一種具有高分子量芳香烴類化合物降解功能的嗜脂環物菌T452及其應用
2024-04-14 03:28:05 1
一種具有高分子量芳香烴類化合物降解功能的嗜脂環物菌t452及其應用
技術領域：
1.本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種在好氧或厭氧條件下具有高分子量芳香烴類化合物降解功能的嗜脂環物菌t452及其應用。
背景技術：
2.芳香烴類化合物(aromatic hydrocarbons)在環境介質中普遍存在，其中許多種類都屬於持久性有機汙染物，如多環芳烴、滷代芳烴和雜環芳烴等。這些有機汙染物多數具有生物毒性，一些甚至具有致畸、致癌和致突變的效應，對人類健康和生態環境具有極大的危害。微生物降解作用是芳香烴類化合物汙染修復的重要途徑，降解功能菌種的獲得及其降解機制的闡明是汙染治理和生態修復等領域的迫切需求。
3.目前已經在環境中發現了許多具有芳香烴類化合物降解能力的微生物，這些微生物能利用氧氣或者在厭氧條件下利用硝酸鹽、硫酸鹽和三價鐵等為電子受體，驅動芳香烴類化合物的降解轉化。但是，由於多數芳香烴類化合物，尤其是多環芳烴、滷代芳烴和雜環芳烴等分子量高、結構穩定的持久性有機汙染物降解過程緩慢，很難通過常規的富集培養方法獲得降解菌。目前，相關降解功能微生物的報導甚少。例如，已報導的在厭氧條件下降解典型高環芳烴類汙染物苯並(a)芘的微生物僅4株。這不僅影響了對這些高分子量芳香烴類化合物微生物降解機制的科學認知，更是極大限制了這類毒害有機物的有效治理。因此，具有高分子量芳香烴類化合物降解功能微生物菌種資源的獲取對相關降解機制的科學認知及相關汙染物的有效治理具有重要意義。
技術實現要素：
4.本發明的目的是提供一種具有在好氧、厭氧或者硝酸鹽還原條件下具有高分子量芳香烴類化合物降解能力的嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452。該菌株於2022年12月12日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，郵編：510070，保藏編號為gdmcc no：63025。
5.本發明的第二個目的是提供了一種嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452在去除高分子量芳香烴類化合物中的應用。
6.優選，嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452在淨化受汙染空氣、水體、沉積物或土壤中高分子量芳香烴類化合物的應用。
7.研究發現，在某曾受芳香烴類化合物汙染的珠三角河流沉積物中，存在著一定豐度的嗜脂環物菌。本發明通過對廣東佛山容桂某曾受芳香烴類化合物汙染的河床底泥進行富集培養、分離和純化得到菌株t452，位於嗜脂環物菌屬，命名為嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452。
8.本發明人在曾經受芳香烴類化合物汙染的河道沉積物中分離獲得了一株能在好氧和厭氧條件下降解高分子量芳香烴類化合物的菌株t452，位於嗜脂環物菌屬
(alicycliphilus)。嗜脂環物菌是具有廣泛的異生物質降解能力的一類細菌，已有研究報導了該類細菌對苯、甲苯和萘等幾種低分子量芳香烴汙染物的降解功能。本發明通過分析該菌株對高分子量多環芳烴的降解能力，重點闡明了該菌株對典型高環芳烴類汙染物苯並(a)芘的降解動力學和降解途徑，並且通過基因組分析揭示了該菌具有廣泛的芳香烴類化合物的降解能力，建立了利用該菌株強化去除高分子量芳香烴類化合物的方法，為受汙染的空氣、水體、沉積物和土壤的淨化提供技術支撐。
9.本發明的嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452為在好氧或者硝酸鹽還原條件下具有高分子量芳香烴類化合物降解的能力，能去除空氣、水體、沉積物和土壤中的高分子量芳香烴類化合物，為空氣淨化、河道修復、廢水處理和土壤治理提供了微生物菌種資源及其強化治理方法。
10.alicycliphilus sp.t452，於2022年12月12日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，郵編：510070，保藏編號為gdmcc no：63025。
附圖說明：
11.圖1是實施例1中嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452的物種親緣關係圖；
12.圖2是實施例1中嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452的透射電鏡圖；
13.圖3是實施例4中嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452的苯並(a)芘降解動力圖；
14.圖4是實施例6中嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452的芳香烴類化合物降解途徑。
具體實施方式：
15.下面結合附圖，進一步通過實施例對本發明的一種具有芳香烴類化合物降解功能的嗜脂環物菌t452及其應用進行詳細說明。本發明不限於以下實施例的描述。
16.實施例1：嗜脂環物菌t452的分類和生理特徵鑑定
17.菌株t452分離於廣東省佛山容桂某河道沉積物。使用r2a固體培養基對菌株t452進行培養，形成菌落後使用通用引物27f(agagtttgat cctggctcag)和1492r(tacgacttaa ccccaatcgc)對菌株t452的16s rrna基因進行pcr擴增和測序，測序結果經過拼接後獲得近完整的16s rrna基因序列，結果如seq id no.1所示。與ncbi的genbank資料庫中的16s rrna序列進行比對，獲取同源性較高的近緣菌株的序列，並在mega5上構建系統發育樹，確定菌株t452的分類地位。使用透射電子顯微鏡對菌株t452進行形態觀察。使用biolog gen iii對菌株t452的碳源利用能力進行測定。使用r2a液體培養基對菌株t452的生長ph(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10)、溫度(4、10、15、20、25、30、35、40、43)和鹽度(硫化鈉等量，0％、1％、2％、3％、4％、5％、10％)進行測定。
18.結果顯示，菌株t452的16s rrna基因序列與alicycliphilus denitrificans k601
t
的相似度最高(98.7％)，並且在進化樹中與嗜脂環物菌屬鄰接(圖1)。說明菌株t452系屬於嗜脂環物菌屬的一個物種。菌株t452在r2a固體培養基上培養3天後形成1-2mm的透明菌落，呈圓形，突起，表面光滑，邊緣整齊的形態。通過透射電鏡觀察發現，菌體1.0～1.8μ
m長，0.5～0.7μm寬，有單一鞭毛(圖2)。生長溫度範圍為20～40℃，生長ph範圍為6.0～9.0，耐鹽度最高達2％。利用的碳源包括乳酸、甘油、d果糖-6-磷酸、l-丙氨酸、l-天冬氨酸、l-穀氨酸、l-焦穀氨酸、l-絲氨酸、l-半乳糖醛酸內酯、d-葡萄糖醛酸、葡糖醛醯胺、粘酸、糖質酸、甲基丙酮酸、檸檬酸、α-酮-戊二酸、d-蘋果酸、l-蘋果酸、α-羥基-丁酸、羥基丁酸、吐溫40、α-酮-丁酸、丙酸和乙酸。
19.經過形態學、生理生化和分子分類學的鑑定表明，菌株t452系屬於alicycliphilus屬的物種，並命名為嗜脂環物菌(alicycliphilus sp.)t452，於2022年12月12日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，郵編：510070，保藏編號為gdmcc no：63025。
20.實施例2：嗜脂環物菌t452對多環芳烴的降解特徵
21.將嗜脂環物菌t452在r2a上進行活化，按od
600
為0.01接種到含有10g/l硝酸鉀的r2a液體培養基中，180rpm厭氧培養到od
600
為0.4時(1天)，分別加入500μg/l芘、苯並(a)蒽和苯並(a)芘，再培養2天後，萃取和用uplc測定各多環芳烴的降解率。設無菌對照組，加入含有10g/l硝酸鉀的r2a液體培養基，以及500μg/l的芘、苯並(a)蒽和苯並(a)芘，不接種嗜脂環物菌t452，180rpm厭氧放置2天後，測定各多環芳烴的濃度。
22.結果顯示：無菌對照組的多環芳烴無明顯的下降，而接種菌株t452的處理組，包括芘、苯並(a)蒽和苯並(a)芘分別降低了約60％、62％和56％。說明菌株t452具有芘、苯並(a)蒽和苯並(a)芘等高分子量多環芳烴的降解能力。
23.實施例3：好氧和硝酸鹽還原條件下嗜脂環物菌t452對苯並(a)芘的降解特徵
24.將嗜脂環物菌t452在r2a上進行活化，按od
600
為0.01接種到含有10g/l硝酸鉀的r2a液體培養基中，180rpm厭氧培養到od
600
為0.2時(約18小時)，8000g離心收集菌體，用m9無機鹽培養基洗滌後，按照od
600
為0.25接種到含有2mg/l苯並(a)芘和2g/l硝酸鉀的m9無機鹽培養基中，設厭氧和好氧兩種條件進行培養。各實驗處理組設3個重複，設置滅菌對照組各三個重複。在第0、4天取樣測定苯並(a)芘濃度的變化。
25.結果顯示，菌株在好氧條件下苯並芘降解率約為38％，而硝酸鹽還原條件下的降解率約為62％。說明菌株t452在好氧和硝酸鹽還原條件下都具有苯並(a)芘的降解能力，並且厭氧的硝酸鹽還原條件下的效率更高。
26.實施例4：硝酸鹽還原條件下嗜脂環物菌t452對苯並(a)芘的降解動力學特徵
27.將嗜脂環物菌t452在r2a上進行活化，按od
600
為0.01接種到含有5g/l硝酸鉀的r2a液體培養基中，加入1mg/l苯並(a)芘，並設置滅菌對照組。分別在0、4、8、12、24、48、72、96小時測定苯並(a)芘的降解率以及od
600
和硝酸鹽濃度的變化。
28.結果如圖3所示，菌株t452在生長的同時，硝酸鹽出現了明顯的下降(圖3a)，說明該菌利用硝酸鹽為電子受體進行生長繁殖。而添加的約1mg/l的苯並(a)芘也隨著菌株厭氧生長的過程逐漸降解去除(圖3b)，最終在100小時降解率達到40.6％，與對照組存在顯著差異(p《0.01)。
29.實施例5：好氧條件下嗜脂環物菌t452對四溴雙酚a的降解特徵
30.將嗜脂環物菌t452在r2a上進行活化，按od
600
為0.2接種到含有10mg/l四溴雙酚a的m9無機鹽培養基中，設3個重複，設置滅菌對照組。在第0和7天取樣測定四溴雙酚a濃度的變化。
31.結果顯示，滅菌對照組的四溴雙酚a降低了12.9％，而添加嗜脂環物菌t452的處理組四溴雙酚a降低了42.3％，顯著低於滅菌對照組(p《0.01)，說明嗜脂環物菌t452具有較高的四溴雙酚a降解能力。
32.實施例6：基因組分析揭示嗜脂環物菌t452降解芳香烴類化合物的途徑
33.提取嗜脂環物菌t452的總dna，通過二代測序方法測定其基因組框架圖，下機數據通過spades v3.13.1軟體進行組裝，prodigal v2.6.3和eggnog-mapper分別進行基因的預測和注釋，並在kegg-mapper進行代謝途徑重構。
34.結果顯示，菌株t452的基因組上存在大量芳香烴類化合物降解相關的基因(圖4)，如苯和苯酚等通過兒茶酚降解途徑進入tca循環而測底降解(圖4a)；3-氯兒茶酚、3-氟兒茶酚等的降解途徑(圖4b、4c)；以及甲苯、甲基苯酚和3-甲基兒茶酚等測底降解的途徑(圖4d)。
35.seq id no.1
36.[0037][0038]