一種納米超薄生物膜差異修飾前後表面的人工角膜及製作方法
2023-10-23 22:42:22 2
一種納米超薄生物膜差異修飾前後表面的人工角膜及製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種納米超薄生物膜差異修飾前後表面的人工角膜及製作方法。目的是提供的人工角膜具有減少人工角膜術後併發症，所提供的製備方法應簡單易行無汙染。技術方案是：一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，光學部的前表面依次反覆沉積有聚陽離子層及表皮生長因子層；光學部的後表面由內而外依次反覆沉積有聚陽離子層以及HA層，最外層為HA層。一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，依次包括以下步驟：1)使人工角膜表面荷以負電荷；2)使得聚陽離子和表皮生長因子交替吸附在人工角膜前表面；3)使得聚陽離子和HA交替吸附在人工角膜後表面；4)乾燥、密封包裝即可。
【專利說明】一種納米超薄生物膜差異修飾前後表面的人工角膜及製作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫療領域，尤其是人工角膜及其製作方法。
【背景技術】
[0002]角膜病是世界上僅次於白內障的第二位致盲眼病。全世界4500萬盲人中，有800萬為角膜病致盲，且平均每年新增150-200萬例因角膜潰瘍和外傷致盲的患者。角膜移植是目前嚴重角膜病的主要治療手段，雖然我國的角膜病致盲患者超過100萬，但每年角膜移植術不足5000例，角膜供體的缺乏一直是並越來越成為角膜移植的重要制約因素；某些嚴重角膜疾病如化學燒傷、幹細胞缺陷、眼症痕性類天皰瘡、31:6^6118-了011118011綜合症等，角膜移植無法成功。因此角膜替代物的研究顯得尤為重要，對於無法進行角膜移植的嚴重角膜疾病患者，人工角膜成為其唯一的治療選擇和復明希望。人工角膜具有化學穩定性與光學性能優良、疾病傳播與術後變形風險低等優點，但迄今已報導的人工角膜生物相容性欠佳，術後併發症風險較高，難以維持術後長期復明效果。同時，近年來的人工角膜大多由光學鏡柱和光學支架組成，設計及製備方法複雜，手術切口大，植入方式繁瑣，這些限制了其臨床應用。
[0003]^1(1^6等統計表明後表面人工角膜後膜(1--) (44% )和前表面永久性上皮缺損(38%)為最常見的術後併發症，直接影響術後遠期視力恢復，而上皮缺損會大大增加感染、人工角膜脫落、角膜溶解等的機率。因此研製具有良好生物相容性的人工角膜，減少術後併發症，對於維持清晰視覺、提高患者術後遠期視力和生存質量具有極其重要的意義。近十多年來通過材料表面改性方法改善人工角膜生物相容性的探索引起了高度重視。其中尤為關注促進前表面的上皮化，原因在於前表面直接接觸外界環境，理想的上皮化能成為角膜的第一道屏障，維持眼表溼潤、阻止微生物入侵及上皮細胞向下長入角膜層間，進而減少感染、角膜溶解壞死、人工角膜脫落的發生。與前表面需要支持上皮化不同的是，人工角膜後表面由於離前房較近，來自前房的炎症反應會引起後表面出現細胞粘附和纖維蛋白沉積，形成影響視軸透明度的，直接引起術後視力下降，因此抑制形成對於提高術後遠期視力至關重要。
[0004]目前已經通過美國八批准進入臨床應用的商業化人工角膜包括硬性？1嫩材料的8081:011人工角膜和軟性邱2嫩材料的八人工角膜。？1嫩和邱2嫩均存在與本體性能相關的不可逆缺點，前者為硬性疏水性材料，植入後無法測量眼壓，易被制:1『雷射損傷，生物相容性差，後者則對眼表要求較高，機械強度較差，容易出現光學部鈣化及沉著等導致人工角膜混濁發生率較高。兩者設計均相對複雜，800011人工角膜為「鏡柱-支架」型結構，由三部分組成，結合部強度較差，容易房水滲漏等汸由透明的光學部和不透明的周邊部組成，雖然兩部分均為？冊嫩成分，但無法一體成型。同樣兩者均存在如前所述的因前表面無法支持角膜上皮細胞生長，後表面人工角膜後膜形成而導致術後遠期效果不佳，併發症風險高的問題。另外，兩者均存在角膜切口大(8000=手術切口約25皿，^1^8001-約為16111111)，手術時間長(大於1小時)的問題，而8081:011的植入仍需要供體角膜的支持，需要兩次手術才能完成人工角膜的植入。
[0005]中國發明專利201110218237.3 「一種人工角膜」，通過共價結合或靜電吸附方法在光學區內外表面設有氟-肝素表面修飾層，有利於防止病理性細胞和組織吸附；但該專利未考慮到人工角膜前後表面所處環境的差異及其對生物相容性需求的差異，前後表面均用抑制粘附的氟-肝素修飾，仍然存在前表面上皮化困難的問題。中國發明專利02116963.2 「聚乙烯醇工具體水凝膠軟性人工角膜的製備方法」，也提出通過載能離子束聯合低溫等離子體表面塗覆技術在人工角膜主體的非周邊部內側面塗敷上低分子肝素；但該專利只提出在內表面塗覆低分子肝素，未考慮到前表面上皮化的需要。而前表面上皮缺損恰恰是感染、人工角膜脫落、角膜溶解等嚴重併發症的根本原因。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種人工角膜及其製備方法的改進，所提供的人工角膜具有減少人工角膜術後併發症，可維持術後視力的特點，所提供的製備方法應簡單易行無汙染。
[0007]本發明提供的技術方案是:一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，為光學部和圍繞在光學部四邊的周邊部組成的透明膜片，其特徵在於:光學部的前表面由內而外依次反覆沉積有聚陽離子層以及表皮生長因子層，最外層為表皮生長因子層；光學部的後表面由內而外依次反覆沉積有聚陽離子層以及撤層，最外層為撤層。
[0008]所述光學部的前表面的聚陽離子層厚度約為4-20=%表皮生長因子層厚度約為5—50歷。
[0009]所述光學部的後表面的聚陽離子層厚度約為4-2011111，撤層厚度約為3-1511111。
[0010]所述周邊部上設置有若干個用於固定人工角膜用的固定孔。
[0011]一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，依次包括以下步驟:
[0012]1)將製作成型的人工角膜分別用丙酮、去離子水清洗後，接著用超聲清洗儀清洗5-10分鐘，在10-40攝氏度溫度下乾燥後將其放入低溫等離子體發生器進行處理，使人工角膜表面荷以負電荷；
[0013]2)將上述表面帶負電荷的人工角膜的前表面浸入帶正電荷的濃度為1-101^/此的聚陽離子水溶液中，吸附60-120分鐘然後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；再將該人工角膜的前表面浸入帶負電荷的濃度為10-100118/此的表皮生長因子的磷酸鹽緩衝溶液中，吸附60-120分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液漂洗，氮氣吹乾；
[0014]重複前述步驟6-10次，使得聚陽離子和表皮生長因子交替吸附在人工角膜前表面，並保證最外層為表皮生長因子層；
[0015]3)將上述人工角膜的後表面浸入帶正電荷的濃度為的聚陽離子水溶液中，吸附60-120分鐘後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；接著將該人工角膜的後表面浸入濃度為1-101^/此的透明質酸鈉的磷酸鹽緩衝溶液中吸附60-120分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液漂洗並氮氣吹乾；
[0016]重複前述步驟6-10次，使得聚陽離子和撤交替吸附在人工角膜後表面，並保證最外層為撤層；
[0017]4)將經過前後表面差異改性的人工角膜，在10-40攝氏度溫度下乾燥、密封包裝即可；
[0018]所述聚陽離子為殼聚糖或聚賴氨酸$1)；
[0019]所述步驟2)、步驟3)同時進行或者分開單獨進行。
[0020]所述步驟1)中等離子體發生器處理時的參數為:發生器功率20-601，氣體壓力40-50%，等離子體光輝放電108-10111111。
[0021]所述的乾燥是真空乾燥，真空壓力為200-500？3。
[0022]所述人工角膜採用矽凝膠或聚丙烯酸酯製成。
[0023]本發明的有益效果是:人工角膜前表面構建帶有重組人表皮生長因子(證即；1126？具有廣泛的生物學效應，能極強地促進各種表皮組織生長)的生物膜後，能夠促進並維持人工角膜表面角膜上皮細胞的生長，從而在人工角膜前表面形成上皮細胞層；顯著減小了接觸角(接觸角越小，表示潤溼性越好，液體容易潤溼人工角膜)；同時，在人工角膜後表面構建帶有強親水性的透明質酸鈉(撤)後，可抑制炎症細胞和蛋白粘附，有效地抑制了人工角膜後膜的形成。
[0024]採用靜電層層自組裝方法在人工角膜的前後表面進行差異改性，簡單易行無汙染，具有足夠的生物穩定性，製備條件溫和，並且組裝過程所採用的均為天然聚電解質或者生物分子，無細胞毒性無免疫原性；因而製成的人工角膜對眼內其他組織無毒副作用，擁有良好的生物相容性。該方法製造出的人工角膜手術創口小，手術時間短，生物相容性良好，可達到預防和減少併發症、提高人工角膜移植的成功率、使眾多角膜病患者重見光明的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是人工角膜的主視結構示意圖。
[0026]圖2是人工角膜的俯視結構示意圖。
[0027]圖3是人工角膜前表面各沉積層的表面接觸角檢測效果示意圖。
[0028]圖4為人工角膜前後表面角膜上皮細胞生長的掃描電鏡圖。
[0029]圖5是前後表面差異改性方法之一不意圖。
【具體實施方式】
[0030]本發明提供的人工角膜為軟性矽凝膠或聚丙烯酸酯製成，這種材料可摺疊，本體性能優良，具有良好的透氧性、透光率、生物學穩定性和力學性能，並能通過改性提高營養物質傳輸及改善疏水性。人工角膜由光學部1和周邊部2組成，為一膜片結構，可一次衝壓成型，光學部和周邊部均透明，光學部厚度略高於周邊部。周邊部設有10-20個固定孔3，用於術中縫線固定人工角膜。由於材料為軟性可摺疊材料，人工角膜可摺疊在特定的推注器中，通過3-4.的角膜切口推注入患者角膜，自動展開後縫線固定即可，大大縮短手術時間(半小時以內)，植入過程一次完成，無需依賴供體角膜，無需二次手術。以上結構與現有人工角膜相同。
[0031]本發明為了同時克服上皮化困難和人工角膜後膜形成的問題，在人工角膜的前表面4設計構建了帶有重組人表皮生長因子(證即)的生物膜；證即具有廣泛的生物學效應，能極強地促進各種表皮組織生長，在醫學上己用於角膜損傷、燒燙傷、潰瘍、各類創傷等的治療；所以利用來促進並維持人工角膜表面角膜上皮細胞的生長，從而在人工角膜表面形成上皮細胞層。同時，在人工角膜的後表面5構建帶有強親水性的透明質酸鈉(撤)來抑制人工角膜後膜的形成；撤是廣泛存在於動物和人體的生理活性物質，其超強的親水性使其具有極強的抗粘附能力，且作為人體本身人體內分布最廣的一種酸性黏糖無致炎性及免疫原性。
[0032]利用靜電層層自組裝技術來同時構建前後表面不同的納米超薄生物膜的具體過程如下:
[0033]1)將製作成型的人工角膜分別用丙酮、去離子水清洗後，再用超聲清洗儀清洗5-10分鐘，然後在10-40攝氏度溫度下乾燥；接著將其放入等離子體發生器中處理，處理參數:發生器功率20-601，氣體壓力40-50%，等離子體光輝放電(推薦參數:發生器功率為401，射頻為13紐2，氣體壓力維持在40-50%，等離子體光輝放電3分鐘)，然後取出人工角膜，使該人工角膜的表面帶負電荷；
[0034]2)將上述表面帶負電荷的人工角膜前表面浸入帶正電荷的濃度為1-101^/此的聚陽離子(殼聚糖或？的水溶液中，吸附60-120分鐘然後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；再將該人工角膜前表面浸入與此前聚電解質所帶電荷相反的濃度為10-100118/11^的表皮生長因子的磷酸鹽緩衝溶液(磷酸鹽緩衝溶液由與磷酸鹽緩衝液即？83組成，邱=7.4)中，吸附60-120分鐘，然後用？83溶液漂洗，氮氣吹乾；
[0035]重複以上步驟6-10次，使得聚陽離子和交替吸附在人工角膜前表面，並保證最外層為￡07層；
[0036]3)將上述人工角膜的後表面浸入帶正電荷的濃度為卜川呢/此的聚陽離子(殼聚糖或？1)的水溶液中，吸附60-120分鐘然後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；再將該人工角膜浸入濃度為卜川呢/此的透明質酸鈉的磷酸鹽緩衝溶液中(磷酸鹽緩衝溶液由透明質酸鈉與磷酸鹽緩衝液組成)，吸附60-120分鐘，然後用？83溶液漂洗，並氮氣吹乾；
[0037]重複以上步驟6-10次，使得聚陽離子和撤交替吸附在人工角膜前表面，並保證最外層為撤層；
[0038]4)如上製得前後表面差異改性的人工角膜，然後在10-40攝氏度溫度下乾燥、密封包裝即可。
[0039]以上所述乾燥為真空乾燥，真空壓力推薦為200-500？3。
[0040]經過前述前後表面差異改性的人工角膜，其光學部的前表面4由內而外依次反覆沉積了聚陽離子層以及表皮生長因子層，其中的聚陽離子層厚度約為4-20=%表皮生長因子層厚度約為5-50=1其光學部的後表面5由內而外依次反覆沉積了聚陽離子層以及撤層，其中的聚陽離子層厚度約為4-2011111，撤層厚度約為3-1511111。
[0041]以上所述的磷酸鹽緩衝液，可自制或者直接外購獲得；自製時推薦採用以下方法:1(01 0.20。狃2？040^ 2。^01 8.00。化腦4.7！！20 1.568 ；攪拌均勻，雙蒸水定容 1000^1,調至邱=7.4，高壓滅菌，41保存。
[0042]以上處理過程中，步驟2)和步驟3)可分開進行或同時進行。
[0043]步驟2)和步驟3)分開進行，一般無需增加製備工具，只需在前表面或後表面製備過程中，注意不要讓處理溶液影響到另一面即可。
[0044]步驟2)和步驟3)同時進行，則需要專用工具6；圖5中顯示了其中的一種工具。由圖可知，該工具包括兩個彎管，彎管的一端管口貼緊在人工角膜的周邊部，保證製備過程中製備溶液能夠接觸前後表面但不洩露；另一端管口 6-1用於注入和傾倒製備溶液(繞水平軸線轉動180度使管口 6-1朝下即可將製備溶液倒出，以便更換成另一種製備溶液)。兩個彎管左右對夾著人工角膜後，就可同時進行處理了。
[0045]靜電層層自組裝技術是近年來倍受關注的表面改性前沿技術，它可在室溫下利用帶相反電荷的聚電解質的交替吸附來構建穩定的超薄多層膜，在納米級別上實現對生物材料表面特異性生物活性作用的精確控制；它不影響組裝成分的天然構象，甚至能在幹態下保持其活性；其製備方法溫和，交替浸塗工藝簡單，容易通過調節組裝條件控制膜的微納結構及性質；適用基體材料種類多，可實現工業化生產；已被用於多種醫用材料的表面改性。因此靜電層層自組裝技術是進行人工角膜表面改性設想的理想技術。
[0046]靜電層層自組裝技術簡單易行無汙染，足夠的生物穩定性，製備條件溫和，並且組裝過程所採用的均為天然聚電解質或者生物分子，無細胞毒性無免疫原性，所以本發明提供的人工角膜對眼內其他組織無毒副作用，擁有良好的生物相容性。而且該人工角膜手術創口小，手術時間短，生物相容性良好，可達到預防和減少併發症、提高人工角膜移植的成功率、使眾多角膜病患者重見光明的目的。
[0047]為檢驗靜電層層自組裝效果，本發明對人工角膜前表面的納米超薄生物膜進行了檢測，獲得的數據(如圖3所示)表明:人工角膜表面接觸角未改性前約為120度，前表面在自組裝過程中隨著殼聚糖和的逐層交替沉積後，其接觸角明顯下降，並呈現交替鋸齒狀變化，證實了 26？在人工角膜前表面的成功組裝。
[0048]圖4提示了人工角膜前後表面的細胞生長情況；其中的左圖八中，人工角膜前表面組裝了後，角膜上皮細胞生長增殖成片；右圖8中，人工角膜後表面組裝了撤後，細胞粘附增殖極少，無法連接成片；證明組裝成功的和撤能夠發揮預期的生物學效應。
【權利要求】
1.一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，為光學部(I)和圍繞在光學部四邊的周邊部(2)組成的透明膜片，其特徵在於:光學部的前表面(4)由內而外依次反覆沉積有聚陽離子層以及表皮生長因子層，最外層為表皮生長因子層；光學部的後表面(5)由內而外依次反覆沉積有聚陽離子層以及透明質酸鈉層，最外層為HA層。
2.根據權利要求1所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，其特徵在於:所述光學部的前表面的聚陽離子層厚度為4-20nm，表皮生長因子層厚度為 5_50nmo
3.根據權利要求2所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，其特徵在於:所述光學部的後表面的聚陽離子層厚度為4-20nm，HA層厚度為3_15nm。
4.根據權利要求2或3所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜，其特徵在於:所述周邊部上設置有若干個用於固定人工角膜用的固定孔(3)。
5.一種納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，依次包括以下步驟: 1)將製作成型的人工角膜分別用丙酮、去離子水清洗後，接著用超聲清洗儀清洗5-10分鐘，在10-40攝氏度溫度下乾燥後將其放入等離子體發生器進行處理，使人工角膜表面荷以負電荷； 2)將上述表面帶負電荷的人工角膜的前表面浸入帶正電荷的濃度為1-lOmg/mL的聚陽離子水溶液中，吸附60-120分鐘然後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；再將該人工角膜的前表面浸入帶負電荷的濃度為10-100Ug/mL的表皮生長因子的磷酸鹽緩衝溶液中，吸附60-120分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液漂洗，氮氣吹乾； 重複前述步驟6-10次，使得聚陽離子和表皮生長因子交替吸附在人工角膜前表面，並保證最外層為表皮生長因子層； 3)將上述人工角膜的後表面浸入帶正電荷的濃度為1-lOmg/mL的聚陽離子水溶液中，吸附60-120分鐘後用去離子水漂洗並氮氣吹乾；接著將該人工角膜的後表面浸入濃度為Ι-lOmg/mL的透明質酸鈉的磷酸鹽緩衝溶液中吸附60-120分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液漂洗並氮氣吹乾； 重複前述步驟6-10次，使得聚陽離子和HA交替吸附在人工角膜後表面，並保證最外層為HA層； 4)將經過前後表面差異改性的人工角膜，在10-40攝氏度溫度下乾燥、密封包裝即可； 所述聚陽離子為殼聚糖或聚賴氨酸； 所述步驟2)、步驟3)同時進行或者分開單獨進行。
6.根據權利要求5所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，其特徵在於:所述步驟I)中等離子體發生器處理時的參數為:發生器功率20-60W,氣體壓力40_50pa,等離子體光輝放電10s-10min。
7.根據權利要求6所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，其特徵在於:所述的乾燥是真空乾燥，真空壓力為200-500Pa。
8.根據權利要求7所述的納米超薄生物膜修飾的前後表面差異改性的可摺疊人工角膜的製備方法，其特徵在於:所述人工角膜採用矽凝膠或聚丙烯酸酯製成。
【文檔編號】A61L27/34GK104436302SQ201410717732
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】王瑤, 沈萍, 姚克 申請人:浙江大學