自植物糖蛋白的聚糖進行質鐠法，所述質鐠法使用例如Kolarich和 Altmann (2000)所述的基質輔助雷射解吸/離子化飛行時間質讒法 (MALDI-TOF-MS)或使用例如Henriksson et al. (2003)所述的液相層析串 聯質譜法(LC/MS/MS)。5.2.分析含有XylT沉默基因的轉基因本氏菸草植物類似地，使用實施例4.2中描述的根癌農桿菌菌林轉化本氏菸草植物， 並如上所述分析蛋白質的聚糖上存在的p-l，2-木糖殘基的水平。用pTKW29葉盤轉化後獲得包含實施例4.2中所述嵌合基因的54個 轉基因本氏菸草林系。為了確定存在於這些植物林系內源蛋白質的聚糖上的P-l，2-木糖殘基 水平，使用p-l，2-木糖特異抗體通過蛋白質印跡分析各個個體的可溶性葉 蛋白質。六個樣品顯示與抗體非常弱的反應，六個樣品不具有與抗體的可檢測 的反應。對於其它樣品而言，與抗體的反應水平在從弱到野生型水平的範 圍內變化。為了確定來自pTKW29的嵌合XylT沉默基因的插入數，從對卩-1，2-木糖特異抗體顯示非常弱或陰性反應的植物林系中分離了基因組DNA，將 其用EcoRI消化並通過DNA印跡分析，所述DNA印跡^f吏用跨越35S啟 動子區的探針和跨越bar膦絲菌素抗性基因編碼區的探針。12個植物林系均不顯示單個插入。 一個植物林系含有兩個插入，並且 使用蛋白質印跡分析對木糖是陰性的。為了測試這兩個嵌合XylT沉默基因是否被獨立地插入並獲得下述植 物，所述植物在蛋白質印跡上對木糖是陰性的並含有單個嵌合的XylT沉 默基因，播種下述後代並通過蛋白質印跡分析分析25個植物林系，所述後 代得自含有兩個插入的植物抹系的自花授粉。參考文獻Baulcombe (2004). Nature 431 : 356-363.Bernatzky and Tanksley (1986). Theor, Appl. Genet. 72: 314-321. Bolivar et al. (1977). Gene 2: 95-113.Cornelissen and Vandewiele (1989). Nucleic Acids Research 17: 19-25. De Block et al. (1984). EMBO J. 3(8):1681誦1689 De Block et al. (1987). EMBO J 6:2513.De Greve et al. (1982). J. Mol. Appl. Genetics 1 (6): 499-511. Faye et al. (1993). Analytical Biochemistry 209: 104-108. Fischer et al. (2004). Curr. Opin. Plant Biol. 7:152-158. Helliwell and Waterhouse (2003). Methods 30: 289-295. Henikoff and Henikoff (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915畫10919.Henriksson et al. (2003). Biochem. J. 375: 61-73.Horsch et al. (1985). Science 227: 1229-1231.Itoh et al. (1984). Plasmid 11: 206.Khoo et al. (1997). Glycobiology 7: 663-677.Kolarich and Altmann (2000). Anal. Biochem. 285: 64-75.Mulder et al. (1995). Eur. J. Biochem. 232: 272-283.Odell et al. (1985). Nature 313: 810.Oka et al. (1981). Journal of Molecular Biology, 147， 217-226. Rosche and Westhoff (1995). Plant Molecular Biology 29 (4): 663-678. Stoger et al. (2002). Curr. Opin. Biotechnol. 13: 161-166. Strasser et al. (2000). FEBS Lett. 472:105-108.Strasser et al. (2004a). 2nd EPSO Conference, October 2004， Italy, Abstract book p. 56, S036.Strasser et al. (2004b). FEBS Lett. 561:132-136. Tezuka et al. (1992). Eur J Biochem. 203(3):401-413. Twyman et al. (2003). 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權利要求
1、生產與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平β-1，2-木糖殘基的菸草屬植物細胞或植物的方法，所述方法包括步驟a)向菸草屬物種或栽培種的植物細胞中引入嵌合基因以產生轉基因植物細胞，所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段i)植物可表達的啟動子，ii)可轉錄的DNA區，其包含(1)第一有義DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連續核苷酸中的至少19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylTcDNA的核苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連續核苷酸中的至少19個包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸，(2)第二反義DNA區，其包含至少19個連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸與所述第一DNA區的互補序列具有至少95％的序列同一性，其中由所述可轉錄的DNA區轉錄得到的RNA分子能夠至少在由所述第一有義DNA區轉錄的RNA區和由所述第二反義DNA區轉錄的RNA區之間形成雙鏈的RNA區iii)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區；b)任選地鑑定轉基因的菸草屬植物細胞，所述轉基因菸草屬植物細胞與未轉化的菸草屬植物細胞相比在與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低的β-1，2-木糖殘基水平；c)任選地再生所述轉基因菸草屬植物細胞以獲得轉基因的菸草屬植物；和d)任選地鑑定轉基因菸草屬植物，所述轉基因菸草屬植物與未轉化的菸草屬植物相比在與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低的β-1，2-木糖殘基水平。
2、 權利要求1的方法，其中所述菸草屬物種特異的XylT胺基酸是本 氏菸草特異的XylT胺基酸，且所述菸草屬物種優選地是本氏菸草。
3、 權利要求1或2的方法，其中所述編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸 序列包含編碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列的核苷, 列。
4、 權利要求1到3中任一項的方法，其中所述菸草屬物種特異的XylT 核苷酸是本氏菸草特異的XylT核苷酸，且所述菸草屬物種優選地是本氏 菸草。
5、 權利要求1到4中任一項的方法，其中所述菸草屬XylT基因的所 述核苷^jf列包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
6、 權利要求l的方法，其中所述菸草屬栽培種特異的XylT胺基酸是 菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT胺基酸，且所述菸草屬栽培種 優選地是菸草栽培種Petite Havana SRl。
7、 權利要求1或6的方法，其中編碼所述菸草屬XylT蛋白的所述核 苷絲列包含編碼SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的胺基酸序列的核苷酸序列。
8、 權利要求l、 6或7中任一項的方法，其中所述菸草屬栽培種特異 的XylT核苷酸是菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT核普酸，且 所迷菸草屬栽培種優選地是菸草栽培種Petite Havana SRl。
9、 權利要求1或6到8中任一項的方法，其中所述菸草屬XylT基因 或所述菸草屬XylT cDNA的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17的核苷斷列。
10、 權利要求1到9中任一項的方法，其中所述第一和所述第二DNA 區包含至少50個連續核苷酸。
11、 權利要求1到9中任一項的方法，其中所述第一和所述第二 DNA 區包含至少200個連續核苷酸。
12、 生產與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平P-l，2-木糖殘基的菸草屬 植物細胞或植物的方法，所述方法包括步驟a) 對菸草屬物種或栽培種的植物細胞或植物提供一個或多個雙鏈 RNA分子，其中雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈， 一條RNA鏈基本由 20到21個連續核苷酸中19個的RNA核苦酸序列組成，所述連續核苷酸 選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列 優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20到21個連續核苷酸 中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸，或所述 連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其 互補序列，所迷核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中 所述20到21個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT核苷酸；b) 鑑定包舍所述雙鏈RNA分子的菸草屬植物細胞或植物，所述菸草 屬植物細胞或植物與不包含所述雙鏈RNA分子的相同菸草屬植物細胞或 植物相比在與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低的p-l,2-木糖殘基水平。
13、 權利要求12的方法，其中通過將嵌合基因整合進所述菸草屬物種 或栽培種的植物細胞基因組中以產生轉基因植物細胞，向所述植物細胞或 植物提供所述雙鏈RNA,並任選地再生所述植物細胞以獲得轉基因植物， 所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段a) 植物可表達的啟動子；b) 反義方向的DNA區，其包含20個連續核普酸中至少19個，所述 連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，所述 核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所迷20個連續核 苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸，或 所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列 或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種特異的XylT 核苦酸；c)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
14、 權利要求12的方法，其中通過將嵌合基因整合進所述植物細胞基 因組中以產生轉基因植物細胞，向所述植物細胞或植物提供所述雙鏈 RNA，並任選地再生所述植物細胞以獲得轉基因植物，所述嵌合基因包含 以下有效連接的DNA片段a) 植物可表達的啟動子；b) 有義方向的DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個，所述 連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，所述 核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連續核 苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XyiT胺基酸，或 所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列 或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種， 其中所述20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種特異的XylT 核苷酸；c) 包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
15、 權利要求12的方法，其中通過將嵌合基因整合進所述植物細胞基 因組中以產生轉基因植物細胞，向所述植物細胞或植物提供所迷雙鏈 RNA，並任選地再生所述植物細胞以獲得轉基因植物，所述嵌合基因包含 以下有效連接的DNA片段a) 植物可表達的啟動子，b) 可轉錄的DNA區，其包含i)反義方向的第一 DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個， 所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列， 所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連 續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨基 酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核普酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種特異 的XylT核苷酸；ii)有義方向的第二DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個， 所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列， 所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽培種，其中所述20個連 續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨基 酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷 酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列優選地可得自所述菸草屬物種或栽 培種，其中所述20個連續核苷酸中的19個包含至少一個菸草屬物種特異 的XylT核苷酸，其中由所述可轉錄的DNA區轉錄得到的RNA分子能夠至少在對應於 所述第一 DNA區的RNA區和對應於所述第二 DNA區的RNA區之間形 成雙鏈的RNA區；和c)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
16、 權利要求12到15中任一項的方法，其中所述菸草屬物種特異的 XylT胺基酸是本氏菸草特異的XylT胺基酸，且所述菸草屬物種優選地是 本氏菸草。
17、 權利要求12到16中任一項的方法，其中所述編碼菸草屬XylT 蛋白的核苷絲列包含編碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗 列的核苷酸序列。
18、 權利要求12到17中任一項的方法，其中所述菸草屬物種特異的 XylT核苷酸是本氏菸草特異的XylT核苷酸，且所述菸草屬物種優選地是 本氏菸草。
19、 權利要求12到18中任一項的方法，其中所述菸草屬XylT基因 的所述核苷絲列包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
20、 權利要求12到15中任一項的方法，其中所述菸草屬栽培種特異的XylT胺基酸是菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT胺基酸，且 所述菸草屬栽培種優選地是菸草栽培種Petite Havana SRl。
21、 權利要求12到15或20中任一項的方法，其中編碼所述菸草屬 XylT蛋白的所述核苷酸序列包含編碼SEQ ID No" 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:lO的胺基酸序列的核苷酸序列。
22、 權利要求12到15、 20或21中任一項的方法，其中所述菸草屬栽 培種特異的XylT核苷酸是菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT核 苷酸，且所述菸草屬栽培種優選地是菸草栽培種Petite Havana SRl。
23、 權利要求12到15、或20到22中任一項的方法，其中所述菸草 屬XylT基因或所述菸草屬XylT cDNA的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17 的核苷^列。
24、 生產與蛋白質結合的N-聚糖上有低水平P-l，2-木糖殘基的菸草屬 植物細胞或植物的方法，所述方法包括步驟a)使用選自下組的工具鑑定可得自第一個菸草屬物種或栽培種的 XylT蛋白編碼DNA序列的片段i) 用作探針的DNA片段，其包含編碼SEQIDNo.:4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列的核苷酸序列；ii) 用作探針的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11 、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一個的核苷酸序列；iii) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ IDNo.:6的胺基酸序列的核苷酸序列；iv) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.: 14的胺基酸序列的核苷酸序列；v) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一個的核苷酸序列；vi) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苦酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的胺基酸序列的核苷酸序列；vii) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基醋列的核苷財歹'J;viii) 用作PCR反應中引物的寡核苷^列，其包含20到200個連續 核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一個的核苷酸序列；或ix) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.: 1 、 SEQ ID No.: 2、SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20 之任一個的核苷酸序列；b) 對所述第一或第二菸草屬物種或栽培種的植物細胞或植物提供一 個或多個雙鏈RNA分子，其中所述雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈，一 條RNA鏈基本由20到21個連續核苷酸的RNA核苷酸序列組成，所述連 續核苷酸選自編碼所述XylT蛋白的DNA片段的核苷酸序列或其互補序 列，其中所述20到21個連續核苷酸分別編碼至少一個菸草屬物種或栽培 種特異的XylT胺基酸，或其中所述20到21個連續核苷酸分別包含至少 一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸；和c) 鑑定包含所述雙鏈RNA分子的菸草屬植物細胞或植物，所述菸草 屬植物細胞或植物與不包含所述雙鏈RNA分子的相同菸草屬植物細胞或 植物相比，在與蛋白質結合的N-聚糖上具有更低的p-l,2-木糖殘基水平。
25、權利要求24的方法，其中通過對所述植物細胞或植物提供雙鏈RNA分子實現所述雙鏈RNA分子的提供，所述雙鏈RNA分子包含20 個連續核苷酸中至少19個的第一核苷,列，所述連續核苷酸選自編碼所 述XylT蛋白的DNA片段的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連 續核苷酸中至少19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT氨基 酸，或其中所述20個連續核苷酸中至少19個包含至少一個菸草屬物種或 栽培種特異的XylT核苷酸；和第二核苷酸序列，其為所述第一核苷^ 列的互補序列。
26、權利要求24的方法，其中通過將嵌合DNA整合進所述植物細胞 的基因組中產生轉基因植物細胞，對所述植物細胞或植物提供雙鏈RNA 分子，並任選地再生所述植物細胞以獲得轉基因植物，所述嵌合DNA包 含以下有效連接的DNA片段a) 才直物可表達的啟動子，b) 可轉錄的DNA區，其包含i) 第一有義DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個的核苷酸 序列，所述連續核苷酸選自編碼所述XyIT蛋白的DNA片段的核苷酸序列 或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的至少19個分別編碼至少一 個菸草屬物種或栽培種特異的XylT胺基酸，或其中所述20個連續核苷酸 中的至少19個分別包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷 酸，ii) 第二反義DNA區，其包含至少19個連續核苷酸的核苷酸序列，所 述連續核苷酸與所述第一 DNA區的互補序列具有至少95 %的序列同 一性，其中由所述可轉錄的區轉錄得到的RNA分子能夠至少在由所述第一 有義DNA區轉錄的RNA區和由所述第二反義DNA區轉錄的RNA區之 間形成雙鏈的RNA區；和c) 包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
27.根據權利要求1到26中任一項的方法，所述方法還包括下述步驟將與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖殘基的所述菸草屬植物 與另一菸草屬植物雜交，獲得與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草屬後代植物。
28、鑑定菸草屬XylTDNA片段的方法，其包括步驟a) 提供可得自菸草屬物種或栽培種的基因組DNA或cDNA;b) 從下組中選擇工具i) 用作探針的DNA片段，其包含編碼SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列的核苷,列；ii) 用作探針的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一個的核苷酸序列；iii) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的胺基酸序列的核苷酸序列；iv) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷斷列；v) 用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574個連續核 苷酸組成的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11 、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一個的核苷酸序列；vi) 用作PCR反應中引物的寡核苷*列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自編碼SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基*列的核苷#列；vii) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200個 連續核苷酸的核苷酸序列，所述連續核普酸選自編碼SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列的核苷紗列；viii) 用作PCR反應中引物的寡核苷酸序列，其包含20到200個連續 核苷酸的核苷酸序列，所述連續核苷酸選自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一個的核苷酸序列；或ix)用作PCR反應中引物的寡核苷酸，其具有SEQIDNo.: 1、 SEQ ID No.: 2、SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20之任一個的核普酸序列；c)通過使用所述基因組DNA或所述cDNA和所述引物進行PCR、或 通過使用所述基因組DNA或所述cDNA和所述探針進行雜交，鑑定來自 所述菸草屬物種或栽培種的XylTDNA片段。
29、 分離菸草屬XylT DNA片段的方法，其包括步驟a) 才艮據權利要求28的方法鑑定所述菸草屬XylT DNA片段；和b) 分離所述菸草屬XylT DNA片段。
30、 鑑定與蛋白質結合的N-聚糖上低水平p-l，2-木糖殘基相關的菸草 屬XylT等位基因的方法，其包括步驟(a) 提供菸草屬物種或栽培種不同植物林系的種群，任選經誘變的種群；(b) 根據權利要求28的方法在所述種群的各植物林系中鑑定菸草屬 XylT等位基因；(c) 分析所述種群各植物林系的與蛋白質結合的N-聚糖上p-l，2-木糖 殘基的水平，並鑑定與其它植物林系相比與蛋白質結合的N-聚糖上具有更 低的卩-l，2-木糖殘基水平的那些植物林系；(d) 將植物林系中與蛋白質結合的N-聚糖上p-l，2-木糖殘基的低水平 與特異菸草屬XylT等位基因的存在相關聯。
31、 獲得與蛋白質結合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖殘基的菸草 屬植物細胞或植物的方法，所述方法包括步驟a) 根據權利要求30的方法鑑定與蛋白質結合的N-聚糖上低水平 |3-1,2-木糖殘1^目關的菸草屬XylT等位基因；b) 將所述菸草屬XylT等位基因引入選擇的菸草屬植物林系中。
32、 編碼下述蛋白質的經分離的DNA片段，所述蛋白質包含SEQIDNo.: 12或SEQ ID No.:14的胺基酸序列或其任一部分，所述胺基酸序列或 其任一部分編碼至少一個本氏菸草特異的XylT胺基酸。
33、 權利要求32的經分離的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列 或其任一部分包含至少一個本氏菸草特異的XylT核苷酸。
34、 編碼下述蛋白質的經分離的DNA片段，所述蛋白質包含SEQID No.:4或SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10的胺基酸序列或 其任一部分，所述胺基酸序列或其任一部分編碼至少一個菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT胺基酸。
35、 權利要求34的經分離的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3或SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9或SEQ ID No.: 17的核苷^f列 或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一個菸草栽培種 Petite Havana SRI特異的XylT核苷酸。
36、 通過權利要求28的方法可以獲得的經分離的DNA片段，其編碼 至少一個菸草屬物種或菸草屬栽培種特異的XylT胺基酸。
37、 權利要求36的經分離的DNA片段，其包含至少一個菸草屬物種 或菸草屬栽培種特異的XylT核苷酸。
38、 包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a) 才直物可表達的啟動子；b) 可轉錄的DNA區，其包含i) 反義方向的第一DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個， 所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列， 其中所述20個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT胺基酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的19個 包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸；ii) 有義方向的第二DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個， 所述連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT胺基酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的19個 包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸，其中由所述可轉錄的DNA區轉錄得到的RNA分子能夠至少在對應於 所述第一 DNA區的RNA區和對應於所述第二 RNA區的RNA區之間通 過鹼基配對形成雙鏈的RNA區；和c)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
39、 包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a) 植物可表達的啟動子；b) 有義方向的DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個，所述 連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，其中 所述20個連續核苦酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的 XylT胺基酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的19個 包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸；和c) 包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
40、 包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a) 植物可表達的啟動子；b) 反義方向的DNA區，其包含20個連續核苷酸中至少19個，所述 連續核苷酸選自編碼菸草屬XylT蛋白的核苷酸序列或其互補序列，其中 所述20個連續核苷酸中的19個編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特異的 XylT胺基酸，或所述連續核苷酸選自菸草屬XylT基因或菸草屬XylT cDNA的核苷酸序列或其互補序列，其中所述20個連續核苷酸中的19個 包含至少一個菸草屬物種特異的XylT核苷酸；和c)包含在植物中有功能的轉錄終止和多聚腺苷酸化信號的DNA區。
41、 根據權利要求38到40中任一項的嵌合基因，其中所述菸草屬物 種特異的XylT胺基酸是本氏菸草特異的XylT胺基酸。
42、 根據權利要求38到41中任一項的嵌合基因，其中所述編碼菸草 屬XylT蛋白質的核苷酸序列包含編碼SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14 的胺基酸序列的核苷酸序列。
43、 根據權利要求38到42中任一項的嵌合基因，其中所述菸草屬物 種特異的XylT核苷酸是本氏菸草特異的XylT核苷酸。
44、 根據權利要求38到43中任一項的嵌合基因，其中所述菸草屬XylT 基因的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 11、SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
45、 根據權利要求38到40中任一項的嵌合基因，其中所述菸草屬栽 培種特異的XylT胺基酸是菸草栽培種Petite Havana SRI特異的XylT氨 基酸。
46、 根據權利要求38到40或45中任一項的嵌合基因，其中編碼所述 菸草屬XylT蛋白的所述核苷酸序列包含編碼SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的胺基酸序列的核苷紗列。
47、 根據權利要求38到40、 45或46中任一項的嵌合基因，其中所述 菸草屬栽培種特異的XylT核苷酸是菸草栽培種Petite Havana SRI特異的 XylT核苷酸。
48、 根據權利要求38到40、或45到47中任一項的嵌合基因，其中 所述菸草屬XylT基因或所述菸草屬XylT cDNA的所述核苷酸序列包含 SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.: 10或SEQ ID No.: 17的核苷酸序列。
49、 包含權利要求38到48中任一項的嵌合基因的菸草屬植物細胞。
50、 基本上由權利要求49的菸草屬植物細胞組成的菸草屬植物。
51、 通過權利要求31的方法獲得的菸草屬植物細胞或植物。
52、 根據權利要求50或權利要求51的菸草屬植物的種子。
53、 編碼下述蛋白質的核苷M列在菸草屬植物中降低與蛋白質結合 的N-聚糖上p-l，2-木糖殘基水平的用途，所述蛋白質包含SEQIDNo" 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ IDNo.:14的胺基酸序列或其任一部分，所述胺基酸序列或其任一部分包含20 個連續核苷酸中至少19個，所述連續核苷酸編碼至少一個菸草屬物種或栽 培種特異的XylT胺基酸。
54、 核苷酸序列在菸草屬植物中降低與蛋白質結合的N-聚糖上p-l，2-木糖殘基水平的用途，所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或 其任一部分包含20個連續核苷酸中的至少19個，所述連續核苷酸包含至 少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。
55、 編碼下述蛋白質的核苦酸序列在菸草屬物種或栽培種中鑑定XylT 基因或XylT cDNA的用途，所述蛋白質包含SEQ ID No.: 4、SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列或其任一部分，所述胺基酸序列或其任一部分編碼至少一個菸草屬 物種或栽培種特異的XylT胺基酸。
56、 下述核苷酸序列在菸草屬物種或栽培種中鑑定XylT基因或XylT cDNA的用途，所述核苷紗列包含SEQIDNo.:3、 SEQIDNo.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQIDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核普酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任 一部分包含至少一個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。
57、 編碼下述蛋白質的核苷酸序列在菸草屬物種或栽培種中鑑定與蛋 白質結合的N-聚糖上低水平p-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的等位基因 的用途，所述蛋白質包含SEQIDNo.: 4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基斷列或其任一 部分，所述胺基酸序列或其任一部分編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT胺基酸。
58、 下述核苷酸序列在菸草屬物種或栽培種中鑑定與蛋白質結合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的等位基因的用途，所述核 苷餅列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ IDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.:21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一 個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。
59、 編碼下述蛋白質的核苷酸序列在菸草屬物種或栽培種中引入與蛋 白質結合的N-聚糖上低水平(5-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的等位基因 的用途，所述蛋白質包含SEQIDNo.: 4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列或其任一 部分，所述胺基酸序列或其任一部分編碼至少一個菸草屬物種或栽培種特 異的XylT胺基酸。
60、 下述核苷酸序列在菸草屬物種或栽培種中引入與蛋白質結合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖殘基相關的XylT基因的等位基因的用途，所述核 苷,列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一 個菸草屬物種或栽培種特異的XylT核苷酸。
全文摘要
本發明提供了新的β-1，2-木糖基轉移酶核苷酸序列及其用途。
文檔編號C12N15/82GK101405395SQ200780009958
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月15日 優先權日2006年3月23日
發明者K·韋特林斯 申請人:拜爾生物科學公司